Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутривидовая дифференциацияфитопатогенного гриба Botrytis стегеа Pers.в локальных популяциях.

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Внутривидовая дифференциацияфитопатогенного гриба Botrytis стегеа Pers.в локальных популяциях."

л

^ о £

о

С\(

г о

о» - , э ^

О;. ST»

На правах рукописи

Чикин Юрий Александрович

Внутривидовая дифференциация фитопатогенного гриба Botrytis cinerea Pers. в локальных популяциях.

Специальность 03.00.24. - "Микология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1997

Диссертационная работа выполнена в 1994-1997 г. на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, ст.н.сотр. Лихачев А Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Жуков A.M.

кандидат биологических наук, вед. науч. сотр. Васин В.Б.

Ведущая организация. Московская сельскохозяйственная академия им. КА Тимирязева

Защита диссертации состоится 19 декабря 1997г. в_ч. на заседании

Специализированного Совета Д.053.05.65. Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан ноября 1997г

Ученый секретарь Совета Д.053.05.65. доктор биологических наук

Лекомцева С.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гриб Botrytis cinerea Pers.: Fr (кл. Fungi mperfecti, лор. Moniliales) является возбудителем серой гнили растений, юражающим широкий круг экономически значимых культур. Особенности пюлогии этого гриба затрудняют борьбу с ним. При химическом методе >орьбы с серой гнилью существует риск возникновения устойчивых к фунгицидам форм, у которых низкоуровневая фунгицид-резистентность иожет длительно сохраняться в популяции гриба, не сншсэя его патоген-1ости. Под давлением обработок фунгицидами в популяциях грибов мо-кет происходить дивергенция и превалирование определенных жизнен-1ых форм, различающихся по экологическим, морфологическим и физио-юго-биохимическим особенностям, что может привести к началу формо-)бразовательных процессов. Знание тенденций изменения популяции фитопатогена создает основу для планирование системы защитных ме-юприятий. В связи с этим исследование структуры популяции В. cinerea шеетне только теоретическое, но и прикладное значение.

Цели работы: Целью настоящей работы было исследование ¡нутривидовой дифференциации гриба В. cinerea в популяции, разви-¡ающейся в условиях Московской области.

Задачи работы: 1)Исследовзть культурально-морфо логическое >азнообразие клонов, составляющих популяцию S. cinerea; 2)Изучить :тепень вариабельности культурально-морфологических и физиологиче-:ких признаков гриба в различных условиях на протяжении жизненного \икла; 3)Исследовать возможность взаимосвязи культурально-лорфологических признаков гриба с его патогенностью, выживаемостью в |рироде, токсинообразованием, и уровнем чувствительности к некото->ым широкоиспользуемым фунгицидам; ^Проанализировать характер >аспределения взаимосвязанных признаков у выборок из популяции cinerea и выявить возможность ее дифференциации по этим селекгив-ю значимым признакам - чувствительности к фунгицидам, патогенности и шгментообразованию.

Научная новизна. Впервые выявлены различия в жизненном 1икле у клонов 8. cinerea, составляющих популяцию фитопатогена в агро-[енозах. Проведена оценка жизнеспособности склероциев у штаммов, сличающихся по культуральным признакам, особенностям жизненного >икла и чувствительности к фунгицидам. Показано, что низкоуровневая стойчивость к исследованным фунгицидам не сказывается на вьокива-1ии склероциев гриба в почве в течение осенне-зимнего сезона и не пияет на возобновление конидиапьной стадии. Клоны В. cinerea, олерантные к исследованным фунгицидам, сохраняют патогенность к

цветкам и "плодам" земляники, но в меньшей степени поражают вегетативные органы растений. Впервые получены данные, свидетельствующие о наличии в популяции гриба штаммов, полирезистентных к взятым фунгицидам. Высказана гипотеза о том, что одним из механизмов толерантности к контактным фунгицидам может быть изменение жизненного цикла гриба.

Практическая ценность работы. Полученные результаты могут быть использованы в планировании системы защиты растений от серой гнили.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференции студентов и аспирантов (Москва, 1997), на международных конференциях (Донецк, 1997; Литва, 1997) и на заседании кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По теме диссертации сдано в печать 3 работы,

1 опубликована.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов. введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, приложения и библиографического списка литературы. Работа изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 48 работ отечественных и 87 работ зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 .Обзор литературы. В этой главе дан аналитический обзор работ по изучению этиологии серой гнили растений, внутривидового разнообразия грибов р. Botrytis и популяционной биологии Botrytis cinerea.

2. Материалы и методы.

Культуры В. cinerea были выделены с материала, собранного в 1993, 1995 и 1996 годах. Сбор материала (пораженных серой гнилью фрагментов растений) производился в нескольких районах: 1) на опытных делянках и в участках леса на территории Звенигородской биостанции МГУ (Московская обл.); 2) в ботаническом саду МГУ (г.Москва); 3) на промышленной плантации культурной земляники совхоза им. Ленина (Бирюлево, Московская обл.). Делянки промышленной плантации, на которых производился сбор материала с симптомами поражения серой гнилью, различались между собой по сроку эксплуатации и режиму обработки фунгицидами (эупареном).

В процессе выделения В. cinerea в чистую культуру отмечали характер спороношения на инфекционном материале (обилие, размеры и характер ветвления конидиеносцев). У выделенных изолятов были учтены культуральные признаки и оценен уровень их чувствительности к

фунгицидам. В чистую культуру выделили в 1995 и 1996 годах, соответственно, 110 и 283 изолята. Из полученной коллекции было отобрано 35 штаммов с характерными культуральными признаками, отражавшими весь спектр культурапьно-морфологического разнообразия коллекции. С отобранными изолятами была проделана серия экспериментов, в ходе которых исследовались: выживаемость склероциев в почве, токсичность культуральной жидкости, патогенность, электрофоретическая подвижность водорастворимых белков, парамагнитные свойства пигментов у мицелия и склероциев. Статистически значимые корреляции между признаками, выявленными в вышеназванных опытах, были использованы для оценки структуры популяции В. cinerea.

Все культуры выращивали при температуре 22"С. Морфолого-культуральные признаки колоний гриба учитывали, начиная с 4-го и до 30-го дня после посева (в ряде случаев - до 3 месяцев), отмечая количество и эазмеры склероциев, характер роста, текстуру мицелия, интенсивность ;пороношения, пигментацию колонии. Наблюдая за образованием скпе-эоциев и пигментацией, отмечали также последовательность и интенсивность проявления этих признаков во времени.

Изучение динамики образования морфологических структур в кизненном цикле - как у растений, так и у грибов (Ростова, 1991; Шевцова, 1986) - позволяет использовать ее для выявления внутривидового разно-збразия. Используя этот подход, мы учитывали: динамику развития морфологических структур; тип закладки склероциев (на поверхности субстрата или преимущественно на погруженном в субстрат мицелии); продолжительность созревания склероциев; быстроту пигментации субстратного мицелия; скорость прорастания склероциев конидиальным :пороношением и время созревания спор на конидиеносцах. Опыты про-зодили на питательных средах и растительном субстрате.

Для выявления особенностей роста клонов В. cinerea в чистой сультуре и в природе мы закладывали на хранение в почву растительный :убстрат, искусственно зараженный разными штаммами. Склероции поучали, выращивая штаммы на стерильном растительном субстрате. Субстрат - зрелые сухие семена клена американского и ясеня обыкно-¡енного - был выбран нами в связи с тем, что названные виды растений иироко распространены, и весной на их семенах, сохраняющихся в под-:тилке, часто встречается спороношение Botrytis (Лихачев, 1997).

После образования склероциев зараженный субстрат извлекали 13 колб и упаковывали в капроновые мешочки, натянутые на проволочный аркас. В ноябре их помещали в почву на глубину около 10 см. Опыт был ¡аложен параллельно на двух делянках: в ботаническом саду МГУ и на >пытном участке Звенигородской биостанции МГУ. Начиная с апреля, :жемесячно извлекали по 1 мешочку, субстрат со скпероциями

раскладывали во влажные камеры. Подсчитывали количество проросших и непроросших склероциев, отмечая особенности развития конидиенос-цев - длину, тип ветвления и характер отделения спор {1- легкое и массовое, происходящее при легком движении воздуха; 2- затрудненное, возможное только при встряхивании конидиеносца).

Чувствительность штаммов к фунгицидам - фундазолу, ронилану, эупарену, даконилу - определяли путем измерения радиального роста мицелия на среде Чапека, содержащей по 0 (контроль), 10, 30, 60 мкг действующего вещества (д.в.) на 1 мл среды.

Патогенность штаммов В. cinerea изучали путем искусственного заражения (1) изолированных листьев фасоли, бобов, подсолнечника, кресс-салата, герани, выращенных в тепличных условиях, и культурной земляники сорта Лорд, выращенной на опытной делянке в ботаническом саду МГУ, а также (2) лепестков цветов яблони и земляники. Для стандартизации инфекционной нагрузки использовали: 1)блоки мицелия диаметром 7 мм, вырезанные из колоний гриба, росших на агаризованной или жидкой среде Чапека; 2)споровую суспензию концентрацией 50-100 конидий в 1 мл. После нанесения инокулюма зараженные листья помещали во влажную камеру.

Токсичность культуральной жидкости (КЖ) оценивали по действию, оказываемому на парамеций и листья различных растений. Для оценки токсичности ЮК использовали культуру парамеций, помещенную в прозрачные пластмассовые ячеистые пластины. В каждую ячейку пластины с помощью автопипетки помещали по 50 мкл КЖ и 15-18 мкл суспензии парамеций (содержащей 20-60 особей), наблюдая через бинокулярную лупу за изменениями в их двигательной активности. Количество погибших за определенные промежутки времени особей выражали в процентах, аппроксимировали методом наименьших квадратов, рассчитывая среднее время 50% и 95 % их гибели и коэффициент m в уравнении линейной регрессии у = b + m х х, где у - процент погибших парамеций, х - время токсического действия КЖ (см. табл.2). Токсичность КЖ оценивали также на срезанных листьях растений - фасоли, земляники, сныти обыкновенной, герани, чистяка весеннего и проростках кресс-салата. Листья с промытыми и подрезанными до одинаковой длины черешками ставили в пробирки с отфильтрованной через стерильную (автоклавированную) вату КЖ. Реакцию листьев оценивали в баллах.

Электрофоретическое разделение изоферментов В. cinerea проводили по методикам, описанным Трувеллером, Нефедовым (1974); Ко-рочкшым и др.(1977); Остерманом (1981).

Для исследования парамагнитных свойств пигментов В. cinerea использовалась высушенная при температуре 110 °С и измельченная биомасса мицелия и скпероциев. В исследованиях был использован

?ПР-спекгрометр 3-сантиметрового диапазона марки РЭ 1307, произве-,енный на экспериментальном заводе АН СССР ( г. Черноголовка) Изме-ения производились при частоте ВЧ модуляции поля 100 Кгц.

Статистическая обработка результатов проводилась ка пересыльном компьютере с помощью программ "Microsoft Excel v.5.0" и Statistika v.4.3.'(Stat Soft, 1993).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Культуральное разнообразие штаммов 3. cinerea

Сопоставив при помощи ранговой корреляции культурэльные ризнаки у 35 штаммов, мы обнаружили, что особенности их роста на 1гаризозанной среде Чапека коррелируют как между собой, так и с размером спор, снятых с проросших конидиальным спороношением склеро-[иев. По культуральным признакам штаммы гриба разделились на две руппы:

1) Штаммы с пушисто-ватосбразным воздушным мицелием, слабой пигментацией субстратного мицелия и образованием псевдоскперо-;иев при контакте мицелия с твердой поверхностью. У этих штаммов ¡ыли выступающие над средой крупные выпуклые скпероции с растяну-ым периодом созревания, постоянное обильное спороношение по всей .олонии, образованное длинными (3-9 мм) ветвистыми кснидиеносцами, I более крупные спооы (размеры 6-7x10-11 мкм, объем 250-380 мкм3).

2) Штаммы с более мелкими спорами (размеры 5-6 х 9-10 мкм, |5ъем 116-220 мкм3), небольшими, плоскими, погруженными в субстрат снально расположенными склероциями. бархатисто-войлочным, прижа-ым воздушным мицелием, не образующим псевдосклероциев. У этой руппы темнопигментированный субстратный мицелий; колонии с очень лабым спорообразованием, формирующимся только через 3-4 недели госта (либо при дополнительном воздействии света или холодовом трессе); легко облетающие с конидиеносца (при движении воздуха) спо-!Ы и короткие (1-2 мм) слабоветвистые или неветвистые конидиеносцы, склоняющиеся в сторону источника света. Развиваясь на растительном :убстрате, они образуют большое количество мелких склероциев.

Установлены значимые положительные корреляции между парами признаков: темная окраска субстратного мицелия (СМ) и уплощенные кпероции; светлая окраска - и выпуклые скпероции. У темноокрашенных ультур, как правило, созревание склероциев происходит одновременно и 10вольно быстро (через 9-13 дней). У светлых культур образование скпе-юциев и их созревание растянуто во зремени (от 6-8 до 15-25 дней), 1епигментированные зачатки склероциев появляются и после созревания ¡ольшинства ранее образовавшихся склероциев.

Темнопигментированные культуры чаще получались при отсеве слабоветвистых, средней длины (около 2 мм) конидиеносцев, а светлые (но с редкими темными пятнами) культуры - развивались из спор, взятых со средних, многоветвистых, пролиферирующих в воздушный мицелий конидиеносцев, которые развивались на "плодах" земляники. Более темные культуры чаще выделялись с засохших бутонов (земляники, розы, пионов), чем светлые.

Необходимо отметить, что все вышеперечисленные культураль-ные признаки, хотя и коррелируют друг с другом, не образуют жесткой структуры. В изученной коллекции культур присутствуют переходные формы со всевозможными сочетаниями признаков, поэтому выделить четко различающиеся культуральные группы мы не сочли возможным. Такое разделение искусственно, так как не отражает нестабильность и пластичность культуральных признаков В. cinerea. Правильнее в нашем случае говорить о тенденции расхождения культуральных типов в две группы - 1)спорулирующие крупносклероциальные со светлым субстратным мицелием и 2)темноокрашенные мелкосклероциальные, аспороген-ные в чистой культуре.

Парамагнитные свойства пигментов штаммов В. cinerea В литературе представлены многочисленные данные о роли меланинов в повышении устойчивости микроорганизмов к негативному воздействию окружающей среды (Лях, 1981). Поскольку большинство культуральных признаков на высоком уровне значимости коррелировало с типом окраски субстратного мицелия штаммов, мы исследовали спектры ЭПР препаратов высушенных и размельченных мицелия и склероциев, чтобы оценить связь пигментации культур с возможным присутствием в клетках мицелия меланиновых пигментов и их парамагнитными свойствами.

Полученные сигналы ЭПР были слегка асимметричны, без сверхтонкой структуры, с. ДН от 4 до 6,6 гс. Интенсивность сигналов в пересчете на концентрацию парамагнитных центров (ПМЦ) была от 1015 до 1013 (спин на 1 г. сухого вещества), что характерно для меланинов.

Выживание склероциев В. cinerea в почве Периодически извлекая из почвы и помещая во влажную камеру растительные остатки со склероциями, мы наблюдали за их прорастанием. Штаммы В. cinerea различались по эффективности прорастания склероциев. С увеличением срока пребывания склероциев в почве эти различия возрастали (см.табл. 1). Выявлено 2 типа прорастания склероциев конидиеносцами:

1) У одних штаммов неветвистые короткие конидиеносцы вырастали уже через 1-2 дня после помещения склероциев во влажную камеру, сразу образуя небольшое количество головок легкоосыпающихся

:пор. Затем эти конидиеносцы росли в длину, не ветвясь, и юследовательно образовывали новые головки спор.

2) У других штаммов склероции прорастали на 2-4-й день после ¡смещения их во влажную камеру, образуя ветвящиеся |епигментированные конидиеносцы, которые сначала вытягивались в 1лину, а позже начинали темнеть и образовывать конидии. На онидиеносцах формировалось одновременно большое количество оловокспор, но споры держались на конидиеносцах довольно крепко, не осыпаясь при их встряхивании пинцетом.

Указанные особенности конидиеносцев для одних и тех же игаммов были стабильны и не зависели от времени пребывания скл.еро-;иев в поЧве.

Таблица 1. Выживание скпероциев штаммов В. cinerea в почве

апр - б/с май- б/с май-ЗБС! июнь, ! ЗБС авг.,б/с I авг.,ЗБС j окт..б/c ! i

ИТ %пр,! N %пр. Nl %npj Ni%npi N %пр. N! %пр.| N %np. N

1 98%} 51 100% 35(98%; 69) 93%) 40 24% 39: 65% i 25 0% 40

2 92%! 36 97% 25 81% 18i33%! 9 37% 23! 39%! 8 0% 19

3 88%! 9 100% 19 47% 13! 43% 13 79% 21! 29%! 11 0% 12

4 86%! 44 92%| 30 89% 44 52% 33 54% 39 97%! 32 0% 47

5 90% 41 100% 11 40% 10 39% 18 57% 6 7%! 14 7% 8

6 96% 46 98% 48 79% 60 85% 45 42% 46 74% I 36 1% 58

7 64% 53 95% 41 91% 26 94% 49 36% 35 63%| 21 o%! 16

29 88% 104 97% 97 58% 62 79% 78 97% 96 L 24%! 65 37% 59

30! 16% 32 0% 0 13% 15 20% 21 0% 5 4%i 14 7% 11

31 94% 98 97% 143 70% 105 75%! 105 91% 125 2%! 74 2%| 82

32 100% 38 95% 36 75%! 10 56%! 16 68% 14 5%! 12 17%! 18

33 99%! 174 99% 214 £6%| 153 83%! 195 98% 123 56%! 95 72% 111

34 90% 161 99% 186 55%! 99 80%! 114 97% 121 35%! 52 62% 98

35 56% 84 82% 64 19%i 48 46%i 46 89% 61 2% 30 4% 29

36 87%; 80 94% 113 70%| 65 7S%! 83 92% 60 5% 42 0%! 48

¡римечание. В головке указаны: %пр - процент проросших скпероциев, N - общее ол-во скпероциев на извлеченных из почвы образцах, шт - номера штаммов гемноокрашенные штаммы - 29-36; сЕатлые - 1-7). Таблица приведена частично, в мссертации - полный вариант (35 штаммов).

Резистентность штаммов В. cinerea к фунгицидам Темноокрашенные и светлые культуры В. cinerea значительно азличались устойчивости к фунгицидам: светлые культуры обычно были увствительны к фундазолу {в концентрации 10 мкг дв./мл), но более стойчивы, чем темные, к даконилу. Темноокрашенные штаммы были олее толерантны к фундазолу, но чувствительны к даконилу.

По чувствительности к ронилану и эупарену светлые и темные культуры значимо не отличались. Штаммы, росшие на среде с фундазолом, росли также и на средах с другими испытанными фунгицидами. Однако, для штаммов с множественной резистентностью скорость роста на среде с даконилом отрицательно коррелировала со скоростью роста на фундазол-содержащей среде и положительно - со скоростью роста на среде с эупареном, скорости роста на средах с фундазолом и рониланом также положительно коррелировали. Штаммы, использованные в нашей работе, выделены с растений; которые не обрабатывались фундазолом. Достоверно известно только о применении эупарена.

Токсичность культуральной жидкости Е. cinerea При исследовании токсичности культуральной жидкости (КЖ) гриба выяснилось, что исследуемые штаммы существенно различаются по ее действию - как на растения, так и на парамеции. В целом КЖ у темноо-крашенных штаммов была менее токсична, чем у светлых культур. Токсичность КЖ к парамециям часто не совпадала с фитотоксичностью. При продолжительном росте гриба фитотоксичность его КЖ всегда увеличивалась, в то время как токсичность к парамециям у одних штаммов увеличивалась, а у других - не изменялась или уменьшалась (см.табл. 2).

Таблица 2. Токсичность КЖизолятов гриба, _хранившихся в почве ЗьС_

2 недели роста 4 недели роста

Т, мин1 ¡наклон л.р. Т, мин [наклон л.р.

шт. 50% 95% j ш £( ш) 50%i 85% j m 6(m)

1 1,5 2,б| 18,0 11.5 1,81 3,5j 25,3 3,3

2 7,5 14,31 6,0 0,8 1,7| 3,2! 25,7 4,9

3 5,3 10,1 6,8 2.1 1.7} 3.2 25,0 5,2

4 3,3 6,2 10.9 2.6 4,2i 7,9 9,0 2,1

5 5,4 10,2 8.5 1,2 8,3: 15,7 6,0 0,2

6 3,5 6,7 13,3 1,6 1j! 3.2 22,4 7,5

7 12,8 24,4 3.4 0,6 4,3! 8.2 i 9,9 1,7

8 3,2 6,0 14,3 2,7 2,4 4,5! 10,0 4,7

34 10,1 19,3 4,5 0.4 19.5 37,1 2,1 0,3

35 13,6 25,е 2,7 0.4 37.2 70,7 1,1 0,3

36 20,1| 38,3 2.0j 0,3 52,7 100,1 0,8 0,1

Примечание. 1)Темноокрашенные штаммы - 34-36; светлые -1-8 ; 2)Таблица приведена частично, в диссертации - полный вариант (35 штаммов).

1 Т - время, за которое погибали в КЖ гриба 50% и 95% парамеций

Пэтогенность изолятов гриба При искусственном заражении растений было отмечено, что бильно спорулирующие штаммы обладают большей вирулентностью и ыстрее осваивают растительный субстрат, чем темноокрашенные сла-оспорулирующие изоляты. В целом (для исследованного набора штам-юв) патогенность к одним растениям сопровождалась патогенностью к ругим. Темнопигментированные мелкосклероциальные штаммы либо не атогеннь; для растения вовсе, либо начинают осваивать ткани иастения же после их увядания. Опыты с реизоляцией патогена из искусственно араженных живых растений показали, что на разных этапах инфекцион-ого процесса из пораженной грибом растительной ткани можно выде-ить изоляты с различными культуральными признаками. Из листьев, араженных темнопигментирозанным аспорогенным штаммом удавалось ыделить как исходные формы, так и обильно спорулирующие изоляты. 1ри заражении мертвых стерильных растительных субстратов подобных ффестов не наблюдалось. В опытах по заражению лепестков яблони и ■тодов" земляники было отмечено, что ткани генеративных органов блони и земляники, поражаются штаммами всех культурзльных групп L cinerea одинаково. Сопоставляя эти данные с результатами исследо-ания токсичности КЖ штаммов на парамециях (а у темноокрашенных яаммов КЖ менее токсична), можно предположить, можно предполо-мть, что в заражении лепестков и "плодов" наличие токсинов менее важ-о, чем для развития патогенеза живых тканей листьев.

Корреляционный анализ признаков гриба Полученные на модельной выборке (35 штаммов) результаты мы группировали и, пользуясь ранговым коэффициентом корреляции Спир-¡енэ, оценили наличие взаимосвязи между морфометрическими призна-ами В. cinerea с их эколого-трофическими свойствами.

При подсчете ранговых корреляций интенсивности сигнала ЭПР другими признаками штаммов обнаружилось, что: 1) темная окраска убстратного мицелия отрицательно коррелировала с концентрацией ¡МЦ б сухих препаратах культур и положительно - с накоплением био-¡ассы в жидкой культуре; 2) у светлых культур концентрация ПМЦ была ог.ьше, чем у темных, хотя варьировала от опыта к опыту значительно 1'льнее. В ряде случаев были также обнаружены корреляции интенсив-ости сигнала ЭПР с эффективностью выживания склероциев в почве. У яаммов, наиболее эффективно прораставших в августе, отмечено ольшее накопление пигментов. Видимо, протекторная функция пигмен-ов сыграла свою роль в обеспечении сохранения склероциев и их спешного прорастания после длительного (S-месячного) пребывания в

почве, но на эффективности выживания в течение 6-8 месяцев пигменто-ообразование не сказывается.

Наряду с этим эффективность прорастания скпероциев положительно коррелирует с токсичностью культуральной жидкости гриба. Лучшая сохранность скпероциев более токсичных штаммов вполне понятна, если принять во внимание, что активному разрушению скпероциев могли способствовать почвенные беспозвоночные; в литературе отмечено, что токсинообразование предохраняет грибы от поедания животными (Clay, 19S0). У реизолятов, выделенных из склероциев, которые зимовали в разных местах, токсичность КЖ к парамециям существенно различалась. Вероятно, токсинообразование у взятых штаммов не является стабильным и зависит не только от происхождения продуцента и условий культивирования, но и от присутствия сопутствующей микробиоты. Возможно, токсинообразование имеет адаптивный характер в условиях сапротроф-ного существования,

С типом прорастания склероциев коррелировал быстрый рост мицелия в жидкой культуре. Штаммы со склероциями, прорастающими короткими неветвистыми конидиеносцами, которым свойственны положительный фототаксис и быстрое созревание мелких спор, в поверхностной жидкой культуре росли быстрее. На агаризованной среде они образовывали небольшие, плоские, погруженные в субстрат зонально расположенные склероции и бархатисто-войлочный, прижатый воздушный мицелий, не образующий при соприкосновении со стенками чашки Петри псев-досклероциев. Штаммы, склероции которых прорастали длинными конидиеносцами, в жидкой культуре росли медленнее, а на агаризованной среде образовывали выступающие над средой крупные выпуклые склероции с растянутым периодом созревания, пушисто-ватообразный воздушный мицелий, отличались слабой пигментацией субстратного мицелия, обильными псевдоскпероциями и густым спороношением по всей колонии, образованным длинными ветвистыми конидиеносцами.

Патогенность штаммов коррелировала как с культуральными, так и с биохимическими признаками. При искусственном заражении растений было отмечено, что обильно спорулирующие штаммы обладают большей вирулентностью и быстрее осваивают растительный субстрат, чем тем-ноокрашенные слабоспорулирующие изоляты.

Для фунгицид-резистентных штаммов была отмечена корреляция скорости роста на средах с фунгицидами с объемом спор (см.табл.З), измеренным у исходных культур (без фунгицида): отрицательная - со скоростью роста на среде с фундазолом, положительная - на среде с даконилом (в концентрации 10 мкт д.в./мл). Размеры конидий традиционно использовались как основной диагностический признак видов рода Botrytis (Рудаков, 1959). Темная окраска субстратного мицелия коррелировала на

1Ысоком уровне значимости с устойчивостью к фундазолу и »трицательно - со способностью расти на среде с даконилом. Вероятно, нелкоконидиальные штаммы с темноокрашенным субстратным чицелием будут иметь преимущество в адаптации к фундазолу, а рупноконидиальные - к контактным фунгицидам.

Таблица 3. Корреляция объема спор штаммов

Коррелирующие признаки N Spearrnan R t(N-2) p-level

D 3F 4 & V SP 30 -0,38167 -2,18499 0,037410

D 6F 4 & V SP 30 -0,50333 -3,08224 0,004579

D 1D 4 & V SP 30 0,51204 3,154342 0,003821

1римечание. В таблице указаны значения R рангового коэффициента корреляции пирмена и (-критерия Фишера-Стьюдента для N степеней свободы на уровне чачимости р; принты обозначения:

I) D_3F_4 - диаметр колонии (на4-й день) на среде с фундазолом (ЗОмкг д.в./мл); !) D_6F_4 - диаметр колонии (на4-й день) на среде с фундазолом (60 мкг д.в./мл); ) D_1D_4 - диаметр колонии (на4-й день) на среде с даконилом (10 мкг д.в./мл); ) V_SP - объем спор; 5) N - число степеней свободы.

Отмечена положительная корреляция между концентрацией па-амагнитных центров и особенностями роста на средах с добавкой за-|ИТно-контактных фунгицидов - эупарена и даконила. Усиление пигмен-зобразования коррелировало с возможностью роста штаммов на среде с аконилом ( в концентрации 45 мкг д.в./мл среды) и со скоростью роста на реде с эупареном ( в концентрации 30 мкг д.в./мл ). Возможно, пигмент пособен нейтрализовать фунгистатическое действие данных концентра-ий пестицидов, что является одним из механизмов их резистентности к гим фунгицидам.

Популяция В. cinerea в условиях Московской области

Сравнительный анализ выборок штаммов В. cinerea, взятых из ззличных районов с одного хозяина (земляники) показал, что их состав /щественно различается на промышленных плантациях и опытных метках биостанции как по чувствительности к фунгицидам, так и по тьтуральным признакам (см. табл. 4).

Среди изолятов гриба, выделенных с промышленных плантаций, зеобладали культуры с темноокрашенным субстратным мицелием, для >торых характерно обильное екпероциеобразование и задержка слоро-эшения (до 20-30 суток), в то время как изоляты с опытных участков гличэлись обильным спороношением, начинающимся на 5-8 день роста.

Проверка чувствительности изолятов к системным и контактным фунгицидам показала, что темноокрашенные изоляты более чувствительны к контактным фунгицидам (эупарен, даконил) и более устойчивы к системным препаратам (фундазол, ронилан ).

Таблица 4. Соотношение в разных выборках клонов с различиями в пигментации и уровне чувствительности к фунгицидам

] совхоз биостанция

! светлые темные светлые темные

всего ! 25 100% 41 ! 100% 49 | 100% | 2

РЗ I 18 72% 18 44% 35 71% I 2

I 2 8% 21 51% 0 0 ! 0

КоБ I 16 64% 18 44% 0 0 ! 2

ЯоК | 2 8% 13 32% 1 2% I 0

Е5 I 13 52% 22 54% 26 53% | 2

ЕГ* I 5 20% 9 ! 22% 4 8% I 0

05 | 2 8% 17 I 41% 6 12% | 1

| 13 52% 7 17% 30 61% ! о

Примечание. 1)""5 - штаммы, не росшие на среде с фунгицидом в концентрации 10 мкг д.е/глп и Еыше; 2)**Я - штаммы, росшие на среде с фунгицидом в концентрации 60 мкг д. в./мл и выше; 3) Буквами (Р, Р?о, Е, 0) обозначены фунгициды - фундазол, ронилан, эупаран. даконил, соответственно.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что в условиях агроценоза фунгицид-резистентные клоны выживают преимущественно за счет заселения цветков, переходя затем на вегетативные органы, интенсивно развиваясь внутри субстрата. Пониженная инфекционность и спорообразование компенсируются у них способностью переносить действие фунгицидов и лучшей приспособленностью к сапрофитному существованию в почве на растительных остатках. Это предположение косвенно подтверждается данными по соотношению культуральных типое среди изолятов, которые были выделены с пораженных листьев, цветков и "плодов" земляники. К осени доля темноокрашенных клонов в популяции на совхозной землянике несколько возрастает. Если рассмотреть выборки с разных частей растения отдельно, то обнаружатся достоверные различия по соотношению пигментных и светлых культур (см. табл. 5).

Таблица 5. Соотношение светлых и темных клонов в

выборка всего темные светлые

в общем 159 97 62 п

100% 61% 39% %

3,14 1,79 1,35 ч>

сухие листья 27 20 7 л

100% 74% 26% %

3,14 2,07 1.07

зеленые листья 40 30 10 п

100% 75% 25% %

3,14 2,09 1,05

цветки 41 17 24 п

100% 41% 59% %

3,14 1,40 1,74 <р

плоды 51 30 21 п

100% 59% 41% %

3,14 1,75 1,39 ?

римечание. Статистическая достоверность различий долей указана в таблице 6.

Таблица 6. Достоверность рззличия выборок по доле темноокрашенных клонов В. cinerea

сухие листья зеленые листья цветки плоды

п 1Ф п 1Ф п 1Ф п 1Ф

в общем 184 1,35 197 1,71 198 2,25 208 0,28

сухие листья | 52 0,00 65 0,09 66 2,72 76 1,37

зеленые листья 65 0,09 78 0 79 3,13 89 1,64

цветки 66 2,72 79 3,13 80 0,00 90 1,66

плоды 76 1,37 89 1,64 90 1,66 100 0,00

римечание. 8 таблице приведены значения Ц критерия Стьюдентз-Фишера (для л гепеней свободы), различия между выборками значимы, если I, 5 ^ (значения ^ пя п=120 и п= 60 равны, соответственно, 1,96 и 2,0).

Как видно из таблиц 5 и 6, с цветков было выделено достоверно еныие пигментированных культур, чем с листьев, и несколько меньше, гм с плодов. С листьев выделялись большей частью темные культуры, ероятно, темноокрашенные клоны в полевых условиях имеют преиму-|ество при заселении листьев и плодов, а в заражении цветков несколько ктивнее участвуют непигментированные клоны. Возможно также, что

большая частота выделения пигментированных изолятов обусловлен; лучшей сохранностью их мицелия в растительных остатках.

Как уже упоминалось выше, все вышеперечисленные культу ральные признаки, хотя и коррелируют друг с другом, не образуют жест кой структуры. Отмеченная нами тенденция расхождения культуральны; типов в две группы сопровождается нестабильностью, пластичность« культуральных признаков, присущей "переходным" формам В. cinerea Так, в процессе выделения гриба в чистую культуру часть изолятов был« нестабильна. При пассажах они давали существенно различавшиеся п< культуральным признакам сектора. Соотношение стабильных изолятов i расщепляющихся при клонировании культур В. cinerea в выборках с про мышленной плантации и делянок ЗБС оказалось примерно одинаковым Однако соотношение культуральных форм, получающихся при расщеп лении нестабильных изолятов, зависело от местообитания зараженны; растений (см. табл. 7). Так, нестабильные изопяты, выделенные из со бранного на промышленных плантациях земляники материала, преиму щественно давали при клонировании культуры, резистентные к тем ит иным фунгицидам (в концентрациях не менее 10 мкг д. в. на мл ). Боль шинство этих культур имели темную пигментацию субстратного мицелия Культуры, которые были получены при расщеплении изолятов В. cinerea выделенных из собранного на ЗБС материала, были чувствительны к< всем четырем испытанным нами фунгицидам и имели светлоокрашен ный субстратный мицелий .

Таблица 7. Доля нестабильных при клонировании изолятов В. cinerea и характер их расщепления

место всего Характер расщепления цвет СМ

сбора у секторов

нестабильных ф/ц-S светлый темный

ЗБС 39 8 21% 3 37% 5 0

совхоз 123 24 20% 1 4% 7 18

Проявление реакций вегетативной несовместимости Возвращаясь к обнаруженным тенденциям дифференциации по пуляции В. cinerea на 2 основные группы клонов (и ряд промежуточных) необходимо затронуть вопрос о возможности их генетической изоляции. Е отечественной литературе по вопросу о вегетативной совместимое™ грибов рода Botrytis высказываются два мнения: 1) у этих грибо! отсутствуют эффективные механизмы генетической изоляцт (Пантелеймонова. 1984); 2) наличие у В.апегеа системы вегетативно! несовместимости способно привод!*тъ к обособлению и дальнейшей

.езависимой эволюции клонов гриба, отличающихся по ряду признаков. Лихачев, 1979).

