Возрастные изменения экспресии генов VEGFA и PEDF при развитии дистрофии сетчатки у крыс OXYS

Марковец, Антон Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Возрастные изменения экспресии генов VEGFA и PEDF при развитии дистрофии сетчатки у крыс OXYS
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Возрастные изменения экспресии генов VEGFA и PEDF при развитии дистрофии сетчатки у крыс OXYS"

На правах рукописи

МАРКОВЕЦ АНТОН МИХАЙЛОВИЧ

ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ КЕСЕ4 И РЕБР ПРИ РАЗВИТИИ ДИСТРОФИИ СЕТЧАТКИ У КРЫС ОХУБ

4859052

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 о НОЯ 2011

Новосибирск 2011

4859052

Работа выполнена в секторе геномной и постгеномной фармакологии Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

Колосова Н.Г.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук профессор

А.ЛМаркель, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Доктор биологических наук профессор А.Ю.Гришанова, Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск Ведущее учреждение: Научно исследовательский институт медицинской генетики СО РАМН, г. Томск

Защита состоится «^7» à/^J^. 2011 г. на утреннем заседании

диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СОР АН, в конференц-зале Института по адресу 630090,г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

Тел/факс: (383) 3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии игенетики СО РАН.

Автореферат разослан "Я& "afffrb^ 2011г.

Ученый секретарь п \ /

диссертационного совета Л. Ат,

доктор биологических наук ]у ' Т.М. Хлебодарова

Введение Актуальность

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) становится основной причиной нарушения и потери зрения у людей старше 50 лет в развитых странах. Наряду с возрастной зависимостью прослеживается генетическая составляющая ВМД в сочетании с влиянием факторов внешней среды. Значительное количество вовлеченных в развитие ВМД генов и наличие симптомов, характерных так же и для других комплексных заболеваний, усложняют диагностику. В основе патогенеза ВМД лежат характерные для старения изменения хориокапилляров, ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и мембраны Бруха, но механизмы, запускающие переход обычных возрастных изменений в патологический процесс, не известны. Считается, что развитие ВМД связано с гипоксией и воспалением (Feigl, 2007, 2009). В качестве основного повреждающего звена выступает окислительный стресс - нарушение баланса в системах генерации и детоксикации активных форм кислорода (АФК). Клинические проявления сильно зависят от формы ВМД: при «сухой» форме -зоны атрофии клеток РПЭ и фоторецепторов, наличие депозитов веществ в сетчатке; при «влажной» - отеки, кровоизлияния, рост новых сосудов или не-оваскуляризация и отслойка пигментного эпителия, которые приводят к гибели фоторецепторов и потере зрения. Растёт количество аргументов в пользу того, что ключевую роль в развитии заболевания играют повреждения клеток РПЭ в силу множества выполняемых ими функций и уникального расположения во внешней сетчатке (Strauss, 2005, Bonilha, 2008). Клетки РПЭ секретируют множество ростовых факторов, в том числе - эндотелиальный фактор роста A (vascular endothelial growth factor A- VEGF-A, далее VEGF) -главный ангиогенный фактор в сетчатке. Именно с повышенным уровнем VEGF связано развитие неоваскуляризации (главной причины потери зрения при ВМД). Ингибиторы VEGF подавляют процесс патологического роста сосудов. Усиление экспрессии гена Vegfa на поздних стадиях заболевания вызывают гипоксия и воспаление, играющие ключевую роль в патогенезе ВМД. Основным антагонистом VEGF в сетчатке является фактор пигментного эпителия (pigment-epithelium derived factor - PEDF), также секретируемый клетками РПЭ и обладающий ангиостатическими и нейротрофическими свойствами. Гипоксия является основным регулятором экспрессии гена VEGF через фактор транскрипции HIF-la, стабильность которого определяет пролил гидроксилаза 2 (prolyl hyxroxylases 2 -PHD-2). На сегодня вклад изменений экспрессии генов этих ключевых регуляторов ангиогенеза (VEGF, PEDF, PHD2) в процесс нормального физиологичного старения и тем более в развитие ВМД, особенно на ранних стадиях, остаётся до конца не ясным в силу сложности проведения таких исследований у людей.

Создание биологических моделей заболеваний человека — один из подходов к выяснению их этиологии и патогенеза, к разработке новых способов лечения. В последние годы получены убедительные аргументы в пользу того, что в качестве модели ВМД можно рассматривать созданную в ИЦиГ СО

РАН генетическую линию крыс 0ХУ8, для которой характерно преждевременное старение. Линия получена селекцией и инбридингом крыс \Vistar, чувствительных к катарактогенному эффекту галактозы (Соловьева и др., 1975). В 5-ти первых поколениях развитие катаракты провоцировали нагрузкой галактозой, в дальнейшем отбор шёл по ранней спонтанной катаракте, сцеплено с которой животные унаследовали синдром преждевременного старения, в том числе - ретинопатию, по клиническим проявлениям аналогичную ВМД у людей. Для доказательства соответствия адекватности модели необходимо установить молекулярные основы развития ретинопатии. Максимально полная характеристика линии крыс ОХУБ как модели ВМД имеет как фундаментальное, так и прикладное значение. Её использование позволит исследовать патогенез заболевания, анализировать генетически детерминированные особенности его течения и давать объективную оценку эффективности новых способов лечения. Примером успешного использования крыс ОХУБ явилось выявление уникального терапевтического потенциала соединения принципиально нового класса - антиоксиданта, способного проникать и накапливаться в митохондриях - пластохинонил-децил-трифенилфосфония (8к(21, Скулачев, 2007, Ыегоеу е1 а1., 2008). Соединение уже используется в ветеринарии в форме глазных капель, проводятся его клинические испытания, однако молекулярные механизмы действия 8кС>1 при ретинопатии не изучены.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы - исследование связи развития ретинопатии у крыс ОХУБ с изменениями экспрессии генов Уе^а, Рей/ и РЫ-2 в тканях глазного дна и влияния на неё митохондриального антиоксиданта БкСН. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести сравнение возрастных изменений паттернов экспрессии генов Уе^а, Рей/и РЫ-2 в тканях глазного дна крыс ОХУБ и \Vistar.

2. Сопоставить изменения экспрессии генов Уе$а, Рей/и Ркй-2 с морфологическими изменения хориоретирального комплекса сетчатки крыс ОХ-УБ.

3. Исследовать возможную связь развития ретинопатии у крыс ОХУБ с изменениями экспрессии генов Уе%/а, Рей/и Р1и1-2.

4. Изучить влияние митохондриального антиоксиданта 8к(21 на уровень экспрессии генов Уе%/а, Рей/и РЫ-2 в тканях глазного дна крыс ОХУ8.

Научная новизна

Впервые изучена экспрессия генов Уе%/а, Рей/и РЫ-2 в сетчатке преждевременно стареющих крыс ОХУ8 и контрольных крыс Wistar в возрасте от 20 дней до 24 мес. и выявлены межлинейные различия, ассоциированные с развитием ретинопатии у крыс ОХУ8. Структурно-функциональной основой развития ретинопатии являются изменения клеток ретинального пигментного эпителия (дистрофические на доклинических стадиях заболевания, дегенеративные - на поздних) и нарушение кровотока в хориокапиллярах. Они выяв-

ляются у крыс ОХУБ начиная с возраста 20 дней при наличии молекулярных признаков острой гипоксии в сетчатке и отсутствии характерного для неё компенсаторного ответа - изменения экспрессии генов Уе^а и Рей/. Впервые показано, что первые клинические проявления ретинопатии развиваются у крыс ОХУБ к возрасту 3 месяцев на фоне характерного для хронической гипоксии снижения уровня мРНК гена Ркй-2 и значительно сниженного по сравнению с крысами Wistar уровня мРНК и белковых продуктов генов Уе^а и Рей/. При выраженных стадиях заболевания уровень мРНК генов Уе^а и Рей/ у крыс ОХУ8 не отличается от крыс \УЪ1аг, а содержание белка Уе%/а снижено. Установлено, что направленность изменений экспрессии генов Уе^а, РеаУ и РЫ-2 под влиянием митохондриального антиоксиданта БкСН у крыс ОХУБ и Wistar различна и зависит от возраста животных. Впервые показано, что и профилактический, и лечебный эффект 8к(21 в отношении ретинопатии у крыс ОХУБ связан с нормализацией экспрессии генов Уе^а, Рей/и РМ-2, характер изменения которой зависит от стадии заболевания. Теоретически и практическая значимость

Знание закономерностей изменения с возрастом и при развитии ретинопатии экспрессии в сетчатке ключевых регуляторов ангиогенеза - генов Уед/а и Рей/- расширяет представления и о механизмах участия этих генов в процессе старения и в патогенезе ВМД, особенно на ранних стадиях заболевания. Полученные данные позволяют рассматривать эти гены как потенциальные кандидаты для создания в перспективе диагностической системы, нацеленной на раннее выявление ВМД у людей. Практическая значимость работы определяется доказательством соответствия линии крыс ОХУБ критериям модели ВМД на молекулярно-генетическом уровне, возможности её использования для исследования патогенеза заболевания, в том числе на ранних доклинических стадиях их развития, а также для корректной оценки эффективности терапевтических воздействий, направленных на его лечение и профилактику. Выявленная ассоциация развития ранних стадий ретинопатии со сниженным уровнем экспрессии генов Уе%/а и Рей/ и нарушениями сосудов хориоидеи указывает на необходимость выработки объективных критериев правомерности применения ингибиторов фактора \ZEGF для лечения атрофической формы ВМД с локальными точечными кровоизлияниями в сетчатке.

Положения выносимые на защиту

1. Развитие ретинопатии у крыс ОХУБ связано с изменениями экспрессии генов Уе^а и Рей/, в основе которых лежат структурно-функциональные изменения клеток ретинального пигментного эпителия.

2. Характер изменения экспрессии генов Уе$/а, Рей/и РМ-2 в сетчатке крыс под влиянием митохондриального антиоксиданта зависит от генотипа животных, их возраста, а его терапевтический эффект в отношении ретинопатии у крыс ОХУБ связан с нормализацией экспрессии этих генов.

Апробация работы и публикация

Полученные результаты были представлены и обсуждены на: XLVI и XLVII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология в г. Новосибирске, 2008 и 2010 гг.; ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки - медицине»в г. Новосибирске, 2008 и 2010 гг.; XIXth IAGG World Congress of Gerontology and Geriatrics в г. Париже в 2009 г.; Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» в г. Новосибирске, 2009 г.; Российском офтальмологическом форуме в г. Москве, 2009 г.; The seventh international conference of bioinformatics of genome regulation and structure\systembiology в г. Новосибирске, 2010 г.; Международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» в г. Судаке, 2010 г. Вклад автора.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Автор принимал личное участие в планировании, проведении и обсуждении всех экспериментов, по результатам которых написана диссертация. Офтальмологические осмотры животных проводились д.м.н. А.Ж.Фурсовой, их результаты анализировались самостоятельно. Гистологическое исследование выполнено в рамках совместных исследований с к.б.н. А.А.Жданкиной. Структура и объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Работа изложена на 151 странице, содержит 27 рисунков.

Материалы и методы Животные. Работа выполнена на 384 крысах-самцах линий OXYS и Wistar в возрасте от 20 дней до 24 мес. на базе ЦКП «Генофонды экспрерименталь-ных животных» ИЦиГ СО РАН. Животных содержали при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище группами по 5 особей в клетках размером 57*36x20 см при температуре 22±2 С.

Офтальмологические осмотры проводили с помощью прямого офтальмоскопа "Betta" (Германия) после расширения зрачков 1% раствором тропокамида. Наличие и степень выраженности изменений сетчатки оценивали в соответствии с протоколом Age-Related Eye Disease Study (AREDS) (http://eyephoto.ophth.wisc.edu).

ПЦР в реальном времени. Уровень экспрессии генов исследовали методом ПЦР в реальном времени в присутствии красителя SYBR Green I. В качестве гена сравнения использовали «ген домашнего хозяйства» RPL 30 (белок 30 большой субъединицы рибосомы). Использовались следующие праймеры: для Rpl30- 5 'ATGGTGGCTGC AAAGAAGAC3' и 5 'С A A AGCTGG АС AGT-TGTTGG3'; для Vegfa - 5 'CTGGCTTTACTGCTGTACCTCCACC3' и 5'GGCA-СACAGGACGGCTTGAA3'; для Pedf- 5 'GATTGCCCAGCTGCCTTTGACA3' и 5 'GGGACAGTCAGCАСАСТТ GGATAG3' для Phd2 - 5 'ATAAAGACTG-

GGACGCCAAG3' и 5'ТТСАА СССТСАСАССТТТСТСЗ'. По получаемым стандартным калибровочным кривым определяли относительный уровень кДНК исследуемых генов (Nolan et al., 2006).

Определение содержания белков. Содержания белка PEDF проводили методом вестерн блот анализа и после разделения белков сетчатки в 14% полиакриламидном геле. Качество переноса белков контролировали окрашиванием мембраны раствором PonceauS в 1% уксусной кислоте. Интенсивность полос белка при окрашивании мембраны использовали для последующей нормализации данных (Romero-Calvo et al., 2010, Aranha et al., 2010). После блокирования 5% обезжиренным молоком, мембрана инкубировалась ночь с антителами против PEDF в 5% обезжиренном молоке (1:200, Santa Cruz) при 4°С. Инкубация с вторичными антителами в 5% обезжиренном молоке (1:5000, Santa Cruz) проводилась в течение 2 часов при комнатной температуре. Проявленные пленки сканировались, и интенсивность свечения бендов замерялась с помощью программы ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ii/).

Содержание белка VEGF оценивали иммуноферментным анализом (ELISA), используя набор Rat VEGF ELISA Kit (RayBiotech), согласно рекомендациям производителя.

Гистологический и морфометрический анализ. Заднюю часть глаза фиксировали в 2,5% глютаральдегиде и 2% 0s04, дегитратировали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, заливали в ероп-812. Полутонкие срезы готовили на ультратоме LKB-4 и окрашивали 0,1%) толуидиновым синим. Подсчеты проводились на областях от 50 до 250 мкм по 50 полей от каждого животного. Площадь клеток РПЭ и удельная площадь хориоидальных сосудов измеряли с помощью программного обеспечения Axiovision (Zeiss, Thornwood, NY).

Влияние антиоксиданта SkQl на развитие ретинопатии у крыс OXYS и экспрессию генов в сетчатке оценивали в двух экспериментах. При оценке профилактического эффекта крысы OXYS и Wistar опытных групп получали ежедневно с кормом по 250 нмоль SkQl на кг массы тела с возраста 1,5 до 3 мес., контролем служили интактные животные. При оценке лечебного потенциала крысы OXYS и Wistar с возраста 9 до 12 мес. ежедневно получали SkQl в форме глазных капель (250нМ), контрольные - плацебо. До и после начала экспериментов проводились офтальмологические осмотры. По окончании приёма препарата забирали образцы сетчатки.

Статистический анализ результатов проводился с помощью программы Statistica 6.0 («Statsoft», США). Использовали факторный дисперсионный анализ (ANOVA) с post-hoc сравнениями групповых средних (Newman-Keul test). Как независимые факторы рассматривали генотип (Wistar,-OXYS), возраст и препарат. Для анализа влияния антиоксиданта SkQl на состояние сетчатки использовали зависимые парные сравнения состояния сетчатки до и после воздействия антиоксиданта (Т-тест). Результаты Western blot анализа оценивали, используя непараметрический U-тест Манна-Уитни. Данные

представлены как М±8.Е. Во всех анализах результат считался статистически значимым при р<0.05.

100

80-

20-

1§12

□ 1

Результаты и обсуждение

Возрастные изменения сетчатки крыс

Согласно офтальмоскопическим осмотрам, у крыс \Vistar первичные патологические изменения сетчатки выявляются только в возрасте 24 мес. и строго не могут быть классифицированы как ретинопатия. У двадцатидневных крыс ОХУБ клинические проявления ретинопатии отсутствуют (Рис. 1).

Первые ВМД-подобные изменения сетчатки появляются к возрасту 1,5 мес. у 22% крыс ОХУБ. Анализ результатов офтальмологических осмотров позволяет выделить два критических периода развития ретинопатии у крыс ОХУБ, которые были выбраны для исследования молекулярных процессов, лежащих в основе дегенеративных изменений сетчатки. Первый -возраст от 1,5 до 3 мес. - период резкого подъема заболеваемости: к возрасту 3 мес. практически 100% крыс ОХУБ имеют патологические изменения глазного дна, соответствующие 1-й стадии заболевания (очаги ишемии, зоны атрофии клеток РПЭ и хориокапилляров). Второй - возраст от 9 до 12 мес. - период активного прогрессирования ретинопатии, которая достигает в основном 2-й стадии (большие «мягкие» и твердые друзы с тенденцией к сливанию, отек центральной зоны сетчатки, серозная отслойка пигментного эпителия и нейроретины). К возрасту 24 мес. необратимые изменения сетчатки, соответствующие 3-й стадии ретинопатии (геморрагическая отслойка сетчатки, кровоизлияния в центральную область, формирование новых сосудов - неоваскуляризация - и признаки рубцевания), наблюдались почти у всех крыс ОХУ8.

Ранее предполагалось, что изменения морфологии сетчатки у крыс ОХУБ развиваются к возрасту 5 мес., а в 3 мес. отсутствуют. Однако выполненный нами морфометрический анализ показал, что уже в возрасте 20 дней в хориоидее незначительно, но достоверно увеличен процент сосудов с признаками тромбоза и стаза (рис. 26). При этом у крыс ОХУ8 удельная площадь клеток РПЭ меньше, чем у крыс \Vistar (рис. 2а), имеются признаки структурно-функциональных нарушений: наряду с нормально функционирующими клетками выявляются клетки РПЭ с вакуолями в цитоплазме, нарушениями микроворсинок и базальной складчатости, сниженным количеством фаго-сом.

0.7 1.5 3 6 9 12 24 Возраст, мес.

Рис. 1. Доля глаз крыс ОХУ8 с различными стадиями ретинопатии в зависимости от возраста. 0-3 -стадии ретинопатии по классификации А1Ш08

Согласно современным представлениям, развитие сначала структурно-функциональных нарушений клеток РПЭ, а затем хориокапилляров характерно для сухой формы ВМД. В этой связи можно заключить, что у крыс ОХУБ ретинопатия соответствует атрофической форме ВМД.

Рисунок 2. (а) Средняя площадь клетки РПЭ в срезе и (б) площадь сосудов хориоидеи со стазом и тромбозом. А - по сравнению с предыдущим возрастом; * - по сравнению с крысами \Vistar. п=5

Профиль экспрессии генов Vegfa и Pedf и развитие ретинопатии у крыс OXYS

В литературе отсутствуют сведения об экспрессии генов антагонистов Vegfa и Pedf на ранних, а тем более - доклинических стадиях развития ВМД у людей. Более того, к моменту постановки задачей исследования в литературе не было информации о возрастных изменениях экспрессии генов Vegfa и Pedf в сетчатке. Первая работа об изменениях с возрастом экспрессии этих генов в сетчатке здоровых крыс, появилась в 2008 году (Steinle et al.). Наше исследование показывает, что роль фактора VEGF неоднозначна на разных стадиях развития ретинопатии у крыс OXYS и ранние стадии развиваются на фоне сниженной экспрессии генов Vegfa и Pedf а так же сниженного уровня мРНК гена Phd2.

С возрастом уровень мРНК генов Vegfa и Pedf в сетчатке крыс OXYS и Wistar существенно снижается, начиная с 20-ти дневного возраста (~10 и ~5 раз для генов Vegfa и Pedf соответственно, рис. За и 4а). Принципиально важно, что у крыс OXYS уровень мРНК значительно снижается уже к возрасту 3 мес., в то время как у крыс Wistar такое снижение происходит лишь к возрасту 12 мес. (рис. За и 4а). Отсутствие межлинейных различий в уровне мРНК в возрасте 20 дней косвенно указывает на то, что изменения экспрессии вторичны по отношению к изменениям функционального

Wistar OXYS

5 10 15 Возраст, мес.

10 15 20 Возраст, мес.

Рисунок 3. (а) Уровень мРНК гена Уер/а в сетчатке крыс. п=5. (б) Содержания белка УЕОР в сетчатке крыс п=4-8. Л - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом; * - по сравнению с крысами \Vistar

состояния клеток РПЭ. В сетчатке оба фактора - УБвР и РЕОР -экспрессируются и секретируются именно клетками РПЭ. Можно полагать, что ускоренное снижение их экспрессии на уровне мРНК в сетчатке крыс ОХУБ происходит из-за нарушений клеток РПЭ и становится отражением снижения их функциональной активности.

a cn

о ct со а> о. х h* О X

о.

■о

а ^

Wistar -е-OXYS

Q Ш

с; ш

* г

шшшшш

- 1 11111 рик ¡Шй! вин

20 25

20дней Змее. 12 мес.

5 10 15 Возраст, мес.

Рисунок 4. (а). Уровень мРНК гена Pedf в сетчатке крыс. п=5. (б) Содержания белка PEDF в сетчатке крыс OXYS. Данные представлены как процент к уровню одновозрастных крыс Wistar. п=3-4. Л - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом; * -достоверные различия по сравнению с крысами Wistar. Л - достоверные различия по сравнению с предыдущим возрастом

Таким образом, у крыс OXYS снижение экспрессии ключевых регуляторов ангиогенеза в сетчатке происходит значительно раньше, чем у крыс Wistar, и по времени оно совпадает с периодом нарушения состояния сосудов и ухудшением состояния клеток РПЭ, а также с периодом активной манифестации клинических проявлений ретинопатии.

Следует рассмотреть различия возрастных изменений экспрессии генов Vegfa и Pedf у крыс OXYS и Wistar (у последних мы не выявили патологических изменений сетчатки вплоть до 24 мес.). Если уровень мРНК указанных генов у крыс OXYS существенно не меняется с возраста 3 до 24

мес., то у крыс Wistar уже с возраста 12 мес. она начинает повышаться и в 24 мес. (рис. За и 4а) достигает половины уровня, свойственного 20-ти дневным крысам этой линии. Мы полагаем, что у крыс Wistar с возрастом из-за снижения экспрессии генов Vegfa и Pedf также постепенно нарушаются связи между клетками РПЭ и хориокапиллярами и развивается гипоксия. Это провоцирует активацию гипоксия-зависимых сигнальных путей и повышение экспрессии гена Vegfa, но одновременно с уровнем экспрессии Vegfa растет и экспрессия гена его ключевого антагониста - Pedf. Известно, что эти факторы регулируют экспрессию друг друга (Ohno-Matsui et al., 2003). В результате у крыс Wistar сохраняется баланс между про- и антиангиогенными факторами и развивается сбалансированный ответ на регуляторные изменения сетчатки, что препятствует развитию патологических изменений вплоть до 24 мес. У крыс OXYS такой компенсаторной реакции мы не наблюдали, и уровень экспрессии генов Vegfa и Pedf оставался низким, на уровне 3-х мес. животных.

