Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Возрастные изменения метаболизма корневой меристемы

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Возрастные изменения метаболизма корневой меристемы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Р Г 5 ОД СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

на правах рукописи УДК 581.142+581.481+577.15

Владимирова Светлана Владимировна

ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЖТАБОШЗМА КОРНЕВОЙ МЕРИСТЕМЫ

03.00.12 - физиология растений

А^лаО/ 4 /

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН. Иркутск

Научные руководители: доктор биологических наук, В. К. Войников.

кандидат биологических наук, И. В. Зеленева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор О.П.Родченко,

кандидатбиотогическихнаук, Р. Т. 1кышарп0чкина.

Ведущее учреждение: Иркутский Государственный Университет

.. Защита диссертации состоится *Л>* илрт 1994 г. в /•У час. на заседании специализированного совета по защитам кандидатских диссертаций при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, ул. Лермонтова. 132, а/я 1243.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН..

Автореферат разослан " Ь " ^¿¿-с? 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Г.Л.Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение структуры и особенностей формирования метаболизма меристемы о процессе роста и развития растения делает возможном решение двух задач обцобиологической важности. Во-первых, такие исследования позволяют продпикутг.ся вперед и понимании специфики обмена веществ у растущих и пролифе-рирув^их ¡слеток; во-вторых, этот подход открывает новые перспективы для количественных исследований организации метаболизма клеток, органов и тканей и становления их функциональной активности.

Теоретический анализ и моделирование законов, определяющих рост и морфогенез целого органа, слагается из роста и пролиферации отдельных клеток и привлекает больное знимание физиологов.

В этом плане наиболее интересен корень, где формируется морфологический и метаболический аппарат поглощения и ассимиляции неорганических соединений, т.е. происходит становление специфических функций корня, непосредственно связанных с продуктивностьи растений. Заметные !<олебанкя скорости роста корней в течение вегетационного периода обязательно должны быть связаны с изменениями в скорости пролиферации и в соотношении метаболических путей в меристематической части, которая представляет собой "депо" всех клеток корня. Сопоставление различных органов проростка и различных типов корня по соотношения метаболических путей позволяет выявлять наиболее общие закономерности формирования структуры метаболизма.

Цель и задачи исследований. Основной целью работы являлось выяснение особенностей метаболизма корневой меристемы у злаков и изучение этих изменений в динамике на примере развития проростка кукурузы.

Для достиаения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1/ определить существует ли специфичность метаболизма корня по сравнению с другими частями зародыша у злаков с различной степенью эволюционной подоинутости; 2/ изучить как происходит становление метаболизма корня при прорастании по изменению активностей ферментов из разных метаболических путей; выяснить существуют ли сдвиги в активностях не отдельных ферментов, а в организации метаболизма, которую можно было бы представить со-

отношением метаболических путей и определить по активности соответствующих маркерных ферментов; 3/ исследовать возрастные изменения в соотношении метаболических путей, происходящие в меристеме главного корня проростка кукурузы; 4/ произвести анализ временных изменений в структуре метаболизма меристемы разных типов корней: главного, придаточных зародышевых и боковых; 5/ проследить каким образом проявляются эти изменения при развитии и старении меристемы корня и других органов проростка.

Научная новизна. В работе в качестве критериев, определяющих специфику корневого метаболизма, впервые применительно к растительным тканям, использованы соотношения метаболических путей, определяемые по активностям ферментов-маркеров. О формировании структуры метаболизма меристеш можно судить по изменении соотношений метаболических путей. Изучена качественная специфика, проли-ферирующей зоны корня на начальных этапах развития. Установлено, что организация или структура метаболизма меристеш не остается постоянной во времени. Изменения относительных активностей ферментов, маркирующих метаболические пути энергетического и азотного обмена начинаются уже в первые сутки после прорастания и в меристеме разных типов корня, различающихся по возрасту, происходят подобным образом. Обнаружен ступенчатый характер изменений в меристеме в отношении метаболических путей к гликолизу, причем как связанных с энергетическим и азотным обменом, так и с синтезом компонентов клеточных стенок у проростка ку1сурузы разного возраста. Впервые выявлена группа ферментов с одинаковым для короткоки-вущих органов проростка (колеоризы, колеоптиля и щитка) направлением изменений активностей при развитии признаков старения. Эта группа ферментов-маркеров, представляющих следующие метаболические пути: цитохромоксидаза - дыхательная цепь, алкогольдегидроге-наза - спиртовое брожение, глутаматдегидрогеназа - азотный обмен и в - галактозидаза, участвующая в метаболизме клеточных стенок, представляется перспективной для поиска количественных критериев старения. Установлено, что метаболическими индикаторами развития меристемы и критериями старения могут выступать изменения отношений дыхательная цепь/гликолиз и алкогольная ферментация/гликолиз.