Наши предварительные исследования показали, что при со-местном выращивании типичных культур "светлых" штаммов с темно-игментированными в зоне их контакта происходит сильная пигментация убстратного мицелия, характерно отсутствие воздушного мицелия и пороношения. При микроскопировании зоны контакта выяснилось, что лфы субстратного мицелия утолщены, узловаты и нередко образуют ламидоспоры. Вероятно, это неспецифическая реакция на неблагопри-тные для роста условия, поскольку она отмечалась нами и другими ис-педователями (Сале, 1989) при росте на средах с фунгицидами, при овместном культивировании с грибами-антагонистами и микопаразита-:и. При отсеве мицелиальных блоков из этой зоны в разных случаях аблюдается обособленное развитие колоний обеих исходных культур, ибо однородный рост одной культуры, внешне не отличавшейся от одой из исходных. Это свидетельствует о вегетативной несовместимости гмноокрашенных клонов со светлыми. При контакте штаммов, не столь езко отличающихся друг от друга по культуральным признакам, проявле-ие реакций вегетативной совместимости имеет смешанный характер - в эне контакта колоний встречаются участки с различной пигментацией, огут частично присутствовать валик воздушного мицелия и спороноше-ие. У таких "промежуточных" культур было отмечено выщепление секго-эв с разными культурапьными признаками - т.н. "реплицирующаяся не-габильность" (Дьяков, 1986). Отсеянные из таких секторов клоны при эвместном посеве показывали разную степень вегетативной совместности и различную стабильность культуральных признаков. Разный ха-зктер проявления реакций вегетативной совместимости у выявленных в зпуляции групп кпонов указывает на сложный механизм этого явления и )ебует дополнительных детальных исследований с использованием ¡нетических маркеров.

Заключение. Результаты выполненных исследований позволяют эедлоложить, что паразитируя на растениях, ежегодно поражающихся ;рой гнилью и образующих в ценозах гомеостатические фитоценопопу-щии - т.н. "реципиентах" (Лихачев, 1997) - часть кпонов популяции cinerea эволюционирует в сторону снижения внутривидового разнооб-ззия, адаптации к узкой трофической нише и возникновению у паразита абильного полиморфизма. Однако, в условиях агроценоза - ввиду обра-)тки растений-реципиентов фунгицидами - создается дополнительные шравленное действие. Оно способствует отбору клонов с признаками, 'щественно отличающимися от признаков, характерных для изолятов с ^обрабатываемых фунгицидами растений. В условиях агроценоза попу-щия гриба распадается на 2 различающиеся жизненной стратегией

группы: 1) быстро разрастающиеся по поверхности субстрата и обильж спорулирующие, с коротким циклом развития - "R-стратеги"; 2) успешж развивающиеся внутри субстрата и способные к длительному сохране нию в неблагоприятных условиях вследствие сильной пигментации мице лия - "K-стратеги". Указанные группы изолятов различаются по способ; освоения живых и мертвых растительных субстратов, стабильности куль туральных признаков при выращивании на различных питательны: средах.

ВЫВОДЫ

1) В модельной выборке штаммов В. cinerea выявлено две группь клонов, различающиеся по ряду культуральных и морфометрически: признаков, особенностям жизненного цикла, патогенности, выживании склероциев в почве, быстроте и обилию образования спор при конидиаль ном прорастании склероциев, а также по резистентности к фунгицидам < разным механизмом действия.

2) Различия между выявленными культуральными группами п< спектрам электроморф ферментов (полифенолоксидазы и эстеразы незначительны. Установлена корреляция между проявлениями токсич ности культуральной жидкости штаммов и активностью определенны; электроморф полифенолоксидазы.

3) Популяция В. cinerea, паразитирующего на землянике в уело виях агроценоза, гетерогенна и распадается на группы, различающиес: особенностями жизненного цикла, интенсивностью образования морфо логических структур и способом перезимовки. Установлено сезонно< изменение количественного соотношения этих групп.

4) В локальных популяциях идет процесс адаптации гриба к узко! трофической нише, сопровождающийся снижением разнообразия культу ральных признаков клонов. Направление этого процесса определяете: конкретными условиями местообитания.

5) Резистентность к исследованным фунгицидам коррелирует < культуральными признаками, патогенностью и выживанием склероциев f почве. Склероции штаммов, толерантных к фундазолу и даконилу, доль ше сохраняют жизнеспособность в почве. Резистентность к эупарену ж коррелирует с особенностями жизненного цикла. Устойчивость к ронила ну отрицательно коррелирует с жизнеспособностью склероциев и не кор релирует с патогенностью.

6) Резистентность к фундазолу сопровождается возникновение*, полирезистентности к другим испытанным фунгицидам (эупарену, дако нилу или ронилану).

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. ЮА Чикин, А.Н. Лихачев. Влияние фунгицидов на структуру )пуляции Botrytis cinerea в условиях Московской области// Методологи-:ские основы познания биологических особенностей грибов-продуцентов изиологически активных соединений и пищевых продуктов: Материалы

й Международной конференции 1-4 октября 1997,- Донецк, 1997. С. 90-Í.

2. ЮА Чикин, АН. Лихачев. Формирование морфологических руктур и проявление реакций вегетативной совместимости изолятами }fryft's cinerea Pers : Fr.11 Микология и фитопатология, 1997 (в печати).

3. AN.Lichachev, Yu AChikin The role of trophic niche in intraspecific versity of Botrytis genus.// Ecological Effects of Microorgamism Action: ateríais of International Conference (1-5 odober 1997, Vilnius, Lithuania) (in ess).

ад разделов работы был выполнен при финансовой поддержке: Института открытого общества (программа "Соросовские аспиранты", ант №а1361);

Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 320-51).