Несколько иными оказались возрастные изменения содержания продуктов исследованных нами генов - белков VEGF и PEDF. Содержание белка VEGF в сетчатке крыс обеих линий было одинаковым в возрасте 20 дней (рис. 36), снижалось к 3 мес., а затем росло и достигало максимальных значений у двухгодовалых животных (рис. 36). Иначе говоря, снижение уровня мРНК гена Vegfa сопровождалось накоплением его белкового продукта, что может являться важной предпосылкой развития ретинопатии: как известно, поздние стадии ВМД ассоциированы с повышенным уровнем VEGF. В возрасте 20 дней межлинейных различий в содержании белков VEGF и PEDF выявлено не было (рис. 36 и 46), а в возрасте 3 мес. содержание обоих белков у крыс OXYS было ниже, чем у крыс Wistar. Сниженное содержание VEGF в сетчатке крыс OXYS при сравнении с крысами Wistar сохранялось и в старших возрастных группах. Как отмечалось выше, в возрасте 3 мес. экспрессия генов Vegfa и Pedf на уровне мРНК у крыс OXYS существенно снижена по сравнению с крысами Wistar. Но если на уровне мРНК снижение было 10- и 5-кратным, соответственно, то по содержанию белков VEGF и PEDF межлинейные различия достигали лишь 35% и 30%, соответственно (рис. 3 и 4). Возможно, синтез относительно большого количества белка на меньшем количестве мРНК у крыс OXYS достигается за счет пост-транскрипционной и/или посттрансляционной регуляции.

Как бы то ни было, у крыс OXYS развитие ретинопатии происходит на фоне сниженной как на уровне мРНК, так и на уровне белка экспрессии генов Vegfa и Pedf, что, можно полагать, связано с нарушением кислородного баланса.

Связь системы регуляции кислородного гомеостаза с изменениями экспрессии генов Vegfa и Pedf у крыс OXYS

Результаты наших офтальмологических и морфологических исследований свидетельствуют о наличии зон ишемии в сетчатке крыс

OXYS, начиная с возраста 3 мес., а нарушений кровотока - с 20 дней. Подтверждением гипоксического состояния в сетчатке крыс OXYS могут служить данные об экспрессии гена пролил гидроксилазы 2 Phd2. В возрасте 3 и 12 мес. нами обнаружен сниженный уровень мРНК этого гена в сетчатке крыс OXYS по сравнению с крысами Wistar (рис. 5).

В данной ситуации было бы логично ожидать повышения уровня HIF-1а и экспрессии его генов-мишеней, в частности Vegfa. Однако в возрасте 3 мес. экспрессия гена Vegfa в сетчатке крыс OXYS была, как отмечалось, на уровне мРНК на порядок, а на уровне белка - в 1,5 раза ниже, чем у крыс Wistar (рис. 3 и 4). То есть мы не обнаружили у крыс OXYS закономерного ответа на гипоксию её косвенного молекулярного маркера - Vegfa. Такая ситуация указывает на отсутствие у крыс OXYS адекватного ответа на гипоксию. При этом у крыс Wistar реакция на гипоксию в возрасте 17 и 24 мес. присутствовала. Аналогичные результаты получены на двухлетних крысах в работе Steinle и соват. (2008), что указывает на то, что развивающиеся в сетчатке крыс Wistar изменения экспрессии гена Vegfa характерны для физиологического старения.

При исследовании экспрессии гена Phd2 в сетчатке 20-дневных животных установлено, что уровень мРНК гена Phd2 у крыс OXYS был выше, чем у крыс Wistar (рис. 5), что характерно для острой стадии гипоксии. Экспрессии РЫ2 может приводить к подавлению пролиферации эндотелия сосудов (Takeda, 2007b), нарушению формирования микроциркуляторного русла, как это недавно показано при ретинопатии, индуцированной кислородом (Duan et al., 2011).

Таким образом, впервые прослежены изменения экспрессии генов Vegfa и Pedf в сетчатке начиная с возраста 20 дней до 24 месяцев у крыс OXYS и Wistar. Выявлены генетически детерминированные отличия изменений экспрессии генов у крыс OXYS, ассоциированные с развитием ретинопатии.

Связь терапевтических эффектов приёма SkQl с кормом с влиянием на экспрессию генов Vegfa, Pedf и Phd2 в сетчатке

В своей работе, мы подтвердили способность митохондриального антиоксиданта SkQl полностью предотвращать развитие ранней ретинопатии у крыс OXYS при его включении в рацион молодых животных (с 1,5 мес.) в период активной манифестации первых клинических признаков заболевания (Табл. 1). Важным является тот факт, что антиоксидант не вызвал побочных эффектов в сетчатке здоровых крыс Wistar.

OXYS

20 дней Змее. 12 мес. Рисунок 5. Уровень мРНК гена Ркс12 в сетчатке крыс. * - достоверные различия по сравнению с крысами \Vistar. п=5-9

Опыт SkQl с кормом с 1,5 до 3 мес. из рас- SkQl в виде глазных капель (250нМ)

чета 250 нмоль/кг веса животного с 9 до 12 мес.

Осмотры глаз 1,5 мес. 3 мес. 9 мес. 12 мес.

Стадия 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2

Контроль 78% 22% 0% 0% 83% 17% 35% 60% 5% 0% 50% 50%

SkQl 79% 21% 0% 82% 18% 0% 3% 90% 7% 17% 77% 6%

о с»)

ф о

ьг X а s

i контроль I SkQ1

контроль SkQ1

Таблица 1. Влияние SkQl на состояние глазного дна крыс ОХУ8. В таблице представлен процент глаз животных с соответствующей стадией заболевания. 0-2 -стадии ретинопатии, по международной классификации АЯЕОЗ.

В этом эксперименте экспрессия генов Уе^а и Рес# в сетчатке контрольных крыс ОХУБ возрасте 3 мес. была ниже, чем у контрольных

крыс \Vistar, что качественно соответствует экспериментам, которые обсуждались выше. После приема курса БкСН с кормом уровень мРНК генов Уе&а и Рес1/ в сетчатке контрольных крыс ОХУБ в возрасте 3 месяцев был ниже, чем у контрольных крыс "Мз1аг, что качественно соответствует

\Л/Ыаг ОХУБ " \ZVistar ОХУЭ Рисунок 6. Эффект Эк01 (а) на уровень мРНК гена п=7 (б) на содержание белка УЕйР в сетчатке, п=4.. Л - достоверные различия по сравнению с крысами ^^^аг; * - эффект препарата.

данным

экспериментам по оценке возрастных изменений экспрессии генов Уе^ и Рес1/ (рис. 3, 4, 6, 7). Содержание белков УЕОР и РЕОР в сетчатке контрольных крыс ОХУБ также было ниже, чем у крыс \Vistar, однако межлинейные различия в этих независимых опытах были сопоставимы. Различия кратности между результатами двух экспериментов по уровню

а°

со

мРНК могли быть обусловлены патологических изменений сетчатки крыс ОХУБ: процент животных с выраженной (2-й) стадией ретинопатии при оценке терапевтического эффекта 8к<31 был ниже, чем в опыте по исследованию возрастных изменений

экспрессии генов Уе&а. и Рес1[ (17 против 25%). Полученные результаты согласуются с выявленной нами картиной развития заболевания: ранние

неодинаковой выраженностью

контроль» Г SkQ1l

х 1 О- qi

2 Ф

& I

Ч о

а.

х О

а.

контроль SkQ1 S

Wistar OXYS

u. о

ш CM

n-cJ

о q

OXYS

Рис. 7. Эффект SkQl (с кормом с 1,5 до 3 мес, 250 нмоль/кг) на (а) уровень мРНК гена Pedf. п=8-10, и (б) на содержание белка PEDF (вестерн блот) в сетчатке. п=3. * - достоверные межлинейные различия.

стадии ретинопатии протекают на фоне сниженной экспрессией гена Vegfa.

Исследования показали, что профилактический эффект 8кС)1 на молекулярном уровне связан с предотвращением снижения уровня мРНК гена Уе^а у крыс ОХУБ (рис. 6а) и, как следствие, с повышением содержания его белка до уровня контрольных крыс Wistar. Подобные данные еще раз подтверждают связь развития ранней ретинопатии у крыс ОХУБ с нарушением экспрессии Уе^а.

Как и при оценке возрастных изменений возрастных изменений уровня мРНК гена Ркс12, у контрольных крыс ОХУБ мы выявили сниженный уровень мРНК гена РИс12 (рис. 8а), что указывает на функционирование сетчатки 3-мес. крыс в условиях гипоксии. На фоне приёма Бк01 произошло повышение экспрессии этого гена до уровня крыс \Vistar, что предполагает

нормализацию напряжения контрольна КИСлорода. Отсутствие * признаков гипоксии в

сетчатке получавших

антиоксидант крыс ОХУБ объяснимо: профилактический приём 8к.01, по данным Иегову й а1. (2008), существенно улучшает состояние

сосудов хориоидеи,

предотвращая развитие артериосклероза и

тромбозов. При этом экспрессия Уеф на фоне приёма препарата у крыс ОХУБ возросла как на уровне мРНК, так и на уровне белка (рис. 6 и 7), до уровня, характерного для сетчатки здоровых крыс ,\\%1аг, иначе говоря - нормализовалась.

Примечательно, что мы не обнаружили какого-либо эффекта 8кС>1 на экспрессию Pedf в сетчатке 3-х мес. животных: как у контрольных, так и у получавших антиоксидант крыс ОХУБ уровень мРНК РеЗ[ оставался более низким, чем у крыс \Vistar (рис. 7). Известно, что РЕОБ обладает антиангиогенными свойствами и является самым сильным эндогенным ингибитором ангиогенеза. Возможно, сниженный уровень экспрессии Pedf у получавших БкО! крыс ОХУ8 способствует полноценному функционированию сосудов и поддержанию нормального метаболизма в сетчатке.

Таким образом, способность митохоидриального антиоксиданта 8к01 предупреждать развитие ретинопатии у крыс ОХУ8 связана с его влиянием на уровень экспрессии генов ключевых регуляторов ангиогенеза Уеф и Pedf и сенсора кислорода - Phd2.

Связь терапевтических эффектов глазных капель 8к(31 с влиянием на экспрессию генов Уе^а, Ре<1/и Phd2 в сетчатке

\ZVistar ОХУБ

Рисунок 3. Эффект БкСН на уровень мРНК гена РМ2. . А - достоверные различия по сравнению с крысами \Vistar. п=7-8. (а) ЭкСЗ! с кормом с 1,5 до 3 мес. из расчета 250 нмоль/кг веса животного, (б) Эк^Н в виде глазных капель (250нМ) с 9 до 12 мес.

Капли - наиболее предпочтительная лекарственная форма при лечении глазных заболеваний. После лечения крыс каплями SkQl (250 нМ, приём с 9 до 12 мес.) мы обнаружили у крыс OXYS увеличение доли глаз без признаков ретинопатии (Табл. 1), в то время как в контрольной группе заболевание активно прогрессировало. На крыс Wistar антиоксидант не оказал побочных эффектов.

Мы показали, что лечебный эффект антиоксиданта, как и профилактический, сопряжен с его влиянием на экспрессию генов Vegfa и Pedf и Phd2 в сетчатке крыс OXYS. Как и ранее, у контрольных крыс OXYS в возрасте 12 мес. уровень мРНК Vegfa был таким же, как у крыс Wistar, а уровень белка даже снижен (рис. 3 и 9).

| 2 контроль®« б s контрольна I контроль«®

£0 „ SkQiœ гоО _г SkQ1 ШШ 2 SkQ1 га

IFiÉ SÉ

t'f -'i * с WM "-Лч * ÛL q : . и ! * . '. 1

;; I f|| fi 111

И I n ,.-.*•. Я1 SÊ x о H f .'JH

5 u Wistar OXYS | 0 Wistar OXYS I u Wistar OXYS

Рисунок 9. Эффект капель SkQl (250 нМ, с 9 до 12 мес.) (а) на уровень мРНК гена Vegfa. п=8-10 (б) на содержание белка VEGF в сетчатке. п=4 (в) на уровень мРНК гена Pedf. п=8-10 Л -по сравнению с крысами \\%Гаг;*-эффект препарата.