Практическая ценность работы. Применение метода сравнения соотношений'метаболических путей может служить в качестве определяющего критерия в решении различных проблем в физиологии расте-

HHfi. Полученные результаты шгут быть использованы п лабораторной практике для дальнейшего изучения Функциональной организации метаболизма клетки. Расширяя и детализируя подобные исследования, учитывая процессы регуляции метаболизма на разных уровнях, особенности иерархической организации по специфическим особенностям и изменениям метаболизма уокно, как мы полагаем, судить и о дифференциальной экспрессии генов, которая выражается d балансе дифференциального синтеза и распада белков.

Публикация к апробация работа. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, 2 работа находятся в печати. Результаты исследований были доложены на лабораторных семинарах лаборатории физиолопмеской генетики Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН (1991-1994 гг.), на научных сессиях Института (1992, 199-1 гг), II съезде БОФР (г.Минск. 1990) и III съезде ВОФР (г. Са>¡кт-Петербург, 1993).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения. обзора литературы, методической части, изложения экспериментальных данных с их обсуждением, заключения, выводов и библиографии, включающей 169 наименований, из них 68 на русском языке; работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 1? рисункоз.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая часть работа традиционно посвящена анализу литературы. Дзка характеристика становления {метаболизма "вверх" по корня при переходе меристема - зона растяжения - зона дифференцировки. а такse морфологических изменений в меристеме и зоне растяжения при развитии корня. Приведен обзор цикла работ по изменению во времени . ультраструктуры меристемы ( количественное соотношение объема органелл ) у разных видов растений. Рассмотрен метаболизм меристемы стебля при переходе к цветению. Оказалось, что в корневом чехлике и стеблевой меристеме направления изменений ультраструктуры меристема во времени однотипны. 0 том, что существуют подобные изменения в метаболизме меристемы корня и их роли ничего не известно. В литературе имеются сведения, касающиеся метаболонов. т.е. комплексов, объединяющих ферменты метаболического пути. Мстаболоны рассматривается как необходимый уро-

вень организации метаболизма (Курганов,Любарев, 1989). Чтобы выявить уровень такой организации в зоне роста корня и проследить за изменениями в ее структуре в процессе развития был применен метод исследования метаболических путей по активности представляющих их ферментов-маркеров. В литературе напли отражение лишь те изменения, которые касаются перехода клетки от меристемы к растяжению и зрелости. Мы предлагаем новый подход к реликтовой проблеме - формирование во времени структуры метаболизма самой меристемы. Структуру метаболизма моает характеризовать соотношение метаболических путей.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По морфологическим показателям, характеризующим эволюционные типы злаков, нами были выбраны три представителя семейства Роасе-аэ (рис, пшеница и кукуруза).

Семена кукурузы (Zea юауз L., гибриды Краснодарский 303 и ВИР-42), пшеницы (Triticum aestivua L.. сорта Скала) и риса (Огу-za sativa L., сорта Дубовский 129) проращивали в термостате в темноте при 27° 24 часа (кукуруза и рис) и 20° 18 часов (пшеница). Из наклюнувшихся зерновок трех злаков выделяли колеоризу, колеоптнль и главный корень, причем у риса и пшеницы корень целиком, а у кукурузы два последовательных отрезка для всех типов корня: меристематическую часть (0-2 мм от кончика) и зону растяжения, в качестве которой использовали отрезок корня длиной 2 ым, следующий за меристемой.

Односуточные проростки оказались различными по физиологическому возрасту и были разделены на три группы: наклюнувшиеся зерновки. у которых корешок еще не прорвал колеоризу (вариант 1/1), из прорвавшейся колеорязы показался кончик корня (вариант 1/2), главный корень достиг длины 6-8 мм (вариант 1/3). У трех- и шестидневных проростков, кроме главного, исследовали зародышевые придаточные и боковые корни. Длину корней измеряли у 60 проростков каждого возраста. Кроме того вычленяли щиток, эпибласт и лигулу риса, щиток и эпибласт пшеницы, щитковый узел кукурузы. Поскольку органы зародыша у разных вшив злаковых значительно отличались по массе, для получения одной навески растительного материала необходимо было брать" по 50 отрезков главного зародышевого

корня. 100-150 отрезков придаточных зародышевых корней и по 300-350 отрезков боковых корней для обеих зон: 50 колеоптилей, 20-30 - колеоризы и 5-7 щитков для кукурузы: у пшеницы: корень -300 отрезков, ксшеориза - 100, эпибласт - 450-500, колеоптиль -200, щиток - 40 на навеску; у риса: корень - 90-100 отрезков, ко-леориза - 70-90, эпибласт - 150-170, колеоптиль - 130-150, щиток - 30 на навеску. Полученный растительный материал немедленно замораживали в гидком азоте, , растирали на холоду в ступне в трис-HCl буфере (100 мМ, pH 7,6) в присутствии тритона Х-100 (в конечной концентрации 0,5 %) для приведения в растворимое состояние мембранносвязанных Ферментов (Buctier et al.,1964; Зеленеза и др.,1980), Соотношение ткани и буфера составляло от 1:10 до 1:79 по объему, в зависимости от объекта. Полученный гомогенат инкубировали 20 мин. при 0°+2°С и центрифугировали (15 ООО g, 20 мин.), надосадочную жидкость использовали для определения активности ферментов.

Соотношение метаболических путей определяли по соотношению активностей ферментов-маркеров этих путей. Результаты выражали в виде относительной активности, расчитаной на единицу активности фосфсглицераткиназы - маркера гликолиза. Числа относительной активности не имеют размерности и представляют чистые величины для сравнения.

Были выбрана фермат» следующих метаболических путей: генерация энергии - фосфорилиривание глюкозы ( маркер гексокиназа, ГК); гликолиз - фосфоглицераткиназа (ФГК) и энолаза Он); спиртовое брожение - алкогольдегидрогеназа (АДГ); молочнокислое брожение г лактатдегидрогеназа (ЛДГ); дыхательная цепь - цитохроыок-сидаза (ЦХО); азотный обмен - глутаматдегидрогеназа < ГлДГ ): а также ферменты вторичного обмена группы гликозидаз: ß - галак-тозидаза, ß - глюкозидаза и ß - ксилозидаза.

Определили отношение ферментов-маркеров этих метаболических путей к гликолизу. В этом случае, например, ГК/ФГК - это отношение фосфорилирование глюкозы/гликолиз: АДГ/ФГК - спиртовое брожение/гликолиз; ЦХО/ФГК - дыхательная цепь /гликолиз и т. д. Если относительная активность постоянна, это означает, что она меняется с такой же скоростью как гликолиз, если растет - обгоняет гликолиз, снижается - отстает от него.

Содержанке белка р экстрактах определяли по методу Лоури (1очгу ег а1., 1951) в модификации Миллера (МШег.1959).

В ходе исследований применялась центрифуга типа К-24 (Германия). Проращивание семян проводилось в термостатах; получение экстрактов из растительного материала б холодной камере; измерение скорости Ферментативной реакции по изменению плотности поглощающего свет раствора на спектрофотометрах СФ-26 и М-4А.

Повторность опытов была трех-восьмикратная. Активность, фер-ментоЕ определяли по данным, полученных» из 3-5 измерений. Результаты были обработаны статистически. Для зтого рассчитывали средние арифметические величины и квадратичные ошибки среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Особенности метаболизма в отдельных частях зародыша злаков.

Прежде, чем обратиться к изучению изменений, происходящих в меристеме корня, необходимо выяснить, существуют ли различия в метаболизме отдельных частей зародыша, каким образом проявляются они при прорастании зерноски, какова связь между функционированием различных органов зародыша и их метаболизмом.

Анализировали актисности ферментов корня, колеоризы, лигулы, эпибласта, щитка и щиткового узла. По активностям ферментов-маркеров отдельных метаболических путей определяли как отношения между метаболическими путями, так и внутри одного пути и на. этом основанш выявляли степень метаболического родства.

В зародыше кукурузы именно у корешка (фактически это меристема) соотношение метаболических путей, связанных с генерацией энергий, особое, не похожее ни на одну из остальных частей зародыша (колеоптиль, колеориза.^ щитковый узел). Такая ае специфика корневого метаболизма и у двух других злаков (пзеницы и риса), где корень резко отличается по соотношению метаболических путей от других частей зародыша (табл. 1).

Величины активностей ферментов в отдальшх частях зародша гыенйца представляют собой почти среднюю величину мезду такосши у риса и кукурузы. Эти даннае шгут представлять интерес в связи с разной эволюционной продпинугость» трех злаков: рис - один из

Таблица 1

Активность ферментов в отдельных частях из наклюнувшихся зерновок риса, пшеницы и кукурузы. (Абсолютная активность отне-

сена к активности ФГК, умноженной на 1(Г3).

