Возрастная динамика маркеров окислительного стресса у крыс линий WISTAR и OXYS

Саттарова, Евгения Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Возрастная динамика маркеров окислительного стресса у крыс линий WISTAR и OXYS
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Возрастная динамика маркеров окислительного стресса у крыс линий WISTAR и OXYS"

На правах рукописи

САТТАРОВА ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА МАРКЕРОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У КРЫС ЛИНИЙ \VISTAR И ОХУБ

03.00.04 - биохимия

Автореферат 00ЗА«*г~»

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2009

003482723

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и Институте цитологии и генетики СО РАН

Научные руководители:

д.х.н., профессор Невинский Георгий Александрович к.б.н. Синицына Ольга Ивановна

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор Ткачев Алексей Васильевич д.б.н. Мордвинов Вячеслав Алексеевич

Ведущая организация: Новосибирский государственный университет

<ю

Защита состоится « » 2009 г. в ¿г часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан « 0 » 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

к.х.н., доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В условиях окислительного стресса гиперпродукция активных форм кислорода (АФК) приводит к окислению липидов, повреждению белков, нуклеиновых кислот и других компонентов живых клеток. В число самых распространенных повреждений ДНК входит окисленное производное гуанина - 8-оксогуанин (8-охоО). Это окисленное основание у эукариот выщепляется 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой (0001). Нарушение механизмов репарации ДНК приводит к различным патологическим процессам, в число которых входят мутагенез, канцерогенез, дефекты развития и старение. Основной проблемой при изучении влияния окислительного стресса на ДНК при тех или иных патологиях человека является отсутствие доступных методов количественного определения поврежденных компонентов нуклеиновых кислот в клетках, а также отсутствие адекватных экспериментальных моделей животных. На сегодняшний день разработаны различные методы количественного определения 8-охоО в ДНК, однако экспериментальные трудности, связанные с измерением, приводят к очень большому разбросу получаемых величин уровня 8-охоО в ДНК. Метод иммунофлуоресцентного анализа позволяет определять количественное содержание и локализацию 8-охоО и 0001, а также отслеживать корреляцию между этими маркерами в различных клетках.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было исследование возрастной динамики маркеров окислительного стресса - 8-оксогуанина (8-охоО) и 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (0001) у крыс линии 0ХУ8 и контрольной линии \Vistar, поиск ранних маркеров окисления ДНК, а также тестирование ряда новых антиоксидантов. В ходе исследования решались следующие задачи:

• оптимизация методов иммуносорбентного анализа и иммунофлуоресцентной микроскопии для оценки относительного количества 8-охоО в геномной ДНК крыс, и для количественного многоцветного совместного определения 8-охоО и 0001 методом иммунофлуоресцентной микроскопии;

• определение методом иммуносорбентного анализа относительного количества 8-охоО в ДНК, выделенной из легких и печени крыс линий 0ХУ8 и \Vistar, в зависимости от возраста животных, а также оценка методом иммунофлуоресцентной микроскопии относительного количества 8-охоО в геномной ДНК клеток печени крыс линий ОХУБ и \Vistar различных возрастных групп;

• анализ методом многоцветной иммунофлуоресцентной микроскопии содержания 8-охоО и ОСС1 в ядрах нервных клеток различного типа СА-1 и СА-3 области гиппокампа и фронтальной коры левого полушария головного мозга 1- и 3-месячных крыс линий 0ХУ8 и \Vistar;

• исследование антиокислительной активности, мутагенности и генотоксичности трех новых серусодержащих производных 2,6-диметилфенола в бактериальных тест-системах, а также в зародышевых клетках мышей методом учета доминантных летальных мутаций, кроме того, оценка влияния антиоксидантных препаратов на уровень 8-охоО и 0001 у экспериментальных крыс линий ОХУБ и АУ181аг.

Научная новизна и практическая ценность работы. В

настоящей работе представлены результаты исследования по изучению возрастной динамики маркеров окислительного стресса 8-оксогуанина и 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы у крыс линии ОХУБ, характеризующейся гиперпродукцией свободных радикалов. Оптимизированы условия для количественного определения 8-охоО методом иммуносорбентного анализа. Впервые показано повышенное окисление геномной ДНК с образованием 8-охоО в органах крыс линии ОХУБ по сравнению с контрольной линией крыс ^Л^аг, при этом в клетках легких 8-охоО образуется интенсивнее, чем в клетках печени у крыс обеих линий. Оптимизированы условия для количественного анализа методом иммунофлуоресцентной микроскопии 8-охоО и 0001 в клетках мозга крыс и определена возрастная динамика содержания этих маркеров в ядрах различных нервных клеток СА-1 и СА-3 области гиппокампа и фронтальной коры левого полушария головного мозга ОХУБ и \Vistar. Выявлено статистически достоверное увеличение количества 8-охоО в ДНК клеток головного мозга гиппокампа и коры левого полушария у крыс линии 0ХУ8 по сравнению с крысами линии \Vistar, а также увеличение уровня 8-охоО в составе ядер нестин- и ОРАР-содержащих клеток по сравнению с другими типами клеток головного мозга для крыс трехмесячного возраста обеих линий. Показано увеличение содержания 0001 в нестин- и ОРАР-содержащих клетках по сравнению с другими клетками у 1-й 3-месячных крыс обеих исследуемых линий. Установлено, что три новых производных 2,6-диметилфенола проявляют выраженный антиокислительный эффект и не обладают мутагенностью и генотоксичностью. При этом, 4-(3-додецилтиопропил)-2,6-диметилфенол обладает более выраженными антиокислительными свойствами и способностью увеличивать

выживаемость клеток, лишенных ферментов репарации, а также существенно понижает уровень 8-oxoG в клетках мозга по сравнению с витамином Е. Полученные результаты позволяют использовать метод иммунофлуоресцентного анализа для определения 8-oxoG и OGG1 в других органах и тканях, а также для оценки антиокислительных свойств потенциальных антиоксидантов.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 печатных работы. Результаты работы были представлены на международной конференции «Chemical and biological problems of proteomics» (Новосибирск, 2004), Международной конференции «Химическая биология» (Новосибирск, 2005), Всероссийской конференции «Фундаментальные науки -медицине» (Новосибирск, 2005), Международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции» (Дубна, 2005), SFRR Free Radical Summer School (Спетсес, Греция, 2006), III международной конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2007) и др.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 16 таблиц. Библиография включает 299 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

• Оптимизация метода иммуносорбентного анализа для определения 8-oxoG в геномной ДНК

Относительное количество 8-oxoG в геномной ДНК печени и легких животных определяли иммуноадсорбцией, сопряженной с детекцией специфически адсорбированных AT методом флуоресцентного анализа. Для количественной оценки относительных величин флуоресценции (AF) необходимо было подобрать условия,.

Рис. 1. Зависимость относительной флуоресценции (AF) раствора ДНК, выделенной из печени двухмесячных крыс линии Wistar при анализе содержания 8-oxoG с помощью AT к 8-oxoG от количества ДНК, вносимой в лунки иммунологического планшета. При

иммобилизации в лунки планшета вносили по 50 мкл раствора облученной ДНК

Концентрация ДНК, мг/мл

когда величины АР линейно увеличиваются при повышении концентрации ДНК, содержащей 8-охоО. С этой целью был проведен анализ зависимостей АР от концентрации крысиной ДНК, содержащей 8-охоО, и показано, что при внесении в лунки 50 мкл ДНК с концентрацией выше 5 мкг/мл линейность зависимости от ее концентрации не соблюдается (рис. 1).

Для оптимизации условий анализа были получены контрольные препараты ДНК, которые отличались по количеству 8-охоО.

Рис. 2. Относительное количество 8-охоО в ДНК (в величинах ДО, среднее 3 измерений), выделенной из печени двухмесячных крыс линии \Vistar, в зависимости от времени облучения препарата видимым светом в присутствии 0,1% метиленового синего. При иммобилизации в лунки планшета вносили по 50 мкл раствора облученной ДНК в концентрации 0,0015 мг/мл. Величиина ДО рассчитана с учетом данных для контрольной ДНК, лишенной 8-охов оснований.

Образование 8-охов индуцировали облучением растворов ДНК крыс линии видимым светом в присутствии метиленового

синего, варьируя время облучения. Для доказательства образования 8-охоО в составе ДНК в использованных условиях полученные препараты ДНК обрабатывали 8-охоО-ДНК-гликозилазой Е.соН. Из данных рис. 2 видно, что относительное количество Fpg-зaвиcимыx разрывов в ДНК возрастает с увеличением времени облучения.

Разведение первичных антител Разведение вторичных антител

Рис. 3. Зависимость относительной флуоресценции (ДО) раствора ДНК крыс при анализе содержания 8-охоО с помощью АТ к этому основанию от уменьшения концентрации этих антител (А) и анализе содержания 8-охоО с помощью АТ к этому основанию в разведении 1/500 от уменьшения концентрации вторичных антител (Б). При иммобилизации в лунки планшета вносили по 50 мкл раствора облученной ДНК в концентрации 0,0015 мг/мл.

Использование моноклональных мышиных АТ к 8-охоС и кроличьих Р1ТС-меченых АТ в избытке по отношению к модифицированным звеньям в ДНК в разбавлении 1:500 и 1:1000 соответственно было оптимальным (рис. 3, А, Б). При слишком больших (разбавление менее 1:150 раз) или очень маленьких количествах этих АТ (разбавление более 1:104) значения ДБ были занижены.

Было показано, что величина ДР, характеризующая неспецифическую сорбцию Р1ТС-АТ, не превышает 10% от величин АР, найденных в случае ДНК тканей крыс, не обработанных белком Fpg. Полученные данные свидетельствуют, что мышиные моноклональные АТ к 8-охоО специфично реагируют с 8-охоО в составе ДНК и пригодны для оценки относительного количества модифицированных оснований в ее составе.

• Анализ содержания 8-охоС в геномной ДНК крыс

Анализ содержания 8-охоО в ДНК, выделенной из клеток печени и легких 2-х и 18-месячных крыс ОХУБ и \Vistar (по 7-8 крыс в каждой группе) проводили методом иммуносорбентного анализа. На рис. 4., А представлены результаты исследования содержания 8-охоО в ДНК печени крыс. На рис. Б приведены данные по относительному содержанию 8-охоО в ДНК из легких крыс. Разработанный метод позволил сопоставить относительное содержание окислительных повреждений ДНК в печени и легких крыс линий \Vistar и ОХУБ разного возраста.

^11

1 И151аг 2 3 ОХУЭ 4

2мес. 18мес. 2 мес. 18мес.

Рис. 4. Относительное количество 8-охоО в ДНК печени (А) и легких (Б) крыс линии ОХУБ и контрольных крыс линии \Vistar. Приведены величины средних значений ДБ (число использованных крыс в каждом случае 7-8) и стандартных отклонений этих величин. Величины М соответствуют относительной флуоресценции ЕГГС-меченых АТ кролика, которые были адсорбированы комплексом ДНК с моноклональными АТ к 8-охоО.

1 УУ151аг 2

Из совокупности полученных данных видно, что окислительный стресс в первую очередь поражает легкие животных обеих линий. Различия в окислительном повреждении ДНК печени несколько меньше.

Количество 8-охоО в ДНК крыс линий ОХУБ и \Vistar и в легких, и в печени животных закономерно увеличивается с возрастом. Важно отметить, что 8-охоС относится к таким окислительным модификациям ДНК, накопление которых приводит к появлению мутаций. Обнаруженный повышенный уровень окислительных повреждений ДНК в клетках печени и легких крыс линии ОХУ8, отражает, таким образом, относительное количество предмутационных повреждений, которые затем «закрепляются» в постоянных мутациях генов.

Возможно, накопление таких мутаций в организме крыс линии ОХУБ проявляется в раннем развитии заболеваний пожилого возраста. Полученные данные являются еще одним свидетельством в пользу связи ускоренного старения крыс линии ОХУБ с окислительным стрессом.Возможно, накопление таких мутаций в организме крыс линии ОХУБ проявляется в раннем развитии заболеваний пожилого возраста. Полученные данные являются еще одним свидетельством в пользу связи ускоренного старения крыс линии ОХУБ с окислительным стрессом.

• Иммунофлуоресцентный анализ 8-охоС в срезах печени крыс

Иммунофлуоресцентное определение 8-охоО в срезах печени крыс проводили методом иммунофлуоресцентной микроскопии, с использованием моноклональных антител к 8-охоО, подобрав оптимальные условия для окрашивания препаратов антителами.

50 ТОО 150

Концентрация НаО„ мМ

Рис. 5. Относительное количество 8-охоО в ядрах печени крыс в зависимости от концентрации перекиси водорода для 25-50 случайно выбранных ядер. Уровень флуоресценции при окраске срезов печени без первичных антител показан квадратом, при обработке срезов 100 мМ перекисью водорода в отсутствие первичных антител - треугольником. Приведены среднее значение и 95 % доверительный интервал.

В качестве контроля использовали срезы печени крыс, обработанные перекисью водорода в возрастающей концентрации в присутствии

ионов железа (II). Получена дозозависимая кривая относительной флуоресценции от концентрации перекиси водорода (рис. 5).

На рис. 6 показана специфичность распределения сигнала в ядрах клеток печени у крыс линии Wistar (А-Е) и у крыс линии OXYS (Ж-М) 2- и 18-месячного возраста.

Рис. 6. Иммунофлуоресцентная локализация 8-охоС в криостатных срезах печени крыс линий ОХ YS и Wistar. А-М: флуоресцентные микрофотографии срезов печени (5 мкм). А, Б, В и Г, Д, Е - срезы печени 2- и 18-месячных крыс линии Wistar соответственно. Ж, 3, И и К. J1. М - срезы печени 2- и 18-месячных крыс линии OXYS соответственно. А, Г. Ж, К -срезы печени, окрашенные с Hoechst 33342, Б. Д, 3. Л - срезы печени, обработанные моноклональными антителами (шАЬ483.15) к 8-oxoG. и вторичными антителами кролика к антителам мыши, конъюгированными с FITC. В. Е, И, М - срезы печени, обработанные как и срезы Б, Д. 3, Л. но без добавления первичных антител к 8-oxoG. А: масштаб, 10 мкм.