Приём капель SkQl вызвал у крыс OXYS снижение экспрессии гена Vegfa и на уровне мРНК, и на уровне белка, а также повышение уровня мРНК гена Pedf (рис. 9в) по сравнению с контрольными животными. На экспрессию гена Phd2 в сетчатке крыс OXYS антиоксидант никак не повлиял (рис. 86). У крыс Wistar эффект капель SkQl на экспрессию генов оказался противоположным: SkQl повысил мРНК и белок гена Vegfa (рис. 9а, б) и снизил, по сравнению с контролем, уровень мРНК генов Pedf и Phd2 в сетчатке (рис. 86 и 9в). Можно полагать, межлинейные различия в реакции на SkQl связаны с особенностями состояния сетчатки годовалых животных. У крыс OXYS к этому возрасту развиваются выраженные стадии заболевания. В такой ситуации снижение уровня VEGF способно предотвратить вызываемые повышенными концентрациями этого фактора нарушения проницаемости сосудов и отеки, неоваскуляризацию.

У крыс Wistar признаки ретинопатии при офтальмоскопических осмотрах не выявляются как в возрасте 12 мес., так и в старших возрастных группах. Тем не менее, у годовалых крыс Wistar на молекулярном уровне появляются молекулярные предпосылки, которые в дальнейшем и приводят к органическим изменениям. SkQl создает молекулярные условия для поддержания сосудов хориоидеи в сетчатке через повышение экспрессии Vegfa и снижение Pedf что препятствует развитию ретинопатии. При этом ответ на SkQl включал в себя снижение экспрессии гена Phd2 и повышение

экспрессии гена УЕОР, что, скорее всего, опосредованно у крыс \Vistar НП7-1а сигнальным путём.

Сходные изменения уровня мРНК гена Уе^а после приема 8кр1 с кормом наблюдались у крыс ОХУ8 в возрасте 3 мес., когда у них происходит активная манифестация

ретинопатии. И хотя для крыс \Vistar не характерно развитие патологических изменений, предпосылки для этого, можно полагать, у годовалых животных уже формируются. Примечательно, что характер изменения - снижение количества белка УЕОБ у крыс \Vistar в возрасте 25 мес. в ответ на (рис. 10) - соответствовал реакции годовалых крыс ОХУБ. То есть и в этом случае мы видим однонаправленные изменения экспрессии генов под влиянием держание белка УЕОБ в сетчат-антиоксиданта у крыс ОХУ8 и №Ъгаг, но в ке в 25 мес.л-по сравнению с разные возрастные периоды. В этой связи крысами \Vistar; * - эффект пре-представляется закономерным отсутствие паРата- п"~4 изменений на уровне белка УБОР у крыс ОХУБ в ответ на воздействие 8кр! в возрасте 25 мес. (рис. 10). К этому возрасту в сетчатке крыс ОХУ8 развивается практически полный фиброз хориоидеи и атрофия слоя РПЭ.

Таким образом, терапевтическая способность ЭкСИ снижать выраженность уже развитых признаков ретинопатии у крыс ОХУ8 связана так же связана с нормализацией экспрессии генов Уе^а и У крыс \Vistar в ответ на БкСИ наблюдалось изменение экспрессии генов Уе^а, Pedf и Phd2, которое качественно соответствовало изменению экспрессии генов у крыс ОХУ8 при профилактике ранней ретинопатии.

Выводы

1. Впервые проведено сравнение возрастных изменений экспрессии генов Уе^а, Pedf и Phd-2 в сетчатке крыс \Vistar и ОХУБ и выявлены различия, ассоциированные с развитием ретинопатии, нарушением регуляции кислородного гомеостаза и ответа на развивающуюся сетчатке крыс ОХУ8 гипоксию.

2. Установлено, что в развитии у крыс ОХУ8 ретинопатии участвуют те же структуры сетчатки и молекулярно-генетические факторы, что и при возрастной макулярной дегенерации у людей, однако направленность изменений экспрессии генов Уе^а, Pedf и Phd-2 и их вклад в развитие патологических изменений зависит от стадии заболевания.

3. При отсутствии клинических проявлений ретинопатии у крыс ОХУ8 в возрасте 20 дней выявлено характерное для острой гипоксии увеличение уровня мРНК гена Phd-2 и снижение площади клеток ретинального пигментного эпителия при не отличающихся от крыс \Vistar уровнях мРНК и белков генов Уе^а и Pedf.

о о см

КОНТРОЛЬ!

4,1 * ЭкОН л

о о

\ZVistar ОХУв

Рисунок 10. Эффект ЭкСН на со-

4. Развитие ранних стадий ретинопатии у крыс OXYS происходит к возрасту 3-х месяцев на фоне значительного снижения уровня мРНК генов Vegfa и Pedf и содержания их белковых продуктов и характерного для хронической гипоксии снижения уровня мРНК гена Phd-2

5. Развитие выраженных стадий ретинопатии у крыс OXYS происходит с 12 месяцев на фоне не отличающегося от крыс Wistar уровня мРНК генов Vegfa и Pedf, а содержание белка Vegfa и уровень мРНК гена Phd-2. снижены, что указывает на нарушение регуляции кислородного гомеостаза и ответа на развивающуюся в сетчатке крыс OXYS гипоксию.

6. Показано, что характер изменения профиля экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 в сетчатке под влиянием митохондриального антиоксиданта SkQl у крыс Wistar и OXYS различен; при этом масштабы и направленность его изменений зависят от возраста животных, а терапевтический эффект в отношении ретинопатии у крыс OXYS ассоциирован с нормализацией -экспрессии этих генов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: Статьи:

1. Марковец A.M., Колосова Н.Г. Обзор. Возрастная макулярная дегенерация и участие фактора роста сосудистого эндотелия в её патогенезе // Российский офтальмологический журнал. - 2009. - Т. 2. - № 3. - С. 5158.

2. Марковец A.M., Жданкина А.А., Фурсова А.Ж. Возрастные изменения экспрессии генов VEGF и PEDFh развитие клинико-морфологических проявлений хориоретинальной дегенерации у крыс OXYS// Сборник научных трудов Российского офтальмологического форума. - М. - 2009. -Т. 2,- С. 184-188.

3. Markovets AM, Saprunova VB, Zhdankina AA, FursovaAZn, Bakeeva LE, Kolosova NG. Alterations of retinal pigment epithelium cause AMD-like retinopathy in senescence-accelerated OXYS rats // Aging (Albany NY). - 2011. -Vol. 3(1).-P. 44-54.

4. Markovets AM, FursovaAZn, KolosovaNG.Therapeutic Action of the Mitochondria-Targeted Antioxidant SkQl on Retinopathy in OXYS Rats Linked with Improvement of VEGF and PEDF Gene Expression // PLoSOne - 2011. - Vol. 6(7):e21682. Epub 2011 Jul 5.

Тезисы конференций:

5. Марковец A.M. Экспрессия гена VEGF в тканях глазного дна при развитии дистрофии сетчатки у крыс OXYS. // Материалы XLVI Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология. - Новосиб. гос. ун-т. - Новосибирск -2008.-с. 114-115

6. Марковец A.M., Фурсова А.Ж., Колосова Н.Г.Экспрессия гена VEGF-A в сетчатке крыс OXYS при развитии дистрофии сетчатки в лечении ми-тохондриально-направленным антиоксидантом SkQ 1// Тезисы научно-

практической конференции «Фундаментальные науки - медицине». -Новосибирск. - 2008. - С. 40.

7. А.М. Марковец, А.А. Жданкина, А.Ж.Фурсова, Н.Г. Колосова. Связь дистрофии сетчатки крыс OXYS с экспрессией генов VEGF и PEDF. Эффекты митохондриально-направленного антиоксиданта SkQl. // Материалы Пятого съезда вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва. - 2009. - Ч. 1. - с. 128

8. Markovets А.М., Zhdankina А.А., Fursova A.J., Kolosova N.G. OXYS rat as animal model of age-related macular degeneration: potential for pathogenesis approach and elevation of treatment // XlXth IAGG World Congress of Gerontology and Geriatrics. - J Nutrition, Health &Aging. - 2009. - V. 13, Suppl. 1.-2009. P. S557

9. Марковец A.M., Жданкина A.A. Перспективы использования митохон-дриально адресованного антиоксиданта SkQl в лечении дистрофических заболеваний сетчатки и связь его эффектов с нормализацией функций пигментного эпителия// Тезисы 4 Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск. - 2009. - С. 144-145

10. Марковец А.М. Сравнение возрастных профилей экспрессии генов VEGF и PEDF в сетчатке крыс OXYS и Wistar // Материалы XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология. - Новосиб. гос. ун-т. - Новосибирск-2010. 10-14 апреля-с. 232

11. Markovets AM, Zhdankina АА. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression and morphological changes during normal aging and development of retinopathy in Wistar and OXYS rat's retina // The seventh international conference of bioinformatics of genome regulation and structure\system biology, 2010, June 20-27, Novosibirsk, p. 178.

12. Kozhevnikova OS, Efimov VM, Markovets AM, Kolosova NG. The transcriptional profile of retinal pigment epithelium/choroid of OXYS rat as a background for the retinopathy development // The seventh international conference of bioinformatics of genome regulation and structure\system biology, 2010, June 20-27, Novosibirsk, p. 141.

13. Марковец AM, Колосова НГ. Молекулярные эффекты антиоксиданта SkQl при лечении возрастной дегенерации сетчатки // Сборник тезисов ежегодной научной конференции «Фундаментальные науки - медицине», 2010,7-10 сентября, Новосибирск, С. 36

14. Марковец A.M.,Жданкина А.А. Механизмы терапевтического эффекта митохондриального антиоксиданта SkQl при лечении дегенерации сетчатки у крыс OXYS // Сборник тезисов Шестой международной крымской конференции «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии», 2010, 20-29 сентября, г.Судак, Украина, С. 42

Подписано к печати 29.09.2011 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16, печ. л. 1, уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 Заказ № 56

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марковец, Антон Михайлович

Список сокращений:.

1. Введение, цели и задачи исследования.

2. Обзор литературы.

2.1 Клинические признаки возрастной макулярной дегенерации и его эпидемиология.

2.2 Этиология возрастной макулярной дегенерации.

2.2.1 Генетические факторы риска возрастной макулярной дегенерации

2.2.1.1 Роль генов системы комплемента и иммунной системы.

2.2.1.2 Роль генов локуса НТЯА1/ АКМ82.

2.3 Патогенез возрастной макулярной дегенерации.

2.3.1 Возрастные структурно-функциональные изменения сетчатки как основа развития заболевания.

2.3.2 Роль факторов УЕвР, РЕОБ и РРЮ2 в патогенезе возрастной макулярной дегенерации и их взаимодействие между собой.

2.3.3 Гипоксия и окислительный стресс в патогенезе возрастной макулярной дегенерации.

2.4 Потенциал антиоксидантов в профилактике/лечении возрастной макулярной дегенерации.

2.4.1 Антиоксиданты адресованные в митохондрии — новый класс биологически активных молекул.

2.5 Биологические модели возрастной макулярной дегенерации.

2.5.1 Крысы линии OXYS как модель преждевременного старения и связанных с ним заболеваний.

3. Материалы и методы.

3.1 Животные и схема экспериментов.:.

3.2 Оборудование.

3.3 Офтальмологические осмотры исследуемых животных.

3.4 Забор сетчатки и хранение материала.

3.5 Выделение РНК из ткани сетчатки.

3.6 Электрофорез РНК в агарозном геле.

3.7 Очистка образцов РНК методом ДНКазной обработки.

3.8 Реакция обратной транскрипции для получения кДНК.

3.9 Приготовление смеси «стандартной» кДНК.

3.10 Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR) для определения уровня мРНК исследуемых генов.

3.11 Выделение общего белка сетчатки для Вестерн блот (Western blot).

3.12 Выделение белка для иммуноферментного анализа ELISA.

3.13 Проведения Вестерн блот анализа.

3.14 Проведение иммуноферментного анализа ELISA.

3.15 Гистологический и морфометрический анализ сетчаток.

3.16 Статистический анализ результатов.

4. Результаты.

4.1 Исследование возрастных изменений сетчатки крыс OXYS и Wistar.

4.1.1 Офтальмологическая характеристика сетчатки крыс OXYS в возрасте от 20 дней до 24 месяцев.