Объект Части АДГ11 Ферменты

зародыша лдг ГлДГ ГК Эн ЦХО ФГК2'

РИС Колеориза 203 .6 36 10 148 120 27619

Зпибласт 233 8 40 12 179 135 20397

Лигула 227 7 33 11 166 136 27937

Корень 323 16 79 22 269 211 48155

Колеоптиль 252 11 39 20 172 121 57566

й;иток 287 3 18 34 152 94 100741

ПШЕНИ- Колеориза 131 3 12 30 121 200 26666

ЦА Зпибласт 153 3 20 40 153 171 19591

Корень 197 36 31 25 223 373 62434

Колеоптиль 252 8 8 22 130 190 59047

0|иток 296 _ 3> 6 46 189 154 94061

КУКУРУ- Колеориза 300 7 16 28 1бе 165 34897

ЗА Щитковый

узел 366 10 10 65 146 160 4487

Корень 188 22 47 15 244 285 10077

Колеоптиль 234 4 10 15 237 313 6755

1' Сокращения названий ферментов: ФГК - фосфоглицераткиназа; Эн -энолаза; АДГ - алкогольдегидрогеназа; ДЦГ - лактатдегидрогенаэа; ГК - гексокиназа; ЦХО - цитохромоксидаза; ГлДГ - глутаматдегидро-

геназа.

2)

3)

кмоль' мин"1' г.1

Ниже определяемого уровня.

- Я -

древних злаксш, кукуруза наиболее подвинута в эволюционном отношении, а лыеница занимает промежуточное положение. Возможно, что между соотношением метаболических путей и степенью эволюционной продвинутости существует связь.

В литературе гипотеза о корневой природе колеориэы (Пашков, 1951) до сих пор язляется предметом дискуссий. Соотношение отдельных систем метаболизма в колеоризе и корне у трех злаков свидетельствует против этой гипотезы. По активности исследованных ферментов, наиболее близкими к колсоризе оказались эгшбласт и лигула, при атом родстве, иые черты калеоркза имела с колеоптилем, но полностью отличалась от корня. Итак, учитывая количественную оценку метаболизма корня г,окно заключить, что у корня тлеется своя, специфическая направленность метаболизма, причем как у риса, так и у паеницы, и кукурузы активности ферментов в корне представляют собой величины одного порядка.(рис.1).

«х лдг Гл5Г гк Зн цхо

ш3 '

6

4

2

' 102

е

\

г

ю'

О"Относительная активность ферментов в керне риса; О- Относительная активность ферментов в корне пшеницы; Относительная активность ферменгоо с корне кукурузы.

оо

о

•О-

о

V

О

-О

Рис.1. Относительные активности ферментов а главном зарода-иевом корне у разных злаков.

2. Влияииз типа и сограста нория на состояние метаболических путей о корневой меристеме проростка кукурузы.

2.1. Определение длины меристематической части у разных типоэ корней проростка кукуругы

Г.срснь, является органом, в котором зоны роста пространственно разделим. Размер зон для определенного вида растений запилит от пила, возраста и сорта растения и от того, является ли зшрень главным, боковым или придаточным, поэтому длину каядой зоны необходимо определять для условий данного опыта (Обручева, 1865).

Э клетках корня при переходе к растяжения сильно падает концентрация белка (1'вашп, 1932). У однодневного главного корня (вариант 1/1) количество белка било одинаковым п первом и втором ; ,'<.лг.к:-.::тро от кончика, во всех остальных париаятах главного и придаточных корней содержание белка самзтно уменьшалось яеяду яерзш и вторым миллиметром , то есть, судя по перепаду в содер-ган-.?!1 белка, донна меристемы в боковом корке составила 1 мм, а в глазном и придаточном 2 им. Упоминающаяся в литературе (Иэа-¡•юз, 1574) еппзь кезду длиной меристематической части и толщиной корил представляется, таким образом, более слокной.

2.2. 1Ьмене!г.1п соотношений елтивностей ферментов из разных

звеньев метаболизма глазного, придаточных згродыпееых и боковых корней.

Сравнили данкке по соотнопеккя метаболических путей, расчи-ТЕ2КШ0 на ачпгакость фосфоглицератккнагы (рис. 2).

В псгг,сгта;е гласного корня изменения появлялись очень раю, у~е у оййяуточнше прсрссткоз. Особенно замешка было увеличение отнспсши ЦХО/ШС при переходе от 1/1 к 1/3. Меяду перпкм и третьи! днем регко сшпэлась величина отношений для всех Сгрмен-тез, '.:рс;:з ГК/СГК и ДЩ73ГК. Маркернко ферменты спиртового п го-г-задшвелвго Срс^сши - АДГ и ЯДГ, оняяшость которых тралициокно •.-гясизгът со стгпоиьо .тгрс&яхяи ткгнтзого |-*зтабсяо!'л гг'эттел

от"сс',л<?,"Л')<',л г^п^^оотъ ЛУ тевтьгхт/ кэ ■ 'С:-, и " гъ .'\:-Т сс1.:!Г\::'.<:ь ; остс:

too

300

¡200

l JM

' 200,

11П1Ш

m-

жM

ГлЗ-

i гтп rg

!&

i rffl ri ffe

1/11/21/3 sran erencn

ДНИ

I—1 - ■•ршсткиа медмаго кормя; Г73 - «ристмм прадатомиого корил: £3 - меристем векового кора*.

i/ti/2 1/9 зг за вгепве ДНК

Рис.2. Изменения относительной активности ферментов в меристеме главного, придаточных зародышевых и боковых корней проростка кукурузы разного возраста (1/1; 1/2; 1/3 - глазшй корень односу-точных проростков; ЗГ.6Г - 3-х и 6-ти дневный главный корень; ЗП, 6П - 3-х и 6-ти дневные придаточные корни; 6Б - боковые корни 6-ти дневного проростка кукурузы).

Независимая регуляция активности этих ферментов yse отмечалась ранее в литературе (Hanson,Jacobsen, 1981), существуют данные о той, что d процессе постнаталъного развития шац ( Pette al., 1970) , как и в нашем случае с изменением возраста церистеш, сохранялось постоянным отношение молочнокислого броаекия к гликолизу, т.е. эти метаболические пути если и менялиг , то параллельно, с одинаковой скоростью. Это подтверждает предположение G.U. Курганова о том, что лактатдегидрогеназа входит в кластер rsuuco-литичоского метаболона.

По величине отношений ЦХО/ФГК и Зн/ФГК придаточные «сорни напоминали главный, но не 3-дневный, а в варианте 1/3, т.е. отста-

вали от главного по темпу изменений. У 6-дневных проростков величина отноиенкя Эн/ФГК в придаточных корнях уае приближалась к глазному, а для ЦХО/ФГК все еще оставалась такой, как у 3-дневных придаточных.

Придаточные аародк;евке и боковые корня отстают ст главного по темпам формирования структуры метаболизма меристемы, но принципиально от него не отличаются: "наиболее подвижными" являются те се метаболические пути, что и в главном корне. Таким образом, у придаточных и боковых корней стадии развития меристема определяют те ке метаболические индикаторы.

2.3 Циклический характер изменений в соотношении метаболических путей при развитии проростка кукурузы.

Особенности иетабол-'гма о зоне растяжения шгно рассматривать как один из способов характеристики меристеш. дающей начало растягивающимся глоткаи. В варнзато 1/2 разница нееду меристемой и зоной т>астти«!я была незначительной, в вгргсантэ 1/3 появлялись различил по откогеинпи фМ/!ГК, н АДГ/ФГК, несмотря на незначительный врсгйммй интервал по сравнен® с вариантом 1/2. У 3-дневных проростков активности ферментов главного корня вновь сближались, но на ново«, белее низком уровне. Формирование структуры метаболизма в меристеме главного корня, видимо, заканчивается к 3-му дню прорастания. У 6-дневных проростков снова обнаруживались . различил иезду меристемой и зоной растяжения, т.е. изменения в соотношении метаболических путей происходит в определенном ритме, или циклами. Изменения начинались в зоне растяжения, а затем распространялись на меристему. Возможно, вновь отмеченные различия кенду зонами .роста корня у 6-днеоного проростка, являлись началом следующего' цикла и меристема включилась бы в них позке.

3. Гликозидазы растущей части корня.

3.1. Активности гликозидаз в меристеме проростка кукурузы.

Метаболический аппарат, обеспечивающий растяжение клеток формируется уке о меристема (Полевой, Саламатова, 1991). Растяжение сопровождается секрецией полисахаридов и синтезом компонентов

клеточных стенок (целлюлоз. геыицеллвлоз,пектинов), Поэтому казалось логичным проследить изменения существующие б активностях ферментов вторичного обмена группы гликозидаз, участвующих в этом синтезе и как меняется соотношение метаболических путей при включении новых программ роста клетки.

При росте клеток растяжением особое внимание привлекают системы феркгнтоз с глинангидролитическими активностями: р - галак-тозидаза (ЕС 3.2.1.23) (V,'allner.WoIker, 1S75; Labrador.Nico-los, 1985; Masuáa et al..1935). д - коиюзидаза (ЕС 3.2.1.37) и глюкозидазы (ЕС 3.2.1.ГЛ; ЕС 3.2.1.21) üfeouda et al.. 1985).

Изучение кислых гидролаз на начальных этапах развития про-pocTica Zea ways показало, что активность гликозидаз с меристеме резко i. ссылается при прорастании в первые сутки. D меристеме главного корня в несколько раз увеличивается активность С -гапак-тозидазы и в - ксилозидазы. а активность а -глюкозидазы повышается более, чем в 11 раз (рис. 3). К третьему див развития проростка активности гликозидаз снижаются, а к аестому - ко активностям £ - глюкозидазы v. % - галактозидазы вновь начинается подъем, причем активности £ - глюкозидазы до максимального уровня, который она имела у односуточных проростков в варианте 1/3.

В придаточных зародышевых корнях 3-х дневного проростка, активности гликозидаз были очень высокими и перекрывали максимальные активности этих ферментов в главном корне, причем d меристеме, так. и в зоне растяжения. В мористе;,:о отношения этих активностей к гликолизу: g - г/шкозидаза/фосфоглкцератюшаза, {) -галачтозидаза/фосфоглицератккназа и f. - ксилоэидаза/фосфоглице-раткиназа были ниае, чем в зоне растяжения. Эта zc тенденция сохранялась и к 6-ти дням развития.

3.2. Активности гликозидаз d sohs раеженпя.

Актисности гликозидаз в зоне растяжения со всех варианта;; вще, чэм в меристеме (рис. 3). Очень самсггпо увеличивается активности р - глакозидазы, р - гглактозвдаги и ¡i - ксилозэдаги в зона растгсенйя в 1/2 - 1/3 возрастных вариантах гласного корня, прячем активность р - глиюзидааи возрастает cípd:.:.;tojiího. Скорее всего такой реет с.тшности обуешвлан регилратецшй наг.окул Лермонтов, а не сглтеао:; de novo, v.к. tpu»re;tce:;:«; и слг; .;;.ip-¡ D

не ингибируют активности гликозидаз (КНгзЬпа еЪ'а1. .1988).

400 г

Краснодарский 303

ВИР-42

Меристема Зона растяжения

- Главный корень

— Придаточный корень

¡/1 1/2 1/3 3 .6 3 6 1/1 1/2 1/3 3 6 3 6

Д !1 И

- глзакогила^у, ? - гэл-хстог-н-возрастоу у проростков кукурузы

Рис 3. Изменения активности лазы ксилозидазы в связи с

оатных гибридоо.

К трем дням развития в зоне растяяения, как и в меристеме активности р - глюкозидазы и Р - ксилозидазы сниааются, ар- га-лактозидаэа остается на прежнем уровне. Похоже, что увеличение размеров клеток и увеличение ферментативной активности осуществляется поэтапно, с какой-то периодичностью. По активности глико-зидаз между меристемой и зоной растяяения у трехдневного проростка не наблюдается сближения, подобно тому, которое мы наблюдали по первой группе ферментов. Разница меаду гонами роста корня составила: по р - глюкозидаэе - 2, по р - галактэзидазе - 2,5 а по р

- кенлозидаэе в 1,4 papa.

У ó-ти дневного проростка в зоне растяжения главного корня отмечалось некоторое увеличение по активности р - глюкозидазы и р

- ксилоендазы, р - галактозидаза все еще «унижалась, но между меристемой и зоной растяжения активности по-прежнему значительно различались.

Таким образом, цикличность в развитии проростка кукурузы в первые дни прорастания, которая по первой группе ферментов выражалась в ступенчатом изменении активностей, по ферментам вторичного обмена отражается в периодическом увеличении и снижении активностей в связи с возрастом и при включении новых генетических программ развития.

3.3. Изменения в активности гликозидаз у гибридов кукруэы с разной скоростью роста.

У двух гибридов кукурузы Краснодарского 303 и ВИР-42 по увеличению длины различных органов проростка выявились различия. Очевидно, что скорость роста влияет и на скорость развития. Рост обоих гибридов происходил почти параллапьно, различаясь лишь в период от 1-го ко 2-му дна. Общим в меристеме главного юэрня у Краснодарского 303 и ВИР-42 являлось то, что относительная активность гликозидаз в меристеме значительно уоеличивапась в первые сутки после прорастания: у ВИР-42 no р - глюкозидаэе в 6,9; по р

- галактозидазе в 2,6; а по р - ксилозидазе в 4,3 раза.

Различия меаду двумя гибридами по соотношения метаболических путей в меристеме главного и придаточных зародышевых корней заключались в том. что придаточные корни или отстают от главного по формирорванию структуры метаболизма, как и по первой группе фер-

ментоз - гибрид Краснодарский 303, или га изменения прочехолят еднновремегага п придаточных и в главном корне - гибрид ВИР-42. Более вазнам. вероятно, становится общий возраст растения.

Сильиое увеличение в активности гликозидаз у ВИР-42 в зоне растяжения приходится на период развития от 1-го к 3-му дню, тогда как у Краснодарского 303 в это время активности снижаются. Таким образом, связь между скоростью роста и изменениями з метаболизме по гликозидазам более сложная: различия в скорости роста корня у двух гибридов обнаруживаются в первый день прорастания, а в относительной активности гликозидаз - во все дни наблюдений, до 6-го. Кроме того, активность гликозидаз возрастает перед началом интенсивного растяжения.

4. Применение метода сравнения метаболических путей при поиске количественных критериев старения.

4.1 Некоторые проблемы биологии старения. Состояние вопроса.

Термин "старение" обычно связывают.с неблагоприятными изменениями, появляющимися в поздний период онтогенеза, но явные результаты процессов старения могут не быть заметными до последних этапов .гнзни, однако сами эти процессы могут начинаться гораздо раньше. Многие ткани Формируются очень рано и остаются практически неизменными на всех последующих стадиях. Поэтому отделять друг от друга процессы развития и старения не только трудно, но, по-видимому, и нежелательно. Чтобы понять природу старения, необходимо изучать этот процесс на уровнях организации более низких, чем уровень организма в целом, т.к. старение целого организма в конечном счете долзено быть обусловлено изменениями, происходящими на низаих уровнях организации. Возрастные изменения функциональных свойств отмечены у большинства (если не у всех) организмов, (М.Лэмб.1980).

4.2 Соотношение метаболических путей в стареющих органах

проростка кукурузы.

По из>-С1;2Ш!ям в пнтлпнест ферментов из разнмх гееньез мота-

болизма, сдвигам в соотношении» метаболических путей во времени можно, как мы полагаем судить о развитии процесса старения. Со старением кажется возможным связать изменения, совпадающие по направлении у нескольких стареющих органов.

В кслеоризе, колеоптиле и читке 7-дневных проростков признаки старения проявлялись по-разному. В 7-дневной колеориэе, по сравнению с 3-дневной, уменьшалась масса сырого вещества и содержание экстрагируемого белка, хотя масса »одолжала расти; в вдетке при постоянной ъассе и уровне белка падала знергообеспеченность -снижалось содержание и других аденилатов (Зеленева, 1990).

Таблица 2

Активность ферментов и направление изменений активности в стареющих органах проростка кукурузы (стрелка, направленная вверх- повышение, вниз - понижение, горизонтально - отсутствие изменений активности

Орган Возр&т дни Эн АДГ ЛИГ ГдДГ . ГК Ш(0 Г* Гад Кен

3 7 163 231 7 ЭО 41 130 237 19 3 £30 143 65 7? 73 184 314 . 23 3

Клп 4 7 113 65 1 19 76 Ь80 330 22 13 105 Ь7 0 61 22 1169 ОТ 50 44

Инге* 4 7 291 63 7 в 18 158 45 7 2 415 21 2 10 14 238 127 18 В

К»р 3 7 1 Г 1 ':(: 1 1: I

К4П 4 7 1 1 1 1 1 Г 1 1 1

«иток 4 7 1 1 1 Ш Г Г 1 .1 1

1' Сокращения названий ферментов как в табл.1.

2) Гл - р - глюкозидаза; Гал - р - галактозидаза; Кси - & - кси-лозидаэа.

3) Клр - колерриза; Клп - колеоптилъ '

Очевидно, что при старении короткоживу^их органов (колеори-за. колеоптиль, щиток), ткани которых наиболее далеко отстоят от меристемы по стадии развития, индикаторами старения выступают соотношения тех же метаболических путей, что и при формировании структуры метаболизма меристемы: дыхательная цепь/гликолиз и алкогольная ферментация/гликолиз.

вывода.

1. Существует определенная специфичность метаболизма корневой меристемы, которая выражается в возрастном изменении активностей ферментов-маркеров метаболических путей : связанных с генерацией энергии { фосфорилирование глюкозы - маркер гексокиназа ; гликолиз - фосфоглицераткиназа и энолаза ; спиртовое брожение -алкогольдегидрогеназа *, молочнокислое брожение - лактатдегидроге-наза; гдаательная цепь - цитохромоксидаза ) и с азотным обменом (глутаьшдегидрогеназа).

2. По соотноаению метаболических путей корень принципиально отличается от ; других частей зародыша <колеоризы, колеоптиля, эпкбласта, лигулы и щитка).

3. Организация или структура метаболизма меристемы не остается постоянной при развитии корня. Наиболее резкие изменения в соотновении активностей ферментов, маркирующих метаболические пути энергетического и азотного обмена,происходят между первым и третьим днем прорастания, когда формирование структуры метаболизма в меристеме главного корня заканчивается.

4. Активности исследованных ферментов в меристеме и зоне растяжения главного корня у однодневных наклюнувиихся и 3-х дневных проростков кукурузы почти не различались и выходили на один уровень, что свидетельствует о периодическом изменении в организации метаболизма меристемы с увеличением возраста проростка. По-ниаение активности начиналось в зоне растяяения, а затем распространялось на меристему.

Таким образом, временная организация метаболизма растущей части корня выражается в периодическом колебании метаболических процессов в клетке.

5. Изменения в соотнесении метаболических путей по активностям ферментов вторичного обмена группы гликозидаз (В - глюкозида-зы, р - ксилозидазы и 6 - галактозидазы) в меристеме главного корня проростка кукурузы также носят ступенчатый характер. Возрастные изменения в активности гидролаз, проявляются в увеличении их активности перед началом интенсивного растяжения.

6. У двух гибридов, различающихся по скорости роста, а значит и по скорости возрастных изменений, активности гликозидаз были максимальными в меристеме и зоне растяжения придаточных эаро-дьшевых корней. Различия в скорости роста у двух гибридов обнаруживаются в пепый день прорастания, а в относительной активности гликозидаз - во все дни наблюдений.

7. Выявлена группа ферментов с одинаковым для трех органов проростка (колеоризы, колеоптиля и читка) направлением изменений активностей при развитии признаков старения. Эта группа ферментов-маркеров, представляющих следующие метаболические пути: ци-тохрошксидаза - дыхательная цепь, апкогольдегидрогеназа - спиртовое брожение, глутаматдегидрогеназа - азотный обмен и р - га-лактозидаза, участвующая в метаболизме клеточных стенок, представляется перспективной для поиска количественных критериев старения.

В. Метаболическими индикаторами развития меристемы и критериями старения могут выступать отношения одних и тех же метаболических путей: дыхательная цепь/гликолиз и спиртовое брожение/гликолиз.

Основные публикации» по теме диссертации

1. И. В. Зелекева, С. В. Анискмова. О длине меристемат1г:еской части в разных типах корней проростка кукурузы // Опер, информ. материалы СКФИБ? СО РАН СССР. - Иркутск. 1985. - С. 14-16.

2. И. В. Зеленева, С. В. Анисимова. К вопросу о природе колеори-зц и эпнбласта у прорстка злаков // Опер, информ. материалы СН -■?ИВР СО РАМ СССР. - Иркутск. 1987. - С. 9-10.

3. И.3. Зелекева, С.В. Владимирова. Относительная активность

птоз в uppstcreue разных типов ксрня // Тезисы докл. Второго

съезда ВО I P, Минск, 1990. - С. 85.

4. 15. D. Зеленева. С. В. Владимирова. О гипотезе корневой природе колеоризы // Ботанический нурнал. - 1992. - Т.71. С.35-38.

5. И. В. Зеленева, С. В. Владимирова. Активность ферментов в ко-поориге ч других частях зародапа злаков: о гипотезе корневой природы колеоризы // Докл. АН РАН. - 1993. - Т. 331, N 5. - С. 645-847.

G. it. ft. Зэленева, С. В. Владимирова. Количественное соотнеиение ийтабояичсских путей в отдрльшх частях зародыша злаков // Тезисы локд. Третьего съезда ВОФР. ■- Санкт-Петербург. - 1993. - Т. 1. -С. ICS.

7. И.В. Зеленева, С. В. Владимирова. Соотнесение метаболических путей з стареющих органах проростка кукурузы (в печати).

3. И. 3. Зэленева. С. 3. Владимирова. Влияние типа и возраста корил на соотношение метаболических путей в меристеме проростка кукурузы (а печати).