Для крыс линии Wistar в большинстве ядер клеток характерно либо отсутствие специфического зеленого сигнала, либо его незначительное количество по сравнению с крысами линии OXYS. Кроме того, с возрастом либо при повышенной чувствительности к окислительному стрессу наблюдалось, помимо ядерной окраски, диффузное окрашивание цитоплазмы клеток (рис. 6). В случае, когда срезы печени инкубировали в отсутствие первичных антител, специфический иммунофлуоресцентный сигнал в ядрах клеток печени не наблюдался (рис. 6, В, Е, И, М). Для индивидуальных животных (как OXYS, так и Wistar) было показано, что интенсивность окрашивания ядер не равномерна, а подчиняется асимметричному статистическому распределению, скошенному вправо (рис. 7, А). Данные обрабатывали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни и теста Крускаля-Уоллиса. В качестве критерия для сравнения использовали суммарное распределение флуоресцентного сигнала ядер в группах животных, что является более веским критерием в данном случае по сравнению с часто используемыми для обработки выборок средним и стандартным отклонением. Проанализировав в каждой исследуемой возрастной группе крыс от 4 до 7 животных и сравнив суммарное распределение флуоресцентного сигнала в ядрах клеток, показали, что у крыс линии OXYS наблюдается больше окислительных повреждений, по сравнению с крысами линии Wistar того же возраста

(рис. 7, Б). Возрастающее количество ядер клеток, содержащих повышенное количество 8-охоС, также свидетельствует о накоплении окислительных повреждений с возрастом у обеих линий крыс.

ГЛ-П-П

Уровень флуоресценции, 1-11

, — Уровень флуоресценции в каждой из 16 групп (для животных всех возрастов)

Рис. 7. Распределение 8-охоО в печени крыс. А: распределение регистрируемого сигнала 8-охоО по ядрам клеток печени для индивидуального животного (крыса линии \Vistar, 12 мес.). Значения сигнала для 42 случайно выбранных ядер клеток разделены на 11 групп по интенсивности флуоресценции ядер (общее количество флуоресценции 0-0,055 единиц, интервал для группы 0,005 единиц). Б\ число ядер соответствующей интенсивности в каждой из групп для крыс линий \Vistar и ОХУЭ в зависимости от возраста животных. В зависимости от интенсивности флуоресценции, все проанализированные ядра клеток были разнесены по 16 группам (суммарная флуоресценция от 0 до 0,8 произвольных единиц, с интервалом 0,05 единиц).

В табл. 1 и на рис. 8 приведены средние значения относительного количества 8-охов в ДНК и 95%

доверительный интервал для 2-, 6-, 12-, и 18-месячных крыс линий ОХУ8 и \Vistar (достоверность различий между линиями р < 0,001), и различия между 2-месячными животными крыс линий ОХУ8 и Wistar по сравнению с животными других возрастных групп (р < 0,01), посчитанные с помощью критерия Манна-Уитни.

Рис. 8. Относительное количество 8-охов в ядрах печени крыс линий ОХУБ (серые столбцы) и \Vistar (белые столбцы) в зависимости от возраста животных. Показаны среднее значение и 95 % доверительный интервал. Приведены достоверности межлинейных различий (** -р < 0.01 и *** -р< 0.001) и различий между 2-месячными животными крыс линий ОХУЭ и \Vistar по сравнению с животными других возрастных групп (+++ - р < 0.01), посчитанные с помощью критерия Манна-

Возраст животных, мес. УИТНИ

Показано, что с возрастом происходит накопление 8-охов в ДНК животных обеих исследуемых линий, однако у крыс линии ОХУБ уровень окислительных повреждений в ДНК выше, по сравнению с контрольной линией крыс \Vistar.

Таблица 1. Количество 8-охоО в ДНК срезов печени крыс линии ОХУЭ и контрольной линии \Vistar в зависимости от возраста животных

Возраст (мес) \Vistar ОХ\5

среднее 95 % дов. инт. среднее 95 % дов. инт.

2 0,019" 0,015-0,024" 0,023 0,019-0,026

6 0,023 0,018-0,030 0,042 0,033-0,052

12 0,027 0,022-0,034 0,060 0,044-0,079

18 0,056 0,045-0,070 0,080 0,058-0,105

* Среднее значение, **95% доверительный интервал, выраженные в усл. ед.

Средний уровень окислительных повреждений в ДНК 18-месячных крыс был в 3,5-, 1,9- и 1,3-раза выше, по сравнению с 2-, 6-, и 12-месячными крысами ОХУБ, соответственно (табл. 1). Следует отметить, что количество 8-охоС в ядрах клеток печени крыс ОХУЭ с возрастом увеличивалось линейно, тогда как у крыс линии \Vistar уровень повреждений значительно возрастал только у самых старых животных (рис. 8). В клетках печени 18-месячных крыс \Vistar уровень 8-охоО в 2,9-, 2,4-, и в 2,1-раза выше по сравнению с 2-, 6-, и 12-месячными крысами линии \Vistar (табл. 1).

Четкие межлинейные различия фиксировались в каждой возрастной группе: уровень 8-охов в печени крыс линии ОХУ5 был 1,2 раза выше по сравнению с крысами линии \Vistar в возрасте 2 месяцев, в 1,8 раза выше в возрасте 6 месяцев, в 2,2 раза выше в возрасте 12 месяцев и в 1,4 раза выше в возрасте 18 месяцев. Эти различия были статистически достоверными. Полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее ярко межлинейные различия были выражены у крыс в возрасте 6 и 12 месяцев. Для 2-месячных животных эти различия были незначительными, вероятно, благодаря высокой эффективности процессов репарации в печени молодых животных обеих линий. Важные выводы, следующие из настоящей работы, касаются модели накопления повреждений в ткани печени. Часто по умолчанию предполагается, что повреждения ДНК равномерно распределены в организме, или сконцентрированы в различных органах (например, в мозге или легких). Показано, что в отдельных тканях существуют различия в уровне окислительных повреждений между ядрами клеток одной ткани. Часть ядер на рис. 6 интенсивно окрашена антителами, тогда как другая часть имеет совсем слабую окраску, почти не превышающую фона. Вероятным объяснением такого распределения сигнала может служить снижение интенсивности процессов репарации ДНК с возрастом в определенных клетках, различия между системами антиоксидантной защиты в клеткахили в концентрации повреждающих агентов, уровень которых

нарастает с увеличением количества повреждений в клетках. Установить такой тип распределения в тканях возможно только иммуногистохимией в совокупности со статистическим анализом данных.

Таким образом, полученные данные показывают, что в ядерной ДНК печени крыс линии OXYS образуется большее количество 8-oxoG по сравнению с крысами линии Wistar, что коррелирует с различными патологиями, характерными для крыс линии OXYS.

• Определение уровня 8-oxoG и OGG1 в ядрах клеток головного мозга крыс линий OXYS и Wistar методом иммуногистохимического анализа in situ

Для количественного определения уровня 8-oxoG в мозге был использован разработанный в настоящей работе метод количественного иммунофлуоресцентного анализа. Окрашивая срезы маркерами, позволяющими дифференцировать нервные клетки различного типа, определяли уровень 8-oxoG и OGG1 в предшественниках нейронов, содержащих нестин (далее - нестин-содержащие клетки), в клетках глии, астроцитах, содержащих GPAP -кислый глиальный фибриллярный белок (далее - GFAP-содержащие клетки), и в клетках с крупными ядрами, окрашенными DAPI без специальных маркеров, которые считали зрелыми нейронами (далее -немаркированные клетки). Были проанализированы ядра нервных клеток СА-1 и СА-3 области гиппокампа и в лобно-височной доле фронтальной коры (далее - фронтальной коры) левого полушария головного мозга 1- и 3-месячных крыс линий OXYS и Wistar. На рис. 9 приведена картина распределения флуоресцентного сигнала в ядрах нервных клеток у крыс линии OXYS (А-Д) и у крыс линии Wistar (Е-К) 3-месячного возраста при окраске срезов головного мозга антителами к 8-oxoG, OGG1, GFAP, а также при окраске срезов вторичными флуоресцентно мечеными антителами без предварительной инкубации с первичными антителами (контрольные препараты).

Для крыс линии Wistar в большинстве ядер клеток характерно либо отсутствие специфического зеленого сигнала (маркер 8-oxoG), либо его незначительное количество по сравнению с крысами линии OXYS. Уровень специфического розового сигнала (маркер OGG1) у крыс линии Wistar статистически достоверно не отличался от такового у крыс линии OXYS. В случае, когда срезы головного мозга инкубировали в отсутствие первичных антител, специфический

иммунофлуоресцентный сигнал в ядрах клеток головного мозга

Рис. 9. Иммунофлуоресцентная локализация 8-oxoG и OGG1 в криостатных срезах мозга крыс линий OXYS и Wistar. А-П: флуоресцентные микрофотографии срезов мозга (18 мкм). А, Б, В, Г. Д и Е, Ж, 3, И, К - срезы головного мозга 3-месячных крыс линии OXYS и Wistar соответственно. Б, Ж. М - срезы, окрашенные DAPI (синяя окраска). В, 3 - срезы головного мозга, обработанные первичными антителами кролика к OGGI, и вторичными антителами осла к антителам кролика,

конъюгированными с Texas Red (розовая окраска). Г, И - срезы головного мозга, обработанные первичными антителами мыши к 8-oxoG, и вторичными антителами осла к антителам мыши, конъюгированными с F1TC (зеленая окраска). Д. К - срезы головного мозга, обработанные первичными антителами курицы к GFAP, и вторичными антителами осла к антителам курицы, мечеными СуЗ (красная окраска). Н. О, П - срезы головного мозга, обработанные, как и срезы В. 3, Г, И, Д, К, но без добавления первичных антител к 8-oxoG, OGGI, GFAP. А, Е, J1 - микрофотографии с визуализацией 4 флуорохромов DAPI, F1TC, СуЗ, Texas Red. Четырехцветная окраска позволяет визуализировать на одном препарате локализацию 8-oxoG (зеленая окраска) и OGG1 (розовая окраска) в ядрах астроцитов (ядра клеток, одновременно окрашенные в красный и синий цвет, отмечены кругом белого цвета на слайде А) и немаркированных клеткок (ядра, окрашенные в синий и не окрашенные в красный цвет, отмечены кругом зеленого цвета на слайде А ). А: масштаб. 10 мкм.

Уровень накопления 8-oxoG измеряли по интенсивности флуоресценции в 50 случайно выбранных ядрах нервных клеток каждого среза. В каждой возрастной группе крыс проводили по 3 эксперимента для каждого животного. Всего в каждой экспериментальной группе было проанализировано по 3 крысы линии OXYS и по 3 крысы линии Wistar для 3-месячных животных, 6 крыс линии OXYS и 5 крыс линии Wistar для одномесячных животных. С помощью теста Крускаля-Уоллиса сравнивали распределение данных для отдельных особей внутри одной экспериментальной группы. Распределения, полученные при оценке различных параметров, сравнивали друг с другом с использованием критерия Манна-Уитни.

отсутствовал (рис. 9, Л, М, Н, О, П).

Оценка уровня 8-охоС у крыс линий ОХУБ и Wistar в ядрах немаркированных клеток головного мозга

На рис. 10-12, 16 приведены бигистограммы, отражающие различия в соответствии с критерием знаков (непараметрический статистический критерий для проверки гипотезы равенства медиан двух связных выборок) между средними значениями сигнала. На рис. 10 приведены группы сравнения (\\Чз1аг/ОХУ8), в порядке увеличения значения 8-охоО-специфичного сигнала у крыс линии \Vistar.

llIl]i'I'IIí5bIt

ilsl

íí

Сравниваемы* группы Сравниваемые группы

Рис. 10. Диаграмма, отражающая различия в соответствии с критерием знаков между средними значениями сигнала 8-охоО в немаркированных клетках крыс линии \Vistar (начало стрелки, круг) и крыс линии ОХУЭ (конец стрелки, черта) в возрасте 1 месяца (А) и 3 месяцев (Б). Приведены только средние для выборок, достоверно различающихся по критерию Манна-Уитни.

Число приведенных групп сравнения варьирует в различных экспериментах, так как критерий знаков учитывает только те данные, где наблюдались статистически достоверные различия по критерию Манна-Уитни (непараметрический статистический критерий, используемый для оценки различий между двумя выборками по уровню какого-либо признака, измеренного количественно). Достоверных различий в содержании 8-охоО в клетках фронтальной коры и гиппокампа левого полушария у крыс исследуемых возрастов обеих линий обнаружено не было. Вероятно, процессы, протекающие при окислительном стрессе, схожи в этих отделах головного мозга, поэтому значительных различий по данному параметру не выявлено. Важно отметить, что в немаркированных клетках головного мозга в возрасте 3 месяцев удалось выявить четкие межлинейные различия в уровне ядерного содержания 8-охоО (рис. 10, Б).

Оценка уровня 8-охоС у крыс линий ОХУБ и Wistar в ядрах немаркированных клеток, и клеток, окрашенных маркерами дифференцировки нервных клеток

Уровень накопления 8-охоО в маркированных клетках измеряли по интенсивности флуоресценции 8-охоО-специфичного сигнала в ядрах

всех обнаруженных нестин- и СР АР-со держащих клетках фронтальной коры и гиппокампа (в среднем 4-5 клеток в исследуемой области головного мозга) в каждом эксперименте.

Рис. П. Диаграмма, отражающая различия в соответствии с критерием знаков между средними значениями сигнала 8-охоО в немаркированных клетках (начало стрелки, круг) и в клетках, окрашенных антителами к БРАР (конец стрелки, черта) крыс в возрасте 3 месяцев. Приведены только средние значения для выборок, достоверно различающихся по критерию Манна-Уитни.

Было обнаружено значительное увеличение количества 8-охоО в составе ядер нестин- и ОРАР-содержащих клеток, по сравнению с немаркированными клетками для крыс 3-месячного возраста.

В возрасте 1 месяц показано, что уровень 8-охоО статистически достоверно выше у животных линии ОХУБ по сравнению с линией \Vistar, как немаркированных клетках, так и в нестин-содержащих клетках. В возрасте 3 месяцев уровень окислительных повреждений у животных обеих линий в нестин- и ОРАР-содержащих клетках увеличивался по сравнению с немаркированными клетками (рис. 11).