4.1.2 Морфологический анализ сетчатки крыс ОХУ8 в возрасте от 20 дней до 24 месяцев.

4.1.2.1 Морфометрический анализ клеток ретинального пигментного эпителия и сосудов хориоидеи сетчатки крыс ОХУ8 и \Vistar в возрасте от 20 дней до 24 месяцев.

4.1.3 Уровень мРНК и содержание белка гена У

§[а в сетчатке крыс ОХУЭ и \Vistar в возрасте от 20 дней до 24 месяцев.

4.1.4 Уровень мРНК в возрасте от 20 дней до 24 месяцев и содержание белка гена Рес1/в возрасте от 20 дней до 12 месяцев сетчатке крыс ОХУ8 и \Vistar.

4.1.5 Уровень мРНК гена Ркс12 в сетчатке крыс ОХУ8 и Wistar в возрасте от 20 дней до 12 месяцев.

4.2 Исследование эффектов антиоксиданта ЭкСН на сетчатку крыс \Vistar и

ОХУБ.

4.2.1 Профилактическое применение БкС)1 с кормом.

4.2.1.1 Офтальмологическая характеристика сетчатки крыс ОХУ8 до и после курса антиоксиданта 8к(^1 с кормом.

4.2.1.2 Уровень мРНК и содержание белка гена Уе%[а в сетчатке крыс ОХУ8 и \Vistar после курса 8кС>1 с кормом в возрасте 3 месяцев.

4.2.1.3 Уровень мРНК и содержание белка гена Реав сетчатке крыс ОХУ8 и \Vistar после курса 8кС> 1 с кормом в возрасте 3 месяцев.

4.2.1.4 Уровень мРНК гена Ркс12 в сетчатке крыс ОХУ8 и "^^аг после курса 8кС>1 с кормом в возрасте 3 месяцев.!.

4.2.2 Лечебное применение глазных капель БкСН.

4.2.2.1 Офтальмологическая характеристика сетчатки крыс ОХУБ до и после курса капель 8кС21.

4.2.2.2 Уровень мРНК и содержание белка гена в сетчатке крыс ОХУ8 и \Vistar после курса капель 8к<31 в возрасте 12 месяцев.

4.2.2.3 Уровень мРНК гена Реау в сетчатке крыс ОХУ8 и 'й^аг после курса капель 8кС>1 в возрасте 12 месяцев.

4.2.2.4 Уровень мРНК гена Ркй2 в сетчатке крыс ОХУЭ и \Vistar после курса капель БкС) 1 в возрасте 12 месяцев.

4.2.3 Содержание белка гена в сетчатке крыс ОХУ8 и \У1з1аг после курса БкСН с кормом в возрасте 25 месяцев.

5. Обсуждение результатов.

5.1 Профиль экспрессии генов Уе%[а и Ре<1/ и развитие ретинопатии у крыс { ОХУБ.

5.2 Связь системы регуляции кислородного гомеостаза с изменениями экспрессии генов Уе^а и Ре<Л/у крыс ОХУ

5.3 Связь профилактических эффектов приёма 8кС>1 с кормом с его влиянием на экспрессию генов Уе%[а, РеаУ и Ркс12 в сетчатке

5.4 Связь терапевтических эффектов глазных капель 8кС)1 с его влиянием на экспрессию генов Уе%[а, Рес$и Ркс12 в сетчатке.

6. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Возрастные изменения экспресии генов VEGFA и PEDF при развитии дистрофии сетчатки у крыс OXYS"

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) становится основной причиной нарушения и потери зрения у людей старше 50 лет в развитых странах. Количество больных ВМД растет на фоне увеличения продолжительности жизни людей и по прогнозам к 2020 года их количество удвоится (Friedman et al., 2004). В России, по разным данным, ВМД страдает от 14 до 46% населения в возрасте старше 65 лет (Либман, 2006). Выбор способов лечения ограничен, поскольку этиология и патогенез ВМД до конца не выяснены. Наряду с возрастной зависимостью прослеживается генетическая составляющая ВМД и влияние на её развитие факторов внешней среды. Значительное количество вовлеченных в развитие ВМД генов и симптомы, характерные и для других комплексных заболеваний, усложняют диагностику. В основе патогенеза ВМД лежат характерные для старения изменения хориокапилляров, ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и мембраны Бруха, но механизмы, запускающие переход обычных возрастных изменений в патологический процесс, не известны.

Развитие ВМД связано с гипоксией и воспалением (Feigl, 2007, 2009). В качестве основного повреждающего звена при этом выступает окислительный стресс - нарушение баланса в системах генерации и детоксикации активных форм кислорода (АФК). Клинические проявления сильно зависят от формы ВМД: при «сухой» - зоны атрофии клеток РПЭ и фоторецепторов, наличие депозитов веществ в сетчатке; при «влажной» - отеки, кровоизлияния, рост новых сосудов или неоваскуляризация и отслойка пигментного эпителия, которые приводят к гибели фоторецепторов и потере зрения.

Растёт количество аргументов в пользу того, что ключевую роль в развитии заболевания играют повреждения клеток РПЭ в силу множества выполняемых ими функций и уникального расположения во внешней сетчатке (Strauss, 2005, Bonilha, 2008). Клетки РПЭ секретируют множество ростовых факторов, в том числе - эндотелиальный фактор роста A (vascular endothelial grows factor A- VEGF-A, далее VEGF) - главный ангиогенный фактор в сетчатке. Именно с повышенным уровнем VEGF связано развитие неоваскуляризации (главной причины потери зрения при ВМД) на поздних стадиях заболевания, а ингибиторы VEGF подавляют процесс патологического роста сосудов. Усиление экспрессии гена Vegfa на поздних стадиях заболевания вызывают гипоксия и воспаление, играющие ключевую роль в патогенезе ВМД. Однако экспрессия этого гена и его участие в развитии ранних стадиях заболевания остаются плохо исследованными. Основным антагонистом VEGF в сетчатке является фактор пигментного эпителия (pigment-epithelium derived factor — PEDF), также секретируемый клетками РПЭ и обладающий ангиостатическими и нейротрофическим свойствами. Гипоксия является основным регулятором экспрессии гена VEGF через фактор транскрипции HIF-1а, стабильность которого определяет пролил гидроксилаза 2 (prolyl hyxroxylases 2 —PHD-2) - молекулярный сенсор напряжения кислорода в тканях (Ferrara, 2008). На сегодня вклад изменений экспрессии генов этих ключевых регуляторов ангиогенеза (VEGF, PEDF, PHD2) в процессе нормального физиологичного старения и тем более в развитие ВМД, особенно на ранних стадиях, остаётся до конца не ясным в силу сложности проведения таких исследований на людях.

Создание биологических моделей заболеваний человека - один из подходов к выяснению их этиологии и патогенеза, к разработке новых способов лечения. В последние годы получены убедительные аргументы в пользу того, что моделью ВМД может стать созданная ( в ИЦиГ СО РАН генетическая модель преждевременного старения - линия крыс ОХУЭ. Животные наследуют синдром преждевременного старения, в том числе - ретинопатию, по клиническим проявлениям аналогичную ВМД у людей. Для доказательства соответствия адекватности модели необходимо установить молекулярные основы развития ретинопатии.

Максимально полная характеристика линии крыс ОХУЭ как модели ВМД имеет как фундаментальное, так и- прикладное значение. Её использование позволит исследовать патогенез заболевания, анализ генетически детерминированных особенностей его течения и давать объективную оценку эффективности новых способов лечения. Примером успешного использования крыс ОХУЭ в тестировании фармакологических препаратов явилось выявление уникального терапевтического потенциала соединения принципиально нового класса - антиоксиданта, способного проникать и накапливаться в митохондриях - пластохинонил-децил-трифенилфосфония (ЭкСН, Скулачев, 2007, №гоеу et а1., 2008). Соединение уже используется в ветеринарии в форме глазных капель, проводятся его клинические испытания, однако молекулярные механизмы действия 8кС>1 не изучены.

Цель настоящей работы - исследование связи развития ретинопатии у крыс ОХУ8 с изменениями экспрессии генов Уе%[а^ Реаи Ркс1-2 в тканях глазного дна и влияния на неё митохондриального антиоксиданта

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Провести сравнение паттернов экспрессии генов Уе%/а, РейУ и РЪ(1-2 в тканях глазного дна крыс ОХУ8 и \\%1аг разного возраста. I

2. Сопоставить изменения экспрессии генов Уе^а, Рес1[ и Ркс1-2 с морфологическими изменения хориоретирального комплекса сетчатки крыс ОХУБ.

3. Исследовать возможную связь развития ретинопатии у крыс ОХУ8 с изменениями экспрессии генов Уе^а, Реаи РЫ-2.

4. Изучить влияние митохондриального антиоксиданта 8к(21 на уровень экспрессии генов Уе%[аь Рес§ и Рк(1-2 в тканях глазного дна крыс ОХУБ.

2. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Марковец, Антон Михайлович

6. Выводы

Из результатов проделанной работы могут быть сделаны следующие выводы:

1. Впервые проведено сравнение возрастных изменений экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 в сетчатке крыс Wistar и OXYS и выявлены генетически детерминированные различия, ассоциированные с развитием ретинопатии, нарушением регуляции кислородного гомеостаза и ответа на развивающуюся сетчатке крыс OXYS гипоксию.

2. Установлено, что в развитии у крыс OXYS ретинопатии участвуют те же структуры сетчатки и молекулярно-генетические факторы, что и при возрастной макулярной дегенерации у людей, при этом направленность изменений экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 и их вклад в развитие патологических изменений зависит от стадии заболевания.

3. Доклинические изменения сетчатки крыс OXYS происходят с возраста 20 дней на фоне характерного для острой гипоксии увеличения уровня мРНК гена Phd-2 и снижения площади клеток ретинального пигментного эпителия при отсутствии отличий в уровне мРНК и белков генов Vegfa и Pedf в сравнении с крысами Wistar

4. Развитие ранних стадий ретинопатии у подавляющего большинства крыс OXYS происходит к возрасту 3-х месяцев на фоне значительного снижения уровня мРНК генов Vegfa' и Pedf и содержания их белковых продуктов и характерного для хронической гипоксии снижения уровня мРНК гена Phd-2

5. Развитие выраженных стадий ретинопатии у крыс OXYS про-исходит с 12 месяцев на фоне не отличающегося от крыс Wistar уровня мРНК генов Vegfa и Pedf, а содержание белка Vegfa и уро-вень мРНК гена Phd-2. снижены, что указывает на нарушение регуляции кислородного гомеостаза и ответа на развивающуюся в сетчатке крыс OXYS гипоксию.

6. Показано, что характер изменения паттерна экспрессии генов Vegfa, Pedf и Phd-2 в сетчатке под влиянием митохондриального антиоксиданта SkQl у крыс Wistar и OXYS различен, при этом масштабы и направленность его изменений зависят от возраста животных, а терапевтический эффект в отношении ретинопатии у крыс OXYS связан с нормализацией экспрессии этих генов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марковец, Антон Михайлович, Новосибирск

1. Астахов Ю.С., Даль Н.Ю. Новые возможности в лечении неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации // Российский- офтальмологический журнал. -2008. -№1.- С. 52-55.

2. Колосова Н.Г., Фурсова А.Ж., Лебедев П.А., Гусаревич О.Г. Макулодистрофия и катарактогенез у преждевременно стареющих крыс OXYS, их связь с окислительным стрессом. // Офтальмологический журнал. 2004. -№ 2(397). - С. 28-32.

3. Колосова, Н., Лебедев, П., Фурсова, А., Морозкова, Т., Гусаревич, О. Преждевременно стареющие крысы OXYS как модель сенильной катаракты человека // Успехи геронтологии. 2003. -Т. 12. - С. 143-148.

4. Либман Е.С., Толмачев P.A., Шахова Е.В. Эпидемиологические характеристики инвалидности вследствие основных форм макулопатий //

5. Тезисы докл. II Всеросс. Семинара «круглый стол» - Макула. 2006. Ростов-на-Дону. С. 15-21.

6. Меныцикова Е., Шабалина И., Зенков Н., Колосова Н. Генерацияактивированных кислородных метаболитов митохондриями преждевременно стареющих крыс OXYS // Бюлл. эксперим. биол. 2002. - Т. 133. - № 2. -С.207-210.

7. Нероев В.В., М.В. Рябина, K.P. Чиковани, Н.В. Нероева. Современные представления и подходы к лечению возрастной макулярной дегенерации // Российский офтальмологический журнал. 2008. - №1. - С. 6-9.

8. Орловская И., Топоркова Л., Феофанова Н., Колосова Н. Особенности костномозгового гемопоэза у преждевременно стареющих крыс OXYS // Бюлл. эксп. биол. 2007. - Т. 144. - № 4. - С. 96-99.

9. Сапрунова В.Б. Ультраструктура митохондрий в условиях окислительного стресса: Дис. док. биол. наук. Москва. 2008. 262 с.

10. Северин Ф.Ф., Скулачев В.П. Запрограммированная клеточная смерть как мишень борьбы со старением организма // Успехи геронтологии. 2009. - Т. 22. — №1. - С. 37-48.

11. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. М.: Наука, 1989.

12. Скулачев, В. Попытка биохимиков атаковать проблему старения: «мегапроект» по проникающим ионам, первые итоги и перспективы. // Биохимия. 2007. - Т. 72. - № 12. - С. 1700 - 1714.

13. Соловьева Н.А., Морозкова Т.С., Салганик Р.И. Получение сублинии крыс с признаками наследственной галактоземии и исследование их биохимических особенностей // Генетика, 1975. - Т.18. -N 5. - С.63-71.

14. Фурсова А.Ж., Гусаревич О.Г., Гончар A.M. и др. Экстракт черники вiпрофилактике макулярной дегенерации и катаракты у крыс OXYS /-// Успехи геронтологии. — 2005. — Вып. 16. — С. 76-79.

15. Allikmets, R., Singh, N., Sun, H., Shroyer, N.F., Hutchinson, A., Chidambaram, A., et al. A photoreceptor cell-specific ATPbinding transporter gene (ABCR) is mutated in recessive Stargardt macular dystrophy // Nat. Genet. 1997. -Vol. 15.-P. 236-246.

16. Alon T, Hemo I, Itin A, Pe'er J, Stone J, Keshet E. Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity // Nat Med. 1995. - Vol. 1. - P. 1024-1028.

17. Amaral J, Becerra SP. Effects of human recombinant PEDF protein and PEDF-derived peptide 34-mer on choroidal neovascularization // Invest Ophthalmol Vis Sei. -2010.-Vol. 51(3).-P. 1318-26.

18. Amol D., Kuppermann D. Wet age-related macular degeneration // Advanced Drug Delivery Reviews. 2005. - Vol. 57 -1. 14. - P. 1994-2009.

19. Anderson, D., Mullins, R., Hageman, G., Johnson, L. A role for local inflammation in the formation of drusen in the aging eye // Am J Ophthalmol. 2002. -Vol. 134.-P. 411-431.

20. SkQl prolongs lifespan and prevents development of traits of senescence // Biochemistry (Mosc). 2008. - Vol. 73(12). - P. 1329-1342.

21. Aranha MM, Santos DM, Xavier JM, Low WC, Steer CJ,4'5 Sola S, Rodrigues CMP. Apoptosis-associate'd microRNAs are modulated in mouse, rat and human neural differentiation // BMC Genomics. -2010.- Vol. 11. P. 514

22. Azarian, S., Travis, G. The photoreceptor rim protein is an ABC transporter encoded by the gene for recessive Stargardt's disease (ABCR). // FEBS Lett. 1997. -Vol. 409.-P. 247-252.

23. Bakeeva L.E., Barskov IV, Egorov MV, Isaev NK, Kapelko VI, Kazachenko1. N.

24. Barron, M., Johnson, M., Andrews, R., Clarke, M., Griffiths, P., Bristow, E., He, L., Durham, S., Turnbull, D. Mitochondrial abnormalities in ageing macular photoreceptors. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001. - Vol. 42. - P. 3016-3022.

25. Becerra, S. Focus on molecules: Pigment epithelium-derived factor (PEDF) // Experimental Eye Research. 2006. - V. 82. - N 5. - P. 739-740.

26. Binder S., Stanzel V, Krebs I., Glittenberg C. Transplantation of the RPE in AMD. // Prog Retin Eye Res. 2007. - N 5. - P. 516-54.

27. Bobko A., Sergeeva S., Bagryanskaya E., Markel A., Khramtsov V., Reznikov V., Kolosova N. 19F NMR measurements of NO production in hypertensive ISIAHand OXYS rats // Biochem Biophys Res Commun. 2005. - Vol. 330(2). - P. 36770.

28. Bonilha VL. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clin Ophthalmol. 2008. - Vol. 2. - P. 413-424.

29. Bonnel S, Mohand-Said, Sahel. THE AGING OF THE RETINA //Experimental Gerontology. 2003. - V. 38. -N. 8. - P. 825-831

30. Bouck N. PEDF: anti-angiogenic guardian of ocular function // Trends Mol Medio 2002. - Vol. 8. - P. 330-334.

31. Burns RJ., Smith RA., Murphy MP. Synthesis and characterization of thiobutyltriphenylphosphonium bromide, a novel thiol reagent targeted to the mitochondrial matrix // Arch Biochem Biophys. 1995. - Vol. 322(1). - P. 60-68.

32. Cai J, Jiang W, Grant MB, Boulton M. Pigment epithelium-derived factoriinhibits angiogenesis via regulated intracellular proteolysis of VEGFR-1 // J Biol Chem 2006. - Vol. 281. - N. 3604-3613.

33. Chen J, Connor K, Smith L. Overstaying their welcome: defective CX3CR1 microglia eyed in macular degeneration. // J Clin Invest. 2007. - N 117(10). -P. 2758-2762.

34. Chen J, Fitzke F, Bird A. Functional loss in age-related Bruch's membrane change with choroidal perfusion defect. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1992. - Vol. 33.-P. 334-340.

35. Chong E, Wong T, Kreis A, Simpson J, Guymer R. Dietary antioxidants and primary prevention of age related macular degeneration: systematic review and metaanalysis. // BMJ. 2007. - N 335(7623). - P. 755.

36. Churchill A, Carter J, Lovell H, Ramsden C, Turner SJ, Yeung A, Escardo J, Atan D. VEGF polymorphisms are associated with neovascular age-related macular degeneration // Hum Mol Genet. 2006. - N 15. - P. 2955-2961.

37. Cousins S, Espinosa-Heidmann D, Alexandridou A, Sail J, Dubovy S, Csaky K. The role of aging, high fat diet and blue light exposure in an experimental mouse model for basal laminar deposit formation // Exp Eye Res. 2002. - Vol. 75. - P. 543-553.

38. Cousins S, Marin-Castano M, Espinosa-Heidmann D, Alexandridou A, Striker L, Elliot S. Female gender, estrogen loss, and Sub-RPE deposit formation in aged mice // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003.- Vol. 44. - P. 1221-1229.

39. Crabb J, Miyagi M, Gu X., Shadrach K., West K, Sakeguchi H, Karnei M, et al. Drusen proteome analysis: an approach to the etiology of age-related macular degeneration. // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. - N 99. - P. 14682-14687.

40. Cruickshanks K, Klein R, Klein B. Sunlight and agerelated macular degeneration: the Beaver Dam Eye Study. // Arch. Ophthalmol.'- 1993. N 111. - P. 514-518.

41. D'Angelo G, Duplan E, Boyer N, Vigne P, Frelin C. Hypoxia up-regulates prolyl hydroxylase activity: a feedback mechanism that limits HIF-1 responses during reoxygenation // J Biol Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 38183-38187

42. Dawson DW, Volpert OV, Gillis P, Crawford SE, Xu H, Benedict W, Bouck

43. Dewan A, Liu M, Hartman S, Zhang SS, Liu DT, Zhao C, Tam PO, Chan WM,1.m DS, Snyder M, Barnstable C, Pang CP, Hoh J. HTRA1 promoter polymorphism in wet age-related macular degeneration // Science. 2006. - Vol. 314. - P. 989-992.

44. Ding X, Patel M, Chan C. Molecular pathology of age-related macular degeneration // Prog Retin Eye Res. 2009. - Vol. 28. - P. 1-18.

45. Donoso L, Kim D, Frost A, Callahan A, Hageman G. The Role of Inflammation in the Pathogenesis of Age-related Macular Degeneration // SURVEY OF OPHTHALMOLOGY. -2006. -N 51(2)-P. 137-152.

46. Drazins P, Mitchell P, Heller R. Sun exposure and agerelated macular degeneration: an Australian case-control study // Ophthalmology. 1997. - N 104. -P. 770-776.

47. Duan LJ, Takeda K, Fong GH. Prolyl Hydroxylase Domain Protein 2y(PHD2) Mediates Oxygen-Induced Retinopathy in Neonatal Mice // Am J Pathol. 2011. -Vol. 178(4).-P. 1881-90.

48. Edwards A, Ritter I, Abel K, Manning A, Panhuysen C, Farrer L. Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration. // Science. 2005. - N 308.-P. 421-424.

49. Ehrlich R., Harris A., ICheradiya N.S., Winston D.M., Ciulla T.A., Wirostko B. Age-related macular degeneration and the aging eye // Clin Interv Aging. 2008. -N. 3(3).-P. 473-82.

50. Ek ET, Dass CR, Choong PF. Pigment epithelium-derived factor: a multimodal tumor inhibitor // Mol Cancer Ther. 2006. - Vol. 5(7). - P. 1641-1646.

51. Evans J. Risk factors for age-related macular degeneration. // Prog Retin Eye Res. 2001. - N 20. - P. 227-253.

52. Feher J, Kovacs 1,/Artico M, Cavallotti C, Papale A, Balacco G. Mitochondrial alterations of retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration // Neurobiol Aging. 2006. - N 27(7). - P. 983-93.

53. Feigl B. Age-related maculopathy linking aetiology and pathophysiological changes to the ischaemia hypothesis // Prog Retin Eye Res. - 2009. - Vol. 28(1). - P. 63-86.

54. Feigl B. Age-related maculopathy in the light of ischaemia. Clin Exp Optom. 2007 Jul;90(4):263-71.

55. Ferrara N, Gerber H, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptor // Nat Med. 2003. - Vol. 9. P. 669-676.

56. Ferrara N. Vascular endothelial growth factor: molecular and biological aspects // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1999. -N. 237. - P. 1-30.

57. Filleur S, Nelius T, de Riese W, Kennedy RC. Characterization of PEDF: a multi-functional serpin family protein // J Cell Biochem. 2009. - Vol. 106(5). - P. 769-75.

58. Fong G-H. Regulation of angiogenesis by oxygen sensing mechanisms // Journal of Molecular Medicine. 2009. - Vol. 87(6). - P. 549-60.

59. Fursova AZh, Gusarevich OG, Gonchar AM, Kolosova NG. Experience of application of bilberry preparation for treatment of central chorioretinal degeneration // Bulletin of the SB RAMS. 2007. - Vol. 1. - P. 92-96.

60. Gale C, Hall N, Phillips D, Martyn C. Lutein and zeaxanthin status and risk of age-related macular degeneration // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. - Vol. 44. -P. 2461-2465.

61. Goverdhan S, Howell M, Mullins R, Osmond C, Hodgkins P, Self J, Avery K, Lotery AJ. Association of HLA Class I and Class II polymorphisms with age-related macular degeneration. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005. - N 46(5). - P. 17261734.

62. Grisanti S., Tatar O. The role of vascular endothelial growth factor and other endogenous interplayers in age-related macular degeneration // Progress in Retinal and Eye Research. 2008. - N. 27. - P. 372-390.

63. Guo L, Hussain AA, Limb GA, Marshall J. Age-dependent variation in metalloproteinase activity of isolated human Bruch's membrane and choroid // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999. - Vol. 40(11). - P. 2676-82.

64. Haddad S, Chen C, Santangelo S, Seddon J. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. // Surv Ophthalmol. 2006. - N 51(4).-P. 316-363.

65. Han D, Ybanez MD, Ahmadi S, Yeh K, Kaplowitz N. Redox Regulation of Tumor Necrosis Factor Signaling // Antioxid Redox Signal. 2009. - Vol. 11(9). - P. 2245-2263.

66. Harman D. The aging process // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1981. - N 78. -P. 7124-7128.

67. Hayashi A, Majji AB, Fujioka S, Kim HC, Fukushima I, de Juan E Jr. Surgically induced degeneration and regeneration of the choriocapillaris in rabbit // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1999. - Vol. 237(8). - P. 668-677.

68. He Y, Tombran-Tink J. Mitochondrial Decay and Impairment of Antioxidant Defenses in Aging RPE Cells // Adv Exp Med Biol. 2010. - Vol. 664. - P. 165-183.

69. Hejtmancik JF, Kantorow M, Iwata T. Models of Age-Related Vision Problem. In: Conn PM, editor. Handbook of Models for Human Aging. / Elsevier Academic Press; London, 2006. P. 813-828.

70. Hendrik P, Scholl M, Charbel P, Keilhauer C, Holz F, Weber B. An update on the genetics of age-related macular degeneration // Molecular Vision. — 2007. N 13. -P. 196-205.

71. Heriot WJ, Machemer R. Pigment epithelial repair // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1992. - Vol. 230. - P. 91-100.

72. Hou DX. Potential mechanisms of cancer chemoprevention by anthocyanins // Curr. Mol. Med. — 2003. — Vol. 3. — N 2. — P. 149-159.93. http://evephoto.ophth.wisc.edu

73. Hyman L, Schachat AP, He Q, Leske MC. Hypertension, cardiovascular disease, and age-related macular degeneration: Age-Related Macular Degeneration Risk Factors Study Group // Arch Ophthalmol. 2000. - Vol. 118. - P. 351-358.

74. Ivert L, Kong J, Gouras P. Changes in the choroidal circulation of rabbit following RPE removal // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2003. - Vol. 241. -P. 656-666.

75. Jakobsdottir J, Conley YP, Weeks DE, Mah TS, Ferrell -RE, Gorin MB. Susceptibility genes for age-related maculopathy on chromosome 10q26 // Am J Hum Genet. 2005. - Vol. 77. - P. 389-407.

76. Johnson EJ. Age-related macular degeneration and antioxidant vitamins: recent findings // Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2010. - Vol. 13(1). - P. 28-33.

77. Jones B, Marc R. Retinal remodeling during retinal degeneration. // Experimental Eye Research. 2005. - N 81. - P. 123-137.

78. Keisuke M, Gehlbach P, Yamamoto S, Duh E, Zack D, Li Q, Berns K, Raisler

79. B, Hauswirth W, Campochiaro P. AAV-Mediated Gene Transfer of Pigment

80. Epithelium-Derived Factor Inhibits Choroidal Neovascularization. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002. - N 43(6). - P. 1994-2000.

81. Kevany BM, Palczewski K. Phagocytosis of Retinal Rod and Cone Photoreceptors // Physiology (Bethesda). 2010. - Vol. 25(1). - P. 8-15.

82. Kijlstra A, La Heij E, Hendrikse F. Immunological factors in the pathogenesis and treatment of age-related macular degeneration. // Ocul Immunol Inflam. 2005. -N13.-P. 3-11.

83. King A, Gottlieb E, Brooks DG, Murphy MP, Dunaief J.L. Mitochondria-derived reactive oxygen species mediate blue light-induced death of retinal pigment epithelial cells // Photochem Photobiol. 2004. - N. 79(5). - P. 470-475.

84. Klaver C, Kliffen M, van Duijn C, Hofman A, Cruts M, Grobbee D, van Broeckhoven C, de Jong PT. Genetic association of apolipoprotein E with age-related macular degeneration. // Am J Hum Genet. 1998. - N 63(1). - P. 200-206.

85. Klein M, Francis P. Genetics of age-related macular degeneration // Ophthalmol Clin North Am. 2003. - N 16(4). - P. 567-574.

86. Klein ML, Francis PJ, Rosner B, Reynolds R, Hamon SC, Schultz DW, Ott J, Seddon JM. CFH and LOC387715/ARMS2' genotypes and treatment with antioxidants and zinc for age-related macular degeneration // Ophthalmology. — 2008. -Vol. 115(6).-P. 1019-1025.

87. Klein R, Klein B, Linton R, Demets D. The Beaver Dam Eye Study: the relation of age-related maculopathy to smoking. // Am. J. Epidemiol. 1993. - N 137.-P. 190-200.

88. Klein R, Zeiss C, Chew E, Tsai J, Sackler R, Haynes C, Henning AK,r

89. SanGiovanni JP, Mane SM, Mayne ST, Bracken MB, Ferris FL, Ott J, Barnstable C, Hoh J. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration // Science. 2005. - N 308. - P. 385-389.

90. Klein R. Overview of progress in the epidemiology of age-related macular degeneration // Ophthalmic Epidemiol. 2007. - N. 14. - P. 184-187.

91. Kliffen H, Sharma C, Mooy S, Kerkvliet P, T V M de Jong. Increased expression of angiogenic growth factors in age-related maculopathy // M. Br J Ophthalmol. 1997. - Vol. 81(2). - P. 154-162.

92. Kolosova N, Shcheglova T, Sergeeva S, Loskutova L. Long-term antioxidant supplementation attenuates oxidative stress markers and cognitive deficits in senescent-accelerated OXYS rats. // Neurobiology of Aging. 2006. - N 27(9). - P. 1289-1297.

93. Kolosova NG, Aidagulova SV, Nepomnyashchikh GI, Shabalina IG, Shalbueva N1. Dynamics of structural and functional changes in hepatocyte mitochondria of senescence-accelerated OXYS rats // Bull Exp Biol Med. 2001. -Vol. 132(2).-P. 814-819.

94. Korshunov SS, Skulachev VP, Starkov AA. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria // FEBS Lett. -1997.-Vol. 416.-P. 15-18.

95. Korte GE, Repucci V, Henkind P. RPE destruction causes choriocapillary atrophy // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1984. - Vol. 25. - P. 1135-1145.

96. Kruk J, Jamiola-Rzeminska M, Stralka K. Plastoquinol and alpha-tocopherol quinol are more active than ubiqinol and alpha-tocopherol in inhibition of lipid peroxidation // Chem. Phys. Lipids. 1997. - Vol. 87. - P. 73-80. "

97. Kunsch Charles, Medford Russell M. Oxidative Stress as a Regulator of Gene Expression in the Vasculature. Circulation Research. 1999;85:753-766

98. Leonard DS, Sugino IK, Zhang XG, et al. Ultrastructural analysis of hydraulic and abrasive retinal pigment epithelial cell debridements // Exp Eye Res. 2003. -Vol. 76.-P. 473^91.

99. Leonard DS, Zhang XG, Panozzo G, Sugino IK, Zarbin MA. Clinicopathologic correlation of localized retinal pigment epithelium debridement // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997. - Vol. 38. - P. 1094-/700.

100. Li G, Hussain AA, Limb GA, Marshall J. Age-Dependent Variation int

101. Metalloproteinase Activity of Isolated Human Bruch's Membrane and Choroid // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1999. - Vol. 40. -N. 11. - P. 2676-2682.

102. Liang F, Godley B. Oxidative stress-induced mitochondrial DNA damage in human retinal pigment epithelial cells: a possible mechanism for RPE aging and age-related macular degeneration // Experimental Eye Research. 2003. - N 76. - P. 397-403.

103. Liberman E, Topali V, Tsofina L, Jasaitis A, Skulachev V. Mechanisms of coupling of oxidative phosphorylation and the membrane potential of mitochondria // Nature.- 1969.-N222.-P. 1076-1078.

104. Lip P, Blann A, Hope-Ross M, Gibson J, Lip G. Age-related macular degeneration is associated with increased vascular endothelial growth factor,hemorheology and endothelial dysfunction // Ophthalmology. 2001. N. 108. P. 705-710.

105. Lombardero M, Vidal S, Hurta R, Román A, Kovacs K, Lloyd RV, Scheithauer BW. Modulation of VEGF/Flk-1 receptor expression in the rat pituitary GH3 cell line by growth factors // Pituitary. 2006. - Vol. 9(2). - P. 137-143.

106. Majji A, Cao J, Chang K, Hayashi A, Aggarwal S, Grebe RR, De Juan E Jr. Age-related retinal pigment epithelium and Bruch's membrane degeneration in senescence-accelerated mouse // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000. - N 41. - P. 3936-3942.

107. Mannermaa E. In vitro Model of Retinal Pigment Epithelium for Use in Drug Delivery Studies. Publications of the University of Eastern Finland. Dissertations in Health Sciences. 2010.

108. Markovets AM, Saprunova VB, Zhdankina AA, Fursova AZn, Bakeeva LE, KolosovaNG. Alterations of retinal pigment epithelium cause AMD-like retinopathy in senescence-accelerated OXYS rats // Aging (Albany NY). 2011. - Vol. 3(1). - P. 44-54.

109. Marsili S, Salganik RI, Albright CD, Freel CD, Johnsen S, Peiffer RL, Costello MJ. Cataract formation in a strain of rats selected for high oxidative stress // Exp Eye Res. 2004. - Vol. 79(5). - P. 595-612.

110. McLeod DS, Grebe R, Bhutto I, Merges C, Baba T, Lutty GA. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009. - Vol. 50. - P. 4982-4991.

111. Metzen E, Stiehl DP, Doege K, Marxsen JH, Hellwig-Burgel T, Jelkmann W. Regulation of the prolyl hydroxylase domain protein 2 (phd2/egln-l) gene: identification of a functional hypoxia-responsive element // Biochem J. 2005. -Vol. 387.-P. 711-717.

112. Meyers S. A twin study on age-related macularclegeneration. // Trans Am Ophthalmol Soc. 1994. - N 92. - P. 775-843.

113. Miquel J. An update on the mitochondrial-DNA mutation hypothesis of cell aging. // Mutation Research. 1992. - N 275. - P. 209-216.

114. Nakajima JI, Tanaka I, Seo S, Yamazaki M, Saito K. LC/PDA/ESI-MS Profiling and Radical Scavenging Activity of Anthocyanins in Various // J. Biomed. Biotechnol. — 2004. — Vol 5. — P. 241 -247.

115. Ndubuizu OI, Chavez JC, LaManna JC. Increased prolyl 4-hydroxylase expression and differential regulation of hypoxia-inducible factors in the aged rat brain // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2009. - Vol. 297(1). - P. R158-R165.

116. Neroev V.V., Archipova MM, Bakeeva LE, Fursova AZh, Grigorian EN,

117. Nolan T, Hands R, Bustin S. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR //Nature protocols. 2006. - V. 1.-N3.--P. 1560-1581.

118. Nowak J. Age-related macular degeneration (AMD): pathogenesis and therapy // Pharmacological Reports. 2006. - N 58. - P. 353-363.

119. Obuhova LA, Skulachev VP, Kolosova NG. Mitochondria-targeted antioxidant SkQl inhibits age-dependent involution of the thymus in normal and senescence-prone rats // Aging. 2009. - V. 1. - P. 389-401.

120. Pang Iok-Hou, Clark Abbot F. Animal Models for Retinal Diseases. Humana Press. 2010 (Книга)

121. Papaconstantinou J. Insulin/IGF-1 and ROS signaling pathway cross-talk in aging and longevity determination // Mol Cell Endocrinol. 2009. - Vol. 299(1). - P. 89-100.

122. Patel N, Adewoyin T, Chong N. Age-related macular degeneration: a perspective on genetic studies. // Nature Eye. 2008. - Vol. 22(6). - 768-776.

123. Penfold P, Liew S, Madigan M, Pro vis J. Modulation of major histocompatibility complex class II expression in retinas with age-related macular degeneration // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1997. -N 38(10). - P. 2125-2133.

124. Perez-Mediavilla LA, Chew C, Campochiaro PA, Nickells RW, Notario V, Zack DJ, Becerra SP. Sequence and expression analysis of bovine pigment epithelium-derived factor // Biochim Biophys Acta. 1998. - Vol. 1398. - P. 203214.

125. Piehl L, Capania F, Facorro G, Lopez E, Rubin de Celis E, Hagerb P, Coirini

126. H, Lopez-Costa J. Nitric oxide increases in the rat retina after continuous illuminationi

127. Brain Res. 2007. - N 2. - P. 1156.

128. Pons M, Marín-Castaño ME. Cigarette Smoke-Related Hydroquinone Dysregulates MCP-1, VEGF and PEDF Expression in Retinal Pigment Epithelium in Vitro and in Vivo // PLoS One. 2011. Feb 28;6(2):e 16722. ,

129. Rakoczy P, Zhang D, Robertson T, Barnett NL, Papadimitriou J, Constable IJ, Lai CM. Progressive age-related changes similar to age-related macular degeneration in a transgenic mouse model // Am J Pathol. 2002. - Vol. 181. - P. 1515-1524.

130. Rakoczy P. Meaghan J. Yu S, Chang B, Heckenlively J. Mouse models of age-related macular degeneration // Experimental Eye Research. 2006. - N 82. - P. 741-752.

131. Ramrattan R, van der Schaft T, Mooy C, de Bruijn W, Mulder P, de Jong P. Morphometric analysis of Bruch's membrane, the choriocapillaris, and the choroid in aging // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994. - N 35. - P. 2857-2864.

132. Rat genome database: http://rgd. mew, edu

133. Rattner A, Nathans J. Macular degeneration: recent advances and therapeutic opportunities // Nature. 2006. - Vol. 7. - P. 860-872.

134. Roginsky V, Barsukova T, Loshadkin D, Pliss E. Substituted p-hydroquinones as inhibitor of lipid peroxidation // Chem. Phys. Lipids. 2003. - Vol. 125. - P. 4958.

135. Romero-Calvo I, Ocón B, Martínez-Moya P, Suárez MD, Zarzuelo A, Martinez-Augustin O, de Medina FS. Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots // Anal Biochem. 2010. - Vol. 401(2). -P. 318-320.

136. Rumyantseva YV, Fursova AZh, Fedoseeva LA, Kolosova NG. Changes in physicochemical parameters and alpha-crystallin expression in the lens during cataract development in OXYS rats // Biochemistry (Mosc). 2008. - Vol. 73(11). -P. 1176-82.

137. Saint-Geniez M, Kurihara T, Sekiyama E, Maldonado AE, D'Amore PA. An essential role for RPE-derived soluble VEGF in the maintenance of thechoriocapillaris // Proc Natl Acad Sci USA. 2009. - Vol. 106(44). - P. 1875118756.

138. Saprunova VB, Pilipenlco DI, Alexeevsky AV, Fursova AZh, Kolosovs NG, Bakeeva LE. Lipofuscin granule dynamics during the development of age-related macular degeneration//Biochemistry (Mosc). -2010. Vol. 75. - P. 130-138.

139. Schaumberg D, Hankinson S, Guo Q, Rimm E, Hunter D. A prospective study of 2 major age-related macular degeneration susceptibility alleles and interactions with modifiable risk factors // JAMA. 2007. - N 297(4). - P. 401-402.

140. Schrader W. Age-related macular degeneration: a socioeconomic time bomb in our aging society // Ophthalmologe. 2006. - N 103(9). - P. 742-748.

141. Sergeeva S, Bagryanskaya E, Korbolina E, IColosova N. Development ofbehavioural dysfunctions in accelerated-senescence OXYS rats is associated with early postnatal alterations in brain phosphate metabolism // Exp.Gerontol. 2006.-N41(2).-P. 141-150.

142. Shabalina IG, Kolpakov AR, Solov'ev VN, Kolosova NG, Panin LE. Energy status of rat liver during the dynamics of cold adaptation // Biokhimiia. 1995. -Vol. 60(3).-P. 441-449.

143. Shichiri M, Kato H, Marumo F, Hirata Y. Endothelin-1 as an autocrine/paracrine apoptosis survival factor for endothelial cells // Hypertension. -1997. Vol. 30. - P. 1198-1203.

144. Sivaprasad S, Chong N. The complement system and age-related macular degeneration // Eye. 2006. - N 20(8). - P. 867-872.

145. Smith C.P., Steinle J.J. Changes in growth factor expression in normal aging of the rat retina //Exp Eye Res. 2007. N. 85(6). P. 817-24.

146. Smith W, Assink J, Klein R, Mitchell P, Klaver CC, Klein BE, Hofman A, Jensen S, Wang JJ, de Jong PT. Risk factors for age-related macular degeneration: pooled findings from three continents // Ophthalmology. 2001. - N 108. - P. 697704.

147. Smith W, Mitchell P, Leeder S. Smoking and age-related maculopathy: the Blue Mountain Eye Study // Arch. Ophthalmol. 1996. - N 114. - P. 1518-1523.

148. Smith W. Mitchell P. Family history and age-related maculopathy: the Blue Mountains Eye Study // Aust N Z J Ophthalmol. 1998. - N 26(3). - P. 203-206.

149. Smith, T. Age related macular degeneration. // Australian Family Physician. -2007.-V. 36.-N. 5.

150. Sonoda S, Sreekumar PG, Kase S, Spee C, Ryan SJ, Kannan R, Hinton DR. Attainment of polarity promotes growth factor secretion by retinal pigment epithelial cells: Relevance to age-related macular degeneration // Aging. 2010. — Vol. 2. — P. 28-42.

151. Sparrow J, Boulton M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology // Exp Eye Res. 2005. - N 80. - P. 595-606.

152. Steinle JJ, Sharma S, Chin VC. Normal aging involves altered expression of growth factors in the rat choroid // J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2008. - Vol. 63. -P. 135-140.

153. Strauss O. The retinal pigment epithelium in visual function // Physiol rev. -2005.-N85.-P. 845-881.

154. Takeda K, Cowan A, Fong G-H. Essential Role for Prolyl Hydroxylase Domain Protein 2 in Oxygen Homeostasis of the Adult Vascular System // Circulation. 2007a. - Vol. 116. - P. 774-781.

155. Takeda K, Fong G-H. Prolyl Hydroxylase Domain 2 Protein Suppresses Hypoxia-Induced Endothelial Cell Proliferation // Hypertension. 2007b. - Vol. 49. -P. 178-184.

156. Tan JS, Mitchell P, Smith W, Wang JJ. Cardiovascular risk factors and the long-term incidence of age-related macular degeneration: the Blue Mountains Eye Study // Ophthalmology. 2007. - Vol. 114(6). - P. 1143-1150.

157. Tan JS, Wang JJ, Flood V, Rochtchina E, Smith W, Mitchell P. Dietary antioxidants and the long-term incidence of age-related macular degeneration: the Blue Mountains Eye Study // Ophthalmology. 2008. - Vol. 115(2). - P. 334-41.

158. The VISION 2020. The Right to Sight website, http://www.v2020.org/

159. Tombran-Tink J, Shivaram SM, Chader GJ, Johnson LV, Bok D. Expression, secretion, and age-related downregulation of pigment epithelium-derived factor, a serpin with neurotrophic activity // J Neurosci. 1995. - Vol. 15. - P. 4992-5003.

160. Tong J, Yu-Feng Y. Contribution of VEGF and PEDF to choroidal angiogenesis: A need for balanced expressions // Clinical Biochemistry. 2006. - V. 39.-I. 3.-P. 267-276.

161. Tsai D, Charng M, Lee F, Hsu W, Chen S. Different plasma levels of vascular endothelial growth factor and nitric oxide between patients with choroidal and retinal neovascularization // Ophthalmologica. 2006. - N. 220. - P. 246-251.

162. Tsoumakidou M, Demedts IK, Brusselle GG, JefFery PK. Dendritic cell in chronic obstructive pulmonary disease: new players in an old game //Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2008. - N. 177. - P. 1180-1186.

163. Tuo J, Smith B, Bojanowski C Meleth AD, Gery I, Csaky KG, Chew EY, Chan CC. The involvement of sequence variation and expression of CX3CR1 in the pathogenesis of age-related macular degeneration // FASEB J. 2004. - Vol. 18. - P. 1297-1299.

164. Vingerling JR, Dielemans I, Bots ML, Hofman A, Grobbee DE, de Jong PT. Age-related macular degeneration is associated with atherosclerosis: the Rotterdam Study // Am J Epidemiol. 1995. - Vol. 142. - P. 404-409.

165. Volpert OV, Zaichuk T, Zhou W, et al. Inducer-stimulated Fas targets activated endothelium for destruction by anti-angiogenic thrombospondin-1 and pigment epithelium-derived factor // Nat Med. 2002. - Vol. 8. - P. 349-357.

166. Wang A, Lukas T, Yuan M, Neufeld A. Increased mitochondrial DNA damage and down-regulation of DNA repair enzymes in aged rodent retinal pigment epithelium and choroid // Mol Vis. 2008. - N 14. - P. 644-651.

167. Wang B, Atherton P, Patel R, Manning G, Donnelly R. Antiangiogenic effects and transcriptional regulation of pigment epithelium-derived factor in diabetic retinopathy//Microvasc Res. 2010. - Vol. 80. - P. 31-36.

168. Wang H, Geisen P, Wittchen ES, King B, Burridge K, DAmore PA, Hartnett ME. The role of RPE cell-associated VEGFi89 in choroidal endothelial cell transmigration across the RPE // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011. - Vol. 52(1). -P. 570-578.

169. Warburton S, Southwick K, Hardman R, Secrest A, Grow R, Xin H, Wooley A, Burton GF, Thulin CD. Examining the proteins of functional retinal lipofuscin using analysis as a guide for understanding its origin // Mol Vis. 2005. - N 11. - P. 1122-1134.

170. Watanabe Y, Dvorak HF. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor inhibits anchorage-disruption-induced apoptosis in micro vesselendothelial cells by inducing scaffold formation // Exp Cell Res. 1997. - Vol. 233. -P. 340-349.

171. Winkler BS, Boulton ME, Gottsch JD, Sternberg P. Oxidative damage and age-related macular degeneration // Mol Vis. 1999. - N. 3. - P. 5-32.

172. Witmer A, Vrensen G, Van Noorden C, Schlingemann R. Vascular endothelial growth factors and angiogenesis in eye disease // Retinal and Eye Research. — 2003. -N22.-P. 1-29.

173. Witmer AN, Dai J, Weich HA, Vrensen GF, Schlingemann RO. Expression of vascular endothelial growth factor receptors 1, 2, and 3 in quiescent endothelia // J Histochem Cytochem. 2002. - Vol. 50. - P. 767-777.

174. Wolf S. Current status of anti-vascular endothelial growth factor therapy in Europe // Jpn J Ophthalmol. 2008. - N. 52. - P. 433-439.

175. Zarbin MA. Current concepts in the pathogenesis of age related macular degeneration // Arch Ophthalmol. 2004. - Vol. 122. - P. 598-614.

176. Zhang DX, Gutterman DD. Mitochondrial reactive oxygen species-mediated signaling in endothelial cells // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007. - Vol. 292(5).-P. H2023-H2031.151 ^

177. Zhdankina A, Fursova AZh, Logvinov SV, Kolosova NG. Clinical and Morphological Characteristicsof Chorioretinal Degeneration in Early Aging OXYS Rats // Bull Exp Biol Med. 2008. - Vol. 146. - P. 455-458.

Информация о работе

Марковец, Антон Михайлович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2011
ВАК 03.02.07

Диссертация

Возрастные изменения экспресии генов VEGFA и PEDF при развитии дистрофии сетчатки у крыс OXYS - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы