Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Канонические и неканонические последовательности эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в геноме дрозофилы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Канонические и неканонические последовательности эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в геноме дрозофилы"

На правах рукописи

КОТНОВА Алина Петровна

КАНОНИЧЕСКИЕ И НЕКАНОНИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЭНДОГЕННОГО РЕТРОВИРУСА МДГ4 (gypsy) В ГЕНОМЕ ДРОЗОФИЛЫ

03. 00. 03. - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005 год

Работа выполнена в лаборатории подвижности генома Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Научные руководители:

академик РАН, доктор биологических наук, профессор Ю. В. Ильин. Официальные оппоненты:

член-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор Л. И. Корочкин, доктор биологических наук Н. А. Чуриков

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН

Защита диссертации состоится «?3> 2005 года в Л часов на заседании

Диссертационного совета Д002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу- 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан ^Кй^Я 2005 года.

кандидат химических наук

Ученый секретарь Диссертационного совета

¿LOOfr-f

? ¿LO?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мобильные генетические элементы являются важным компонентом генома эукариот. У Drosophila melanogaster на их долю приходится около 10% геномной ДНК. Взаимодействие мобильных элементов с геномом клетки носит сложный характер: они могут встраиваться в различные участки клеточных генов (в их экзонные, интронные и регуляторные последовательности), что в большей или меньшей степени сказывается на экспрессии этих генов; в свою очередь клетка контролирует транспозиции мобильных элементов, препятствуя их активному перемещению.

Элемент МДГ4 (в англоязычной литературе известный как gypsy) - один из наиболее изученных ретротранспозонов дрозофилы. Особенности его структуры и инфекционные свойства позволяют говорить о МДГ4 как об эндогенном ретровирусе беспозвоночных. Подобно ретровирусам, он содержит три открытые рамки считывания (ОРС), а цикл его транспозиции проходит через стадию обратной транскрипции. Несмотря на то, что эндогенные ретровирусы являются предметом пристального внимания исследователей, в настоящий момент очень мало известно об их генетическом взаимодействии с организмом-хозяином Это обусловлено тем, что обычно в роли хозяина выступают позвоночные - трудные объекты для генетического анализа. Присутствие ретротранспозона МДГ4 в геноме классического модельного объекта D melanogaster дает уникальную возможность для детального изучения взаимоотношений ретровируса и клетки.

Ранее было показано существование двух подсемейств ретротранспозона, имеющих чёткие структурпые различия и отличающихся друг от друга способностью к перемещениям Эти подсемейства получили условные названия «активное» и «неактивное».

«Активный» и «неактивный» варианты МДГ4 различаются на уровне рестриктных карт. В частности, наличие сайтов HindIIl (4483), Muí (5335) и Clal (6939) является характерной особенностью «активного» подсемейства. По всей видимости, «активный» вариант МДГ4 является эволюционно более молодым и образовался в результате постепенного накопления точечных мутаций, затрагивающих «неактивный» вариант. Предполагается, что первым появился рестрикционный сайт MIuI, затем - Clal и, наконец, HindIIl Такая последовательность событий подтверждается результатами рестрикционного анализа геномной ДНК 20 исследованных линий мух. Исключением является линия Г32. В этой линии присутствуют варианты МДГ4, которые содержат сайт HindIIl, но не содержат сайтов Muí и/или Clal. .—

Известно, что все копии

мутагенеза, содержали в кодирующей части сайт рестрикции Hindlll (4483), что позволило рассматривать его как маркер на принадлежность к «активному» подсемейству. В то же время, было показано, что участок, влияющий на ретротранспозиционную активность, расположен между сайтами рестрикции PvuII (2733) и Kpnl (3127). Замещения этого участка в «неактивном» варианте соответствующим участком из «активного» достаточно для повышения ретротранспозиционной активности такого варианта МДГ4 в культуре клеток, несмотря на отсутствие у такой копии сайта рестрикции Hindlll (4483). Таким образом, присутствие необычных копий в линии Г32 вызывает особый интерес. Можно предположить, что они образовались в результате рекомбинационвых процессов, затрагивающих «активный» и «неактивный» варианты, однако нельзя исключать вероятность того, что они относятся к новому, ранее неизвестному подсемейству МДГ4 (gypsy).

Цель и задачи исследования.

Целью данной работы явилось изучение структурных особенностей различных вариантов ретротранспозона D melanogaster МДГ4 в геноме линии Г32. Данное исследование было предпринято в рамках изучения возможных механизмов эволюции ретротранспозона МДГ4.

В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи:

• Клонировать ДНК из линии Г32 D melanogaster, используя в качестве вектора бактериофаг XGEM11.

• Провести скрининг геномной библиотеки линии Г32 и отобрать клоны, имеющие гомологию с последовательностью МДГ4 {gypsy).

• Используя метод Саузерн-блот гибридизации, провести предварительный анализ выявленных клонов па предмет их соответствия различным областям МДГ4 (gypsy).

• Провести детальный структурный анализ клонов, содержащих полноразмерный МДГ4 (gypsy), включая секвенирование функционально значимых участков.

• Провести рестрикционный анализ клонов, содержащих последовательности, существенно отличающиеся от канонических.

• Исследовать представленность в геноме дрозофилы неканонических полноразмерных ретротранспозонов, имеющих существенную гомологию с последовательностью МДГ4 (gypsy).

Научная новизна и практическая ценность работы.

В настоящей работе клонированы из генома D melanogaster и охарактеризованы 28 различных последовательностей, имеющих гомологию с МДГ4.

Среди них выявлено 4 полноразмерпых копии этого ретротранспозона, две из которых принадлежат к «активному» подсемейству, одна - к «неактивному»; еще одна копия оказалась гибридной У гибридного варианта присутствует сайт рестрикции ITindlll в положении 4483, наличие которого характерно для всех копий «активного» подсемейства, клонированных из систем инсерционного мутагенеза, однако отсутствуют, как у «неактивных» копий, рсстрикционные сайты Ми/(5335) и Clal (6939). Определение нуклеотидной последовательности функционально важного для ретротранспозиционной активности МДГ4 района, расположенного между сайтами рестрикции PvuII (2733) и Kpnl (3127), показало, что у гибридного варианта она полностью соответствует последовательности «неактивных» копий. Можно предположить, что гибридный вариант возник в результате рекомбинационных процессов между «активной» и «неактивной» копиями, однако нельзя исключать вероятность того, что уникальность обнаруженной копии не ограничивается рестрикционной картой, и мы имеем дело с ранее неизвестным подсемейством МДГ4 (gypsy).

Впервые были клонированы 4 копии нового неизученного мобильного элемента gtwin, входящего в группу Gypsy ретротранспозонов. Этот мобильный элемент, имеющий три открытые рамки считывания (ОРС), был открыт in silico в начале 2000-х годов. Проведен сравнительный структурный анализ МДГ4 и gtwin, показана их высокая гомология в области второй и третьей ОРС. Особенно интересным представляется тот факт, что наибольшая степень гомологии - до 77% как для нуклеотидных, так и аминокислотных последовательностей этих двух элементов - наблюдается в районе третьей ОРС. Последовательность ОРСЗ ретротранспозонов гомологична ретровирусному гену env, кодирующему компоненты, ответственные за взаимодействие вирусной частицы с мембранными рецепторами клетки Роль гена env эрантивирусов дрозофилы до настоящего времени остается неясной. Наиболее привлекательной кажется гипотеза о том, что продукт третьей рамки обеспечивает способность эрантивирусов к горизонтальному переносу и является аналогом env ретровирусов позвоночных. Для ретротранспозона дрозофилы МДГ4 [gypsy) была прямо показана инфекционность образованных им частиц. Высокая гомология генов env МДГ4 и gtwin позволяет предположить, что открытый недавно регротранспозон gtwin также обладает инфекционными свойствами.

Исследованы особенности структурной организации третьей ОРС ретротранспозона gtwin, выявлено два варианта этого мобильного элемента, различающихся наличием или отсутствием стоп-кодона в середине третьей ОРС.

Изучено распределение копий ретротранспозона gtwin в геноме рода Drosophila. Показано, что в геноме D virilis и D. hydei копии этого мобильного элемента отсутствуют.

В геноме D melanogaster ретротранспозон gtwin представлен небольшим числом копий (2-6), обнаружена лишь одна линия (Г32), в геноме которой присутствует свыше 20 копий этого мобильного элемента. В культуре клеток ретротранспозон gtwin сильно амплифицирован.

Полученные результаты открывают широкие возможности для дальнейших исследований эволюционных взаимоотношений в группе Gypsy ретротранспозонов и способности мобильных элементов МДГ4 и gtwin к горизонтальному переносу. Особый интерес представляют дальнейшие исследования линии Г32, в которой ретротранспозон gtwin значительно амплифицирован.

Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на ежегодных отчетных конференциях аспирантов ИМБ РАН (2002, 2003, 2004 i.) и на XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, апрель 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 1JD страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы Библиография включает в себя источников. Работа проиллюстрирована У5рисунками и 3_ таблицами.

Результаты и обсуждение 1. Скрининг геномной библиотеки линии Г32 Drosophila melanogaster

Для создания библиотеки геномную ДНК мух обрабатывали специфической рестрикционной эндонуклеазой ВатШ, поскольку канонические последовательности МДГ4 не содержат сайтов узнавания этой рестрикционной эндонуклеазой. Полученные фрагменты дотировали с вектором XGEM11, также обработанным ВатШ Рост родительских бактериофагов эффективно подавлялся при размножении библиотеки на штамме Е coli XL1 -Blue MRA, лизогенном по бактериофагу Р2.

При первичном скрининге библиотеки методом Саузерн-блот гибридизации было проанализировано не менее 45000 рекомбинантных фагов. Этой выборки достаточно, чтобы охватить почти все уникальные последовательности геномной ДНК дрозофилы В качестве зонда при гибридизации был использован фрагмент ДНК МДГ4 Xhol - Xhol (Рис.1, зонд 1), содержащий полную последовательность ретротранспозона. Это позволило отобрать как полноразмерные, так и делегированные геномные копии МДГ4, за исключением элементов, последовательность ДНК которых содержит сайты рестрикции BamHI.

При скрининге геномной библиотеки линии Г32 Л melcmogaster было отобрано 28 уникальных клонов, имеющих гомологию с последовательностью МДГ4. Мы полагаем, что нам удалось практически полностью проанализировать геном линии Г32, поскольку многие из гибридизующихся со специфическим зондом клонов были отобраны нами в нескольких повторностях.

МШ(5335)*

Щп<1Ш(4483)

Ш орс2

Рис. 1. Строение ретротранспозона МДГ4 (gypsy).

Показана рестрикционная карта мобильного элемента. Звездочкой отмечены сайты рестрикции, отсутствующие в "неактивной" копии. Цифры в скобках обозначают порядковый номер нуклеотида в последовательности МДГ4 (соответствуют первому нуклеотиду в узнаваемой ферментом последовательности). Линиями под рестрикционной картой обозначены зонды, использованные при проведении Саузерн-блот гибридизации. Ниже представлена схема строения МДГ4, указаны длинные концевые повторы (ДКП) и открытые рамки считывания (ОРС).

2. Структурный анализ отобранных клонов 2.1. Выявление полноразмерных копий МДГ4

Для выявления клонов, содержащих полноразмерные копии МДГ4, был проведен Саузерн-блот анализ ДНК, выделенной из этих клонов.

ДНК рекомбинантных бактериофагов была обработана специфической рестрикционной эндонуклеазой Xhol, поскольку ее сайты содержатся только в ДКП ретротранспозона Фрагменты, соответствующие полноразмерпым копиям, выявляли

гибридизацией с меченным 32Р фрагментом ДНК Нра1-Ри1 (рис. 1, зонд 2), содержащим ДКП ретротранспозона. Полноразмерным копиям, имеющим два концевых повтора, при гибридизации с зондом Нра1-Р$И соответствуют три полосы на радиоавтографе (см рис.2).

1.1 3.1 4.1 5.1 6.1 7.1 8.1 9.1 10.1 12.1 2.2 3.2 4.2 13 12А 40А

Рис. 2. Результаты Саузерн-блот гибридизации.

ДНК, выделенную из рекомбинантных бактериофагов (номера дорожек соответствуют номерам клонов), обрабатывали рестрикционной эндонуклеазой ХИо1. В качестве зонда использовали 32Р-меченый фрагмент ДНК МДГ4 Нра1~ (зонд 2, рис 1)

Одна из них - «тело» МЭ - составляет около 7 т.п.н., а две другие, соответствующие фрагментам ДКП с прилегающими к ним последовательностями геномной ДНК дрозофилы, варьируют по длине.

Фрагменты, соответствующие полноразмерным копиям, были выявлены только для 4 клонов (4.1, 8 1, BIO, В18). Остальные клоны содержат последовательности, существенно отличающиеся от канонических МДГ4.

2.2. Структурный анализ полноразмерных копий МДГ4, клонированных из линии Г32 2.2.1. Рестрикционный анализ полноразмерных копий МДГ4 Для определения принадлежности получеппых копий МДГ4 к «активному» или «неактивному» подсемействам, бьи проведен рестрикционный анализ этих клопов с последующей Саузерн-блот гибридизацией Так как все копии элемента, принадлежащие к «активному» подсемейству, содержат факультативные сайты рестрикции ITindlll (4483), Mul(5335), Clal(6939) и Xbal(430, 7417), их использовали как молекулярные маркеры на выявление «активных» копий. Дня облегчения проведения рестрикционного анализа рекомбинантные вставки были переклонированы по сайтам рестрикции BamHI из фага X в плазмидный вектор pBluescript II SK (-) ("Fermentas")

ДНК рекомбинантных бактериофагов обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами в следующих комбинациях: 1) Xhol-HindIII, 2) Xhol-Mlul, 3) Xhol-Clal, 4) Xhol-Xbal. Фрагменты, соответствующие «активному» варианту МДГ4, выявляли гибридизацией со специфическим ДНК-зондом HindlII-EcoRI (Рис. 1, зонд 5) в случае первых трех комбинаций, с зондом Hpal-Pstl (Рис. 1, зонд 2) - в случае четвертой На основании проведенного аншшза можно считать копию, находящуюся в клоне 4.1, «неактивпой», а копии, присутствующие в клопах 8.1 и В18 - «активными», поскольку они содержат факультативные сайты рестрикции HindIII, Muí, Clal и Xbal Особый интерес вызывает копия, содержащаяся в клоне BIO. В ней присутствуют сайты рестрикции HindIII в положении 4483 и Xbal в обоих ДКП, но отсутствуют факультативные сайты Muí и Clal Ранее было показано, что эволюция «неактивного» варианта МДГ4, по-видимому, шла за счст накопления точечных мутаций, в результате чего сначала появился факультативный сайт рестрикции Muí (5335), затем Clal (6939) и только потом HindIII (4483) Исходя из полученных нами данных, можно предположить, что в эволюции мобильных элементов важную роль играют также рекомбинационные процессы, и копия BIO возникла в результате рекомбинации между «активным» и «неактивным» вариантами МДГ4.

2.2.2. Секвенирование функционально важного для ретротранспозиционной активности района полноразмерных копий МДГ4, клонированных из линии Г32

Функционально важный для ретротранспозиционной активности МДГ4 участок расположен между сайтами рестрикции PvuII (2733) и Kpnl (3127). В этом районе

«активная» копия отличается от «неактивной» пятью нуклеотидными заменами, три из которых приводят к двум заменам аминокислот: Thr - Asrt (нуклеотид в положении 2928) и Lys -Arg (нуклеотиды в положении 3107, 3108).

Для сравнения нуклеотидной последовательности района Pvull/Kpnl «активных» (клоны 8.1 и В18), «неактивной» (клон 4.1) и необычной (клон BIO) копий МДГ4 из линии Г32 с описанными ранее «активным» и «неактивным» вариантами, проводили их частичное секвенирование. В качестве праймера использовали последовательность 5'-gaa tac cag ggc ate get g-31, комплементарную области 2696-2714 ретротранспозона МДГ4. При сравнении полученных нуклеотидных последовательностей с описанными ранее использовали программу BLAST, доступную в Internet (http'//www nebi nlm nih.gov/blast/).

Проведенный анализ показал, что нуклеотидная последовательность района Pvull/Kpnl у клонов 8.1 и В18 полностью соответствует последовательности ранее описанного «активного» варианта; у клонов 4.1 и BIO - последовательности «неактивного».

2.3. Исследование структуры неканонических клонов, имеющих гомологию с МДГ4 2.3.1. Саузерн-блот анализ неканонических клонов

Из 28 клонов, имеющих гомологию с последовательностью МДГ4, только 4 содержали его полноразмерные копии.

Для проведения структурного анализа, ДНК остальных клонов обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами Xhol и HindIII Рестрикционные фрагменты разделяли электрофорезом в агарозном геле. ДНК переносили на нейлоновый фильтр и гибридизовали с меченными 32Р фрагментами ДНК, практически полностью перекрывающими последовательность МДГ4 (Рис 1): 1) зонд 2 - Hpal-Pstl (ДКП), 2) зонд 3 - NcoI-PvuII (область гена gag), 3) зонд 4 - HindlII-HindlIl (частично область гена pol), 4) зонд 5 - HindIII-EcoRI (частично область гена pol - область гена env). Результаты Саузерн-блот гибридизации приведены на рис. 3 и суммированы в табл.1.

Рис. 3. Результаты Саузерн-блот гибридизации.

ДНК, выделенную из рекомбинантных бактериофагов (номера дорожек соответствуют номерам клонов), обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами ШгиШI и Хко1. В качестве зонда использовали 32Р-меченые фрагменты МДГ4: а) Пра1-РШ (зонд 2, рис. 1), б) Исо1-РттП (зонд 3, рис. 1).

11 31 5.1 41 7 1 91 101 121 22 3 2 4.2 и «А 12А

т"н ШЩШЩШШ

В2 В8 В12 В13 В15 В20 В22 В25 ВЗО В36

Рис. 3 (продолжение). Результаты Саузерн-блот гибридизации.

ДНК, выделенную из рекомбинантных бактериофагов (номера дорожек соответствуют номерам клонов), обрабатывали рестрикционными эндонуклеазами НШШ и Хко! В качестве зонда использовали 32Р-меченые фрагменты МДГ4: в) НШПТ-НМШ (зонд 4, рис. 1), г) НШШ-ЕсоЮ (зонд 5, рис. 1).

Таблица 1. Результаты Саузерн-блот-гибридизации ДНК, выделенной из рекомбинантных клонов бактериофага Я, со специфическими ДНК-зондами. "+" -

значительная гибридизация, "+/-" - слабая гибридизация, "-" — отсутствие гибридизации с соответствующим ДНК-зондом

№ клона Гибридизация с фрагментом Hpal-Pstl (зонд 2) Гибридизация с фрагментом NcoI-PvuII (зонд 3) Гибридизация с фрагментом HindlH-Hindlll (зонд 4) Гибридизация с фрагментом Hindlll-EcoRI (зонд 5)

1.1 + + + +

6.1 + + + +

9.1 + + + +

1.3 + + + +/-

В2 + + + +

В13 + + + +

В15 + + + +

В25 + + + +

ВЗО + + + +/-

В36 + + + +

40А + + - +

4.2 + - + +

12А +/- - - +/-

10.1 + - + +

12.1 + - + +

22 + - + +

3.2 + - + +

5.1 - + + +

7.1 - + + +

3.1 ■ + + -

В8 - +/- - -

В12 - - - +

В20 - + - -

В22 - + - -

Как видно из таблицы, клоны, содержащие неканонические последовательности МДГ4, можно разделить на 5 групп.

К первой, наиболее многочисленной, относятся последовательности 10-ти клонов (1.1, 6.1, 9.1, 1.3, В2, В13, В15, В25, ВЗО, В36), имеющих гомологию со всеми использованными зондами. Строение этих вариантов значительно отличается от канонических полноразмерных копий МДГ4. Сюда же можно отнести клон 40А, не

гибридизуклцийся с фрагментом МДГ4 HindlII-HindlJI (зонд 4). По всей видимости, эта копия подверглась делеционным перестройкам

Во вторую группу входят клоны, имеющие гомологию только с 3' концом МДГ4 (4 2, 12А) Исходя из результатов гибридизации, мы предположили, что эти клоны имеют лишь один длинный концевой повтор- З'-ДКП. Такие варианты могли образоваться в результате встраивания в последовательность МДГ4 других мобильпых элементов.

Особый интерес у нас вызвали клоны 10 1,12.1, 2 2 и 3.2, результаты гибридизации которых с использовавшимися ДНК-зондами оказались схожими, но в то же время значительно отличались от ранее описанных вариантов МДГ4. Па основании этого мы решили выделить их в отдельную группу.

Четвертая группа представлена клонами, у которых отсутствует гомология с последовательностью ДКП, но присутствуют последовательности, гомологичные всем трем ОРСМДГ4 (5.1,7.1).

К пятой группе относятся клоны, гибридизующиеся лишь с одним-двумя использованными зондами, содержащими последовательности ОРС ретротранспозона (3.1, В8, В20, В22) По всей видимости, эти варианты являются следствием древних транспозиций МДГ4 в гетерохроматин, где копии этого элемента потеряли способность к перемещениям и подверглись значительным структурным перестройкам.

2.3.2. Рестрикционный анализ неканонических клонов Для проведения более детального структурного анализа неканонических клонов проводили их рестрикционный анализ. Рекомбинантные вставки переклонировали по сайтам рестрикции BamHI из фага X в плазмидный вектор pBluescript II SK (-) ("Fermentas") и обрабатывали специфическими рестрикционными эндонуклеазами Clal, EcoRI, HindlII, Kpnl, PstI, Xbal, и Xhol в различных сочетаниях. Рестрикционные фрагменты разделяли электрофорезом в агарозном геле, переносили па пейлоновый фильтр и гибридизовали с меченными 32Р фрагментом ДНК МДГ4 Xhol-Xhol (Рис Л, зонд 1), содержащим полную последовательность ретротранспозона. На основании полученных данных были построены рестрикционные карты 24 клонов, содержащих неканонические последовательности МДГ4, после чего было проведено их частичное секвенирование в районах, имеющих гомологию с МДГ4.

Результаты проведенного структурного анализа показали, что большинство клонов содержат последовательности, имеющие гомологию с МДГ4, но значительно отличающиеся по своему строению от полноразмерного элемента. По всей видимости, эти клоны содержат сильно дивергировавтие копии из гетерохроматических и прицентромерных областей генома D melanogaster. Несмотря на это, несомненно,

представляет интерес их дальнейшее исследование Такие копии, потерявшие способность к ретротранспозиции и постепенно накапливающие мутации в гетерохроматине, не подвергаются элиминирующему действию отбора. В результате рекомбинации между собой или с полноразмерными копиями, эти варианты способны образовывать новые, в том числе и активно перемещающиеся подсемейства мобильных элементов Тем не менее, в данной работе мы решили сосредоточиться на характеристике канонических и неканонических полноразмерных вариантов МДГ4, поэтому особый интерес у нас вызвали клоны 10.1, 12.1, 2.2 и 3 2, которые еще в процессе Саузерн-блот анализа давали сходные между собой результаты, но значительно отличающиеся в то же время от «активного» и «неактивного» подсемейств МДГ4.

л кЬ,

Рис. 4. Ресгрикционные карты клонов 10.1,12.1,2.2,3.2.

* для клона 3.2 дополнительно построена рестрикционная карта по Линией под каргой клона 3.2 обозначен клонированный в составе вектора рВ1иезсг1р1 II ЯК (-) и частично отсеквенированный фрагмент.

Построенные рестрикционные карты этих клонов оказались одинаковыми на протяжении более 7 т п.п. (см. рис.4), однако не совпадали с рестрикционными картами обоих подсемейств МДГ4. Это позволило предположить, что мы имеем дело с каким-то другим, родственным ему мобильным элементом.

2.3.3. Идентификация клонированного мобильного элемента

Для определения природы клонированного нами мобильного элемента, мы провели частичное секвенирование общей для всех четырех клонов области Для этого в составе плазмидного вектора pBluescript IISK (-) ("Fermentas") был клонирован фрагмент из клона 3 2. ДНК этого клона обрабатывали рестрикционной эндонуклеазой Bglll. Рестрикционные фрагменты разделяли электрофорезом в агарозном геле, выделяли фрагмент размером 4,7 т.п.н. (см. рис. 4) и лигировали с вектором, обработанным рестрикционной эндонуклеазой BamHI. Полученную конструкцию секвенировали с плазмидных праймеров ТЗ и 77 и анализировали нуклеотидпую последовательность с помощью npoipaMMbi BLAST.

В базе данных генома дрозофилы была обнаружена последовательность, в которой отсеквенированный нами участок клона 3.2 повторяется дважды через примерно 7 т.п.н. Мы предположили, что этот фрагмент содержит длинный концевой повтор (ДКП) клонированного нами неизвестного мобильного элемента, а найденная последовательность, заключенная между двумя предполагаемыми ДКП, является его кодирующей областью. С помощью компьютерной программы Vector NTI для обнаруженной в базе данных генома дрозофилы последовательности размером свыше 7 т.п.н. была построена рестрикционная карта. Она полностью совпала с построенной нами экспериментальным путем картой общего для клонов 10.1, 12.1, 2.2 и 3.2 участка. Компьютерный анализ с применением программы Vector NTI показал, что мы имеем дело с мобильным элементом, содержащим три ОРС и имеющим на концах полностью идентичные друг другу ДКП.

Благодаря осуществлению проекта «Геном дрозофилы» появились широкие возможности для исследования in silico генов, регуляторных областей и повторяющихся элементов D. melanogaster В последние годы опубликовано несколько работ, посвященных изучению эволюционных взаимоотношений разных классов мобильных элементов. При этом две группы ученых независимо друг от друга обнаружили в геноме D melanogaster несколько ранее неизвестных мобильных элементов При анализе имеющихся данных выяснилось, что мобильный элемент, клонированный нами из генома линии Г32 - это открытый in silico ретротранспозон gtwin (Hamilton), принадлежащий к группе Gypsy ДКП-ретротранспозонов.

3. Ретротранспозон gtwin 3.1. Сравнительный анализ структурной организации ретротранспозонов МДГ4 и gtwin

Ретротранспозон gtwin, входящий в группу Gypsy ДКП-ретротранспозонов,

содержит три ОРС, кодирующие gag, pol и еиу-подобные белки Из всех представителей этой многочисленной группы ретроэлементов gtwin наиболее близок хорошо изученному эндогенному ретровирусу МДГ4 (gypsy) D melanogaster

С помощью программы BLAST мы сравнили аминокислотные последовательности трех полипептидов, кодируемых этими двумя элементами На всем протяжении они хорошо выравниваются между собой.

В области гена gag гомология между МДГ4 и gtwin составляет 53% Высокой гомологией (76%) отличается область гена pol, продукты которого (протеаза, обратная транскриптаза, рибонуклеаза Н, интеграза) играют ключевую роль в процессе ретротранспозиции. Интересным представляется тот факт, что для гена env гомология между двумя элементами достигает 77%. Как правило, у разных ретроэлементов отличия в последовательности третьей ОРС значительно выше.

Сравнение нуклеотидных последовательностей МДГ4 и gtwin методом выравнивания также показало, что наибольшая степень гомологии - свыше 75% -наблюдается во второй и третьей ОРС Гораздо слабее гомология в области гена gag Лишь в Ol дельных участках первой ОРС она превышает 50% ДКП, не кодирующие белковых продуктов, как и следовало ожидать, являются наименее консервативными районами мобильных элементов. Сходство нуклеотидных последовательностей ДКП ретротранспозонов gtwin и МДГ4 невелико, их трудно выровнять между собой на значительном протяжении

Как известно, ретротрансиозон МДГ4 имеет сложно организованную лидерную область, расположенную после 5' ДКП Предполагается, что эта область (инсулятор) действует как позитивный регулятор транскрипции МДГ4. При сравнении мы не нашли в нуклеотидной последовательности мобильного элемента gtwin значительной гомологии с инсулятором МДГ4.

3.2. Исследование структуры третьей открытой рамки считывания I ретротранспозопов gtwin, клонированных из линии Г32

При анализе содержащейся в базе данных генома дрозофилы нуклеотидной последовательности ретротранспозона gtwin (АС006215 и АС107326) мы обнаружили, что последовательность гена env элементов прерывается в ее середине стоп-кодоном (позиция 6117-6119 нуклеотидной последовательности gtwin). Мы решили исследовать на наличие терминирующего кодона в этой области копии gtwin, клонированные нами из генома линии Г32 D. melanogaster. Для этого мы провели частичное секвенирование последовательности гена env всех четырех копий. В качестве праймера использовали последовательность 5'-tgc-tgt-cgg-act-gaa-gaa-c-3', комплементарную области 6184-6166

ретротранспозона gtwin. Проведенный анализ показал, что все четыре клонированные копии из линии Г32 не содержат стоп-кодона в положении 6117-6119 (триплет ТАА заменен па GAA). Таким образом, можно говорить о существовании двух разновидностей мобильного элемента gtwin, различающихся наличием или отсутствием терминирующего кодона в середине их третьей ОРС.

3.3. Распределение копий ретротранспозона gtwin в линиях дрозофилы

Bowen и McDonald обнаружили в геноме D melanogaster две копии мобильного элемента gtwin, расположенные тандемно и соединенные общим ДКП Мы провели дополнительный поиск копий этого ретротранспозона в базе данных генома дрозофилы Помимо ранее описанных (АС006215), мы нашли еще одну копию gtwin в Х-хромосоме D. melanogaster (АС 107326). По всей видимости, мобильный элемент gtwin представлен в эухроматических районах генома небольшим числом копий. Мы решили проверить это предположение экспериментальным путем, а также провести поиск ретротранспозона gtwin в геномах других видов рода Drosophila

Для исследования распределения копий элемента gtwin в линиях рода Drosophila были выбраны 4 линии D virilis, 1 линия D hydei и 11 линий D melanogaster, которые представлены как старыми лабораторными линиями, так и недавно изолированными из природных популяций (Табл.2).

Рис.5. Строение ретротранспозона gtmn.

Показана рестрикционная карта мобильного элемента. Линиями под рестрикционной картой обозначены зонды, использованные при проведении Саузерн-блот гибридизации. Ниже представлена схема строения указаны длинные концевые повторы (ДКП) и открытые рамки считывания (ОРС). Стрелкой обозначено положение факультативного терминирующего кодона.

Табл. 2. Некоторые характеристики линий дрозофилы, использованных в эксперименте.

№ Вид Drosophila Линия Происхождение линии Генетические маркеры Источник получения линии

1 melanogaster Г32 Лабораторная линия, изолированная из природной популяции Гваделупы в 1995г Дикий тип Коллекция кафедры генетики МГУ им. Ломоносова

2 melanogaster FM4 Лабораторная линия РМ4у" а5с"В/Ой:1 )РВ<1*К2 Коллекция ИБГ РАН

3 melanogaster xx/y Старая лабораторная линия С(1)Ш,у Коллекция ИМБ РАН

4 melanogaster BL3127 Получена из Bloomlngton Drosophila Stock Center ОА[ЗЬ)п-79сЛМЗ,ЗЬ[1) Коллекция ИЫ РАН

5 melanogaster BL2400 Получена из Bloommgton Drosophila Stock Center ОЯ[31.)1К17г1ю[уе1]/ТМ6 Коллекция ИБГ РАН

6 melanogaster SS Старая лабораторная линия, изогенизирована более 30 лет назад w Коллекция кафедры генетики МГУ им. Ломоносова

7 melanogaster CantonS Старая лабораторная линия изогенизирована более 50 лет назад Дикий ТИП Коллекция ИБГ РАН

8 melanogaster Нальчик Линия изолирована из природной популяции Нальчика в 1999г. Дикий тип Коллекция ИБГ РАН

9 melanogaster Звенигород Линия изолирована из природной популяции Звенигорода в 1999г. Дикий тип Коллекция ИБГ РАН

10 melanogaster DfU) Старая лабораторная линия У,1* Коллекция ИМБ РАН

11 melanogaster 140GFP Лабораторная линия Ш71, Р{»мпС=Ай бРР} I МЯЗ/С(1) Ш, I Коллекция ИМГ РАН

12 hydet Odessa Линия изолирована из природной популяции Одессы Дикий тип Коллекция ИМБ РАН

13 vtrihs 9 Старая лабораторная линия, изолированная из природной популяции Батуми в 1970г Дикий тип Коллекция ИМБ РАН

14 virihs 40 Старая лабораторная линия, изолированная из природной популяции Ташкента в 1970г. Дикий тип Коллекция ИМБ РАН

15 virtlts T-53 Лабораторная линия, изолированная из природной популяции Ташкента в 1998г. Дикий тип Коллекция ИМБ РАН

16 Vtrllls 101 Старая лабораторная линия, изолированная в Японии Дикий тип Коллекция ИМБ РАН

Мы также исследовали распределение копий gtwin в геноме культуры клеток D melanogaster линии Schneider. Геномную ДНК, выделенную из мух и культуры клеток, обрабатывали рестрикционной эндонуклеазой Hindlll Известно, что в геноме дрозофилы содержится значительное число сайтов рестрикции Hindlll, в то же время мы точно знаем, как расположены Hindlll-сайты внутри мобильного элемента gtwin

В качестве зонда мы использовали меченый Э2Р рестрикционный фрагмент ДНК из лидерной области мобильного элемента gtwin Sphl(661)-Pstl(1086), не имеющий заметной гомологии с последовательностью МДГ4 (рис.5, зонд 1). Так как расстояние от сайта HindIII(I288) в теле мобильного элемента до сайта узнавания этой же рестрикционной эндонуклеазой, расположенного в геномном окружении элемента со стороны его 5'-копца, различно для каждой копии gtwin, можно оценить количество копий ретротранспозона, содержащихся в геноме каждой линии.

Как видно из рис.бА, мобильный элемент gtwin обнаруживается в геноме всех исследованных линий D melanogaster (Рис.бА, дорожки 1-11) В геноме D virilis и D hydei не удается выявить копий этого ретротранспозона (Рис.бА, дорожки 12-16). Следует также отметить, что в соответствии с рестрикционной картой gtwin все гибридизующиеся фрагменты ДНК имеют длину не менее 1,3 т.п н

Линии D melanogaster раз тачаются по количеству содержащихся в геноме копий элемента. Большинство из пих содержит 2-6 копий. Исключением является линия Г32 (Рис 6А, дорожка1), в которой gtwin амплифицирован Наличие большого числа копий с различным геномным окружением в линии Г32 свидетельствует о том, что, по крайней мере, в недавнем прошлом gtwin активно перемещался в ее геноме.

На радиоавтографе присутствует общая для большинства линий полоса, соответствующая размеру около 7 т.п.н. Исключение составляют линии FM4 (Рис.бА, дорожка 2) и BL2400 (Рис.бА, дорожка 5) По-видимому, в геноме разных линий D melanogaster существует копия мобильного элемента gtwin в одинаковом геномном окружении Можно по-разному объяснить наличие в геноме разных линий D melanogaster такой копии Во-первых, это может быть следствием древней транспозиции, произошедшей до того, как изучаемые линии эволюционно разошлись. Во-вторых, наблюдаемый эффект может объясняться тем, что в геноме D melanogaster существует "горячая точка" встраивания gtwin. Кроме того, можно предположить, что произошла инсерция ретротранспозона gtwin в другой мобильный элемент. Исследования, проведенные в последние годы, показали, что мобильные элементы часто встраиваются друг в друга, поэтому такой вариант развития событий представляется довольно вероятным.

О 7 -

О 6 -

О 5 —

Б)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис. 6. Саузерн-блот анализ распределения копий ретротранспозона gtwin в геноме различных линий и культуры клеток Drosophila.

В качестве зона использовали 32Р-меченные рестрикционные фрагменты ДНК gtwin А) Sphl(661)-Pstl(l 086), Б) HindIIl(1288)-HindIII(4271), ДНК выделяли из линий мух, представленных в табл 2 (номера дорожек соответствуют номерам линий в таблице), и культуры клеток D. melanogaster линии Schneider (дорожка 17) и обрабатывали рестрикционной эндонуклеазой Hindlll.

В культуре клеток мобильный элемент gtwin сильно амплифицирован Вероятно, это связано с тем, что в этом случае не действуют или сильно ослаблены механизмы репрессии транспозиций.

Принимая во внимание высокую гетерогенность клеток в культуре и их разную плоидность, по результатам гибридизации трудно определить количество копий ретротранспозона, содержащихся в геноме линии Schneider (Рис.бА, дорожка 17).

Для того чтобы оценить гомогенность копий мобильного элемента gtwin в геноме изучаемых линий D melanogaster и проверить их на наличие внутренних делеций, мы провели повторную Саузерн-блот гибридизацию того же самого фильтра с меченым 32Р рестрикционным фрагментом ДНК HindIIl(1288)-HindIII(4271) этого элемента (Рис.5, зонд 2). Для всех исследованных линий на радиоавтографе была обнаружена только одна полоса, соответствующая размеру 3 т.п.н. (рис. 6Б).

Таким образом, можно говорить о гомогенности копий ретротранспозона gtwin в геноме D melanogaster.

По результатам исследований особый интерес представляет амплификация ретротранспозона gtwin в линии Г32. Для определения ее причин требуются дальнейшие исследования, но уже сейчас можно говорить том, что мы имеем дело с новым активно перемещающимся функциональным элементом.

ВЫВОДЫ

1. Из линии Г32 D melanogaster клонированы 28 последовательностей, имеющих гомологию с эндогенным ретровирусом МДГ4 (gypsy), среди которых только 4 содержат полноразмерный МДГ4.

2. Рестрикционный анализ полноразмерных копий МДГ4 из линии Г32 показал, что две (8.1 и В18) относятся к «активному» подсемейству, одна (4.1) - к «неактивному». Копия BIO, имеющая сайта рестрикции Hindlü (4483) и Xbal (430, 7417), но не имеющая сайтов Mlul (5335) и Clal (6939), является гибридной.

3. Анализ нуклеотидной последовательности функционально важного для ретротранспозиционной активности элемента района PvuII (2733) - Kpnl (3127) показал, что у вариантов 8 1 и В18 эта область соответствует ранее описанному «активному» подсемейству, а у клонов 4.1 и BIO - «неактивному».

4. Наряду с дивергировавшими копиями МДГ4, подвергшимися рекомбинационным перестройкам, из линии Г32 D melanogaster впервые были клонированы 4 копии не изученного ранее ретротранспозона gtwin, входящего в группу

Gypsy ДКП-ретротранспозонов.

5. Сравнительный структурный анализ ретротранспозонов МДГ4 {gypsy) и gtwin выявил значительное сходство между ними. Наибольшая гомология - свыше 75% -наблюдается в области второй и третьей ОРС как на уровне аминокислотных, так и нуклеотидных последовательностей. В районе ОРС1 гомология значительно слабее -около 50%. В пекодирующих областях (ДКП и лидерные последовательности) значительной гомологии между этими двумя элементами не наблюдается В отличие от МДГ4, ретротранспозон gtwin не содержит регуляторной последовательности-инсулятора

6. Показано, что существует как минимум две разновидности ретротранспозона gtwin, различающихся наличием/отсутствием стоп-кодона в третьей ОРС (позиция 6117-6119 нуклеотидной последовательности gtwin).

7. Методом гибридизации по Саузерну исследовано распределение ретротранспозона gtwin в разных линиях рода Drosophila. Показано, что в геноме D virilis и D hydei этот мобильный элемент отсутствует, В линиях D melanogaster он представлен, как правило, небольшим количеством копий (2-6) в геноме, в то время как в линии Г32 D melanogaster содержится свыше 20 копий ретротранспозона gtwin В культуре клеток D melanogaster линии Schneider ретротранспозон gtwin сильно амплифицировап.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Глухое И А, Карпова Н К, Котиова А П, Любомирская Н В, Ильин Ю В Структурные особенности третьей открытой рамки считывания ретротранспозона gtwin в различных линиях Drosophila melanogaster. Доклады Академии Наук, 2004, Т.399 (2), С. 257-259.

2. Котнова А П., Карпова Н. Н, Феоктистова М А , Любомирская Н В, Ким А И, Ильин Ю В Ретротранспозон gtwin: структурный анализ и распределение в линиях дрозофилы. Генетика, 2005, Т.41 (1), С. 23-29.

3. Котнова А. П, Карпова Н. Н, Саленко В. Б, Любомирская Н В, Ильин Ю В Канонические и неканонические последовательности МДГ4 (gypsy), содержащиеся в геноме Drosophila melanogaster. Доклады Академии Наук, 2005, Т 400 (6), С. 827830.

t

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 17.05.2005 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ 305. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

111 15¿

РНБ Русский фонд

2006-4 7205

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Котнова, Алина Петровна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. РЕТРОТРАНСПОЗОНЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

2.1.Классификация мобильных элементов дрозофилы.

2.2. Строение ретротранспозонов.

2.2.1. Особенности строения не-ДКП-ретротранспозонов.

2.2.2. Структурная характеристика ДКП-ретротранспозонов. Ь

2.3. Роль ретротранспозонов в функционировании генома.

2.3.1. Ретротранспозоны как фактор поддержания целостности генома

2.3.2. Ретротранспозоны как фактор генетической изменчивости.

2.4. Ретротранспозон МДГ4 и генетическая нестабильность.

2.4.1. Структура ретротранспозона МДГ4.

2.4.1.1. Белковые продукты открытых рамок считывания МДГ4.

2.4.1.1.1. Ген gag и его продукты.

2.4.1.1.2. Ген pot и его продукты.

2.4.1.1.3. Ген env.

2.4.2. Генетическая нестабильность в мутаторной линии MS

Drosophila melanogaster.

2.4.3. «Активный» и «неактивный» варианты МДГ4.

2.4.4. Ген flamenco - регулятор транспозиции МДГ4.

2.4.5. Сравнение ретротранспозиционной активности двух вариантов МДГ4.

2.4.6. Распределение двух вариантов МДГ4 в различных линиях Drosophila melanogaster.

2.5. Линия Г32 Drosophila melanogaster.

З.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Штаммы Е. coli, использованные в работе.

3.2. Праймеры, использованные в работе.

3.3. Линии D. melanogaster, использованные в работе.

3.4. Приготовление компетентных клеток.

3.4.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК.

3.4.2. Приготовление бактерий для заражения бактериофагом X.

3.5. Скрининг бляшек бактериофага X методом гибридизации.

3.5.1. Заражение Е. coli бактериофагом X.

3.5.2. Перенос молекул неупакованной ДНК бактериофага X на нейлоновый фильтр.

3.5.3. Приготовление радиоактивного ДНК-зонда.

3.5.4. Гибридизация.

3.6. Выделение ДНК.

3.6.1. Выделение плазмидной ДНК.

3.6.2. Выделение ДНК фага X.

3.6.3. Выделение геномной ДНК из мух.

3.7. Рестрикция ДНК.

3.7.1. Рестрикция плазмидной ДНК.

3.7.2. Рестрикция ДНК бактериофага X.

3.7.3. Рестрикция геномной ДНК дрозофилы.

3.8. Лигирование.

3.9. Саузерн-блот гибридизация.

3.9.1. Перенос ДНК с агарозных гелей на нейлоновые фильтры.

3.9.2. Приготовление радиоактивного ДНК-зонда.

3.9.3. Гибридизация на фильтрах по Саузерну.

3.10. Секвенирование двуцепочечной ДНК.

3.10.1. Заливка полиакриламидного геля для секвенирования.

3.10.2. Секвенирование двуцепочечной ДНК с помощью набора

MBI Fermentas reader™ DNA sequencing kit.

3.10.3. Электрофорез в полиакриламидном геле.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Скрининг геномной библиотеки линии Г32 D. melanogaster.

4.2. Структурный анализ отобранных клонов.

4.2.1. Выявление полноразмерных копий МДГ4.

4.2.2. Структурный анализ полноразмерных копий МДГ4, клонированных из линии Г32.

4.2.2.1. Рестрикционный анализ полноразмерных копий МДГ4.

4.2.2.2. Секвенирование функционально важного для ретротранспозиционной активности района полноразмерных копий МДГ4, клонированный из линии Г32.

4.2.3. Исследование структуры неканонических клонов, имеющих гомологию с МДГ4.

4.2.3.1. Саузерн-блот анализ отобранных клонов.

4.2.3.2. Рестрикционный анализ отобранных клонов.

4.2.3.3. Идентификация клонированного мобильного элемента.

4.3. Ретротранспозон gtwin.

4.3.1. Сравнительный анализ структурной организации ретротранспозонов МДГ4 и gtwin.

4.3.2. Исследование структуры третьей открытой рамки считывания ретротранспозонов gtwin, клонированных из линии Г32.

4.3.3. Распределение копий ретротранспозона gtwin в линиях дрозофилы.

5. ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Распределение полноразмерных вариантов МДГ4 в геноме Drosophila melanogaster.

5.2. Мобильные генетические элементы в составе гетерохроматина: распространение и функции.

5.3. Распространение ретротранспозона gtwin в геноме дрозофилы, возможные причины амплификации в линии Г32.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Канонические и неканонические последовательности эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в геноме дрозофилы"

Мобильные генетические элементы (МГЭ) являются важным компонентом генома эукариот. У Drosophila melanogaster на их долю приходится около 10% геномной ДНК [Pimpinelly et al.,1995]. Взаимодействие МГЭ с геномом клетки носит сложный характер: мобильные элементы могут встраиваться в различные участки клеточных генов (в их экзонные, интронные и регуляторные последовательности), что в большей или меньшей степени сказывается на их экспрессии; в свою очередь клетка контролирует транспозшщи МГЭ, препятствуя их активному перемещению.Элемент МДГ4 (в англоязычной литературе известный как gypsy) - один из наиболее изученных ретротранспозонов дрозофилы. Особенности его структуры и инфекционные свойства позволяют говорить о МДГ4 как об эндогенном ретровирусе беспозвоночных [Kim et al. 1994а, Song et al. 1994, Lecher et al, 1997]. Подобно ретровирусам, он содержит три открытые рамки считывания (ОРС), а цикл его транспозиции проходит через стадию обратной транскрипции [Arkhipova et al, 1995].Несмотря на то, что эндогенные ретровирусы являются предметом пристального внимания исследователей, в настоящий момент очень мало известно об их генетическом взаимодействии с организмом-хозяином. Это обусловлено тем, что обьгано в роли хозяина выступают позвоночные - трудные объекты для генетического анализа. Присутствие ретротранспозона МДГ4 в геноме классического модельного объекта D. melanogaster дает уникальную возможность для детального изучения взаимоотношений ретровируса и клетки.Спонтанные транспозиции мобильных элементов происходят чрезвычайно редко (с частотой примерно 10"^ ), но в некоторых системах перемещения наблюдаются с повышенной частотой. Существует два основных типа генетической нестабильности у дрозофилы: один из них обнаруживается только в специальных скрещиваниях (гибридный дисгенез) [Arkhipova et al, 1995], другой наблюдается в мутаторных линиях, где нестабильность поддерживается в течение длительного времени. Эти линии служат удобной моделью для изучения регуляции транспозиций МГЭ. Одной из таких линий является линия K4S D. melanogaster, которая характеризуется увеличенной до 10"^ -10"^ частотой спонтанного мутирования, нестабильным характером мутаций и активными, независимыми друг от друга транспозициями двух МГЭ - МДГ4 (gypsy) и hobo [Kim et al, 1990; Kim, Belyaeva, 1991]. Мутаторная линия MS (Mutator Strain) ведёт своё происхождение от стабильной лабораторной линии SS (Stable Strain). Молекулярный анализ структурной организации МДГ4, клонированных из геномов мух линий MS и SS, выявил существование двух подсемейств этого ретротранспозона, имеющих чёткие структурные различия и отличающихся друг от друга способностью к перемещениям [Lyubomirskaya et al, 1990]. Эти подсемейства получили названия «активное» и «неактивное». Названия носят условный характер, так как сравнение ретротранспозиционной активности подсемейств в культуре клеток D. hydei показало, что оба варианта могут образовьшать новые копии элемента [Смирнова и др.,1998]. Однако МДГ4, обозначенный как «активный», способен к транспозиции в определенных линиях D. melanogaster, в то время как перемещений второго («неактивного») варианта не наблюдается ни в одной из ранее изученных линий мух. «Активный» и «неактивный» варианты МДГ4 различаются на уровне рестриктных карт. В частности, наличие сайтов Hindlll (4483), Mlul (5335) и Clal (6939) является характерной особенностью «активного» подсемейства [Lyubomirskaya et al., 1990]. По всей видимости, «активный» вариант МДГ4 является эволюционно более молодым и образовался в результате постепенного накопления точечных мутаций, затрагивающих «неактивный» вариант [Разоренова и др.,2001; Lyubomirskaya et. al.,2001]. Предполагается, что первым появился рестрикционный сайт Mlul, затем Clal и, наконец, - Hindlll. Такая последовательность событий подтверждается результатами рестрикционного анализа геномной ДНК 20 исследованных линий мух.Исключением является линия Г32. В этой линии присутствуют варианты МДГ4, которые содержат сайт Hindlll, но не содержат сайтов Mlul и/или Clal [Разоренова и др.,2001].Известно, что все копии МДГ4, клонированные из систем инсерционного мутагенеза, содержали в кодирующей части сайт рестрикции Hindlll (4483), что позволило рассматривать его как маркер на принадлежность к «активному» подсемейству. В то же время, было показано, что участок, влияющий на ретротранспозиционную активность, расположен между сайтами рестрикции PvuII (2733) и Kpnl (3127). Замещения этого участка в «неактивном» варианте соответствующим участком из «активного» достаточно для повышения ретротранспозиционной активности такого варианта МДГ4 в культуре клеток, несмотря на отсутствие у такой копии сайта рестрикции Hindlll (4483) [Любомирская и др, 1998].Таким образом, присутствие необычных копий в линии Г32 вызывает особый интерес.Можно предположить, что они образовались в результате рекомбинационных процессов, затрагивающих «активный» и «неактивный» варианты, однако нельзя исключать вероятность того, что они относятся к новому, ранее неизвестному подсемейству МДГ4 {gypsy).Целью данной работы явилось изучение структурных особенностей различных вариантов ретротранспозона D. melanogaster МДГ4 в геноме линии Г32. Данное исследование было предпринято в рамках изучения возможных механизмов эволюции ретротранспозона МДГ4.В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи: Клонировать ДНК из линии Г32 D. melanogaster. используя в качестве вектора бактериофаг XGEMl 1.Провести скрининг геномной библиотеки линии Г32 и отобрать клоны, имеющие гомологию с последовательностью МДГ4 {gypsy).Используя метод Саузерн-блот гибридизации, провести предварительный анализ выявленных клонов на предмет их соответствия различным областям МДГ4 (Sypsy).Провести детальный структурный анализ клонов, содержащих полноразмерный МДГ4 {gypsy), включая секвенирование функционально значимых участков.Провести рестрикционный анализ клонов, содержащих последовательности, существенно отличающиеся от канонических.Исследовать представленность в геноме дрозофилы неканонических полноразмерных ретротранспозонов, имеющих существенную гомологию с последовательностью МДГ4 {gypsy).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Котнова, Алина Петровна

6. выводы

1. Из линии Г32 D. melanogaster клонированы 28 последовательностей, имеющих гомологию с эндогенным ретровирусом МДГ4 (gypsy), среди которых только 4 содержат полноразмерный МДГ4.

2. Рестрикционный анализ полноразмерных копий МДГ4 из линии Г32 показал, что две (8.1 и В18) относятся к «активному» подсемейству, одна (4.1) — к «неактивному». Копия В10, имеющая сайты рестрикции Hindlll (4483) и Xbal (430, 7417), но не имеющая сайтов Mlul (5335) и Clal (6939), является гибридной.

3. Анализ нуклеотидной последовательности функционально важного для ретротранспозиционной активности элемента района PvuII (2733) - Kpnl (3127) показал, что у вариантов 8.1 и В18 эта область соответствует ранее описанному «активному» подсемейству, а у клонов 4.1 и В10 - «неактивному».

4. Наряду с дивергировавшими копиями МДГ4, подвергшимися рекомбинационным перестройкам, из линии Г32 D. melanogaster впервые были клонированы 4 копии не изученного ранее ретротранспозона gtwin, входящего в группу Gypsy ДКП-ретротранспозонов.

5. Сравнительный структурный анализ ретротранспозонов МДГ4 (gy/wy) и gtwin выявил значительное сходство между ними. Наибольшая гомология — свыше 75% - наблюдается в области второй и третьей ОРС как на уровне аминокислотных, так и нуклеотидных последовательностей. В районе ОРС1 гомология значительно слабее — около 50%. В некодирующих областях (ДКП и лидерные последовательности) значительной гомологии между этими двумя элементами не наблюдается. В отличие от МДГ4, ретротранспозон gtwin не содержит регуляторной последовательности-инсулятора.

6. Показано, что существует как минимум две разновидности ретротранспозона gtwin, различающихся наличием/отсутствием стоп-кодона в третьей ОРС (позиция 6117-6119 нуклеотидной последовательности gtwin).

7. Методом гибридизации по Саузерну исследовано распределение ретротранспозона gtwin в разных линиях рода Drosophila. Показано, что в геноме D. virilis и D. hydei этот мобильный элемент отсутствует. В линиях D. melanogaster он представлен, как правило, небольшим количеством копий (2-6) в геноме, в то время как в линии Г32 D. melanogaster содержится свыше 20 копий ретротранспозона gtwin. В культуре клеток D. melanogaster линии Schneider ретротранспозон gtwin сильно амплифицирован.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Котнова, Алина Петровна, Москва

1. Аведисов С.Н., Черкасова В.А., Ильин Ю.В. Характеристика первичной структуры полноразмерной копии ретротранспозона дрозофилы МДГ1. Генетика, 1990, Т.26, С. 1905-1914.

2. Аведисов С.Н., Зеленцова Е.С., Ильин Ю.В. Транс-мобилизация делегированных копий ретротранспозона МДГЗ в культуре клеток дрозофилы. Генетика, 1998, Т.34(3), С.335-342.

3. ГловерД., ред. Клонирование ДНК. Методы. М: Мир, 1988, 538с.

4. Глухое И.А., Карпова Н.Н., Котнова А.П., Любомирская Н.В., Ильин Ю.В. Структурные особенности третьей открытой рамки считывания ретротранспозона gtwin в различных линиях Drosophila melanogaster. Доклады Академии Наук, 2004, Т.399 (2), С. 257-259.

5. Данилевская О.Н., Пардю M.JI. Теломерный ретротранспозон НеТ-А и его роль в формировании теломер дрозофилы. Мол. Биол. 1999, Т.ЗЗ, С. 38-47.

6. Евгеньев М.Б., Мнджоян Е.И., Зеленцова Е.С., Шостак Н.Г., Лезин Г.Т., Великодворская В.В., Полуэктова Е.В. Мобильные элементы и видообразование. Мол. Биол., 1998, Т.32, С. 184-192.

7. Любомирская Н.В, Смирнова Ю.Б, Аведисов С.Н, Сурков С.А, Ильин Ю.В. Сравнительный анализ структуры и транспозиционной активности двух вариантов мобильного элемента МДГ4 Drosophila melanogaster. Молекулярная биология,1998, Т.32(5), С.689-694.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сомбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. 1984, Москва, "Мир".

9. Сёмин Б.В., Ильин Ю.В. Функциональные мотивы, выявляемые в аминокислотной последовательности Gag ретровируса gypsy. Докл. Акад. Наук, 2004, Т. 398(3), С. 419-421.

10. Сёмин Б.В., Pellison А., Ильин Ю.В., Bucheton А. Экспрессия структурного белка Gag ретровируса gypsy рекомбинантным бакуловирусом в культуре клеток Spodoptera frugiperda. Докл. Акад. Наук, 2004, Т. 398(5), С. 702-704.

11. Смирнова Ю.Б., Любомирская Н.В., академик Ильин Ю.В. Изучение кинетики амплификации двух вариантов ретротранспозона D. melanogaster МДГ4. Докл. Акад. Наук, 1998, Т.295(1), С. 125-135.

12. Arkhipova I.R Mazo А.М, Cherkasova V.A, Gorelova T.V, Schuppe N.G, Ilyin Y.V. The steps of reverse transcription of Drosophila mobile dispersed genetic elements and U3-R-U5 structure of their LTRs. Cell, 1986, V.44(4), P.555-563.

13. Arkhipova I.R, Lyubomirskaya N.V., Ilyin Y.V. Drosophila retrotransposons. Mol. Biol. Intel. Unit: R. G. Landes Company, USA. 1995.130р.

14. Arkhipova IR and Ilyin Yu. Properties of promoter regions of mdgl Drosophila retrotransposon indicate that it belongs to a specific class of promoters. EMBO J, 1991, V.10, P. 1169-1177.

15. Bayev A., Lyubomirskaya N., Dzhumangaliev E., Ananiev A. Structural organization of transposable element mdg4 from Drosophila melanogaster and a nucleotide sequence of its long terminal repeats. Nucleic Acids Res, 1984, V.12, P.3707-3723

16. Biessmann H., Mason J.M. Telomere maintenance without telomerase. Chromosoma 1997; V. 106, P. 63-69.

17. Bowen N.J., McDonald J.F. Drosophila euchromatic LTR retrotransposons are much younger than the host species in which they reside// Genome Res. 2001. V. 11 (9). P. 152740.

18. Brierley C., Flavell A. J. The retrotransposon copia controls the relative levels of its gene products post-transcriptionally by differential expression from its two major mRNAs. Nucleic Acids Res, 1990, V.18, P.2947-2951

19. Bucheton A. I transposable elements and I-R hybrid dysgenesis. Trends. Genet, 1990, V.6, P. 16- 19.

20. Charlesworth В., Transposable elements in natural populations of Drosophila. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol., 1989, V.36, P.25-36. Review.

21. Davis P.S., Shen M.W., Judd B.H. Asymmetrical pairing of transposons in and proximalto the white locus of Drosophila account for four classes of regularly occurring exchange products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, V.84, P. 174-178.

22. Dej K.J., Gerasimova Т., Corces KG., Boeke J.D. A hotspot for the Drosophila gypsy retroelement in the ovo locus. Nucl Acids Res, 1998, V.26(17), P.4019-4024.

23. Doolitle R., Feng D., Johnson M., McClure M. Origins and evolutionary relationships of retroviruses. Quart.Rev. Biol., 1989, V.64, P.955-966

24. Dunn B.M, Goodenow M.M, Gustchina A., Wlodawer A. Retroviral proteases. Genome Biol., 2002;3(4):REVffiWS3006. Epub 2002 Mar 26.

25. Eanes W.F, Wesley C.t Charlesworth B. Accumulation of P elements in minority inversions in natural populations of Drosophila melanogaster. Genet Res., 1992, V.59(l), P. 1-9.

26. Evgen'ev M.B, Corces V.G, Lankenau D.H. Ulysses transposable element of Drosophila shows high structural similarities to functional domains of retroviruses. J Mol Biol. 1992 Jun 5;225(3):917-24.

27. Evgen'ev MB, Zelentsova H., Poluectova H., Lyozin G.T, Veleikodvorskaja K, Pyatkov K.I, Zhivotovsky L.A, Kidwell M.G. Mobile elements and chromosomal evolution in the virilis group of Drosophila- Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, V.97, P. 11337-11342.

28. Fawcett D.H., Lister C.K., Kellet E. Transposable elements controlling I-R hybrid dysgenesis in D. melanogaster are similar to mammalian LINEs. Cell, 1986, V.47, P. 1007-1015.

29. Finnegan D.J. F and related elements in Drosophila melanogaster. In: Berg D.E. and Howe M.M. ed. Mobile DNA. Washington DC: American Society for Microbiology, 1989, P.519-521.

30. Finnegan D.J. Transposable elements. Curr Opin Genet Dev. 1992, V.2(6), P.861-867. Review.

31. Finnegan D.J. Transposable elements: how non-LTR retrotransposons do it. Curr Biol., 1997, V.7(4), P.245-248.

32. Kapitonov V.V., Jurka J. Molecular paleontology of transposable elements in the Drosophila melanogaster genome// Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. V. 100(11). P. 65696574.

33. Katzman M., Mack J.P.G., Skalka A., Leis J. A covalent complex between retroviral integrase and nicked substrate DNA. Proc.Natl.Acad. Sci., USA, 1991, V.88, P. 46954699.

34. Kazazian H.H Jr, Moran J. V. The impact of LI retrotransposons on the human genome. Nat Genet. 1998May;19(l):19-24.

35. Kim A.I. Terzian C., Santamaria P., Pelisson A et al. Retroviruses in invertebrates: The gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of D. melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA 1994a, V.91, P. 1285-1289.

36. Kim А.1., Belyaeva E.S. Transposition of mobile elements gypsy (mdg4) and hobo in germ line and somatic cells of a genetically unstable Mutator Strain of Drosophilamelanogaster. Mol. Gen. Genet, 1991, V.229, P.437 444.

37. Kim A.I., Belyaeva E.S., Aslanyan M.M. Autonomous transposition of gypsy mobile elements and genetic instability in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet, 1990, V.224, P.303 308.

38. Kulguskin V.V., llyin Y.V., Georgiev G.P. Mobile dispersed genetic element MDG1 of Drosophila melanogaster. nucleotide sequence of long terminal repeats. Nucl. Acids Res, 1981, V.9,P.3451-3463.

39. Laurencon A., Bregliano J.C. Evidence for an inducible repair-recombination system in the female germ line of Drosophila melanogaster. II. Differential sensitivity to gamma rays. Genetics., 1995, V.141(2), P.579-585.

40. Lecher P., Bucheton A., Pelisson A. Expression of the Drosophila retrovirus gypsy as ultrastructurally detectable particles in the ovaries of flies carrying a permissive flamenco allele. J Gen Virol., 1997, V.78(9), P.2379-88.

41. Levis It, Dunsmuir P., Rubin G.M. Terminal repeats of the Drosophila transposable element copia: nucleotide sequence and genomic organization. Cell, 1980, V.21, P.581-588.

42. Levis RW, Ganesan R, Houtchens K, Tolar LA, Sheen FM. Transposons in place of telomeric repeats at a Drosophila telomere. Cell, 1993, V.75, P. 1083-1093.

43. Luan DD, Korman MH, Jakubczak JL, Eickbush TH. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. Cell., 1993, V.72(4), P.595-605.

44. Lyubomirskaya N.V., Arkhipova I.R., Ilyin Y.V. Molecular analysis of the gypsy (mdg4) retrotransposon in two Drosophila melanogaster strains differing by genetic instability. Mol. Gen. Genet, 1990, V.223, P.305 309.

45. Lyubomirskaya N.V., Avedisov S.N., Surkov S.A. et al. Two Drosophila retrotransposon gypsy subfamilies differ in ability to produce new DNA copies via reverse transcription in Drosophila cultured cells. Nucl. Acids. Res, 1993, V.21, P.3265 3268.

46. Malik H.S, Eickbush Т.Н. Modular evolution of the integrase domain in the Ty3/Gypsy class of LTR retrotransposons. J Virol, 1999, V.73(6), P.5186-5190.

47. Malik H.S, Eickbush Т.Н. Phylogenetic analysis of ribonuclease H domains suggests a late, chimeric origin of LTR retrotransposable elements and retroviruses. Genome Res., 2001, V. 11(7), P. 1187-1197.

48. Marlor R., Parkhurst S., Corces V. The Drosophila melanogaster gypsy transposable element encodes putative gene products homologous to retroviral proteins. Mol Cell Biol, 1986, V.6, P. 1129-1134

49. McClintock B. Controlling elements and the gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1956; V.21, P. 197-216.

50. Minchiotti G, Di Nocera PP. Convergent transcription initiates from oppositely oriented promoters within the 5' end regions of Drosophila melanogaster F elements. Mol Cell Biol., 1991, V.l 1 (10), P. 5171 -5180.

51. Misseri Y, Cerutti M, Devauchelle G, Bucheton A, Terzian C. Analysis of the Drosophila gypsy endogenous retrovirus envelope glycoprotein. J Gen Virol., 2004, 85(Pt 11):3325-3331.

52. Mizrokhi L.J, Georgieva S.G, llyin Y.V. Jockey, a mobile Drosophila element similar to mammalian LINEs, is transcribed from the internal promoter by RNA polymerase II. Cell. 1988 Aug 26;54(5): 685-691.

53. Pardue M.L., Danilevskaya O.N., Traverse K.L., Lowenhaupt K. Evolutionary links between telomeres and transposable elements. Genetica, 1997, V.100,P.73-84.

54. Pasyukova E.G, Belyaeva E.S, Kogan G.L, Kaidanov L.Z, Gvozdev V.A. Concerted transpositions of mobile genetic elements coupled with fitness changes in Drosophila melanogaster. Mol. Biol. Evol., 1986, V.3, P.299-305.

55. Prud'homme N., Gans M, Terzian C, Bucheton A. Flamenco, a gene controlling the gypsy retrovirus of Drosophila melanogaster. Genetics, 1995, V.139, P.697-711.

56. Robert V., Prud'homme N., Kim A., Bucheton A., Pelisson A. Characterization of the flamenco region of the Drosophila melanogaster genome. Genetics, 2001, V.158(2), P.701-713.

57. Sarot E., Payen-Groschene G., Bucheton A., Pelisson A. Evidence for a piwi-dependent RNA silencing of the gypsy endogenous retrovirus by the Drosophila melanogaster flamenco gene. Genetics, 2004, V. 166(3), P.1313-1321.

58. Schneuwly S., Kuroiwa AGehring W.J. Molecular analysis of the dominant homeotic Antennapedia phenotype. EMBO J., 1987, V.6, P.201-206.

59. Shevelyov Y.Y., Balakireva M.D., Gvozdev V.A. Heterochromatic regions of different Drosophila melanogaster stocks contain similar arrangements of moderate repeats with inserted copia-like elements (mdgl). Chromosoma, 1989, V. 98, P. 117-122.

60. Shiba T, Seigo K. Retrovirus-like particles containing RNA homologous to the transposable element copia inD.melanogaster. Nature, 1983, V.302, P.l 19-124

61. Sniegowski P.D., Charlesworth B. Transposable element numbers in cosmopolitan inversions from a natural population of Drosophila melanogaster. Genetics, 1994, V. 137(3), P.815-827.

62. Song S. U, Gerasimova Т., Kurkulos M., Boeke J.D, Corces V.G. An env-like protein by a Drosophila retroelement: evidence that gypsy is an infection retrovirus. Genes Deb, 1994, V.8, P.2046-2057

63. Spana С., Corces V.G. DNA bending is a determinant of binding specificity for a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev, 1990, V.4, P. 1505-1515

64. Spana C, Harrison D.A, Corces V.G. The Drosophila melanogaster suppressor of Hairy-wing protein binds to specific sequences of the gypsy retrotransposon. Genes Dev. 1988 Nov;2(ll):1414-23.

65. Syomin В., Surkov S., Ну in Yu Presence of the gypsy (mdg4) retrotransposon in extracellular virus-like particles. FEBS Letters, 1993, V.323, P.285-288

66. Syomin B.V, Fedorova L.I, Surkov S.A, llyin Y.V. The endogenous Drosophila melanogaster retrovirus gypsy can propagate in Drosophila hydei cells. Mol Gen Genet., 2001, V. 264(5), P. 588-594.

67. Terrinoni A., Franco C.D., Dimitri P., Junakovic N. Intragenomic distribution and stability of transposable elements in euchromatin and heterochromatin of Drosophila melanogaster: non-LTR retrotransposon. J. Mol. Evol. 1997, V. 45, P. 145-153.

68. Terzian C., Pelisson A., Bucheton A. Evolution and phylogeny of insect endogenous retroviruses. BMC Evol Biol., 2001;1(1):3. Epub 2001 Aug 10.

69. Varmus H., Brown P. Retroviruses. In: Mobile DNA (Berg D.E., Howe M.M., eds., Washington D.C.: American Society for Microbiology), 1989. P.53-108.

70. Vogt V.M. Ubiquitin in retrovirus assembly: actor or bystander? Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, V. 97(24), P. 12945-12947.

71. Wilhelm M., Wilhelm F.X. Reverse transcription of retroviruses and LTR retrotransposons. Cell Mol Life Sci., 2001, V.58(9), P.1246-62.

72. Xiong Y., Eickbush Т.Н. Origin and evolution of retroelements based on their reverse transcriptase sequences. EMBOJ., 1990, V.9, P.3353-3362.

73. Yuki iS, Inouye S, Ishimaru S, Saigo K. Nucleotide sequence characterization of a Drosophila retrotransposon, 412. Eur J Biochem. 1986 Jul 15;158(2):403-10.1. БЛАГОДАРНОСТИ

74. Автор выражает признательность всему коллективу лаборатории подвижности генома Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН за их помощь в работе и поддержку.

75. Огромную благодарность автор выражает кандидату биологических наук Нине Николаевне Карповой, которая всегда была рядом, учила, помогала, воспитывала и сделала все, чтобы данная работа была успешной.

76. Автор глубоко признателен аспирантам лаборатории подвижности генома Ивану Андреевичу Глухову и Вениамину Борисовичу Саленко, за их участие в работе, поддержку и дружбу.

77. Автор глубоко признателен своей семье за терпение, понимание и поддержку.

78. CACCGGATGAGTAACGAAAACCTACATTCCATCCAAAACCTTATGGATGACGTGGAATCTGAAGGCTCGCCCAGA 6847