Оценка уровня белка 0(767 в ядрах немаркированных клеток головного мозга и клеток, окрашенных ВАР1 и маркерами диффереицировки нервных клеток у крыс линий 0ХУ8 и \Vistar

При определении уровня 0001 в нейронах, нестин-содержащих клетках и клетках глии, у животных в возрасте 1 месяца не было получено статистически достоверных межлинейных различий в уровне 0001, также не наблюдалось различий в уровне содержания 0001 во фронтальной коре головного мозга по сравнению с гиппокампом. Однако было показано увеличение содержания 0001 в нестин-содержащих клетках по сравнению с немаркированными клетками у крыс обеих исследуемых линий (рис. 12).

В возрасте 3 месяцев статистически достоверной межлинейной разницы в количестве 0001 также не было обнаружено. Следует подчеркнуть, что сохранялась динамика увеличения уровня 0001 в нестин- и ОРАР-содержащих клетках по сравнению с немаркированными клетками, как у \Vistar, так и у ОХУБ крыс. Выявлено, что клетки головного мозга крыс линии 0ХУ8 более подвержены действию окислительного стресса по сравнению с контрольными животными линии \Vistar.

Сравниваемы* группы

!!»М!

10 15 20 25

Срмиимвмы* группы

Рис. 12. Диаграмма, отражающая различия в соответствии с критерием знаков между средними значениями сигнала ООО в немаркированных клетках головного мозга (начало стрелки, круг), и в маркированных клетках (конец стрелки, черта) крыс в возрасте 1 месяца (Л) и 3 месяцев (Б). Приведены только средние значения для выборок, достоверно различающихся по критерию Манна-Уитни.

Выраженное раннее проявление действия окислительного стресса на клетки головного мозга крыс дает возможность для данной экспериментальной модели исследовать перспективность антиоксидантной коррекции, как фенотипических, так и молекулярно-биологических маркеров окислительного повреждения ДНК. С этой целью был проведен поиск новых более эффективных антиоксидантов.

• Анализ мутагенности, генотоксичности и антиокислительной активности серосодержащих соединений, полученных на основе 2,6-диметилфенола

Были исследованы серусодержащие соединения фенольного типа -додецил-3,5-диметил-4-гидроксибензилсульфид (Ф-1), 2-

гидроксиэтил-(3,5-диметил-4-гидроксибензил)сульфид (Ф-2) и додецил-3-(3,5-диметил-4-гидроксифенил)пропилсульфид (Ф-3),

полученные на основе 2,6-диметилфенола (рис. 13), синтезированные в центре исследования антиоксидантов ИЕСЭН НГПУ.

Анализ мутагенности исследуемых соединений в тесте Эймса

Для выявления мутагенной активности синтезированных соединений в тесте Эймса использовали штамм 5. /урЫтигшт ТА 102. Показано, что добавление к клеткам штамма ТА102 исследуемых соединений, растворенных в ДМСО, в конечной концентрации 20 нМ приводит к статистически достоверному образованию большего числа

Рис. 13. Схема синтеза исследуемых соединений: а, аллиловый спирт/ЫаОН; Ь, водн. Н2СО, С,2Н258Н/водн. ЕЮН; с, водн. Н2СО, 8НС2Н4ОН; с1. конц. НВг; е, С12Н258Н/КОН, ЕЮН.

2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

Шз+-ревертантов, чем в случае спонтанного их образования в контроле с клетками этого штамма, необработанными ДМСО (рис. 14).

Рис. 14. Анализ мутагенной активности трех новых соединений и контрольных антиокислителей в концентрации 20 нМ (белые столбцы) и ВО нМ (заштрихованные столбцы) в отсутствие перекиси водорода: контрольные необработанные клетки (1), клетки, обработанные ДМСО (2) и этим растворителем, содержащим тролокс (3), витамин Е (4), соединение Ф-1 (5), соединение Ф-2 (6), соединение Ф-3 (7). Приведены средние значения величин 3 экспериментов при каждой концентрации и стандартные отклонения этих величин. За 100% приняты максимальные значения мутагенности в серии этих значений, полученных в экспериментах.

В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что все три новых соединения (Ф-1-Ф-3), как и контрольные витамин Е и тролокс, не имеют выраженного мутагенного эффекта и не снижают количество спонтанных мутаций (рис. 14).

Рис. 15. Анализ антиокислительной активности трех новых соединений и контрольных антиокислителей в концентрации 20 нМ (белые столбцы) и 80 нМ (заштрихованные столбцы) в присутствии 3 мМ Н2О2: контрольные необработанные клетки (1), клетки, обработанные ДМСО (2) и этим растворителем, содержащим тролокс (3), витамин Е (4), >6 7 1 2 3 4 5 6 7 соединение Ф-1 (5), соединение Ф-2 (6),

соединение Ф-3 (7). Приведены средние значения величин 3 экспериментов при каждой концентрации и стандартные отклонения этих величин. За 100% приняты максимальные значения антиокислительной активности в серии этих значений, полученных в экспериментах.

При оценке способности новых соединений проявлять антиокислительные свойства, защищая клетки от действия 3 мМ Н202, было обнаружено, что максимальной антиокислительной активностью в концентрации 20 нМ обладал тролокс, защитные свойства витамина Е и соединения Ф-1 были практически сопоставимы. Активность соединений Ф-2 и Ф-3 была несколько ниже (рис. 15). В концентрации 80 нМ максимальную активность сохранял тролокс, эффективность защитного действия соединения Ф-1 и витамина Е снижалась. В то же время, антиокислительные свойства соединений Ф-2 и Ф-3 заметно возросли и стали близкими к таковым для тролокса. При высокой концентрации соединений Ф-2 и Ф-3 их защитный эффект выше, чем у витамина Е. Таким образом, по результатам теста Эймса три новых

синтезированных соединения не обладают мутагенной активностью, а их антиокислительный эффект сопоставим с эффектом витамина Е и тролокса.

Анализ антиокислительной активности исследуемых соединений с помощью штаммов клеток Е. coli, дефицитных по репарации окислительных повреждений в ДНК

Исследована антиокислительная активность синтезированных соединений по их способности увеличивать выживаемость бактериальных клеток, обработанных пероксидом водорода. Предварительная обработка клеток штаммов E.coli штаммов СС104, СС104 mutT и СС104 fpg mutY антиоксидантами увеличивала их выживаемость после воздействия на них 3 мМ Н202 (табл. 2).

Таблица 2. Выживаемость клеток Е. coli штаммов СС104, СС104 mutT, СС104 fpg mutY после их обработки 3 мМ Н2Ог

Штамм с, нМ Выживаемость клеток, относит, ед.

Вит. Е тролокс Ф-1 Ф-2 Ф-3 дмсо

СС104 В 8,0 ±0,5' 8,7 ±0,4 4,6 ±1,2 3,3 ±1,1 4,3 ±0,2 3,6 ±0,7

20 6,1 ±2,6 22,2 ± 2,7 5,4 ±1,9 7,9 ±3,6 16,2 ± 2,2* 4,9 ±3,1

80 31,6 ±1,5" 10,4 ±0,9 -6,8"'± 1,1 -3,9 ±1,8 11,0 ±1,3 10,4 ± 1,1

СС104 mutT 8 2,5 ±1,1 1,3 ± 1,5 0,4 ± 0,7 3,6 ±0,7 7,4 ± 1,4 4,1 ±0,6

20 2,0 ± 3,2 6,3 ± 2,2 22,8 ±3,8 10,8 ±2,9 25,9 ±3,8 3,7 ±1,6

80 26,9 ± 0,8 19,3 ± 1,9 9,1 ±1,5 3,9 ±0,8 14,7 ± 1,8 14,2 ± 1,8

СС 104 fpg mutY 8 1,6 ±3,7 5,0 ± 4,3 -0,6 ±1,4 9,9 ± 1,9 10,4 ±3,0 0,3 ± 1,0

20 4,4 ± 1,3 6,0 ± 1,2 4,1 ± 1,6 2,0 ±0,4 3,9 ± 1,6 1,8 ±0,2

80 3,4 ± 0,8 11,6 ±1,9 22,9 ±2,6 10,3 ±1,5 2,0 ±0,1 0,1 ±0,3

"Средние величины значений выживаемости (в относительных единицах), с учетом выживаемости клеток, не обработанных исследуемыми соединениями, и клеток, обработанных мутагеном (п=3 для каждой концентрации) и стандартных отклонений этих величин. **Жирным шрифтом показана концентрация соединения, при которой достигается максимальный антиокислительный эффект. "Отрицательное значение выживаемости получается в случае, когда выживаемость клеток, обработанных перекисью водорода в присутствии антиоксиданта ниже значения выживаемости клеток, необработанных исследуемыми соединениями.

Следует отметить, что соединение Ф-3 ни с одним из штаммов Е. соИ и ни при одной из концентраций, в отличие от других соединений, включая витамин Е и тролокс, не проявляет прооксидантного эффекта. Эффективность роста клеток штамма СС104 при концентрации Ф-3 20 нМ была в ~2 раза выше, чем в присутствии всех других исследованных соединений, и лишь в ~1,3 раза ниже, чем при действии тролокса. Для штамма СС104 тШТ эффективность соединения Ф-3 в концентрации 20 нМ выше в 12,5 раз выше, чем эффективность витамина Е, и в 4 раза выше эффективности защиты клеток тролоксом. Эффективность действия Ф-3 в ~2,5 раза выше, чем

соединения Ф-2, и практически сопоставима с таковой для соединения Ф-1. В концентрации 8 нМ соединение Ф-3 в отношении клеток штамма СС104 Jpg muí Y эффективней витамина Е в ~6 раз и тролокса в ~2 раза. Таким образом, среди всех исследованных контрольных и опытных соединений в данной системе анализа наибольшей антиокислительной активностью обладало соединение Ф-3, которое увеличивало выживаемость клеток как штамма дикого типа, так и штаммов, дефектных по генам ферментов репарации.

Определение доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей

Соединение Ф-3 и витамин Е вводили животным в концентрации 52 мкМ, заведомо превышающей терапевтическую дозу для этих соединений. Было показано (таблица 3), что самки всех использованных групп равноценны по величине потенциальной плодовитости.

Таблица 3. Величина эмбриональной смертности и уровень доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей

Ф-3 | Витамин Е

Стадии сперматогенеза

Зрелые сперм. Поздн. сперм. Ранние сперм. Зрелые сперм. Поздн. сперм. Ранние сперм.

Кол. берем, самок 42 34 38 29 36 30

Потен ц. плодовит, (кол>во желтых тел) 8,2± 0,2 7,8±0,2 7,2±0,2 8,1±0,2 7,6±0,2 7,4±0,3

Эмбрионы IIa 1 берем, самку число импл. 7,6±0,2 6,8±0,3 6,4±0,2 6,7±0,3 6,8±0,2 6,8±0,3

живые 7,0±0,3 6,7±0,3 6,0±0,2 6,6±0,3 6,3±0,2 6,5±0,2

погибш. 0,45 0,18 0,42 0,28 0,39 0,33

Обшая эмбр. смерти., % 14,5 12,8 17,1 19,1 16,1 12,6

Выживаемость, % 0,003 0,002 0,250 0,023 0,080 0,047

Доминант. летали,% 85,4 87,1 82,9 80,6 83,9 87,2

1,7 1,3 12,7 4,3 7,5 6,1

Величины эмбриональной смертности на всех этапах беременности у самок опытной и контрольных групп были сопоставимы. Следовательно, соединение Ф-3 не влияет ни на доимплантационную, ни на постимплантационную стадии эмбриогенеза. Частота возникновения доминантных деталей у самок, спаренных с самцами, обработанными соединением Ф-3, не зависела от стадии сперматогенеза (табл. 3). В целом, полученные данные показывают, что два новых антиоксиданта, Ф-1 и Ф-3 при оптимальных концентрациях сопоставимы по свойствам с витамином Е и тролоксом, а соединение Ф-3 может оказаться более эффективным и перспективным антиокислителем при лечении болезней, вызванных окислительным стрессом.

Влияние исследуемых антиоксидантов на уровень 8-охо(х и 0(7С/ в клетках головного мозга крыс линий ОХУБ и \Vistar

Методом многоцветной иммунофлуоресцентной микроскопии был определен уровень 8-охоО и СЮС1 у животных, получающих витамин Е и соединение Ф-3. Анализ данных показал, что добавление витамина Е приводит к незначительному снижению содержания 8-охоО в клетках мозга крыс, тогда как у крыс, получавших соединение Ф-3, уровень 8-охоО в ядрах нервных клеток был снижен, как по сравнению с контрольной группой животных, так и по сравнению с группой животных, получавших витамин Е. Более того, уровень окислительных модификаций ДНК был ниже в ядрах всех исследованных типов нервных клеток головного мозга у крыс линии ОХУБ, получавших соединение Ф-3, и уровень этих модификаций был близок уровню 8-охоС в клетках головного мозга контрольной линии крыс \Vistar соответствующего возраста (рис. 16).

ее

8. 2

Г I 11

°0 5 10 15

Сравниваемые группы

гы!!!!!!"!!^

"о 5 10 15 "о 5 10 15 20

Сравниваемы« труппы Сравниваемы« группы

Рис. 16. Диаграмма, отражающая различия в соответствии с критерием знаков между средними значениями сигнала 8-охоО в клетках головного мозга крыс в возрасте 3 месяцев. А: получающих с пищей витамин Е (начало стрелки, круг), и на обычной диете (конец стрелки, черта); Е: получающих с пищей соединение Ф-3 (начало стрелки, круг), и на обычной диете (конец стрелки, черта); В: получающих с пищей соединение Ф-3 (начало стрелки, круг), и получающих с пищей витамин Е (конец стрелки, черта). Приведены только средние для выборок, достоверно различающихся по критерию Манна-Уитни.

Оценка влияния антиоксидантой диеты на уровень 0001 показала отсутствие достоверных различий между исследуемыми группами животных, поэтому можно предположить, что соединение Ф-3 эффективно снижает действие окислительного стресса во всех исследованных отделах головного мозга преждевременно стареющих крыс ОХУ8 за счет своих антиокислительных свойств, а не благодаря

стимуляции процесса репарации ДНК. Были определены коэффициенты корреляции между содержанием 8-охоО и 0001 во всех экспериментах для индивидуальных особей и, где это было возможно, в объединенных группах по нескольким особям. Примерно в половине случаев корреляция была статистически достоверной (р < 0.05). Корреляция между 8-охоО и ООй 1 была в основном в немаркированных клетках, возможно потому, что в нейронах анализировалось большее количество данных, позволяющих находить статистически достоверную слабую корреляцию. В остальных группах сравнения с примерно одинаковым количеством данных не было достоверных корреляций этих двух маркеров, кроме того все исследуемые параметры (линия животного, антиоксидантная диета, отдел ГМ) не влияли на силу корреляции между анализируемыми маркерами. Интересно, что практически все наборы данных имели статистически достоверную корреляцию, коэффициент корреляции между маркерами был положительным, то есть, наблюдалась прямая зависимость между содержанием 8-охоО и 0001. Предположительно, генотоксический стресс, приводящий к увеличению уровня 8-охоО, может индуцировать наработку дополнительных количеств 0001.

ВЫВОДЫ

1) Впервые показано увеличение уровня окисления геномной ДНК с образованием 8-оксогуанина в органах крыс линии 0ХУ8, характеризующейся ускоренным старением, по сравнению с контрольной линией крыс "\Vistar. Оптимизированы условия для количественного определения 8-охоО методом иммуносорбентного анализа. Показано, что в клетках легких происходит более интенсивное образование 8-охоО, чем в клетках печени у крыс обеих линий. Относительное количество 8-охоО в клетках печени крыс линии ОХУБ, определенное методом иммунофлуоресцентной микроскопии, было статистически достоверно выше, чем у крыс линии \Vistar для всех исследованных возрастов животных.

2) Оптимизированы условия для количественного анализа 8-охоО и 0001 в клетках центральной нервной системы методом иммунофлуоресцентной микроскопии и определено относительное содержание этих маркеров в ядрах различных типов нервных клеток СА-1 и СА-3 в области гиппокампа и фронтальной коры левого полушария головного мозга одно- и трехмесячных крыс линий ОХУБ и Установлено статистически достоверное увеличение относительного количества 8-охоО в ДНК клеток головного мозга гиппокампа и коры левого полушария у крыс линии ОХУБ по

сравнению с крысами линии '\yistar, а также увеличение уровня 8-охоО в составе ядер нестин- и вРАР-содержащих клеток по сравнению с другими типами клеток головного мозга для крыс трехмесячного возраста обеих линий. Показано увеличение содержания 0001 в нестин-содержащих клетках по сравнению с другими клетками у одномесячных крыс обеих исследуемых линий. В возрасте 3 месяцев уровень ОСС1 в нестин- и ОРАР-содержащих клетках повышен по сравнению с другими клетками у крыс \Vistar и ОХУБ.

3) Установлено, что три новых производных 2,6-диметилфенола проявляют выраженные антиокислительные свойства, и не обладают мутагенностью и генотоксичностью. При этом 4-(3-додецилтиопропил)-2,6-диметилфенол (соединение Ф-3) обладает более выраженными антиокислительными свойствами и способностью увеличивать выживаемость клеток, лишенных ферментов репарации, по сравнению с витамином Е и тролоксом.

4) Показано, что соединение Ф-3 существенно понижает уровень 8-охоО в клетках мозга по сравнению с витамином Е, незначительно снижающим содержание 8-охоО. Поскольку Ф-3 не влияет на уровень гликозилазы 0001, удаляющей 8-охоО из ДНК, следует полагать, что соединение Ф-3 эффективно снижает действие активных форм кислорода на ДНК за счет своих антиокислительных свойств.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1.Кемелева Е.А., Синицина О.И., Конлон К.А., Берриоз М., Колосова Н.Г., Жарков Д.О., Васюнина Е.А., Невинский Г.А. Окисление гуанина в ДНК печени и легких преждевременно стареющих крыс линии OXYS // Биохимия. -2006. -Т. 71. -С. 612 — 618.

2. Kemeleva Е.А., Sinitsyna O.I., Kolosova N.G., Vasyunina E.A.,

Zharkov D.O., Cordon K.A., Berrios M., Nevinsky G.A. Immunofluorescent detection of 8-oxoguanine DNA lesions in liver cells from aging OXYS rats, a strain prone to overproduction of free radicals // Mutat. Res. -2006. -V. 599. -C. 88-97.

3. Кемелева E.A., Васюнина E.A., Синицина О.И., Хомченко А.С.,

Гросс М.А., Кандалинцева Н.В., Просенко А.Е., Невинский Г.А. Новые перспективные антиоксиданты на основе 2,6 -диметилфенола // Биоорг. химия. -2008. -Т. 34. -С. 558-569.

Подписано к печати 1 октября 2009г. Формат бумаги 60X84, 1/16. Тираж 115 экз. Заказ № 72 Отпечатано полиграфический салон «Визитка Ул. Первомайская, 8, г. Бердск, 633011

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Саттарова, Евгения Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Активные формы кислорода в организме.

1.1.1. Перекись водорода.

1.1.2. Супероксидный анион-радикал.

1.1.3. Синглетный кислород.

1.1.4. Гидроксильный радикал.

1.1.5. Оксид азота.!

1.2. Цитотоксическое действие АФК в организме.

1.2.1. Взаимодействие АФК с белками.

1.2.2. Перекисное окисление липидов.

1.2.3. Взаимодействие АФК с нуклеиновыми кислотами.

1.2.3.1. Повреждения дезоксирибозы.

1.2.3.2. Образование сшивок.

1.2.3.3. Окисленные пуриновые основания.

1.2.3.4. Окисленные пиримидиновые основания.

1.2.4. Репарация окислительных повреждений ДНК.

1.3. Антиокислительная защита организма.

1.3.1. Механизмы антиокислительной защиты неферментативной природы.

1.3.2. Механизмы ферментативной антиокислительной защиты.

1.3.2.1. Супероксиддисмутаза.

1.3.2.2. Каталаза.

1.3 2.3. Пероксидаза.

1.3.2.4. Глутатион зависимые ферменты.

1.4. Молекулярные маркеры окислительного стресса.

1.5. Методы анализа повреждений в ДНК.

1.6. Роль окислительных повреждений в процессе старения и возникновении АФК - зависимых заболеваний.

1.7. Модели животных для изучения механизмов окислительного стресса.

2.1. Реактивы и материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение и очистка геномной ДНК крыс.

2.2.2. Определение концентрации ДНК.

2.2.3. Электрофоретический анализ препаратов ДНК.

2.2.4. Получение контрольных препаратов ДНК.

2.2.5. Определение оптимальной концентрации гибридомной надклеточной жидкости, содержащей антитела к 8-oxoG для иммуноферментного определения 8-oxoG в геномной ДНК.

2.2.6. Определение оптимальной концентрации вторичных антител для иммуноферментного определения 8-oxoG в геномной ДНК.

2.2.7. Определение концентрации ДНК для количественной иммобилизации в лунки планшетов.

2.2.8. Определение 8-oxoG в геномной ДНК крыс линий OXYS и Wistar.

2.2.9. Иммунофлуоресцентное определение 8-oxoG в клетках печени крыс.

2.2.10. Регистрация флуоресцентного сигнала и статистический анализ данных. по определению 8-oxoG в клетках печени крыс.

2.2.11. Получение контрольных препаратов срезов печени крыс.

2.2.12. Определение мутагенности новых синтетических производных на основе 2,6-диметилфенола.

2.2.13. Определение антиокислительной активности исследуемых соединений.

2.2.14. Определение доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей.

2.2.15. Иммунофлуоресцентное определение 8-oxoG и 8-оксогуанин-ДНК- гликозилазы в различных клетках головного мозга крыс.

2.2.16. Регистрация флуоресцентного сигнала и статистический анализ данных по определению 8-oxoG в клетках головного мозга крыс.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.:.

3.1. Оптимизация метода иммуносорбентного анализа-для определения 8-oxoG в геномной ДНК.

3.2. Анализ содержания 8-oxoG в геномной ДНК крыс.

3.3. Иммунофлуоресцентное определение 8-oxoG в срезах печени крыс.

3.4. Возрастная и межлинейная динамика уровня окислительных повреждений ДНК клеток печени крыс.

3.5. Определение уровня 8-oxoG и OGG1 в ядрах клеток головного мозга крыс линий OXYS и Wistar методом иммунофлуоресцентной микроскопии in situ.

3.5.1. Оценка уровня 8-oxoG у крыс линий OXYS и Wistar в ядрах немаркированных клеток головного мозга.

3.5.2. Оценка уровня 8-oxoG у крыс линий OXYS и Wistar в ядрах немаркированных клеток, и клеток, окрашенных маркерами дифференцировки нервных клеток.

3.5.3. Оценка уровня белка OGG1 в ядрах немаркированных клеток головного мозга и клеток, окрашенных DAPI и маркерами дифференцировки нервных клеток у крыс линий OXYS и Wistar.

3.6. Синтез новых антиокислителей на основе 2,6-диметилфенола.!.

3.7. Анализ мутагенности исследуемых соединений в тесте Эймса.

3.8. Анализ антиокислительной активности исследуемых соединений с помощью штаммов клеток Е. coli, дефицитных по репарации окислительных повреждений в ДНК.

3.9. Определение доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей.

3.10. Влияние исследуемых антиоксидантов на уровень 8-oxoG и OGG1 в клетках головного мозга крыс линий OXYS и Wistar.

3.11. Статистический анализ внутри- и межлинейной динамики уровня 8-oxoG и OGG1 в маркированных и немаркированных клетках головного мозга крыс линий OXYS и Wistar.

3.12. Сравнение иммуногистохимических маркеров в различных группах крыс.

3.13. Корреляция между иммуногистохимическими маркерами.

ВЫВОДЫ.;.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Возрастная динамика маркеров окислительного стресса у крыс линий WISTAR и OXYS"

Окислительным стрессом называют процесс повреждения клетки при нарушении метаболизма активации кислорода и образования активных форм кислорода в клетке. Причиной возникновения окислительного стресса считается действие внешних прооксидантов (радиация, ультрафиолет, загрязнители воздуха, и др.) и активация эндогенных механизмов генерации активированных кислородных метаболитов, приводящих к сбою механизмов антиоксидантной защиты организма [1].

Окислительный стресс является одной из причин таких тяжелых патологий, как лучевая болезнь, инфаркт миокарда, атеросклероз, диабет, а также онкологических, бронхолегочных и нейродегенеративных заболеваний, возникновению и прогрессированию которых способствует действие неблагоприятных экологических факторов, а в ряде случаев и генетические аномалии. Проблема изучения клеточных механизмов развития окислительного стресса является необычайно актуальной, так как на сегодняшний день окисли гельный t стресс является универсальным механизмом патогенеза большого числа заболеваний человека в любом возрасте, особенно пожилых людей. Можно выделить четыре наиболее вероятные мишени окислительной цитотоксической атаки активных форм кислорода (АФК): индукция процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах, повреждение мембрансвязанных белков, инактивация ферментов и повреждение ДНК клеток.

Основной проблемой при изучении последствий действия факторов окислительного стресса на ДНК при тех или иных патологиях человека является отсутствие доступных методов количественного определения поврежденных компонентов нуклеиновых кислот в клетках, а также отсутствие адекватных экспериментальных моделей животных. Известно, что образование 8-оксогуанина (8-oxoG) в ДНК в клетках тесно связано с такими биологическими процессами как мутагенез, канцерогенез, старение и рядом болезней* при старении [2-5]. 8-oxoG часто используется как биомаркер окислительного повреждения ДНК, связанного с канцерогенезом [6]. Известны многочисленные корреляции между возрастом организма и содержанием окислительных повреждений ДНК, в частности, 8-oxoG, а также между продолжительностью жизни различных животных и человека определенного вида и их способностью к репарации ДНК [7, 8]. Однако, экспериментальные трудности, связанные с измерением, приводят к очень большому разбросу получаемых величин уровня 8-oxoG в ДНК [9].

На сегодняшний день разработаны различные методы количественного определения 8-oxoG в ДНК [10], однако многие из них требуют дорогостоящего оборудования и использования больших количеств ДНК.

В норме 8-oxoG эффективно репарируется 8-оксогуанин-ДНК-Л^-гликозилазами: Fpg у прокариот и OGG1 у эукариот, и процессы эти весьма индивидуальны, поэтому до сих пор существуют трудности по определению уровня содержания 8-oxoG у здоровых организмов [11-13]. При нарушении баланса между процессами образования 8-oxoG и процессами репарации происходит накопление модифицированных оснований в клетке [9, 13-17].

9 12

Методы иммунофлуоресцентного анализа обладают высокой чувствительностью (10" -10" М), что предполагает возможность быстрого и эффективного определения концентрации различных антигенов. С использованием моноклональных антител к 8-oxoG и OGG1 [2, 1820] методом иммунофлуоресцентного анализа можно определять количественное содержание и локализацию 8-oxoG и OGG1, а также отслеживать корреляцию между этими маркерами в различных клетках.

Использование животных с повышенной продукцией АФК открывает возможность для выявления роли кислородных радикалов в патогенезе ряда заболеваний, помогает изучить эффективность антиоксидантной терапии, а также найти другие пути предотвращения и лечения заболеваний, вызванных действием АФК. Одной из моделей для изучения окислительного стресса является линия крыс OXYS, характеризующаяся преждевременным старением и повышенной чувствительностью к АФК, так как симптомы различных свободнорадикальных патологий, характерных для крыс этой линии, схожи с человеческими АФК-зависимыми дегенеративными заболеваниями, такими, например, как катаракта, дистрофия сетчатки, остеопороз, гипертония, изменения в эмоциональной и когнитивной сферах и т.д. [21-24].

Цель настоящей работы заключалась в исследовании возрастной динамики маркеров окислительного стресса - 8-оксогуанина (8-oxoG) и 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (OGG1) у крыс линии OXYS и контрольной линии. Wistar, поиске ранних маркеров окисления ДНК, а также в тестировании ряда новых антиоксидантов.

В ходе выполнения работы необходимо было решить следующие задачи:

• оптимизация методов иммуносорбентного анализа и иммунофлуоресцентной микроскопии для оценки! относительного количества 8-oxoG в геномной ДНК крыс, и для количественного многоцветного совместного определения 8-oxoG и OGG1 методом иммунофлуоресцентной микроскопии;

• определение методом иммуносорбентного анализа относительного количества 8-oxoG в ДНК, выделенной из легких и печени крыс линий OXYS и Wistar, в зависимости от возраста животных, а также оценка методом иммунофлуоресцентной микроскопии относительного количества 8-oxoG в геномной ДНК клеток печени крыс линий OXYS и Wistar различных возрастных групп;

• анализ методом многоцветной иммунофлуоресцентной микроскопии содержания 8-oxoG и OGG1 в ядрах нервных клеток различного типа СА-1 и СА-3 области гиппокампа и фронтальной коры левого полушария головного мозга 1 и 3 месячных крыс линий OXYS и Wistar;

• исследование антиокислительной активности, мутагенности и генотоксичности трех новых серусодержащих производных 2,6-диметилфенола в бактериальных тест-системах, а также в зародышевых клетках мышей методом учета доминантных летальных мутаций, кроме того, оценка влияния антиоксидантных препаратов на уровень 8-oxoG и OGG1 у экспериментальных крыс линий OXYS и Wistar.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Саттарова, Евгения Александровна

выводы

1. Впервые показано увеличение уровня окисления геномной ДНК с образованием 8-оксогуанина в органах крыс линии OXYS, характеризующейся ускоренным старением, по сравнению с контрольной линией крыс Wistar. Оптимизированы условия для количественного определения 8-oxoG методом иммуносорбентного анализа. Показано, что в клетках легких происходит более интенсивное образование 8-oxoG, чем в клетках печени у крыс обеих линий. Относительное количество 8-oxoG, определенное методом иммунофлуоресцентной микроскопии, в клетках печени крыс линии OXYS было статистически достоверно выше, чем у крыс линии Wistar для всех исследованных возрастов животных.

2. Оптимизированы, условия для количественного анализа 8-oxoG. и OGG1 в клетках центральной нервной системы методом иммунофлуоресцентной микроскопии и определено относительное содержание этих маркеров в ядрах различных типов нервных клеток СА-1 и СА-3 в области гиппокампа и фронтальной коры левого полушария, головного мозга одно- и трехмесячных крыс линий OXYS и Wistar. Установлено' статистически, достоверное увеличение относительного количества 8-oxoG в ДНК клеток головного мозга гиппокампа и коры левого полушария у крыс линии OXYS по сравнению с крысами линии Wistar, а также увеличение уровня 8-oxoG в составе ядер нестин- и GFAP-содержащих клеток по сравнению с другими ,типами клеток, головного мозга для крыс трехмесячного возраста обеих линий. Показано увеличение содержания OGG1 в нестин-содержащих клетках по сравнению с другими клетками у одномесячных крыс обеих исследуемых линий. В возрасте 3 месяцев уровень OGG1 в нестин- и GFAP-содержащих клетках повышен по сравнению с другими клетками у крыс Wistar и OXYS.

3. Установлено, что три новых производных 2,6-диметилфенола проявляют выраженные антиокислительные свойства, и не обладают мутагенностью и генотоксичностыо. При этом 4-(3-додецилтиопропил)-2,6-диметилфенол (соединение Ф-3) обладает более выраженными. антиокислительными свойствами и способностью увеличивать выживаемость клеток, лишенных ферментов репарации, по сравнению с витамином Е и тролоксом.

4. Показано, что соединение Ф-3 существенно понижает уровень 8-oxoG в клетках мозга по сравнению с витамином Е, незначительно снижающим содержание 8-oxoG. Поскольку Ф-3 не влияет на уровень гликозилазы OGG1, удаляющей 8-oxoG из ДНК, следует полагать, что соединение Ф-3 эффективно снижает действие активных форм кислорода на ДНК за счет своих антиокислительных свойств.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Саттарова, Евгения Александровна, Новосибирск

1. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Меньшикова, Е.Б., Ланкин, В.З., Зенков, Н.К. и др. М.: Слово, 2006. - 553 с.

2. Nakabeppu, Y, Tsuchimoto, D, Yamaguchi, H, Sakumi, К. Oxidative Damage in Nucleic Acids and Parkinson's Disease // J. Neurosci. Res. 2007. - V. 85(5). - P. 919-934.

3. Pratico, D. Evidence of oxidative stress in Alzheimer's disease brain and antioxidant therapy: lights and shadows // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2008. - V. 1147. - P. 70-78.

4. Saxowsky, T.T., Meadows, K.L, Klungland, A, Doetsch, P.W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2008. — V. 105(48). P. 18877-18882.

5. Brcgeon, D., Peignon, P.A., Sarasin, A. Transcriptional mutagenesis induced by 8-oxoguanine in mammalian cells // PLoS Genet. 2009. - V. 5(7). - el000577.

6. Valavanidis, A., Vlachogianni, Т., Fiotakis, C. 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis // J. Environ. Sci. Health C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 2009. - V. 27(2). - P. 120-139.

7. Perez, D.D., Strobel, P., Foncea, R., Diez, M.S., Vasquez, L., Urquiaga, I., Castillo, O., Cuevas, A., San Martin, A., Leighton, F. Wine, diet, antioxidant defenses and oxidative damage // Ann. NY. Acad. Sci. 2002. - V. 957. - P. 136-145.

8. Singh, K.K. Mitochondria damage checkpoint, aging, and cancer // Ann. NY Acad. Sci. -2006. V. 1067.-P. 182-190.

9. Gedik, C.M., Collins, A. ESCODD (European Standards Committee on Oxidative DNA Damage). Establishing the background level of base oxidation in human lymphocyte DNA: results of an interlaboratory validation study // FASEB J. 2005. - V. 19(1). - P. 82-84.

10. Pilger, A., Rudiger, H. 8-Hydroxy-2-deoxyguanosine as a marker of oxidative DNA damage related to occupational and environmental exposures // Int. Arch. Occup. Environ. Health.-2006.-V. 80.-P. 1-15.

11. Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods. European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD) // Free Radic. Biol. Med. 2003. - V. 34(8). - P. 1089-1099.

12. Collins, A.R. Assays for oxidative stress and antioxidant status: applications to research into the biological effectiveness of polyphenols // Am. J. Clin. Nutr. — 2005. — V. 81. — P. 261267.

13. Collins, A.R., Cadet, J., Moller, L., Poulsen, H.E., Vina, J. Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells? // Arch. Biochem. Biophys. — 2004.-V. 423.-P. 57-65.

14. European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD) Comparison of different methods of measuring 8-oxoguanine as a marker of oxidative DNA damage // Free Radic. Res.-2000.-V. 32.-P. 333-341.

15. Barja, G. Free radicals and aging // Trends Neurosci. 2004. - V. 27. - P. 595-600.

16. Ohno, M., Oka, S., Nakabeppu, Y. Quantitative analysis of oxidized Guanine, 8-oxoguanine, in mitochondrial DNA by immunofluorescence method // Methods Mol. Biol. — 2009.-V. 554.-P. 199-121.

17. Conlon, K.A., Grollman, A.P., and Berrios, M. Immunolocalization of 8-oxoguanine in nutrient-deprived mammalian tissue culture cells // J. Histotechnol. 2000. - V. 23. - P. 3744.

18. Conlon, K.A., Zharkov, D.O., Berrios, M. Immunofluorescent localization of the murine 8-oxoguanine DNA glycosylase (mOGGl) in cells growing under normal and nutrient deprivation conditions // DNA Repair. 2003. - V. 2. - P. 1337-1352.

19. Bobko, A.A., Sergeeva, S.V., Bagryanskaya, E.G., Markel, A.L., Khramtsov, V.V., Reznikov, V.A., and Kolosova, N.G. 19F NMR measurements of NO production in hypertensive ISIAH and OXYS rats // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. - V. 330. -P. 367-370.

20. Колосова, H. Г., Лебедев, П.А., Айдагулова, C.B., Морозкова, Т.С. Крысы OXYS как модель сенильной катаракты // Бюлл. Эксперим. Биол. и Мед. 2003. - V. 36(4). — Р. 415-419.

21. Marsili, S., Salganik, R.I., Albright, C.D., Freel, C.D., Johnsen, S., Peiffer, R.L., Costello, M.J. Cataract formation in a strain of rats selected for high oxidative stress // Exp. Eye. Res. 2004. - V. 79(5). - P. 595-612.

22. Naqui, A. Chance B. Reaction oxygen intermediates in biochemistry // Arm. Rev. Biochem. 1986.-V. 55. —P. 137-166.

23. Bandy, В., Davison, A.J. Mitochondrial mutations may increase oxidative stress: implications for carcinogenesis and aging? // Free Radical Biol. Med. — 1990. — V. 8. P. 523535.

24. Mori, H., Arai, Т., Mori, K. et al. Use of M4PO and oxygen -17 in the study hydroxyl radical generation in the hypoxanthine- xanthine oxidize reaction // Biochem. Mol. Biol. Int. — 1994. V. 32.-P. 523-529.

25. Болдырев, A.A. Окислительный стресс и мозг // Соросовский образовательный журнал. 2001. - Т. 7.-С. 21-28.29. von Sonntag, С. Free-Radical-Induced DNA Damage and Its Repair: A Chemical Perspective. Berlin - Heidelberg.: Springer, 2006. - 523 p.

26. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т. 12. - С. 13-19.

27. Brunory, М., Rotilio, G. Biochemistry of oxygen radical species // Methods Enzymol. -1984.-V. 105.-P. 22-35.

28. Ioshida, R., Hayaishi, O. Overview: Superoxygenase // Methods Enzymol. 1984. - V. 105.-P. 61-70.

29. Lovaas, E. Free radical generation and coupled thiol oxidation by lactoperoxidase SCN-/Н202//Free Radical Biol. Med. 1992.-V. 13.-P. 187-195.

30. Block, E.R. Hydrogen peroxide alters the physical state and function of the plasma membrane of pulmonary artery endothelial cells // J. Cell. Physiol. 1991. - V. 146(3). - P. 362-369.

31. Гамалей, И.А., Клюбин, И.В. Перекись водорода как сигнальная молекула // Цитология. 1996. - Т. 38. - С. 1233-1247.

32. Chen, R., Warden, J.T., Stonken, J.A. Microdialysis sampling combined with electron spin resonance for superoxide radical detection in microliter samples // Anal. Chem. — 2004. -V. 76(16).-P. 4734-4740.

33. Свободнорадикальное окисление и старение / Хавинсон, В.Х., Баринов, В.А., Арутюнян, А.В., Малинин, В.В. СПб.: Наука, 2003. - 327 с.

34. Byczkowski, J.Z., Gessner, Т. Biological role of superoxide ion- radical // Int. J. Biochem. 1988. - V. 20. - P. 569-580.

35. Kalra, J., Chaudhary, A.K., Massey, K.L., Prasad, K. Effect of oxygen free radicals, hypoxia and pH on the release of liver lysosomal enzymes // Mol. Cell Biochem. 1990. - V. 94(1).-P. 1-8.

36. Weiss, S.J. The role of superoxide in the destruction of erythrocyte targets by human neutrophils // J. Biol. Chem. 1980. - V. 255(20). - P. 9912-9917.

37. Dix, T.A., Aikens, J. Mechanisms and biological relevance of lipid peroxidation initiation // Chem Res Toxicol. 1993. - V. 6(1). - P. 2-18.

38. Владимиров, Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биомембранах М.: Наука, 1972. - 272 с.

39. Berki, Т., Nemeth, P. Photo-immunotargeting with haematoporphyrinconjugates activated by a lowpower He-Ne laser // Cancer Immunol. Immunother. 1992. - V. 35. — P. 69-74.

40. Осипов, Ф.Н., Азизова, О.А., Владимиров, Ю.В. Активные формы кислорода и их роль в организме // Успехи Биол. Химии. 1990. - Т. 31. - С. 180-208.

41. Vladimirov, Y.A., Olenev, V.I., Suslova, N.B., Cheremissina, Z.P. Lipid peroxidation in mitochondrial membrane // Adv.Lipid.Res. 1980. - V. 17. - P. 173-249.

42. Leisman, G.B., Daub, M.E. Singlet oxygen yields, optical properties and photo toxicity of reduced derivatives of the photosensitizer cercosporin // Photochem. Photobiol. — 1992. -V. 55.-P. 373-379.

43. Cadenas, E., Boveres, A., Chance, B. Low-level chemiluminescence of biological systems //Methods in Enzymology, N.Y.: Acad. Press. 1984. - V. 105. - P. 211-242.

44. Зенков, H.K., Меныцикова, Е.Б., Шергин, C.M. Окислительный стресс. Диагностика, терапия, профилактика. Новосибирск.: РАМН, Сибирское отделение, 1993.- 181 с.

45. Aust, А.Е., Eveleigh, J.F. Mechanisms of DNA oxidation // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -1999. V. 222(3). - P. 246-252.

46. Simic, M.G., Bergtold, D.S., Karam, L.R. Generation of oxy radical in biosystems // Mutat. Res. 1989. - V. 214. - P. 3-12.

47. Imlay, J.A., Linn, S. DNA damage and oxygen radical toxicity // Science. 1988. - V. 240.-P. 1302-1309.

48. Richards, D.M., Dean, R.T., Jessup, W. Membrane proteins are critical targets in free radical mediated cytolysis // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - V. 946(2). - P. 281-288.

49. Melov, S. Animal models of oxidative stress, aging and therapeutic antioxidant interventions // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2003. - V. 34. - P. 1395-1400.

50. Маеда, X., Акаике, Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. 1998. — Т. 63. — С. 1007-1019.

51. Sagone, F.L., Greewald, J., Kraut, E.N.et al. Glucose: a role as a free radical scavenger in biological systems//J. Lab. Clin. Med. 1983. -V. 101.-P. 97-104.

52. Thornalley, P.J. Protein and nucleotide damage by glyoxal and methylglyoxal in physiological systems—role in ageing and disease // Drug Metabol. Drug Interact. — 2008. V. 23(1-2).-P. 125-150.

53. Van Remmen, H., Jones, D.P. Current thoughts on the role of mitochondria and free radicals in the biology of aging // J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 2009. - V. 64(2). - P. 171-174.

54. Spiteller, G. The important role of lipid peroxidation processes in aging and age dependent diseases // Mol. Biotechnol. 2007. - V. 37(1). - P. 5-12.

55. Evans, J., Maccabee, M., Hatahet, Z., Courcelle, J., Bockrath, R., Ide, H., Wallace, S. Thymine ring saturation and fragmentation products: Lesion bypass, misinsertion and implications for mutagenesis // Mutat. Res. 1993. - V. 299. - P. 147-156.

56. Chen Y.-H., Bogenhagen D.F. Effects of DNA lesions on transcription elongation by T7 RNA polymerase // J. Biol. Chem. 1993. -V. 268. - P. 5849-5855.

57. Grollman, A.P., Moriya, M. Mutagenesis by 8-oxoguanine: an enemy within // Trends Genet. 1993. - V. 9. - P. 246-249.

58. Beckman, K.B., Ames, B.N. The free radical theory of aging matures // Physiol. Rev. -1998.-V. 78(2).-P. 547-581.

59. Ames, B.N., Gold, L.S., Willett, W.C. The causes and prevention of cancer // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995. - V. 92. - P. 5258-5265.

60. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature. — 1993. V. 362.-P. 709-715.

61. Dubinina, E.E., Pustygina, A.V. Free radical processes in aging, neurodegenerative diseases and other pathological states // Biomed. Khim. 2007. - V. 53(4). - P. 351-372.

62. Dubinina, E.E., Pustygina, A.V. Oxidative modification of proteins, its role in pathologic states // Ukr. Biokhim. Zh. 2008. - V. 80(6). - P. 5-18.

63. Khansari, N., Shakiba, Y., Mahmoudi, M. Chronic inflammation and oxidative stress as a major cause of age-related diseases and cancer // Recent Pat. Inflamm. Allergy Drug Discov. -2009.-V. 3(1).-P. 73-80.

64. Yan, L.J., Sohal, R.S. Analysis of oxidative modification of proteins // Curr. Protoc. Protein Sci. 2001. - Chapter 14. - Unitl4.4.

65. Wright, A., Bubb, W.A., Hawkins, C.L. et al. Singlet oxygen-mediated protein oxidation: evidence for the formation of reactive side chain peroxides on tyrosine residues. // Photochem. Photobiol. 2002,- V. 76(1). - P. 35-46.

66. Hawkins, C.L., Davies, M.J. Generation and propagation of radical reactions on proteins // Biochim. Biophys. Acta. -2001,- V. 1504(2-3). P. 196-219.

67. Gunther, M.R. Probing the free radicals formed in the metmyoglobin-hydrogen peroxide reaction // Free Radic. Biol. Med. 2004. - V. 36(11). - P. 1345-1354.

68. Jung, Т., Engels, M., Kaiser, B. et al. Intracellular distribution of oxidized proteins and proteasome in HT22 cells during oxidative stress // Free Radic. Biol. Med. -2006. V. 40(8). -P. 1303-1312.

69. Radak, Z., Chung, H.I., Goto, S. Systemic adaptation to oxidative challenge induced by regular exercise // Free Radic. Biol. Med. -2008. V. 44(2). - P. 153-159.

70. Sohal, R.S. Role of oxidative stress and protein oxidation in the aging process // Free Radic. Biol. Med. 2002. - V. 33(1). - P. 37-44.

71. Vila, M., Ramonet, D., Perier, C. Mitochondrial alterations in Parkinson's disease: new clues // J. Neurochem. 2008. - V. 107(2). - P. 317-328.

72. Davies, K.J.A. Protein damage and degradation by oxygen radicals. I. General aspects // J.Biol.Chem. 1987. -V. 262. - P. 9895-9901.

73. Friguet, B. Oxidized protein degradation and repair in ageing and. oxidative stress // FEBS Lett. 2006. - V. 580.-P. 2910-2916.

74. Jore, D., Kaouadji, M.N., Ferradini, C. Bitamin E and correlated antioxidants: Ay-radiolysis study // Antioxidants in Therapy Preventive Medicine, NY.: Plenum Press, 1990. — P. 151-154.

75. Halliwell, B. Free Radical in the brain. Aging, neurological and mental disorders / Eds. Packer, L., Philipko, L., Christen, Y. Springer-Verlag, Berlin, N.Y., London, 1992. - P. 2140.

76. Aksenov, M.Y., Aksenova, M.V., Butterfield, D.A. et al. Protein oxidation in the brain in Alzheimer's disease // Neuroscience. 2001. V. - 103(2). - P. 373-383.

77. Маркосян, K.A., Курганов, Б.И. Фолдинг, неправильный фолдинг и агрегация белков. Образование телец включения и агресом // Биохимия. — 2004. — Т. 69(9).' С. 1196-1212.

78. Junn, Е., Lee, S.S., Suhr, U.T., Mouradian, М.М. Parkin accumulation in aggresomes due to proteasome impairment // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277(49). - P. 47870-47877.

79. Porter, N. Chemistry of lipid peroxidation // Methods Enzymol. 1984. - V. 105. - P. 273-282.

80. Чудинова, B.B., Алексеев, C.M., Захарова, Е.И., Евстигнеева, Р.П. Перекисное окисление липидов и механизм антиоксидантного действия витамина Е // Биоорганическая химия. 1994. - Т. 20(10). - С. 1029-1046.

81. Peyroux, J., Sternberg, М. Advanced glycation endproducts (AGEs): pharmacological inhibition in diabetes // Pathol. Biol. (Paris). 2006. - V. 54. - P. 105-419.

82. Petersen, D.R., Doom, J.A. Reactions of 4-hydroxynonenal with proteins and cellular targets // Free Radic. Biol. Med. 2004. - V. 37. - P. 937-945.

83. Zarkovic, N. 4-hydroxynonenal as a bioactive marker of pathophysiological processes // Mol. Aspects Med. 2003. - V. 24. - P. 281-291.

84. McEwen, J.E., Zimniak, P., Mehta, J.L., Reis, R.J. Molecular pathology of aging and its implications for senescent coronary atherosclerosis // Curr. Opin. Cardiol. — 2005. V. 20. -P. 399—406.

85. Voss, P., Siems, W. Clinical oxidation parameters of aging // Free Radic. Res. 2006. -V. 40.-P. 1339-1349.

86. Esterbauer, H. Cytotoxicity and genotoxicity of lipid-oxidation products // Am. J. Clin. Nutr. 1993. - V. 57(5). - P. 779-786.

87. Van Kuijk, F.J., Holte, L.L., Dratz, E.A. 4-Hydroxyhexenal: a lipid peroxidation product derived from oxidized docosahexaenoic acid // Biochim. Biophys. Acta. 1990. - V. 1043. -P. 116-118.

88. Schaur, R.J. Basic aspects of the biochemical reactivity of 4-hydroxynonenal // Mol. Aspects Med. 2003. - V. 24. - P. 149-159.

89. Uchida, K., Itakura, K., Kawakishi, S., Hiai, H., Toyokuni, S., Stadtman, E.R. Characterization of epitopes recognized by 4-hydroxy-2-nonenal specific antibodies // Arch. Biochem. Biophys. 1995. - V. 324. - P. 241-248.

90. Poli, G., Schaur, R.J. 4-Hydroxynonenal in the pathomechanisms of oxidative stress // IUBMB Life. 2000. - V. 50. - P. 315-321.

91. Esterbauer, H., Schaur, R.J., Zollner, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes // Free Radic. Biol. Med. 1991. - V. 11.-P. 81-128.

92. Thornalley, P.J., Langborg, A., Minhas, H.S. Formation of glyoxal, methylglyoxal and 3-deoxyglucosone in the glycation of proteins by glucose // Biochem. J. 1999. - V. 344(1). -P. 109-116.

93. Leonarduzzi, G., Chiarpotto, E., Biasi, F., Poli, G. 4-Hydroxynonenal and cholesterol oxidation products in atherosclerosis // Mol. Nutr. Food Res. 2005. - V. 49. - P. 1044-1049.

94. Jenner, P. Oxidative stress in Parkinson's disease // Ann. Neurol. 2003. - V. 53(3). - P. 26-38.

95. Weber, L.W., Boll, M., Stampfl, A. Hepatotoxicity and mechanism of action of haloalkanes: carbon tetrachloride as a toxicological model // Crit. Rev. Toxicol. — 2003. — V. 33.-P. 105-136.

96. Finkel, Т., Holbrook, N. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing // Nature. — 2000.-V. 408.-P. 239-247.

97. Barja, G., Herrero, A. Oxidative damage to mitochondrial DNA is inversely related to maximum life span in the heart and brai of mammals // FASEB J. 2000. - V. 14. - P. 312318.

98. Cadenas, E., Davies, K.J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging // Free Rad. Biol. Med., 2000. - V. 29. - P. 222-230.

99. Кнорре, Д.Г., Федорова, О.С., Фролова, Е.И. Окислительная деградация нуклеиновых кислот // Успехи химии. 1993. - Т. 62. — С. 70-91.

100. Trevino, A.V., Woynarowska, В.A., Herman, T.S., Priebe, W., Woynarowski, J.M. Enhanced-topoisomerase II targeting by annamycin and related 4-demethoxy anthracycline analogues//Mol. Cancer Ther. -2004. V. 3(11).-P. 1403-1410.

101. Izzotti, A., Cartiglia, C., Taningher, M., De Flora, S., Balansky, R. Age-related increases of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine and DNA-protein crosslinks in mouse organs // Mutat. Res. -1999. V. 446(2). - P. 215-223.

102. Steenken, S. Purine bases, nucleosides and nucleotides: Aqueous solution redox chemistry and transformation of their radical cations and e~ and OH adducts // Chem. Rev. -1989.-V. 89.-P. 503-520.

103. Cadet, J., Douki, Т., Gasparutto, D., Ravanat, J.-L. Oxidative damage to DNA: Formation, measurement and biochemical features // Mutat. Res. 2003. - V. 531. — P. 5-23.

104. Olinski, R., Gackowski, D., Rozalski, R., Foksinski, M., Bialkowski, K. Oxidative DNA damage in cancer patients: A cause or a consequence of the disease development? // Mutat. Res.-2003.-V. 531.-P. 177-190.

105. Suzuki, J., Inoue, Y., Suzuki, S. Changes in the urinary excretion level of 8-hydroxyguanine by exposure to reactive oxygen-generating substances // Free Radic. Biol. Med.- 1995.-V. 18.-P. 431-436.

106. Gajewski, E., Rao, G., Nackerdien, Z. and Dizdaroglu, M. Modification of DNA bases in mammalian chromatin by radiation-generated free radicals // Biochem. — 1990. — V. 29. — P. 7876-7882.

107. Shibutani, S., Takeshita, M., Grollman, A.P. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG//Nature. 1991.-V. 349.-P. 431-434.

108. Burrows, C.J., Muller, J.G. Oxidative nucleobase modifications leading to strand scission//Chem. Rev.-1998.-V. 98.-P. 1109-1151.

109. Boiteux, S., Laval, J. Imidazole open ring 7-methylguanine: An inhibitor, of DNA synthesis // Biochem. Biophys. 1983- V. 110. - P. 552-558.

110. Patro, J.N., Wiederholt, C.J., Jiang, Y.L., Delaney, J.C., Essigmann, J.M., Greenberg, M.M. Studies on the replication of the ring opened formamidopyrimidine, FapydG in Escherichia coli // Biochemistry. 2007. - V. 46. - P. 10202-10212.

111. Asagoshi, K., Terato, H., Ohyama, Y., Ide, H. Effects of a guanine-derived formamidopyrimidine lesion on DNA replication: Translesion DNA synthesis, nucleotide insertion, and extension kinetics // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 14589-14597.

112. Friedberg, E.C., Walker, G.C., Siede, W., Wood, R.D., Schultz, R.A., Ellenberger, T. DNA Repair and Mutagenesis. Washington, D.C.: ASM Press, 2006. - 1118<p.

113. Tchou, J., Kasai, H., Shibutani, S., Chung, M.-H., J. Laval, A.P. Grollman, and S. Nishimura 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. -V. 88. - P. 4690-4694.

114. Michaels, M.L., Cruz, C., Grollman, A.P., Miller, J.H. Evidence that MutY and MutM combine to prevent mutations by an oxidatively damaged form of guanine in DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 7022-7025.

115. N-methylformamidopyrimidine // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - P. 51975202.

116. Rosenquist, T.A., Zharkov, D.O., Grollman, A.P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. — V. 94. -P. 7429-7434.

117. Berti, P.J., McCann, J.A.B. Toward a detailed understanding of base excision repair enzymes: Transition state and mechanistic analyses of N-glycoside hydrolysis and N-glycoside transfer // Chem.Rev. 2006. - V. 106. - P. 506-555.

118. Zharkov, D.O., Rosenquist, T.A., Gerchman, S.E., Grollman, A.P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase // J. Biol. Chem. 2000: -V. 275.-P. 28607-28617.

119. Girard, P.M., D'Ham, C., Cadet, J., Boiteux, S. Opposite base-dependent excision of 7,8-dihydro-8-oxoadenine by the Oggl protein of Saccharomyces cerevisiae // Carcinogenesis. -1998.-V. 19.-P. 1299-1305.

120. Stacker, R., Frei, B. Endogenous antioxidant defences in human blood plasma // Oxidative stress: oxidants and antioxidants. London.: Academic Press, 1991. — P. 213-243.

121. Frei, В., Gaziano, J.M. Content of antioxidants, preformed lipid hydroperoxides and cholesterol- as predictors of the susceptibility of human LDL to metal ion dependent and independent oxidation // J.lipid Res. 1993. - V. 34. - P. 2135-2145.

122. Зенков, Н.К., Меньшикова, Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в биологических системах // Успехи современной биологии. — 1993. — Т. 113. — С. 286296.

123. Machlin, L., Bendich, A. Free radical tissue damage: protective role of antioxidant nutrients // FASEB J. 1987. - V. 1. - P. 441-445.

124. Washko, P., Rotrosen, D., Levine, M. Ascorbic acid in human neutrophils // Am. J. Clin. Nutr. 1991. -V. 54(6).-P. 1221-1227.

125. Reiter, R.J., Tan, D.X., Poeggeler, В., Chen, L.D., Menendez Pelaez, A. Melatonin, free radicals and cancer initiation // Advances in Pineal Research. 1994. — V. 7. — P. 211-228.

126. Aruoma, O.I., Halliwell, В., Gajewski, E., Dizdaroglu, M. Copper-iron dependent damage to the bases in DNA in the pre- sence of hydrogen peroxide // Biochem. J. — 1991. — V. 273.-P. 2601-2604.

127. Krinsky, N.I., Deneke, S.M. Interaction of oxygen and oxy-radicals with carotenoid // J.Natl.Cancer Inst. 1982. - V. 69. - P. 205-209.

128. Al-Turk, W.A., Stohs, S.J., El-Rashidy, F.H., Othman, S., Shaheen, O. Changes in glutathione, glutathion reductase and glutathione-S-transferase as a function of concentration and age // Pharmacology. 1987. - V. 34. - P. 1-8.

129. Farooqui, M.Y., Day, W.W., Zamorano, D.M. Glutathione and lipid peroxidation in the aging rat // Comp.Biochem.Physiol. 1987. - V. 88. - P. 177-180.

130. Владимиров, Ю.А., Азизова, О.А., Деев, А.И. и др. Свободные радикалы в живых системах // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика / ВИНИТИ. 1991. — Т. 29. — С. 1252.

131. Душкин, М.И. Биологическая роль окисленных производных холестерина в клетках млекопитающих // Успехи соврем, биологии. 1991. - Т. 111. — С. 845-857.

132. Yasuda, М., Fujita, Т. Effect of lipid peroxidation on phospholipase A2 activity of rat liver mitochondria // J.Pharmacol. Jpn. 1977. - V. 27. - P. 429-435.

133. Rivett, A.J. High molecular mass intracellular proteases // Biochem. J. 1989. - V. 263. -P. 625-633.

134. Stadtman, E.R. Protein modification in aging // J.Gerontol. 1988. - V. 43. - P. 112120.

135. Davies, К.J.A., Goldberg, A.L. Oxygen radicals stimulate proteolysis and lipid peroxidation by independent mechanisms in erythrocytes // J. Biol. Chem. J. — 1987. — V. 262. -P. 8220-8226.

136. Кения, M.B., Лукаш, А.И., Гуськов, Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при окислительном стрессе // Успехи современной биологии. — 1993. — Т. 113. — С. 456470.

137. Кулинский, В.И., Колесниченко, Л.С. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы // Успехи соврем, биологии. — 1993. Т. 113. - С. 107122.

138. Aruoma, O.I., Grootveld, М., Bahorun, Т. Free radicals in biology and medicine: from inflammation'to biotechnology // Biofactors. 2006. - V. 27(1-4). - P. 1-3.

139. Roberts, L.J., Moore, K.P., Zackert, W.E., Oates, J. A., Morrow, J.D. Identification of the major urinary metabolite of the F2-isoprostane 8-iso-prostaglandin F2alpha in humans // J. Biol. Chem. 1996. -V. 271. - P. 20617-20620.

140. Basu, S. Isoprostanes: Novel bioactive products of lipid peroxidation // Free Radic. Res. -2004,-V. 38.-P. 105-122.

141. Cracowski, J.L., Stanke-Labesque, F., Souvignet, C., Bessard, G. Isoprostanes: New markers of oxidative stress in human diseases // Presse Med. — 2000. — V. 29. P. 604-610.

142. Salahudeen, A.K., Reckelhoff, J.F., Morrow, J.D., Roberts, L.J. F2-isoprostanes and the kidney // Drug News Perspect. 1998. - V. 11. - P. 287-290.

143. Roberts, L.J., Reckelhoff, J.F. Measurement of F(2)-isoprostanes unveils profound oxidative stress in aged rats // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 287. - P. 254256.

144. Wong, S.H., Knight, J.A., Hopfer, S.M., Zaharia, O., Leach, C.N. Jr., Sunderman, F.W., Jr. Lipoperoxides in plasma as measured by liquid-chromatographic separation of malonaldehyde-thiobarbituric acid adduct // Clin. Chem. 1987. - V. 33. - P. 210-220.

145. Mutlu-Turkoglu, U., Ilhan, E., Oztezcan, S., Kuru, A., Aykac-Toker, G., Uysal, M. Age-related increase in plasma malondialdehyde and protein carbonyl levels and lymphocyte DNA damage in elderly subjects // Clin. Biochem. 2003. - V. 36. - P. 397-400.

146. Hernanz, A., Fernandez-Vivancos, E., Montiel, C., Vazquez, J.J., Arnalich, F. Changes in the intracellular homocysteine and glutathione content associated with aging // Life Sci. -2000.-V. 67.-P. 1317-1324.

147. Diamond, J., Skaggs, J., Manaligod, J.M. Free-radical damage: A possible mechanism of laryngeal aging//Ear. Nose Throat. -2002. V. 81.-P. 531-533.

148. Gil, L., Siems, W., Mazurek, В., Gross, J., Schroeder, P., Voss, P., Grune, T. Age-associated analysis of oxidative stress parameters in human plasma and erythrocytes // Free Radic. Res. 2006. - V. 40(5). - P. 495-505.

149. Requena, J.R., Levine, R.L., Stadtman, E.R. Recent advances in the analysis of oxidized proteins // Amino acids. 2003. - V. 25. - P. 221-226.

150. Stadtman, E.R., Levine, R.L. Free radical-mediated oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins // Amino acids. 2003. — V. 25. — P. 207-218.

151. Tom, A., Nair, K.S. Assessment of branched-chain amino acid status and potential for biomarkers // J. Nutr. 2006. - V. 136. - P. 324-330.

152. Lee, A.T., Cerami, A. Role of glycation in aging // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992. - V. 663.-P. 63-70.

153. Allen, T.J., Waldron, M.J., Casley, D., Jerums, G., Cooper, M.E. Salt restriction reduces* hyperfiltration, renal enlargement, and albuminuria in experimental diabetes // Diabetes. — 1997.-V. 46(1).-P. 19-24.

154. Richter, C. Biophysical consequence of lipid peroxidation in membranes // Chem. Phys. Lipids. 1987.-V. 44.-P. 175-189.

155. Poon, H.F., Calabrese, V., Scapagnini, G., Butterfield, D.A. Free radicals and brain aging // Clin. Geriatr. Med. 2004. - V. 20. - P. 329-359.

156. Chevion, M., Berenshtein, E., Stadtman, E.R. Human studies related to protein oxidation: Protein carbonyl content as a marker of damage // Free Radic. Res. — 2000. — V. 33. -P. 99-108.

157. Buss, H., Chan, T.P., Sluis, K.B., Domigan, N.M., Winterbourn, C.C. Protein carbonyls measurement by a sensitive ELISA method // Free Radic. Biol. Med. 1997. - V. 23. - P. 361-366.

158. Stadtman, E.R. Role of oxidant species in aging // Curr. Med. Chem. 2004. - V. 11.-P. 1105-1112.

159. Daneshvar, В., Dragsted, L.O., Frandsen, H., Autrup, H. y-Glutamyl semialdehyde and 2-amino apidic semialdehyde: biomarkers of oxidative damage to proteins // Biomarkers. -1997.-V. 2.-P. 117-123.

160. Gladilin, S., Bidmon, H.J., Divanaeh et al. Ebselen lowers plasma interleukin-6 levels and glial heme oxygenase-1 expression after focal photothrombotic brain ischemia // Arch. Biophys. 2000. - V. 380(2). - P. 237-242.

161. Heinecke, J., Li, W., Daehnke A. et al. Dityrosine, a specific marker of oxidation, is synthesized by the myeloperoxidase-hydrogen peroxide system of human neutrophils and; macrophages // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268(6). - P. 4069-4077.

162. Culcasi, M., Lafon-Cazal, M., Pietri, S., Bockaert, J. Glutamate receptors induce a burst of superoxide via activation of nitric oxide synthase in arginine-depleted neurons // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269(17). - P. 12589-12593.

163. Floyd, R.A. Antioxidants, Oxidative Stress, and Degenerative Neurological Disorders // PSEBM. 1999. - V. 222(3). - P. 236-245.

164. Beal, M.F. Oxidatively modified proteins in aging and disease // Free Radic. Biol. Med. -2002.-V. 32.-P. 797-803.

165. Ferrer, I., Blanco, R., Cutillas, В., Ambrosio, S. Fas and Fas-L expression in Huntington's disease and Parkinson's disease // Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2000. - V. 26(5).-P. 424-433.

166. Турпаев, K.T. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии генов // Биохимия. 2002. - Т. 67(3). - С. 339-352.

167. Dizdaroglu, М. Chemical determination of free radical-induced damage to DNA // Free Radic. Biol. Med. 1991. -V. 10(3-4). - P. 225-242.

168. Brunk, U.T., Terman, A. Lipofuscin: Mechanisms of agerelated accumulation and influence on cell function // Free Radic. Biol. Med. 2002. - V. 33. - P. 611-619.

169. Floyd, R.A. Role of oxygen free radicals in carcinogenesis and brain ischemia // FASEB J. 1990. - V. 4. - P. 2587-2597.

170. Lu, Т., Pan, Y., Kao, S.Y., Li, C., Kohane, I., Chan, J., Yankner, B.A. Gene regulation and DNA damage in the ageing human brain // Nature. 2004. - V. 429. - P. 883-891.

171. Shigenaga, M.K., Ames, B.N. Assay for 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine: a biomarker of in vivo oxidatve DNA damage // Free Radic. Biol. Med. 1991. - V. 10(3-4). - P. 211-220.

172. Lee, B.M., Kwack, S.J., Kim, H.S. Age-related changes in oxidative DNA damage and benzo(a)pyrene diolepoxide-I, (BPDE-I)-DNA adduct levels in human stomach // J. Toxicol. Environ. Health. 2005. - V. 68. - P. 1599-1610.

173. Randerath, K., Li, D.H., Randerath, E. Age-related DNA modifications (I-compounds): Modulation by physiological and pathological processes // Mutat. Res. 1990. - V. 238. - P. 245-253.

174. Gedik, C.M., Boyle, S.P., Wood, S.G., Vaughan N.J., Collins, A.R. Oxidative stress in humans: Validation of biomarkers of DNA damage // Carcinogenesis. 2002. - V. 23. - P. 1441-1446.

175. Halliwell, В., Gutteridge, J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine // 2nd ed. -Oxford.: Clarendon Press, 1989. 543 p.

176. Kasai, H., and Nishimura, S. Hydroxylation of deoxyguanosine at the C-8 position by ascorbic acid and other reducing agents // Nucleic Acids Res. 1984. - V. 12. - P. 2137-2145.

177. Dizdaroglu, M. Formation of an 8-hydroxyguanine moiety in deoxyribonucleic acid on gamma-irradiation in aqueous solution // Biochemistry. 1985. - V. 24. - P. 4476-4481.

178. Shigenaga, M.K., Gimeno, C.J., Ames, B.N.-Urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine as a biological marker of in vivo oxidative DNA damage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. -V. 86.-P. 9697-9701.

179. Moriya, M., Ou, С., Bodepudi, V., Johnson, F., Takeshita, M., Grollman, A. Site-specific mutagenesis using a gapped duplex vector: a study of translesion synthesis past 8-oxodeoxyguanosine in E. coli // Mutat. Res. 1991. - V. 254. - P. 281-288.

180. Cheng, K.C., Cahill, D.S., Kasai, H., Nishimura, S., Loeb, L.A. 8-Hydroxyguanine, an abundant form of oxidative DNA damage, causes G-T and A-C substitution //J. Biol. Chem. — 1992.-V. 267.-P. 166-172.

181. Halliwell, B. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence? // Lancet. 1994. - V. 344. - P. 721-724.

182. Pouget, J.P., Douki, Т., Richard, M.J., Cadet, J. DNA damage induced in cells by у and UVA radiation as measured by HPLC/GC-MS and HPLC-EC and comet assay // Chem. Res. Toxicol. 2000. - V. 13. - P. 541-549.

183. Yin, В., Whyatt, R.M., Perera, F.P., Randallk M.C., Cooper, T.B., Santella, R.M. Determination of 8-hydroxydeoxyguanosine by an immunoaffinity chromatography-monoclonal antibody-based ELISA // Free Radical Biol. Med. 1995. - V. 18. - P. 10231032.

184. Collins, A.R., Cadet, J., Ере, В., Gedik, C. Problems in the measurement of 8-oxoguanine in human DNA. Report of a workshop, held in Aberdeen // Carcinogenesis. -1997.-V. 18. P. 1833-1836.

185. Иммуноферментный анализ // Под ред. Т. Т. Нго, Г. Ленхофф. М.: Мир, 1988. -446 с.

186. Harman, D. Free radical theory of aging: nutritional implications // Age. 1978. - V. 1. -P. 143-150.

187. Laganiere, S., Yu, B.P. Effect of chronic food restriction in aging rats. I. Liver subcellular membranes // Mech. Dev. 1989. - V. 48. - P. 207-219.

188. Wolfe, L.S. Eicosanoids: prostaglandins, thromboxanes, leukotrienes, and other derivatives of carbon-20 unsaturated fatty acids // J. Neurochem. 1982. - V. 38. - P. 1-14.

189. Vijg, J. DNA sequence changes in aging: how frequent, how important? // Aging. -1990.-V. 2(2).-P. 105-123.

190. Dolle, M.E., Snyder, W.K., Duttson, D.B., Vijg, J. Mutational fingerprints of aging // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - P. 545-549.

191. Giese, H., Snyder, W.K., van Ooslman, C. et al. Age-related mutation accumulation at a lacZ reporter locus in normal and tumor tissues of Trp53-deficient mice // Mutat. Res. 2002. -V. 514. — P. 153-163.

192. De Haan, C., Gelman, R., Watson, A. A putative gene causes variability in lifespan among genotypicall у identical mice // Nature Genet. — 1998. — V. 19(2). P. 103-104.

193. Alexander, J. Use of transgenic mice in identifying chemopreventive agents // Toxicol. Lett.-2000.-V. 112-113.-P. 507-512.

194. Wong, A.W., McCallum, G.P., Jeng, W., Wells, P.G. Oxoguanine Glycosylase 1 Protects Against Methamphetamine-Enhanced Fetal Brain Oxidative DNA Damage and Neurodevelopmental Deficits // J. Neurosci. 2008. - V. 28(36). - P. 9047-9054.

195. Takeda, Т., Matushtta, Т., et al. Pathobicdogy of the senescence-accelerated mouse (SAM) // Exp. Gerontol. 1997. - V. 32. - P. 117-127.

196. Takeda, T. Senescence-accelerated mouse (SAM): a biogerontological resourse in aging research // Neurobiol. Aging. 1999. - V. 20. - P. 105-110.

197. Hosokawa, M. A higher oxidative status accelerates senescence and aggravates age-related disorders in SAMP strains of mice // Mech. Ageing Dev. 2002. - V. 123. - P. 15531561.

198. Юнева, M.O., Гусева, И.В., Болдырев, A.A. Линия мышей SAM как модель процесса старения, вызываемого активными формами кислорода // Успехи геронтол. -2000.-Т. 4.-С. 147-152.

199. Park, J.W., Choi, С.Н., Kim М. S., Chung M. H. Oxidative status in senescence-accelerated mice // J. Gerontol. Biol. Sci. Med. 1996. -V. 51(5). - P. 337-345.

200. Miyamoto, H., Manabe, N., Mitani, Y. et al. Female reproductive properties and prenatal development of a senescence-accelerated mouse strain // J. Exp. Zool. — 1995. — V. 272. — P. 116-122.

201. Урываева, И.В., Маршак T.JI., Захидов C.T. и др. Микроядрышковые аберрации накапливаются с возрастом в клетках печени мышей линии SAM с ускоренным старением // Докл. РАН. 1999. - Т. 368. - С. 703-705.

202. Розенфельд, С.В., Того, Е.Ф., Михеев, B.C. и др. Влияние эпиталона на частоту хромосомных повреждений у мышей SAM с ускоренным старением // Бюл. экспер. биол. мед. 2002. - Т. 133. - С. 320-322.

203. Bartke, A., Brown-Borg, H., Mattison, J. et al. Prolonged longevity of hypopitui-tary mice//Exp. Gerontol.-2001.-V. 36.-P. 21-28.

204. Brown-Borg, H.M., Borg, K.E., Meliska, C.J., Bartke, A. Dwarf mice and the aging process //Nature. 1996. -V. 384. - P. 6604-6633.

205. Qin, X., Zhang, S., Matsukuma, S. et al. Protection against malignant progression of spontaneously developing liver tumors in transgenic mice expressing O'-methylguanine-DNA methyltransferase // Jpn. J. Cancer Res. 2000. - V. 91.-P. 1085-1089.

206. Колосова, Н.Г., Щеглова, T.B., Амстиславская, Т.Г., Лоскутова, Л.В. Сравнительный анализ содержания продуктов ПОЛ в структурах мозга крыс Вистар и OXYS разного возраста // Бюлл. эксп. биол. 2003. - Т. 135. - С. 696-699.

207. Колосова, Н.Г., Гришанова, А.Ю., Крысанова, Ж.С., Зуева, Т.В., Сидорова, Ю. А., Синицина, О.И. Возрастные изменения окисленности белков и липидов в печени преждевременно стареющих крыс OXYS // Биомедицинская химия. — 2004. — Т. 50: С. 73-78.

208. Колосова, Н.Г., Лебедев, П.А., Дикалова, А.Э. Сравнительный анализ способности антиоксидантов предупреждать развитие катаракты у преждевременно стареющих крыс OXYS // Бюлл. эксп. биол. 2004. - Т. 137. - С. 280-284.

209. Valko, M., Rhodes, C.J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer // Chem. Biol. Interact. — 2006. — V. 160(1). — P.1-40.

210. Valko, M., Izakovic, M., Mazur, M., Rhodes, C.J., Telser, J. Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence // Mol. Cell. Biochem. 2004. - V. 266(1-2). - P. 37-56;

211. Klaunig, J.E., Kamendulis, L.M. The role of oxidative stress in carcinogenesis // Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2004. - V. 44. - P. 236-267.

212. Weinberg, F., Chandel, N.S. Reactive oxygen species-dependent signaling regulates cancer // Cell. Mol. Life.Sci. 2009. - Epub ahead of print.

213. Gilboa.R, Zharkov DO, Golan G, Fernandes AS, Gerchman SE, Matz E, Kycia JH, Grollman AP, Shoham G. Structure of formamidopyrimidine-DNA glycosylase covalently complexed to DNA (2002) J Biol Chem., 277(22), 19811-19816.

214. Cabrera, M., Nghiem, Y., Miller, J.H. MutM, a second mutator locus in Escherichia coli that generates G.C=T.A transversions // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 5405-5407.

215. Nghiem, Y., Cabrera, M., Cupples, C.G., Miller, J.H. The mutY gene: a mutator locus in Escherichia coli that generates G.C-T.A transversions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. -V. 85.-P. 2709-2713.

216. Levin, D.E., Hollstein, M. Christman, E.A. Schwiers, E.A. Ames, B.N. A new Salmonella tester strain (TA102) with A X T base pairs at the site of mutation detects oxidative mutagens // Proc. Natl. Acad. Sci. 1982. - V. 79. - P. 7445-7449.

217. Досон, P.', Элиот, Д., Элиот, У., Джонс, К. Справочник биохимика // М;.: Мир, 1991. 429 с.

218. Ере, В., Pflaum, М!, and Boiteux, S. DNA damage induced by photosensitizers in cellular and cell-free systems // Mutat. Res. 1993. - V. 299. - P. 135-145.

219. Maron, D.M., Ames, B.N. Revised method s for the Salmonella mutagenicity test // Mutat Res. 1983.- V. 113(3-4).-P. 173-215.

220. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике // М.: Мир. -395 с.

221. Cupples, C.G., Miller, J.H. A set of lacZ mutations in Escherichia coli that allow rapid detection of each of the six base substitutions // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1989. — V. 86(14). — P. 5345-5349.

222. Miller, J.H., Michaels, M. Finding new mutator strains of Escherichia coli a review // Gene. - 1996. - V. 179(1). - P. 129-132.

223. Методические рекомендации Фармакологического государственного комитета РФ "Оценка мутагенных свойств фармакологических средств" // Ведомости фармакологического комитета. 1998. - Т. 4. - С. 37-38.

224. Колосова, Н.Г., Лебедев, П.А., Фурсова, А.Ж., Морозкова, Т.С., Гусаревич, О.Г. Преждевременно стареющие крысы OXYS как модель сенильной катаракты человека // Успехи геронтологии. 2003. - Т. 12. - С. 143-148.

225. Лоскутова, Л.В., Колосова, Н.Г. Эмоциоциональный статус и способность к однократному обучению у крыс линии OXYS с наследственно повышенной способностью к радикалообразованию // Бюлл. эксперим. биол. 2000. — Т. 8. — С. 155— 158.

226. Kolosova, N.G., Lebedev, P.A., and Dikalova, A.E. Comparison of antioxidants in the ability to prevent cataract in prematurely aging OXYS rats // Bull. Exp. Biol. Med. 2004. -V. 137.-P. 249-251.

227. Esposito, L.A., Kokoszka, J.E., Waymire, K.G., Cottrell, В., MacGregor, G.R., Wallace, D.C. Mitochondrial oxidative stress in mice lacking the glutathione peroxidase-1 gene // Free Radic. Biol. Med. 2000. - V. 28(5). - P. 754-756.

228. Inbred strains of rats: OXYS Rat genome. 1996. - P. 52-54.

229. Колосова, Н.Г., Айдагулова, С.В., Непомнящих, Г.И., Шабалина, И.Г., Шалбуева, Н.И. Динамика структурно-функциональных изменений митохондрий гепатоцитов преждевременно стареющих крыс линии OXYS // Бюлл. эксп. биол. мед. 2001. - V. 132.-Р. 814-819.

230. Shigenaga, М.К., Hagen, Т.М., Ames, B.N. Oxidative damage and mitochondrial decay in aging // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 10771-10778.

231. Richter, C., Park, J.W., Ames, B.N. Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 6465-6467.

232. Yoon, S.H., Hyun, J.W., Choi, J., Choi, E.Y., Kim, H.J., Lee, S.J., Chung, M.H. In vitro evidence for the recognition of 8-oxoGTP by Ras, a small GTP-binding protein // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. - V. 327. - P. 342-348.

233. Frank, A., Seitz, H.K., Bartsch, H., Frank, N., Nair, J. Immunohistochemical detection of 1 ,N6-ethenodeoxyadenosine in nuclei of human liver affected by diseases predisposing to hepatocarcinogenesis // Carcinogenesis. -2004. V. 25. -P. 1027-1031.

234. Афанасьев, Ю.И., Юрина, H.A., Кузнецов, C.JI. Гистология, цитология и эмбриология. -М.: Медицина; Издание б-е, перераб. и доп., 2004. 768 с.

235. Benedetti, S., Pirola, В., Polio, B. et al. Gene therapy of experimental brain tumors using neural progenitor cells // Nat. Med. 2000. - V. 6(4). - P. 447-450.

236. Stemple, D.L., Mahanthappa, N.K. Neural stem cells are blasting off // Neuron. 1997. -V. 18.-P. 1-4.

237. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F.G., Lyman, W.D. Cjmparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord // Neurol.Res. 2000. - V. 23(2-3). - P. 260266.

238. Murali, G., Panneerselvam, C. Age-associated oxidative macromolecular damages in rat brain regions: role of glutathione monoester // J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 2007. - V. 62(8). - P. 824-830.

239. Eichenbaum, H. The hippocampus and declarative memory: cognitive mechanisms and neural codes // Behav. Brain Res. 2001. - V. 127. - P. 199-207.

240. Markesbery, W.R., Kryscio, R.J., Lovell, M.A. and Morrow, J.D. Lipid peroxidation is an early event in the brain in amnestic mild cognitive impairment // Ann. Neurol. 2005. - V. 58.-P. 730-735.

241. Miller, D.B. and O'Callaghan, J.P. Aging, stress and the hippocampus // Ageing Res. Rev. 2005. - V. 4. - P. 123-140.

242. Jazwinski, S.M. Genetics of longevity // Exp. Gerontol. 1998. - V. 33(7-8). - P. 773783.

243. Wilson, D.M., III, McNeill, D.R. Base excision repair and the central nervous system 11 Neuroscience. — 2007. — V. 145.-P. 1187-1200.

244. Просенко, A.E., Марков, А.Ф., Хомченко, A.C., Бойко, М.А., Терах, Е.И., Кандалинцева, Н.В. Синтез и антиокислительная активность алкил-3-(4-гидроксиарил)пропилсульфидов // Нефтехимия. 2006. - Т. 46(6). - С. 471-475.

245. Просенко, А.Е., Дюбченко, О.И., Терах, Е.И., Марков, А.Ф., Горох, Е.А., Бойко, М.А. Синтез и исследование антиокислительных свойств алкилзамещенных гидроксибензилдодецилсульфидов // Нефтехимия. — 2006. Т. 46(4). — С. 310-318.

246. De Flora, S., Bennicelli, С., Rovida, A., Scatolini, L., Camoirano, A. Inhibition of the 'spontaneous' mutagenicity in Salmonella typhimurium ТА 102 and ТА 104 // Mutat. Res. -1994.-V. 307.-P. 157-167.

247. Grey, C.A., Adlercreutz, P. Ability of antioxidants to prevent oxidative mutations in Salmonella typhimurium TA102 // Mutat. Res. 2003. - V. 527. - P. 27-36.

248. Marczewska, J., Koziorowska, J. Effects of iron and copper ions on the inducibility of hydrogen peroxide in E. coli // Acta. Pol. Phar. 2000. - V. 27. - P. 49-52.

249. Asad, N.R., Asad, L.M., Silva, A.B. et al. Hydrogen peroxide effects in Escherichia coli cells // Acta. Biochim. Pol. 1998. - V. 45. - P. 677-690.

250. Eder, E., Favre, A., Stichtmann, C., Deininger, C. Induction of sfiA SOS function by peroxides using three different E. coli strains // Toxicol. Lett. — 1989. — V. 48. P. 225-234.

251. Imlay, J.A., Linn, S. Mutagenesis and stress responses induced in Escherichia coli by hydrogen peroxide // J. Bacteriol. 1987. - V. 169(7). - P. 2967-2976.

252. Gomes, E.M., Souto, P.R.F., Felzenszwalb, I. Shark-cartilage containing preparation protects cells against hydrogen peroxide induced damage and mutagenesis // Mutat. Res. -1996. -V. 367.-P. 203-208.

253. Muller, J., Janz, S. Modulation of the H202-induced SOS response in Escherichia coli PQ300 by amino acids, metal chelators, antioxidants, and scavengers of reactive oxygen species // Environ. Mol. Mutagen. 1993. - V. 22. - P. 157-162.

254. Nakayama, Т., Hiramitsu, M., Osawa, Т., Kawakishi, S. The protective role of gallic acid esters in bacterial cytotoxicity and SOS responses induced by hydrogen peroxide // Mutat. Res. 1993. - V. 303, - P. 29-34.

255. Duthie, S.J., Ma, A., Ross, M.A., Collins, A.R. Antioxidant supplementation decreases oxidative DNA damage in human lymphocytes // Cancer Research. 1996. - V. 56, - P. 1291-1295.

256. Оценка мутагенности новых лекарственных средств. Методические рекомендации. -М., 1994.-20 с.

257. Ehling, U.H., Machemer, J, Buselmaier, W. et al. Standard protocol for the dominant lethal test on male mice set up by the work group "Dominant Lethal Mutations of the ad hoc Committe Chemogenetics // Arch. Toxicol. 1978. - V. 39, - P. 173-185.

258. Anderson, D., Bishop, J.B., Garner, R.C., Ostrosky-Wegman, P., Selby, P.B. Cyclophosphamide: review of its mutagenicity for an assessment of potential germ cell risks MutatRes.- 1995.-V. 330,-P. 115-181.

Информация о работе

Саттарова, Евгения Александровна
кандидата химических наук
Новосибирск, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Возрастная динамика маркеров окислительного стресса у крыс линий WISTAR и OXYS - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы