Внутриклеточные перемещения белков антиоксидантного комплекса. Новая система локализационных репортеров

Чумаков, Степан Петрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Внутриклеточные перемещения белков антиоксидантного комплекса. Новая система локализационных репортеров
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Внутриклеточные перемещения белков антиоксидантного комплекса. Новая система локализационных репортеров"

На правах рукописи

ЧУМАКОВ Степан Петрович

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПЕРЕМЕЩЕНИЯ БЕЛКОВ АНТИОКСИДАНТНОГО КОМПЛЕКСА. НОВАЯ СИСТЕМА ЛОКАЛИЗАЦИОННЫХ РЕПОРТЕРОВ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2010

□□3493275

003493275

Работа выполнена в Лаборатории биологии клетки Учреждения Российской Академии Наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Прасолов B.C.

доктор биологических наук Калинина H.A.

доктор биологических наук, профессор Лазаревич H.JI.

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГНЦ РФ ГОСНИИГЕНЕТИКА)

./У

с О

Защита диссертации состоится: »

Диссертационного совета Д 002.235.01 им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул.Вавилова, д.32.

L-S SCyy/j / ¿"У в на заседании в Институте Молекулярной биологии

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан: «¿V» ^¿¿¿СгУ/ 2010

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических паук

года.

Список используемых сокращений (в порядке появления в тексте)

ROS reactive oxygen species соединения активного кислорода

GFP green fluorescent protein зеленый флуоресцентный белок

ПЦР полимеразная цепная реакция

мРНК матричная рибонуклеиновая кислота

EGFP enhanced Green fluorescent protein модифицированный зеленый

флуоресцентный белок

IGF1 insulin-like growth factor инсулин-подобный фактор роста

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

РКВ protein kinase В протеинкиназа В

PI3K phosphoinositide З-kinase фосфатидилинозитол-3-киназа

DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium Среда Игла в модификации Дульбеко

EGF epidermal growth factor эпидермальный ростовой фактор

hTNF human tumor necrosis factor фактор некроза опухолей человека

FCS fetal calf serum фетальная телячья сыворотка

РМА phorbol 12-myristate 13-acetate форбол-12-миристрат-13-ацетат

РКС protein kinase С протеинкиназа С

NOX NADPH oxidase НАДФ-Н оксидаза

EGFR epidermal growth factor receptor рецептор эпидермального ростового

фактора

NAC N-acetyl-cysteine Н-ацетил-цистеин

DPI Diphenylene iodinum

DCF 2',7'-dichlorofluorescin 2',7'-дихлорфлуоресцин

PTK phosphotyrosin kinase фосфотирозинкиназа

РКА protein kinase А протеинкиназа A

CKII casein kinase II казеинкиназа II

Актуальность проблемы

Нормальная жизнедеятельность клеток сопряжена с постоянным координированным перемещением белковых молекул во внутриклеточном пространстве. Эти перемещения осуществляются с момента синтеза белковых молекул (полипептидных цепей) на рибосомах и продолжаются в ходе выполнения молекулами своих функций. Перемещения сопровождают такие процессы как внутриклеточный транспорт, секреция, созревание белков и образование белковых комплексов, различные регуляторные взаимодействия, осуществление процессов передачи сигналов между клетками и внутри клеток. Изучение характера и динамики внутриклеточных перемещений необходимо для понимания механизмов происходящих в клетке процессов.

Чрезмерные уровни соединений активного кислорода повреждают многие компоненты клетки, что приводит к окислительному стрессу. В тоже время, локальные колебания концентрации перекиси водорода служат медиатором многих сигнальных путей. Белки, регулирующие уровень кислородных радикалов, осуществляют защиту клетки от окислительных повреждений и могут контролировать процесс передачи сигналов. Исследование механизмов антиоксидантной защиты в клетке является важной задачей, которая в настоящий момент далека от полного решения. Семейство белков сестринов играет важную роль в антиоксидантной защите и контроле сигнальных путей, благодаря их способности восстанавливать активность пероксиредоксинов после переокисления их каталитических цистеинов до сульфинатов. Механизм действия этих белков включает внутриклеточные перемещения, изучение которых может дать важную информацию о регуляции передачи сигналов и функицонировании антиоксидантной защиты клеток.

Цель и задачи исследования

Целью работы было создание репортерной системы для количественного определения внутриклеточных перемещений белков и выяснение с помощью этой системы закономерностей внутриклеточного перераспределения сестринов и других компонентов системы регенерации пероксиредоксинов.

В ходе данного исследования были поставлены следующие задачи:

• Сконструировать систему репортеров, использующих эффект а-комппементации, для определения внутриклеточной локализации исследуемого белка.

• Получить репортерные линии клеток, характеризующиеся оптимальным уровнем экспрессии введенных белковых конструктов и обеспечивающие широкий динамический диапазон и высокую чувствительность определения внутриклеточных перемещений.

• Провести испытания репортерной системы на примере транскрипционного фактора F0X03A.

• Исследовать динамику перемещения сестринов в ядро в ответ на увеличение уровней внутриклеточных ROS.

• Установить взаимосвязь между перемещающимися в ядро сестринами и локализацией связанного с ними белка Srx.

• Определить возможные механизмы, регулирующие перемещение сестринов в ядро.

Научная новизна и практическая ценность работы

В настоящее время существует ряд методов, позволяющих регистрировать внутриклеточные перемещения белковых молекул. Однако, большинство этих методов требует либо фиксации клеток, что исключает возможность наблюдения за внутриклеточными перемещениями in vivo, либо присоединения к исследуемому белку громоздких маркеров, что вносит дополнительные искажения в характер внутриклеточной динамики исследуемого белка.

Описываемая система позволяет определять внутриклеточную локализацию белка путем прикрепления к нему короткого пептида, практически не влияющего на его внутриклеточные перемещения.

Были получены и испытаны линии культур клеток, несущие со-пептид р-галактозидазы, соединенный с сигнальными пептидами, определяющими внутриклеточную локализацию. Такие модельные репортерные клеточные линии могут быть использованы не только для изучения механизмов перемещения белков, но и в качестве удобных тест-систем, позволяющих проводить поиск модуляторов внутриклеточных перемещений путем скрининга библиотек химических соединений или генетических конструкций.

Пригодность локализационного репортера была испытана на примере транскрипционного фактора F0X03A, характер перемещений которого был ранее изучен другими методами и описан в литературе.

На заключительном этапе локализационная репортерная система была использована для изучения внутриклеточных перемещений сестринов в условиях окислительной нагрузки. Были установлены факторы и воздействия, способствующие перемещению сестринов из цитоплазмы в ядро, а также определены вероятные механизмы, принимающие участие в этих перемещениях.

Апробация диссертации

Материалы диссертационной работы были доложены на международном симпозиуме в Keystone, Colorado, США, февраль 2008, на конференции "Mechanisms of early differentiation: embryogenesis, myogenesis (cardiac differentiation) and hematopoiesis/ lymphopoesis", Barsinghausen, Германия, сентябрь 2008, и на конференции молодых ученых ИМБ РАН, октябрь, 2008.

Принцип действия и структура локализационного репортера

Существующие в настоящее время методы регистрации внутриклеточных перемещений белков далеки от совершенства. При использовании флуоресцентных белков или ферментов к исследуемому белку присоединяются значительные по размеру репортерные белки (GFP и т.п.), что может влиять на его подвижность. В основу предложенного нами метода положено явление а-комплементации, при котором активность фермента р-галактозидазы проявляется при совмещении короткого (56 аминокислот) N-концевого а-пептида и длинного, но неактивного ю-пептида фермента, имеющего делецию в области 11-51 аминокислот. Активность фермента реконструируется при простом сближении двух пептидов, даже если они входят в состав разных белков. Фактически, активность фермента проявляется в случае нахождения обоих пептидов в общем внутриклеточном объеме (компартменте). К исследуемому белку присоединяется короткий а-пептид, что минимально влияет на его свойства. Таким образом, если второй компонент (ш-пептид) снабжен сигналом, определяющим его расположение в определенной клеточной структуре, то при появлении в непосредственной близости от него белка, содержащего а-

пептид, возникает работоспособный фермент. По величине его ферментативной активности можно судить о количестве находящегося в данном объеме белка. Если ы-пептид присутствует в избытке, активность фермента меняется пропорционально изменению количества а-пептида, что позволяет оценивать перемещения белка количественно. В то же время, сила взаимодействия двух пептидных фрагментов Р-галактозидазы невелика, и поэтому она практически не влияет на перемещения взаимодействующих компонентов внутри клетки. Эффективность комплементации весьма высока и пригодна для определения перемещений белков между достаточно изолированными объемами, а именно, при определении перемещений из цитоплазмы в ядро и обратно. Однако, этот подход мало пригоден для регистрации перемещений белков в пределах одного объема или структуры, например, при перемещении из плазматической мембраны в эндоплазматический ретикулум, или из цитозоля в митохондрии. В этом случае более эффективно использование пары пептидов с еще меньшей аффинностью, что позволяет существенно снизить фоновый уровень ферментативной активности, наблюдаемый вне непосредственного контакта молекул.

При создания репортерной культуры клеток производится введение одной из генетических конструкций, экспрессирующих ш-пептид (3-галактозидазы, снабженный сигналом внутриклеточной локализации для его доставки в клеточную структуру, в которой предполагается произвести измерения. Эта конструкция также содержит селективный маркер (ген устойчивости к флеомицину), экспрессирующийся под независимым промотором.

После трансдукции таким конструктом и проведения селекции, в клетки вводится вторая репортерная конструкция, экспрессирующая исследуемый белок, соединенный с а-пептидом фермента, и другой селективный маркер, для отбора успешно трансдуцированных клеток.

Для введения репортерных конструкций в клетку был выбран способ доставки с помощью лентивирусного вектора. В отличие от простых ретровирусов, которые способны эффективно заражать только клетки, находящиеся в Б-фазе клеточного цикла, лентивирусы могут заражать также клетки, находящихся в 01 и 62 - фазах. Таким образом, достигается в десятки раз большая эффективность заражения клеточной популяции. Этот эффект особенно важен при работе с линиями медленно пролиферирующих клеток, существенно сокращая время, требующееся для селекции. Способность лентивирусов проникать в ядро клетки во время, когда в нем идет активная транскрипция и участки генома более открыты, вероятно, объясняет тот факт, что введенные при помощи лентивирусного вектора конструкции менее подвержены последующему затуханию экспрессии, что характерно для конструкций, введенных с помощью ДНК-трансфекции.

Таким образом, с помощью лентивирусной доставки ы-пептид (3-галактозидазы был помещен в ядра клеток нескольких линий, которые могут быть использованы в качестве тест систем для анализа перераспределения исследуемых белков между ядром и цитоплазмой.

Конструирование вектора для экспрессии ы-пептида

В качестве основы для создания генетических конструкций был использован лентивирусный вектор р1_СМ\/, в который вводили дополнительную кассету для экспрессии гена устойчивости к флеомицину (ген Ыео). й-фрагмент р-галактозидазы был получен путем введения делеции (с помощью ПЦР) участка, кодирующего

аминокислотные остатки 11-51. Этот фрагмент помещался под промотор цитомегаловируса лигированием по сайтам Xbal и BamHI.

При создании конструкций, экспрессирующих ы-фрагмент в определенных клеточных структурах, использованы следующие сигнальные последовательности: сигнал для локализации в митохондриях, соответствующий N-концевым 29 аминокислотным остаткам субъединицы VIII цитохром с оксидазы человека; сигнал для локализации в эндоплазматическом ретикулуме, соответствующий двадцати N-концевым аминокислотам калретикулина; сигнал для локализации в плазматических мембранах, соответствующий двадцати N-концевым аминокислотам нейромодулина; сигнал ядерной локализации, расположенный на С-конце и соответствующий четырем копиям сигнала ядерной локализации Т-антигена вируса SV40.

Сборка конструкта, экспрессирующего ы-фрагмент (3-галактозидазы, проводилась в несколько стадий. Вначале в исходный вектор pLCMV вводился локализационный сигнал, снабженный соответствующими сайтами для рестриктаз, по которым в дальнейшем вводились прочие компоненты конструкций. Далее, в конструкцию вводили со-пептид таким образом, чтобы он оказался в общей рамке считывания с сигналом локализации. На последнем этапе в конструкцию вводили кассету с геном Ыео под контролем конститутивного промотора гена р53 человека (NP-промотор).

Сконструированные рекомбинантные векторы вводились с помощью липофекгаминовой трансфекции в клетки культуры НЕК293Т, для получения вирулентных лентивирусных частиц одноразового действия. С их помощью рекомбинантные конструкции затем могут быть введены в любую выбранную в качестве клеточной модели культуру для получения стандартной репортерной линии клеток. Клетки такой культуры постоянно экспрессируют ы-фрагмент р-галактозидазы, заякоренный на определенной клеточной структуре за счет слитого локализационного белкового сигнала. Помимо этого, трансдуцированные клетки экспрессируют ген Ыео, который обеспечивает им устойчивость при селекции на антибиотике флеомицине. Было создано несколько типов подобных конструкций, заякоривающих ш-фрагмент на плазматической мембране, митохондриях, мембранах эндоплазматического ретикулума и направляющие белок в ядро. С их помощью получены стабильные репортерные линии клеток, постоянно экспрессирующие неактивный профермент в определенной клеточной структуре.

Конструирование векторов для экспрессии белков, слитых с а-пептидом

При создании конструкций, экспрессирующих a-пептид р-галактозидазы, последний помещали на С-конце слитого белка, перед антигенным эпитопом белка с-тус, или, в некоторых случаях, на N-конце. Варианты конструкций с направленной локализацией слитого исследуемого белка создавали с использованием тех же сигнальных пептидов, которые были использованы в си-конструкциях.

Сборка a-конструкций также проводилась в несколько этапов. Вначале в вектор pLCMV вводили синтетический олигонукпеотид, содержащий a-пептид и эпитоп гена туе. При создании конструктов с направленной локализацией, синтетический олигонукпеотид вводили в векторы, уже содержащие соответствующие локализационные пептиды. Далее, в рамку считывания a-пептида вводили исследуемый белок, после чего вводили кассету для устойчивости к антибиотику G418 (ген neo под контролем NP-промотора).

Название конструкта Исходный конструкт Добавленные элементы Функции

pLCMV Исходный вектор Нет Содержит лентивирусную кассету с CMV-промотором. На З'-конце CMV-промотера заложены рестрикционные сайты Xbal, BamHI и Sail.

pLCMV-C-Nuc pLCMV-N-ER pLCMV-N-Mit pLCMV-N-Mem pLCMV Локализационный сигнал Nue (ER, Mit, шет), с полилинкерной областью Xhol, BamHI, (EcoRI у nue и ER) на 5'- (nue) или З'-конце Промежуточная конструкция, служащая для создания экспрессоров белков с направленной локализацией

pLCMV-Q-LacZ-Nuc-bleo pLCMV-ER-Q-LacZ-bleo pLCMV-Mit-Q-LacZ-Ыео pLCMV-Mem-Q-LacZ-bleo pLCMV-C-Nuc pLCMV-N-ER pLCMV-N-Mit pLCMV-N-Mem Q-пептид, ген устойчивости Ыео с промотором NP Экспрессор io-цепи 3-галактозидазы с сигналом внутриклеточной локализации и селективным маркером Ыео

pLCMV-EGFP-nuc-PMN pLCMV-ER-EGFP-PMN pLCMV-mit-EGFP-PMN pLCMV-mem-EGFP-PMN pLCMV-C-Nuc pLCMV-N-ER pLCMV-N-Mit pLCMV-N-Mem a-пептид, эпитоп туе, мРНК EGFP, ген устойчивости neo с промотором NP Экспрессирует EGFP с сигналом локализации, эпитопом туе и а-пептидом р-галактозидазы. Селекция на G418

pLCMV-F0X03A-PMN pLCMV-F0X03A-nuc-PMN PLCMV-ER-F0X03A-PMN pLCMV-mit-F0X03A-PMN pLCMV-mem-F0X03A-PMN pLCMV pLCMV-C-Nuc pLCMV-N-ER pLCMV-N-M¡t pLCMV-N-Mem а-пептид, эпитоп туе, мРНК F0X03A, ген устойчивости neo с промотором NP Экспрессирует F0X03A, с сигналом локализации или нелокализованный, с эпитопом туе и а-пептидом Р-галактозидазы. Селекция на G418

pLCMV-Sesn2-PMN pLCMV-Sesn2-nuc-PMN pLCMV-ER-Sesn2-PMN pLCMV-m¡t-Se$n2-PMN pLCMV-mem-Sesn2-PMN pLCMV pLCMV-C-Nuc pLCMV-N-ER pLCMV-N-Mit pLCMV-N-Mem а-пептид, эпитоп туе, мРНК Sesn2, ген устойчивости neo с промотором NP Экспрессирует Sesn2, с сигналом локализации или нелокализованный, с эпитопом туе и а-пептидом р-галактозидазы. Селекция на G418

pLCMV-SRX-PMN pLCMV-SRX-nuc-PMN pLCMV-ER-SRX-PMN pLCMV-mit-SRX-PMN pLCMV-mem-SRX-PMN pLCMV pLCMV-C-Nuc pLCMV-N-ER pLCMV-N-M¡t pLCMV-N-Mem а-пептид, эпитоп туе, мРНК SRX, ген устойчивости neo с промотором NP Экспрессирует Sesn2, с сигналом локализации или нелокализованный, с эпитопом туе и а-пептидом Р-галактозидазы. Селекция на G418

pLCMV-Prx1-PMN pLCMV-Prx2-PMN pLCMV-Prx3-PMN pLCMV а-пептид, эпитоп туе, мРНК Ргх1, Ргх2 или РгхЗ, ген устойчивости NP-neo Экспрессирует Ргх1, Ргх2 или РгхЗ, без сигнала локализации, с эпитопом туе и а-пептидом р-галактозидазы. Селекция на G418

pLCMV-PTKa-PMN pLCMV-PTKr-PMN pLCMV-PKCa-PMN pLCMV-PKCr-PMN pLCMV-CKIla-PMN pLCMV-PKAa-PMN pLCMV а-пептид, эпитоп туе, мРНК мутантного Sesn2, ген устойчивости neo с промотором NP Вариант pLCMV-Sesn2-PMN, с мРНК мутантных Sesn2, содержащих перманентно активированные сайты фосфорилирования фосфотирозинкиназы (РТКа), протеинкиназы С (РКСа), казеинкиназы-2 (СКПа) и протеинкиназы А (РКАа), или перманентно репрессированные сайты фосфорилирования фосфотирозинкиназы (РТКг) и протеинкиназы С (РКСг)

Таблица 1. Варианты конструкций для локализационного репортера, использовавшиеся в работе

Готовые конструкции способны экспрессировать исследуемый белок, соединенный с коротким а-фрагментом фермента р-галактозидазы и антигенным эпитопом белка с-тус (10 аминокислотных остатков), что позволяет контролировать количество и местонахождение белка стандартными иммунологическими методами. Это особенно удобно в случае отсутствия специфических антител, узнающих исследуемый белок.

В качестве контролей были также созданы несколько а-конструкций, в которых а-пептид р-галактозидазы расположен в составе гетерологичного зеленого флуоресцентного белка EGFP. В этих конструкциях белок EGFP либо не имеет локализационных сигналов, либо снабжен соответствующими сигнальными пептидами, направляющими его в различные клеточные структуры. Удобство EGFP заключается в возможности визуального контроля локализации белка. Все созданные репортерные конструкции описаны в таблице 1.

Получение клонов u>-nuc-bleo

После трансдукции культуры клеток рекомбинантными конструкциями, экспрессирующими ы-фрагмент |3-галактозидазы, слитый с сигналом внутриклеточной локализации, была проведена селекция клеток путем культивации с флеомицином. После прохождения i селекции в культуру клеток вводились конструкты, содержащие флуоресцентный белок GFP, слитый с а-фрагментом р-галактозидазы, а также с сигналом ядерной локализации (GFP-nuc-PMN), или не обладающий специфическим локализационным сигналом (GFP-PMN). Затем, в этих клеточных культурах, с помощью тест-системы Gal-Screen измерялся уровень активности (З-галактозидазы для определения функциональной активности репортера.

Рис. 1. Уровень активности р-галактозидазы в массовых культурах клеток RKO с введенной конструкцией pLCMV-ю-пис-Ыео, после введения экспрессоров GFP-PMN и GFP-nuc-PMN.

Уровень активной р-галактозидазы различается в этих массовых культурах лишь незначительно (рис. 1). Однако, внутри массовой культуры возможны широкие вариации уровня экспрессии трансгена, что обусловлено местом интеграции, влиянием окружающих регуляторных элементов, а также эпигенетическим состоянием всего прилегающего участка. Для получения оптимальной репортерной линии были отобраны индивидуальные клоны клеток, экспрессирующие в определенных клеточных структурах ы-пептид р-галактозидазы.

В качестве примера опишем отбор репортерной линии для анализа ядерной локализации белков. В индивидуальные клоны клеток РЖО с введенной конструкцией р[_СМ\/-и)-1ас2-пис-Ыео параллельно вводили конструкции рЮМУ-СРР-РМЫ, рЬСМУ-СРР-пис-РМЫ или рЮМУ-тет-ОРР-РМЫ, которые экспрессируют слитый с а-пептидом зеленый флуоресцентный белок (содержащий или не содержащий сигналы внутриклеточной локализации). После селекции на антибиотике С418 экспрессию оценивали флуоресцентной микроскопией (рис. 2).

500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

RKO-ш-пис-Ыео

GFP PMN

GFP NUC

Рис. 2 Результаты флуоресцентного анализа, проведенного на клонах клеток 11КО с введенными конструктами рЬСМУ-вРР-РМЫ, рЬСМУ-СРР-пис-РМЫ или рЬСМУ-тет-ОРР-РММ, соответственно.

Были отобраны клоны с приблизительно одинаковым уровнем экспрессии ЭРР, после чего определялась активность (3-галактозидазы. Критерием для отбора оптимального клона было максимальное соотношение между уровнями активности р-галактозидазы в культурах, содержащих ядерный и мембранный ш-фрагмент. Немаловажное значение имела также чувствительность системы, которая зависит от уровня (3-галактозидазной

активности. Поэтому из 24 первичных клонов были вначале отобраны клоны, демонстрирующие максимальную

ферментативную активность при введении конструкции рЮМУ-СРР-пис-РМЫ (рис. 3).

1000000 100000 10000 1000

clone4 clone5

mass GFP-fJUC

Рис. 3. Уровни активности р-галактозидазы в различных клонах клеточной линии ЯКО с введенным конструктом рЬСМУ-со-пие-Ысо и рЬСМУ-ОРР-пис-РММ. Шкала логарифмическая.

Далее из отобранных клонов (N21 и N211) выявляли клон, в котором наблюдается максимальное соотношение уровней ферментативной активности при введении ядерного белка по сравнению с мембранным белком.

Как видно из Рис. 4, клон N21 обладает наиболее выраженной специфичностью. Высокий фон, полученный с линией N211, может обуславливаться либо присутствием части ш-фрагмента вне ядра, либо сравнительно высоким уровнем митотической активности клеток - во время митоза происходит смешивание белковых продуктов ядра и цитоплазмы.

I 0.5

□ EGFP-mic ■ EGFP-mem

NZ1

NZ11

Рис. 4. Уровни активности р-галактозидазы, измеренные по Оа^сгееп в репортерных клонах ЯКО-Ыг1 и ИКО-ЖП с введенным конструктом ЕвРР-пис (положительный контроль) и ЕОРР-тет (отрицательный контроль).

Аналогичным образом были получены и испытаны клоны с оптимальной экспрессией ы-фрагмента с сигналом митохондриальной, мембранной и эндоплазматической локализации. Полученные результаты указывают на то, что Г

репортеры, локализованные в «закрытых» клеточных структурах, таких как ядро и митохондрии, характеризуются существенно большим динамическим диапазоном работы. Скорее всего, это связано с тем, что в «открытых» структурах повышена вероятность встречи двух компонентов репортерного комплекса, даже если связанный с а-пептидом белок имеет другой сигнал локализации. Однако, даже при введении ш-конструкта в «открытые» структуры, было показано достоверное различие в уровне активации репортера между положительным (с той же локализацией а-пептида) и отрицательным (а-пептид располагается в другой структуре) контролями. Это дает основания предполагать, что такие репортеры могут быть успешно использованы для определения внутриклеточной транслокации белков в «открытых» структурах, по крайней мере, в том случае, если эти перемещения будут велики в процентном отношении к общему количеству белка, входящего в данную структуру.

Отработка функционирования репортера на примере белка FOXQ3A

В качестве проверки функционирования локализационного репортера, полученные репортерные линии клеток были применены для количественной оценки ядерной транслокации белка F0X03A. Этот белок участвует в сигнальном пути, запускаемом инсулин-подобным фактором роста IGF1, и относится к транскрипционным факторам семейства Forkhead. Известно, что белки подсемейства FOXO курсируют между ядром и цитоплазмой, за счет чего происходит регуляция их активности. Проникая в ядро, они взаимодействует со специфическими участками ДНК контролируемых ими генов, активируя транскрипцию. Белки FOXO содержат как сигнал ядерной локализации, так и сигнал ядерного экспорта, а их перемещение между ядром и цитоплазмой, по-видимому, является равновесным, зависящим от ряда вспомогательных белков процессом. Известно, что импорту белка FOXO в ядро способствуют импортины, в то время как его выход из ядра контролируется экспортином Crm1. Ключевую роль в определении соотношения процессов ядерного импорта и экспорта белков FOXO играет серин-треониновая протеинкиназа В (РКВ или Akt). Протеинкиназная функция белка Akt активируется за счет связывания с вторичным липидным посланником, фосфатидилинозитолом, который, в свою очередь, фосфорилируется фосфатидил-инозитол-3-киназой (РОК). Активированный Akt фосфорилирует ядерный F0X03A по Thr32, что приводит к взаимодействию комплекса белка FOXO и экспортина Сгт1 с белком 14-3-3, приводящему к подавлению сигнала ядерной локализации и преимущественному расположению белка FOXO в цитоплазме. Влияя на данные регуляторные процессы, можно манипулировать внутриклеточным расположением белка F0X03A, что представляет собой хорошую модель для проверки эффективности разрабатываемой локализационной репортерный системы.

Помимо конструкции pLCMV-F0X03A-PMN, были созданы две контрольные конструкции для экспрессии белка F0X03A, снабженного а-пептидом и локализующегося в ядре и в плазматической мембране. Уровень ферментативной активности при введении таких конструкций в репортерную линию RKO-NZ1 позволяет определить максимально и минимально возможный уровень присутствия белка F0X03A в ядре. Большая часть белка F0X03A в клетках RKO располагалась вне ядра, поскольку ферментативная активность у клеток, экспрессирующих конструкт pLCMV-F0X03A-PMN, всего в два раза превышала значение отрицательного контроля, т.е. клеток, с введенным pLCMV-mem-F0X03A-PMN, но была в 8 раз ниже активности в клетках с введенной конструкцией, экспрессирующей ядерный белок (Рис. 5).

Рис. 5. Уровни ферментативной активности в рспортерных клетках линии RKO-NZ1 с введенным F0X03A с сигналом ядерной, мембранной локализации, или без сигналов локализации.

Далее, нами было определено влияние среды культивирования на перераспределение белка F0X03A между ядром и цитоплазмой. Известно, что недостаток глюкозы сопровождается угнетением активности киназы РКВ, что приводит к ослаблению фосфорилирования и ядерного экспорта белка F0X03A. Это адаптивное движение белка F0X03A из ядра должно подавляться в случае конститутивной активации киназы РКВ, что может быть достигнуто введением активированного онкогена Akt. При помощи лентивирусной инфекции мы ввели конститутивно активированный Akt в клетки линии RKO-NZ1 и использовали эту линию в качестве контроля. Инкубация контрольных клеток RKO-NZ1 в течение одного часа в среде DMEM, лишенной глюкозы приводила к почти двукратному повышению ферментативной активности, в то время как в клетках, экспрессирующих активированный Akt, повышение было в пределах 20%.

Рис. 6. Переход F0X03A в ядро при культивации клеток в среде без глюкозы и возвращение F0X03A в цитоплазму при добавлении глюкозы в среду. Показана динамика в клетках RKO-NZI с введенным F0X03A-PMN в присутствии и отсутствие Akt.

После восстановления нормального содержания глюкозы в среде в течение одного часа наблюдалось практически полное восстановление исходного уровня

ферментативной активности, что указывает на выход части белка F0X03A из ядра (рис. 6). В контрольном опыте с культурой, Часы 6 8 экспрессирующей белок EGFP вместо белка

F0X03A, изменения содержания глюкозы не сказывались на уровне ферментативной активности. Обратная тенденция с уменьшением ферментативной активности в ответ на глюкозное голодание и ее последующее восстановление при добавлении глюкозы была отмечена в репортерной линии RKO-MemZ11, содержащей ш-фрагмент в плазматической мембране. Другим приемом для изменения внутриклеточного распределения белка F0X03A является обработка клеток ингибитором Р13-киназы вортманнином, который опосредованно подавляет активность РКВ и тем самым препятствует перемещению белка F0X03A в цитоплазму. Обработка клеток RK0-NZ1-F0X03A-PMN в течение двух часов вортманнином в концентрации 40 пМ приводила к четырехкратному увеличению ферментативной активности. Последующая отмывка вортманнина свежей средой в течение двух часов приводила к обратному процессу, указывающему на выход белка F0X03A из ядра (рис. 7).

■ FOX03A

□ F0X03A-mem

□ ГОХОЗА-nuc

3 -глюкоза + АКТ

•«#».+глюкоза + АКТ - глюкоза - АКТ

Рис. 7. Результаты измерения активности локализациошюго репортера методом GalScrccn в клетках RKO-NZ1-F0X03A-PMN после смены среды с DMEM на Earle (1) и обработки клеток 40пМ вортмашша (2) с последующей отмывкой через а) 2 часа инкубации; б) четыре часа инкубации; в) без отмывки

Для подтверждения того, что наблюдаемые изменения ферментативной активности связаны не с повышением или снижением общего уровня белка F0X03A в клетке, нами было проведено количественное определение белка F0X03A методом Вестерн-анализа с использованием антител, узнающих пришитый к этому белку С-концевой антигенный эпитоп с-тус. Было установлено, что как в контрольных необработанных клетках, так и после обработки вортманнином и последующей его отмывки, уровень рекомбинантного белка F0X03A существенно не меняется. Очевидно, изменения активности р-галактозидазы связаны с перераспределением рекомбинантного белка внутри клетки, что делает его более или менее доступным для функционального взаимодействия с расположенным в определенных клеточных структурах ш-фрагментом фермента.

Влияние обработки hTNF и культивации в среде без сыворотки на изменение внутриклеточной локализации белка Sesn2

В ходе метаболических реакций в клетке постоянно образуются соединения активного кислорода, которые затем нейтрализуются антиоксидантными ферментами. Кроме того, многие взаимодействия лигандов с мембранными рецепторами сопровождаются образованием Н2О2, молекулы-медиатора внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих, в том числе, такие важные процессы, как пролиферация и апоптоз. Предотвращение негативных последствий, связанных с окислительным стрессом, достигается за счет специальных механизмов, регулирующих уровень сигнальных молекул Н2О2. Большая часть кислородных радикалов восстанавливается в клетке за счет тиол-содержащих пероскидаз семейства пероксиредоксинов (Prxns). В ходе этой реакции активные цистеины каталитических центров пероксиредоксинов, образующих гомодимер, окисляются и связываются друг с другом, формируя дисульфидную связь. В дальнейшем, окисленные пероксиредоксины подвергаются восстановлению тиоредоксин-редуктазной системой. Однако образование дисульфидной связи происходит довольно медленно, и если концентрация ROS в клетке слишком высока, активные цистеины пероксиредоксинов подвергаются более полному окислению. Продукт такого окисления, Cys-S02H, не может быть восстановлен тиоредоксин-редуктазной системой. Несмотря на это, в клетках, подвергшихся сильному окислительному стрессу, количество переокисленных пероксиредоксинов с течением времени падает. По некоторым данным восстановление таких пероксиредоксинов осуществляет белковый комплекс, компонентами которого

являются как тиоредоксин-редуктаза, так и белки семейства сестринов (Эевиз). Белок 5еБп2 принадлежит к этому семейству и принимает непосредственное участие в восстановлении переокисленных пероксиредоксинов, что важно для предотвращения окислительного стресса.

ЩШЯШЯ При помощи локализационного репортера ЩШ был предпринят анализ влияния условно----- —ашмих физиологических обработок, приводящих к

повышению внутриклеточного уровня ROS, на передислокацию Sesn2 в ядро. В качестве отправной точки было решено использовать обработку 500рМ Н202. Результаты иммунофлуоресцентного анализа были получены на клетках линии MCF7, а локализационный репортер был разработан на основе линии клеток RKO, которые больше подходят для измерений активности фермента системой GaIScreen из-за высоких темпов пролиферации. Сравнение уровня ROS после обработки клеток 500рМ Н202, выявило примерно одинаковые значения для обеих клеточных линий (рис. 9).

Данные иммунофлуоресцентного анализа, проведенного на клетках линии MCF7, показывают, что Sesn2, находящийся в отсутствие окислительного стресса преимущественно в цитоплазме, после обработки клеточной культуры 500рМ Н202, приводящей к значительному повышению ROS, переходит из цитоплазмы в ядро (рис. 8).

Рис. 8. Клетки линии MCF7, содержащие тетрациклин-зависимый экспрессор Sesn2-Flag, были обработаны 500pM Н2О2 в присутствии (ряд +tet) и в отсутствие (ряд -tet) тетрациклина, и подвергнуты иммунофлуоресцснтному окрашиванию антителами на Flag.

MCF7/tet-Hi95Flag Необработанные Н202,500цМ

■ RKO □ MCF7

% Рис. 9. Доля популяции клеток RKO и

100 «о^л MCF7, демонстрирующих

надпороговые уровни окисленного DCF-DA после смены среды DMEM на свежую, обработки 500цМ Н2О2, 100 ng/ml эпидермальным фактором роста (EGF), и 0.25 ng/pl фактора некроза опухолей liTNF. В качестве положительного контроля использовалось УФ-облученис культуры с добавленным DCF-DA в течение 20 секунд. Все обработки длились 40 минут. При измерении использовалось по 105 клеток на точку.

Параллельная инкубация в присутствии 500рМ Н202 культур RKO, экспрессирующих репортеры Sesn2-PMN и Sesn2-nuc-PMN, показала, что уже через 2 часа после начала

жз ш

1. 11

нгог

500[iM

К+ (UV 20sec)

70000

- HÍ95-PMN H¡95-nuc-PMN

i......

обработки уровень ферментативной активности в репортере Безп2-РММ практически в два раза превышает контрольные значения. С течением времени уровень активности возрос еще больше. При этом репортер Зезп2-Р1\М имел довольно низкий фоновый уровнь активности, который был в 5 раз ниже уровня активности репортера Зезп2-пис-Р1\М (с введенным сигналом ядерной локализации), что говорит о довольно широком динамическом диапазоне системы (рис. 10).

Рис. 10. Динамика изменения уровня активации локализационного репортера

......1 8с5п2-РМЫ под действием 500 цМ Н2О2 с

течением времени. В качестве контроля был использован репортер 8с5п2-пис-РМЫ с введенным сигналом ядерной локализации. Измерения проводились через 1, 3,6, 9 и 12 часов после добавления Н2О2.

Добавление 500 рМ Н2Ог вызывает быстрое и значительное увеличение ферментативной активности.

Однако, это воздействие выходит за физиологически-допустимые пределы. Такие высокие концентрации ROS могут приводить к необратимым нарушениям клеточной жизнедеятельности, окислительному стрессу, и, впоследствии, к апоптозу. Не исключено, что такие высокие уровни перехода Sesn2 в ядро на поздних сроках после добавления перекиси в значительной степени вызваны пост-стрессорными нарушениями клеточного метаболизма и не являются адаптивным, физиологическим ответом на повышенные уровни ROS. В пользу этого также свидетельствует статистически достоверное увеличение присутствия в ядре Sesn2 с введенным сигналом ядерной локализации, происходящее в ответ на обработку Н2Ог.

л Рис. 11. Динамика активации

локализационного репортера Scsn2-PMN после добавления к клеткам, культивировавшимся на среде без сыворотки, 10%FCS (линия "FCS"), и обработки клеток 50nM hTNF (линия "TNF"). По оси Y: кратность увеличения уровня сигнала относительно исходных значений.

нет Нг02 1чН,Ог Зч Нг02 6чНгО, ЭчНг02 12чН,Ог

2,5

Напротив, культивация клеток на среде DMEM без фетальной сыворотки (FCS), с последующим добавлением FCS до 10% объема 05 среды, или добавление в клеточную

среду умеренных доз фактора некроза опухолей человека (hTNF) также

и л, ч и та"-. t>i о 14 '

достоверно повышают уровни внутриклеточных ROS, не приводя при этом к летальным последствиям.

Испытание воздействия таких обработок на переход Sesn2 в ядро с помощью локализационного репортера показало, что под действием hTNF Sesn2 демонстрирует впечатляющую динамику ядерной передислокации. Однако, добавление сыворотки,

несмотря на наблюдаемые увеличения уровней ROS, не приводило к значимым увеличениям уровня ядерного Sesn2 (рис. 11).

Перемещения Sesn2 в митохондрии и к плазматической мембране при окислительном стрессе

Для того, чтобы определить, не является ли наблюдаемый переход Sesn2 в ядро под действием перекиси следствием простого увеличения количества белка за счет изменения темпов транскрипции или трансляции, были отобраны репортерные клоны, содержащие ы-пептид в митохондриях или плазматических мембранах. В эти клоны были введены a-конструкции, экспрессирующие свободный Sesn2, либо Sesn2, заякоренный на митохондрии или плазматические мембраны. Далее, клеточные культуры подверглись обработке Н202 в течение 2-х часов, после чего в них была измерена активность репортера. В спокойном состоянии количество Sesn2, локализованного в митохондриях, было достаточно велико, причем, существенно выше, чем количество Sesn2 с сигналом митохондриальной локализации. При обработке перекисью Sesn2, не обладающий локализационным сигналом, покидает митохондрии, a Sesn2-mit, наоборот, накапливается в них. Такая разнонаправленная динамика движения, вероятно, связана с конкуренцией за возможность связывания различных форм Sesn2 в митохондриях, причем при перекиси свободный Sesn2 выходит из митохондрий в ядро, освобождая место для Sesn2, имеющего специфический сигнал митохондриальной локализации. Уменьшение уровня свободного Sesn2 в митохондриях, в свою очередь, указывает на то, что обработка Н202 способна приводить к внутриклеточному перераспределению Sesn2, которое не может быть объяснено простым увеличением количества белка.

■ MEZP11 □ MEZA11

Контроль

Рис.12. Уровни активности локализационного репортера в клонах с митохондриальной (MIZP3, M1ZA3) и мембранной (MEZP11, MEZA11) локализацией со-пептида ß-галактозидазы до и после обработки

Н2Ог Контроль НгОг

в течение 2 часов 500 |аМ Н202. В клетках МКРЗ и МЕгР! 1 присутствует 8сзп2-РМЫ, в клетках МКАЗ присутствует Бевпг-тИ-РММ, а в клетках МЕгАП присутствует 8с5п2-тст-РММ.

Репортер, экспрессирующий мембранный ш-пептид, напротив, выявляет противоположную динамику перемещения Эезп2 в ответ на окислительный стресс. Исходно невысокие уровни активности для свободного Зеэп2 после обработки Н2О2 увеличиваются более чем в 3 раза. Имеющий сигнал мембранной локализации Зезп2-тет-РМЫ, напротив, отходит от плазматической мембраны (рис. 12). Можно предположить, что 5езп2, в норме слабо представленный вблизи плазматической мембраны, активно накапливается на ней в ходе реакции на окислительный стресс. Уменьшение же количества Эе8п2 с сигналом мембранной локализации может быть объяснено супрессией нейромодулиновых локализационных механизмов, возникающей в ответ на стресс.

Чтобы оценить возможные уровни стресс-индуцированного неспецифического перемещения Эеэпг в ядро, которое может быть вызвано, например, повышением проницаемости ядерных пор в результате окислительного повреждения некоторых нукпеопоринов, Зезп2-тК-РММ, имеющий сигнал митохондриальной локализации, был

введен в клетки репортерной линии NZ1 (содержит ядерный ы-пептид), с последующей обработкой перекисью водорода. Для сравнения была использована а-конструкция,

Рис. 13. Динамика перемещения в ядро Scsn2-mit (NZlmi), и свободного Scsn2 (NZIP) после обработки клеток 500 |JM Н2О2.

Полученная динамика перемещения Sesn2-mit-PMN в ядро подтверждает предположение о нарушении ядерной проницаемости при значительном окислительном стрессе (рис. 13). Однако факт, что свободно перемещающийся Sesn2-PMN переходит в ядро более интенсивно, указывает на то, что наблюдаемые перемещения связаны не I о 2 4 часы 6 8 ю только с неспецифическим увеличением

| ядерной проницаемости.

Влияние сульфиредоксина на передислокацию Sesn2

Белковый комплекс, осуществляющий восстановление переокисленных пероксиредоксинов, помимо тиоредоксин-редуктазы и сестринов, включает в себя белок сульфиредоксин (Srx). Этот относительно небольшой (11 кД) белок способен восстанавливать пероксиредоксины in vitro в присутствии Sesn2. В нашей лаборатории установлено, что при ко-экспрессии белков Sesn2 и Srx они образуют комплекс, выявляемый методом иммунопреципитации с последующим иммуноблоттингом. При этом значительная часть Sesn2, присутствующего в клетке, находится в комплексе с Srx. Возможно, образование комплекса с белком Srx также влияет на внутриклеточную локализацию Sesn2. Мы транедуцировали клетки репортерной линии NZ1-Sesn2-PMN, конструктом, экспрессирующим Srx, снабженный сигналом митохондриальной или мембранной локализации. В ходе селекции выяснилось, что белок Srx-mem чрезвычайно | токсичен для клеток, и получить соответствующую стабильную культуру невозможно. Экспрессор Srx-mit, в свою очередь, также несколько подавлял рост клеток. После проведения селекции клетки NZ1-Sesn2-PMN с введенным Srx-mit были обработаны | 25нг/мл hTNF в течение 20 часов.

I Результаты указывают на то, что Sesn2 способен переходить в ядро в присутствии Srx-mit, j однако интенсивность перехода достоверно снижена по сравнению с контрольной культурой, где Srx-mit не экспрессируется. Также, абсолютные значения активности [3-галактозидазы свидетельствуют о том, что в присутствии Srx-mit фоновый уровень Sesn2 в ядре в 2,5 раза ниже, чем в контрольных культурах. Под действием hTNF уровень ядерного Sesn2 в культурах с введенным Srx-mit едва достигает фонового уровня для контрольного ядерного Sesn2 (рис. 14). Эти данные указывают на то, что Srx оказывает I влияние на внутриклеточные перемещения белка Sesn2.

экспрессирующая свободный Sesn2.

Рис. 14. Динамика перемещений 8е$п2 в ядро под действием И ТЫ Г в присутствии (Ш1Р вгх-МИ) и в отсутствие (N21?) Бгх-тЛ.

Контроль

Переход Sesn2 в ядро под действием РМД

Все воздействия, описанные выше и применявшиеся для анализа внутриклеточной локализации Sesn2, приводили к подъему уровня внутриклеточных ROS, но, либо были недостаточно сильны, чтобы вызвать значимую передислокацию Sesn2, либо оказывались избыточными и со временем вызывали апоптоз. В частности, при обработке 25нг/мл hTNF происходило существенное замедление пролиферации и наблюдалось заметное количество апоптозных клеток. В ходе поиска нетоксичных обработок, вызывающих существенное повышение ROS, было обнаружено, что обработка форболовым эфиром РМА, вызывая увеличение уровня кислородных радикалов, приводит к интенсивному и продолжительному переходу Sesn2 в ядро. РМА, являясь промотором опухолевого роста, приводит к активации протеинкиназы С (РКС), что, в свою очередь, стимулирует активность NADPH-зависимых оксидаз (NOX) и приводит к запуску ROS-опосредованных сигналов. Примечательно, что при одновременной обработке репортерных клеток NZ1-Sesn2-PMN hTNF и РМА наблюдалось их кумулятивное действие на ядерную транслокацию Sesn2 (рис. 15).

Рис. 15. Перемещение Sesn2 в ядро в клетках рспортерной культуры NZ1-Sesn2-PMN под действием РМА, hTNF, и их смеси, в зависимости от добавленной концентрации препаратов. Обработки проводились в течение 5 часов.

Длительные измерения динамики перехода Sesn2 в ядро под действием РМА показали, что даже спустя 36 часов после обработки, активность ядерного репортера в несколько раз превышает контрольные значения (рис. 16).

3,5

2,5 -

1,5 -

0,5 -

■ РМА

□ TNF

□ PMA+TNF

0,3125пМ 1,6125пд

0,625пМ 3,125ng

1,25nM 6,25ng

2,5nM 12,5ng

5nM 25ng

юлы 50ng

20п 100ng

6 1

5 -

■PMA (обработка 2 часа) PMA (обработка без отмыва )

500

2000 2500

Рис. 16. Динамика перемещения Scsn2 в ядро в клетках NZl-Scsn2-PMN при добавлении 5пМ РМА.

Обработка РМА приводила также к стойкому повышению уровня ROS. Таким образом, РМА приводит к запуску сигнальных путей,

использующих Н2О2, причем после удаления РМА этот сигнал остается активным длительное время. Наблюдения за культурой клеток после обработки РМА показали, что он не оказывает токсического действия на клетки, не приводит к апоптозу и несколько стимулирует пролиферацию. Таким образом, переход Sesn2 в ядро в данном случае не является следствием

3,5

1000 1500 минуты

токсического, предапоптозного перераспределения белков.

Известно, что Sesn2 участвует в восстановлении переокисленных пероксиредоксинов, образуя с ними единый белковый комплекс. Поэтому, если переход Sesn2 в ядро под действием РМА связан с процессом восстановления пероксиредоксинов, то количество комплексов Sesn2-Prx в ядре также должно возрастать, что может происходить в связи с увеличением ядерного импорта пероксиредоксинов.

Рис. 17. Изменения активности ядерных локализационных репортеров на Prxl, Ргх2 и РгхЗ, (NZl-Prxl-PMN, NZl-Prx2-PMN и NZl-Prx3-PMN) после обработки 5пМ РМА в течение 18 часов.

Для того чтобы пронаблюдать перемещения пероксиредоксинов в ядро под воздействием РМА, в репортерные клетки NZ1 были введены конструкты, экспрессирующие Ргх1, Ргх2, и РгхЗ, соединенные с а-пептидом. Далее, клетки инкубировали с 5 пМ РМА в течение 18 часов, после чего была измерена активность репортера. Репортеры на Ргх1 и РгхЗ показали, что количество этих белков в ядре не претерпевает существенных изменений под действием РМА. Однако, количество Ргх2 в ядре после обработки РМА возрастало в 3 раза (рис. 17). Таким образом, в клетках, контроль рма 18ч стимулированных РМА, происходит одновременная

передислокация Sesn2 и Ргх2, что возможно указывает на их совместную роль в ядре.

■ Ргх1

□ Ргх2

□ РгхЗ

m и

Исследование механизмов РМА-индуцированной передислокации Sesn2

РМА является активатором протеинкиназы С, которая способна активировать сигнальные пути, приводящие к повышению внутриклеточных уровней ROS. Это, в свою очередь, приводит к ядерной транслокации Sesn2. РКС играет также роль в ряде клеточных сигнальных путей, использующих Н2О2 в качестве медиатора, например, при передаче сигнала от рецептора эпидермального ростового фактора (EGFR). Мы решили выяснить,

какой из компонентов сигнальных путей, активируемых РМА, непосредственно вызывает1 перемещение Sesn2 из цитоплазмы в ядро.

Рис. 18. Схема H2O2-I опосредованного пути передачи! сигналов на примере сигнапьногО| пути эпидермального ростового фактора (EGF). EGF, связываясь d рецептором (EGFR), воздействует на! ГТФазу Rae и активирует РКС, что приводит к активации связанного с

Поддержание защиты мембраной комплекса ЫОХ, которы{^ 1Кп0еМреокисленияДра °Т вызывает выброс супероксида, Е| дальнейшем превращающегося к

Н2О2. Это, в свою очередь, приводит* к модификации редокс-

чувствительных мишеней, к способствует передаче сигнала! Обработка клеток ангиокеидантом № ацетил-цистеином (NAC) или катапазой нейтрализует образовавшийся Н2О2. DP! является специфически^ ингибитором NOX5. Ингибиторы Н7 и BMI подавляют активность протеинкиназы С.

Для этого были использованы специфические ингибиторы отдельных стадий передачу сигнала. Diphenylene iodonium (DPI) специфически подавляет NOX, предотвраща образование кислородных радикалов в ответ на обработку РМА или действие EGF, Ингибиторы киназ Н7 и BMI угнетают протеинкиназу С, подавляя РКС-зависиму; активацию NOX. NAC и каталаза нейтрализуют Н2О2, и предотвращают модификации редокс-чувствительных компонентов сигнальных путей (рис.18).

Рис. 19. Влияние ингибиторов NOX, РКС и ROS на повышени уровня соединений активного кислорода после обработки клеток РМА и Н202.

Измерение уровня ROS н клетках, инкубированных 5 пМ РМА или 500 рМ Н20' и обработанны.

ингибиторами NOX, РКС i ROS (по флуоресценции DCF-DA, измеряно

методом проточно'

флуориметрии) показал что обработка каталазой и D

Контроль

Каталаза

клето!

эффективно защищает клетки от повышения уровней ROS под действием РМ В то же время, BMI, специфический ингибитор РКС, сам по себе приводя к некотором повышению уровней ROS, ослаблял способность РМА и Н2О2 повышать уровни RO (рис 19).

Параллельно, на репортерной культуре NZ1-Sesn2-PMN была испытана способность указанных ингибиторов влиять на перемещение Sesn2 в ядро под действием 5пМ РМА.

Несмотря на то, что и каталаза, и DPI эффективно предотвращают повышение уровня внутриклеточных ROS, вызванное РМА, только ингибиторы протеинкиназы С Н7 и BMI оказались способными предотвращать PMA-индуцированный переход Sesn2 в ядро (рис. 20). По-видимому, именно протеинкиназа С, активированная под действием РМА, подвергает фосфорилированию либо сам Sesn2, либо белки, с которыми он ассоциирован, что приводит к перемещению Sesn2, в ядро.

Рис. 20. Переход Sesn2 в ядро в клетках репортера NZl-Scsn2-PMN, обработанных ингибиторами РКС, NOX и ROS после культивации в среде с 5 пМ РМА в течение 15 часов.

Помимо физиологических выбросов ROS, которые возникают за счет активности NOX при проведении сигнала, клетка может подвергаться окислительному стрессу,

например при обработке Н202. Под действием экзогенных ROS Sesn2 также переходит в ядро, однако регуляция этого процесса может быть иной по сравнению с транслокацией Sesn2 под действием лигандов мембранных рецепторов и РМА. Для того, чтобы проверить это, репортерные клетки NZ1-Sesn2-PMN обрабатывали ингибиторами NOX, РКС и ROS и культивировали в среде с 5 пМ РМА, 500 рМ Н202 или 25 нг/мл hTNF.

Отдельные обработки могут по-разному влиять на общий уровень ядерного импорта. Для исключения влияния артефактных воздействий, приводящих к неспецифическим эффектам, параллельно с локализационным репортером на Sesn2 (NZ1-Sesn2-PMN), аналогичным обработкам была подвергнута контрольная репортрная культура, экспрессирующая GFP (NZ1-GFP-PMN). Сравнивая динамику перемещения не участвующего в проведении редокс-сигналов GFP с перемещениями Sesn2, можно вычленить вклад, который могут вносить неспецифические изменения ядерного импорта-экспорта.

н Н! ■ контроль О + РМА

1 S Hill

контроль Каталаза BMI H7 DPI

Рис. 21. Культуру клеток репортера NZl-Sesn2-PMN культивировали в течение 2-х часов с ингибиторами РКС (Н7, BMI), NOX (DPI) и ROS (каталаза), и обрабатывали РМА, Н202 и hTNF в течение 5 часов. Перемещение Sesn2 в ядро определяли путем измерения активности ß-галактозидазы тест-системой GalScreen. Зеленым цветом отмечено движение в ядро белка GFP в контрольной репортерной культуре NZ1-GFP-PMN, подвергнутой тем же обработкам.

Обработка ингибиторами РКС (Н7 и BMI) приводила к резкому подавлению перехода Sesr\2 в ядро под действием РМА, что подтвердило вывод о ключевой роли этой киназы в ядерной транслокации Sesn2. Переход Sesn2 в ядро под действием Н2О2 наиболее эффективно подавлялся под действием каталазы и ингибитора киназы Н7. В то же время, транслокация Sesn2 под действием hTNF, была чувствительна к ингибитору киназ H7, и, в меньшей степени, к обработке каталазой и ингибитором NOX DPI. Видимо, Н202-индуцированный переход Sesn2 в ядро имеет регуляцию, в меньшей мере зависимую от РКС, поскольку Н7, в отличие от BMI, обладает меньшей специфичностью действия, а BMI, в свою очередь, не подавляет транслокацию Sesn2 под действием перекиси. Аналогично, hTNF, по-видимому, влияет на транслокакцию Sesn2 как посредством активации NOX, так и путем активации киназ, отличных от РКС и угнетаемых Н7 (рис. 21).

Влияние сайтов фосфорилирования белковой молекулы Sesn2 на динамику ядерной транслокации

Хотя роль протеинкиназы С в процессе передислокации Sesn2 в ядро в ответ на оксидативный стресс кажется установленной, остается неясным, какие мишени этой киназы опосредуют ее действие. РКС может как непосредственно фосфорилировать специфические сайты на самом Sesn2, так и действовать на другие белки, либо находящиеся с ним в комплексе, либо косвенно влияющие на процесс транслокации. Амнокислотная последовательность Sesn2 содержит несколько потенциальных сайтов для фосфорилирования такими протеинкиназами как РКС, фосфотирозинкиназа (РТК), протеинкиназа А (РКА) и казеинкиназа II (CKII). Для изучения влияния фосфорилированного статуса этих сайтов на внутриклеточную динамику Sesn2, была изготовлена серия локализационных репортеров, экспрессирующих белок Sesn2, в который были введены точечные мутации двух типов по каждой категории сайтов фосфорилирования. Первый тип мутаций (РКСа, РКАа, СКПа, РТКа) имитировал

перманентно-фосфорилированное состояние сайта (замена Ser, Thr и Туг на Asp), а второй тип (PKCr, PKAr, СКИг, РТКг) имитировал нефосфорилированный белок (замена Ser или Thr на Ala; Туг на Cys или Phe) и делал сайт недоступным для фосфорилирования киназами.

Репортерные конструкции, экспрессирующие мутантные Sesn2, вводили в клетки RKO-NZ1, которые затем обрабатывали 5 nM РМА в течение 8 часов, и измеряли активность фермента. Мутантные варианты Sesn2, содержащие перманентно активированные сайты фосфорилирования РТК, CKII и РКА, перемещались а ядро в ответ на обработку РМА аналогично нормальному Sesn2, причем, перемещения мутанта РТКа также оказалось чувствительным к ингибитору РКС BMI. В то же время, перманентно-репрессированные по сайтам РТК и РКС мутантные Sesn2, а также Sesn2, перманентно-активированный по сайтам РКС, переходили в ядро под действием РМА гораздо более интенсивно, причем, переход сохранял чувствительность к обработке BMI (рис. 22).

1 Контроль 8ч РМА

Рис. 22. Динамика перемещения в ядро мутантных Sesn2, содержащих перманентно-активированные сайты фосфорилирования фосфотирозинкиназы (РТКа), протсинкиназы С (РКСа), казеинкиназы-2 (СКПа) и протсинкиназы А (РКАа), или перманентно-репрессированные сайты фосфорилирования фосфотирозинкиназы (РТКг) и протсинкиназы С (РКСг), и контрольного Sesn2 (95Р), после культивации в течение 8 часов с 5 пМ РМА. Параллельно, репортерные линии на некоторые мутанты и контрольный Sesn2 были обработаны ингибитором протсинкиназы С BMI (РТКа BMI, РТКг BMI, РКСа BMI, PKCr BMI, 95Р BMI).

Исходя из предположения, что Sesn2 переходит в ядро под действием прямого фосфорилирования при помощи, например, РКС, следовало бы ожидать, что РМА не будет оказывать существенного влияния на перемещения перманентно активированного мутантного Sesn2, поскольку он будет располагаться в ядре даже в отсутствие сигнальных воздействий. Однако, несмотря на высокую кратнность перехода отдельных мутантных Sesn2 в ядро, их абсолютные концентрации в ядре могут быть незначительными, если

4,5

5 ■ РТКа и РТКа BMI ® РТКг

■ РТКг BMI

□ РКСа

■ РКСа BMI а РКСг aPKCrBMI В95Р

□ 95Р BMI

□ CIIKa

■ РКАа

исходный уровень экспрессии данного мутанта ничтожен. Количественный анализ образцов белка из клеток, экспрессирующих различные варианты Sesn2 (иммуноблоттинг с антителами к с-тус с последующей денситометрией на инфракрасном сканнере Odyssey) выявил значительные количественные различия, вероятно указывающие на разницу в скорости их разрушения в клетке.

Полученные количественные данные были использованы для нормализации значений активности локализационного репортера. Скорректированные данные указывают, что мутанты PTKr-Sesn2 и PKCr-Sesn2, несмотря на впечатляющую динамику перемещения в ядро под действием РМА, практически отсутствуют в ядре как в спокойном состоянии, так и после обработки РМА. Также довольно низки количества локализованных в ядре мутантов CKlla-Sesn2 и PKAa-Sesn2. Мутант PKCa-Sesn2, напротив, содержится в ядре в спокойном состоянии в количестве, аналогичном количеству нормального Sesn2, а при обработке РМА накапливается там гораздо интенсивнее, чем нормальный Sesn2 (рис. 23).

80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0

Рис. 23. Абсолютные значения активности р-гапактозидазы в репортерах с мутантами 8с^п2, из предыдущего опыта. См. рис. 22.

На основании представленных данных можно сделать вывод о том, что фосфорилирование сайтов РКС, а также, в той или иной степени, сайтов других киназ, влияет на перемещение Эезп2 в ядро. Однако фосфорилирование этих сайтов не является единственным необходимым условием, поскольку перемещение мутантных белков продолжает зависеть от ингибитора РКС.

■ РТКа

и РТКаBMI

■ РТКг

■ РТКг BMI

□ РКСа

□ РКСа BMI

■ РКСг

и РКСг BMI а 95Р и 95Р BMI и СИКа

□ РКАа

Контроль

8ч РМА

Заключение

Разработанная система локализационных репортеров является мощным инструментом для определения изменений внутриклеточной локализации белков. Широкий динамический диапазон и высокая чувствительность позволяют использовать локализационный репортер для определения небольших, относительно общего количества, перемещений исследуемого белка внутри клетки. Изучение внутриклеточной динамики белка Sesn2, являющегося компонентом клеточной защиты от переокисления, показало, что в ответ на окислительный стресс, комплекс белков, в который входит Sesn2, передислоцируется из цитоплазмы в ядро. Возможно, транслокация в ядро способствует повышению устойчивости компонентов ядра к окислению под действием сигнальных молекул Н2О2. Важную роль в процессе перехода белка Sesn2 из цитоплазмы в ядро играет протеинкиназа С. Sesn2 содержит три сайта фосфорилирования при помощи РКС. Фосфорилирование этих сайтов увеличивает интенсивность перехода Sesn2 из цитоплазмы в ядро в ответ на окислительный стресс, однако само по себе фосфорилирование недостаточно для транслокации Sesn2 в ядро. Весьма вероятно, что для перемещения требуется также фосфорилирование других белков, возможно входящих в комплекс с Sesn2. В настоящий момент детали процесса, приводящего к перемещению Sesn2 в ядро, неизвестны и требуют дальнейшего изучения.

Выводы

1. Сконструирована репортерная система для определения внутриклеточных перемещений исследуемого белка, основанная на эффекте a-комплементации р-галактозидазы

2. Получены клоны клеток линии RKO, стабильно экспрессирующие компоненты локализационной системы. Возможности репортерной системы испытаны на примере флуоресцентного белка GFP и транскрипционного фактора F0X03A.

3. При исследовании антиоксидантного белка Sesn2 установлено, что повышение внутриклеточных уровней ROS приводит к перемещению Sesn2 из цитоплазмы в ядро, что может способствовать защите генома от окислительных повреждений.

4. Установлено, что активация протеинкиназы С вызывает переход Sesn2 из цитоплазмы в ядро, а ее ингибирование предотвращает такой переход. Фосфорилирование сайтов РКС в структуре Sesn2 усиливает его переход в ядро в ответ на стресс, а предотвращение фосфорилирования по этим сайтам снижает количество Sesn2 в ядре.

5. Предложена модель, объясняющая механизм перемещения Sesn2 в ядро в ответ на внешние стимулы, Под влиянием активации мембранных рецепторов происходит стимуляция протеинкиназы С, которая, в свою очередь, стимулирует активность NOX и продукцию соединений активного кислорода. Одновременно протеинкиназа С стимулирует переход Sesn2 в ядро, тем самым настраивая ядерные антиоксидантные системы перед ожидаемым повышением уровня соединений активного кислорода.

Содержание диссертации изложено в следующих работах: Публикации:

1. А.Э.Вильгельм, С.П.Чумаков, В.С.Прасолов, Интерференция РНК: биология и перспективы применения в биомедицине и биотехнологии. Молекулярная биология, (2006) 40:3,387-403

2. С.П.Чумаков, Г.В.Ильинская, Ю.Е.Кравченко, Е.И.Фролова, В.С.Прасолов, П.М.Чумаков, Система для количественного определения внутриклеточных перемещений рекомбинантных белков на основе лентивирусных векторов. Молекулярная биология, (2008) 42:6, 1004-1011

3. Чумаков С. П., Прасолов В. С., Чумаков П.М., Организация и регуляция транспорта между цитоплазмой и ядром. Молекулярная биология, (2010) 44:2,195-208

4. Chumakov S.P., Kravchenko J.E.,Prassolov V.S., Frolova E.I., Chumakov P.M., Efficient downregulation of multiple mRNA targets with a sigle shRNA-expressing lentiviral vector. Plasmid, (2010)63:1

Постер:

5. Chumakov, S.P., et al., Nuclear translocation of antioxidant sestrins protects the cells from DNA damage and apoptosis, Keystone, 2008.

Типография МГУ 119991, ГСП-1, г. Москва, Ленинские Горы, д. 1, стр. 15 Заказ № 6401 Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чумаков, Степан Петрович

Оглавление.

Список используемых сокращений.

Глава 1. Организация и регуляция транспорта между цитоплазмой и ядром.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутриклеточные перемещения белков антиоксидантного комплекса. Новая система локализационных репортеров"

Кариоферины и их роль в организации ядерно-цитоплазматического транспорта.7

ГТФаза Ran и Ran-зависимый транспорт.11

Транспорт рецепторов стероидных гормонов.16

Нукпеопорины, их строение и функции.17

Транспортные функции Nup98.22

Модели функционирования NPC.23

Транслокация трансмембранных белков на внутреннюю ядерную мембрану.27

Иерархическая регуляция ядерного транспорта.28

Регуляция на уровне отдельного груза.29

Внутримолекулярное маскирование NLS/NES.29

Межмолекулярное маскирование NLS/NES.30

Модуляция аффинности к кариоферинам посттранскрипционной модификацией.31

Модуляция аффинности к кариоферинам путем посттрансляционной модификации.32

Удержание в цитоплазме или ядре.32

Регуляция на уровне транспортных рецепторов.33

Модуляция экспрессии компонентов нукпеоцитоплазматической транспортной системы.33

Роль импортинов в гаметогенезе.34

Роль экспортинов в процессе развития организма.35

Регуляция на уровне компонентов NPC.36

Роль нукпеопоринов и других модуляторов ядерного транспорта в процессе развития.36

Роль нукпеопоринов в митозе.36

Роль нукпеопоринов в онкогенезе и развитии вирусной инфекции.37

Глава 2. Материалы и методы.39

Используемые клеточные линии, их культивирование и обработка.39

Селекция клеточных культур после трансдукции лентивирусными конструктами 40

Измерение концентрации белка по методу Бредфорд.40

Фракционирование белков в полиакриламидном геле.40

Перенос белков из гелей на фильтры и иммунодетекция.40

Получение компетентных клеток E.coli и трансформация.41

Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.41

Обработка ДНК рестрикционными эндонукпеазами.42

Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.42

Реакция лигирования.42

Трансфекция лентивирусных и плазмидных конструктов и получение клеточных линий.42

Иммунофлуоресценция.43

Определение активности (3-галактозидазы при помощи системы GalScreen®.44

Определение уровней внутриклеточных ROS на FACS при помощи DCF-DA.44

Получение экспрессионных лентивирусных конструктов.44

Этапы клонирования ш-конструкта.44

Этапы клонирования а-конструктов.49

Получение а-конструктов, экспрессирующих мутантные.50 варианты Sesn2 с перманентно-активированными и перманентнорепрессированными сайтами фосфорилирования.50

Получение конструктов, одновременно экспрессирующих несколько shPHK, специфичные к различным генам.52

Глава 3. Резульаты и обсуждение.54

Принцип действия и структура локализационного репортера.54

Конструирование вектора для экспрессии ш-пептида.55

Конструирование векторов для экспрессии белков, слитых с а-пептидом.56

Получение клонов oo-nuc-bleo.58

Отработка функционирования репортера на примере белка F0X03A.60

Влияние обработки hTNF и культивации в среде без сыворотки на изменение внутриклеточной локализации белка Sesn2.63

Перемещения Sesn2 в митохондрии и к плазматической мембране при окислительном стрессе.65

Влияние сульфиредоксина на передислокацию Sesn2.67

Переход Sesn2 в ядро под действием РМА.68

Исследование механизмов PMA-индуцированной передислокации Sesn2.70

Влияние сайтов фосфорилирования белковой молекулы Sesn2 на динамику ядерной транслокации.72

Заключение.75

Выводы.75

Список литературы.76

Список используемых сокращений

AFMAtomic Force MicroscopyАтомно-силовая микроскопия

Ala Alanine Алании

APC Anaphase Promoting Complex Циклосома

BSA Bovine Serum Albumin Бычий сывороточной альбумин

CKII Casein Kinase II Казеинкиназа II

CTE Constitutive Transport Element Конститутивный транспортный элемент

Cys Cysteine Цистеин

DCF 2,,7'-dichlorofluorescin 2',7'-дихлорфлуоресцин

DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Среда Игла в модификации

Medium Дульбеко

DMSO Dimethyl Sulfoxide Диметилсульфоксид

DPI Diphenyleneiodonium chloride Дифенилиод хлорид

EBSS Earle's Balanced Salt Solution Сбалансированный солевой раствор

Эрла

EGF Epidermal Growth Factor Эпидермальный ростовой фактор

EGFP Enhanced Green Fluorescent Модифицированный зеленый

Protein флуоресцентный белок

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor Рецептор эпидермального ростового фактора

ER Endoplasmic Reticulum localization Сигнал эндоплазматической signal локализации

FACS Fluorescence-Activated Cell Sorter Проточный цитофлуориметр

FCS Fetal Calf Serum Фетальная телячья сыворотка

FG Fenilalanine-Glycine Фенилапанин-глициновый домен; повтор)

FITC Fluorescein isothiocyanate Флуоресцин изотиоцианат

FRET Fluorescence Resonance Energy Резонансный перенос энергии

Transfer флуоресценции

GAG Group-specific antigen Антиген Групповой специфичности

GFP Green Fluorescent Protein Зеленый флуоресцентный белок

HIV Human Immunodeficiency Virus Вирус иммунодефицита человека hTNF Human Tumor Necrosis Factor Фактор некроза опухолей человека

IGF1 Insulin-like Growth Factor Инсулин-подобный фактор роста

INM Inner Nuclear Membrane Внутренняя ядерная мембрана

Kaps Karyopherins Кариоферины

LB Lysogeny Broth Лизогенный бульон

LTR Long Terminal Repeat Длинный концевой повтор

Mem Membrane localization signal Сигнал локализации на плазматической мембране

Mit Mitochondrial localization signal Сигнал митохондриапьной локализации

MOPS 3-(N-morpholino) propanesulfonic 3-(Ы-морфолино)пропансульфоновая acid кислота

NAC N-acetyl-cysteine N-346™ л-ци стеи н

NES Nuclear Export Signal Сигнал ядерного экспорта

NF-AT2 Nuclear factor of activated Ядерный фактор активированных

T-lymphocytes 2 Т-лимфоцитов N92

NLS Nuclear Localization Signal Сигнал ядерной локализации

NOX NADPH Oxidase 4 НАДФ-Н оксидаза

NPC Nuclear Pore Complex Комплекс белков ядерной поры

NTD N-Terminal Domain N-концевой домен

NUC Nuclear Localization Signal Сигнал ядерной локализации

Nup Nucleoporin Нукпеопорин

ONM Outer Nuclear Membrane Внешняя ядерная мембрана

PBS Phosphate Buffered Saline Фосфатный Буферный Раствор

Phe Phenylalanine Фенилаланин

PI3K Phosphoinositide 3-kinase Фосфатидилинозитол-З-киназа

PKA Protein Kinase A Протеинкиназа А

PKB Protein Kinase B Протеинкиназа В

PKC Protein Kinase C Протеинкиназа С

PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate Форбол-12-миристрат-13-ацетат

PoM Pore Membrane Поровая мембрана

PTK Phosphotyrosin Kinase Фосфотирозинкиназа

PVDF Polyvinylidene Fluoride Фторопласт

RanBPI Ran-Binding Proteinl Ran-связывэющий белок1

RanGAP Ran GTPase Activating Protein Белок-активатор ГТФазы Ran

RanGEF Ran Guanidine Exchange Factor Фактор гуанидинового обмена Ran

Ran-GTP Ran-Guanidinediphosphate Ran-гуанидиндифосфат

Ran-GTP Ran-Guanidinetriphosphate Ran-гуанидинтрифосфат

Rev Revertase Ревертаза

ROS Reactive Oxygen Species Соединения активного кислорода

Ser Serine Серин shRNA Short hairpin RNA Короткая шпилечная РНК

SOB Super Optimal Broth Супер-оптимальный питательный бульон

TBS Tris-Buffered Solution Трис-буфер

Thr Threonine Треонин

TRITC Rhodamine Родамин

Tvr Tyrosine Тирозин

UTR Untranslated Region Нетранслируемая область мРНК

VSVG Vesicular Stomatitis Virus glycoprotein Гликопротеин Вируса Везикулярного Стоматита

ГР Глкжокортикоидный рецептор гяРНП Гетерогенная ядерная рибонуклеопротеиновая частица

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота мРНК Матричная рибонуклеиновая кислота

НТФ Нукпеотидтрифосфат

ПЦР Полимеразная Цепная Реакция

РНК Рибонуклеиновая кислота тРНК Транспортная рибонуклеиновая кислота

ЭДТА Этилендиаминтетрауксусная кислота

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чумаков, Степан Петрович

Выводы

1. Сконструирована репортерная система для определения внутриклеточных перемещений исследуемого белка, основанная на эффекте а-комплементации 3-галактозидазы

5. Предложена модель, объясняющая механизм перемещения Sesn2 в ядро в ответ на внешние стимулы, Под влиянием активации мембранных рецепторов происходит стимуляция протеинкиназы С, которая, в свою очередь, стимулирует активность NOX и продукцию соединений активного кислорода. Одновременно протеинкиназа С стимулирует переход Sesn2 в ядро, тем самым настраивая ядерные ан-тиоксидантные системы перед ожидаемым повышением уровня соединений активного кислорода.

Заключение

Разработанная система локализационных репортеров является мощным инструментом для определения изменений внутриклеточной локализации белков. Широкий динамический диапазон и высокая чувствительность позволяют использовать локализационный репортер для определения небольших, относительно общего количества, перемещений исследуемого белка внутри клетки. Изучение внутриклеточной динамики белка Sesn2, являющегося компонентом клеточной защиты от переокисления, показало, что в ответ на окислительный стресс, комплекс белков, в который входит Sesn2, передислоцируется из цитоплазмы в ядро. Возможно, транслокация в ядро способствует повышению устойчивости компонентов ядра к окислению под действием сигнальных молекул Н202. Важную роль в процессе перехода белка Sesn2 из цитоплазмы в ядро играет протеинкиназа С. Sesn2 содержит три сайта фосфорилирования при помощи РКС. Фосфорилирование этих сайтов увеличивает интенсивность перехода Sesn2 из цитоплазмы в ядро в ответ на окислительный стресс, однако само по себе фосфорилирование недостаточно для транслокации Sesn2 в ядро. Весьма вероятно, что для перемещения требуется также фосфорилирование других белков, возможно входящих в комплекс с Sesn2. В настоящий момент детали процесса, приводящего к перемещению Sesn2 в ядро, неизвестны и требуют дальнейшего изучения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чумаков, Степан Петрович, Москва

1. Callan, H.G. and S.G. Tomlin, Experimental studies on amphibian oocyte nuclei. I. Investigation of the structure of the nuclear membrane by means of the electron microscope. Proc R Soc Lond В Biol Sci, 1950.137(888): p. 367-378.

2. Franke, W.W. and U. Scheer, The ultrastructure of the nuclear envelope of amphibian oocytes: a reinvestigation. II. The immature oocyte and dynamic aspects. J Ultrastruct Res, 1970. 30(3): p. 317-327.

3. Gall, J.G., Octagonal nuclear pores. J Cell Biol, 1967. 32(2): p. 391-399.

4. Fahrenkrog, B. and U. Aebi, The nuclear pore complex: nucleocytoplasmic transport and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003. 4(10): p. 757-766.

5. Beck, M., et al., Nuclear pore complex structure and dynamics revealed by cryoelectron tomography. Science, 2004. 306(5700): p. 1387-1390.

6. Beck, M., et al., Snapshots of nuclear pore complexes in action captured by cryo-electron tomography. Nature, 2007. 449(7162): p. 611-615.

7. Fahrenkrog, В., et al., Molecular architecture of the yeast nuclear pore complex: localization of Nsplp subcomplexes. J Cell Biol, 1998.143(3): p. 577-588.

8. Kiseleva, E., et al., Yeast nuclear pore complexes have a cytoplasmic ring and internal filaments. J Struct Biol, 2004.145(3): p. 272-288.

9. Yang, Q., M.P. Rout, and C.W. Akey, Three-dimensional architecture of the isolated yeast nuclear pore complex: functional and evolutionary implications. Mol Cell, 1998.1(2): p. 223-234.

10. Gerace, L. and B. Burke, Functional organization of the nuclear envelope. Annu Rev Cell Biol, 1988. 4: p. 335-374.

11. Gorlich, D. and U. Kutay, Transport between the cell nucleus and the cytoplasm. Annu Rev Cell Dev Biol, 1999.15: p. 607-660.

12. Maeshima, K., et al., Cell-cycle-dependent dynamics of nuclear pores: pore-free islands and lamins. J Cell Sci, 2006.119(Pt 21): p. 4442-4451.

13. Ribbeck, K. and D. Gorlich, Kinetic analysis of translocation through nuclear pore complexes. EMBO J, 2001. 20(6): p. 1320-1330.

14. Pante, N. and M. Kann, Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol Biol Cell, 2002.13(2): p. 425-434.

15. Weis, K., The nuclear pore complex: oily spaghetti or gummy bear? Cell, 2007.130(3): p. 405407.

16. Fried, H. and U. Kutay, Nucleocytoplasmic transport: taking an inventory. Cell Mol Life Sci, 2003. 60(8): p. 1659-1688.

17. Tran, E.J. and S.R. Wente, Dynamic nuclear pore complexes: life on the edge. Cell, 2006. 125(6): p. 1041-1053.

18. Rexach, M. and G. Blobel, Protein import into nuclei: association and dissociation reactions involving transport substrate, transport factors, and nucleoporins. Cell, 1995. 83(5): p. 683-692.

19. Wozniak, R.W., M.P. Rout, and J.D. Aitchison, Karyopherins and kissing cousins. Trends Cell Biol, 1998. 8(5): p. 184-188.

20. Pemberton, L.F. and B.M. Paschal, Mechanisms of receptor-mediated nuclear import and nuclear export. Traffic, 2005. 6(3): p. 187-198.

21. Melchior, F., et al., Inhibition of nuclear protein import by nonhydrolyzable analogues of GTP and identification of the small GTPase Ran/TC4 as an essential transport factor. J Cell Biol, 1993.123(6 Pt 2): p. 1649-1659.

22. Moore, M.S. and G. Blobel, The GTP-binding protein Ran/TC4 is required for protein import into the nucleus. Nature, 1993.365(6447): p. 661-663.

23. Gorlich, D., et al., Identification of different roles for RanGDP and RanGTP in nuclear protein import. EMBO J, 1996.15(20): p. 5584-5594.

24. Weis, K., Regulating access to the genome: nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle. Cell, 2003.112(4): p. 441-451.

25. Mosammaparast, N. and L.F. Pemberton, Karyopherins: from nuclear-transport mediators to nuclear-function regulators. Trends Cell Biol, 2004.14(10): p. 547-556.

26. Goldfarb, D.S., et al., Importin alpha: a multipurpose nuclear-transport receptor. Trends Cell Biol, 2004.14(9): p. 505-514.

27. Conti, E., et al., Crystallographic analysis of the recognition of a nuclear localization signal by the nuclear import factor karyopherin alpha. Cell, 1998.94(2): p. 193-204.

28. Kobe, В., Autoinhibition by an internal nuclear localization signal revealed by the crystal structure of mammalian importin alpha. Nat Struct Biol, 1999. 6(4): p. 388-397.

29. Rosenblum, J.S., et al., Nuclear import and the evolution of a multifunctional RNA-binding protein. J Cell Biol, 1998.143(4): p. 887-899.

30. Fischer, U., et al., The HIV-1 Rev activation domain is a nuclear export signal that accesses an export pathway used by specific cellular RNAs. Cell, 1995. 82(3): p. 475-483.

31. Johnson, A.W., E. Lund, and J. Dahlberg, Nuclear export of ribosomal subunits. Trends Bio-chem Sci, 2002. 27(11): p. 580-585.

32. Yoshida, K. and G. Blobel, The karyopherin Kap142p/Msn5p mediates nuclear import and nuclear export of different cargo proteins. J Cell Biol, 2001.152(4): p. 729-740.

33. Kaffman, A. and E.K. O'Shea, Regulation of nuclear localization: a key to a door. Annu Rev Cell Dev Biol, 1999.15: p. 291-339.

34. Kutay, U., et al., Export of importin alpha from the nucleus is mediated by a specific nuclear transport factor. Cell, 1997. 90(6): p. 1061-1071.

35. Arts, G J., et al., The role of exportin-t in selective nuclear export of mature tRNAs. EMBO J, 1998.17(24): p. 7430-7441.

36. Kim, V.N., MicroRNA precursors in motion: exportin-5 mediates their nuclear export. Trends Cell Biol, 2004.14(4): p. 156-159.

37. Lei, E.P. and P.A. Silver, Protein and RNA export from the nucleus. Dev Cell, 2002. 2(3): p. 261272.

38. Chook, Y.M. and G. Blobel, Karyopherins and nuclear import. Curr Opin Struct Biol, 2001. 11(6): p. 703-715.

39. Conti, E., Structures of importins. Results Probl Cell Differ, 2002.35: p. 93-113.

40. Matsuura, Y. and M. Stewart, Structural basis for the assembly of a nuclear export complex. Nature, 2004. 432(7019): p. 872-877.

41. Petosa, C., et al., Architecture of CRM1/Exportin1 suggests how cooperativity is achieved during formation of a nuclear export complex. Mol Cell, 2004.16(5): p. 761-775.

42. Cingolani, G., et al., Molecular basis for the recognition of a nonclassical nuclear localization signal by importin beta. Mol Cell, 2002.10(6): p. 1345-1353.

43. Cingolani, G., et al., Structure of importin-beta bound to the IBB domain of importin-alpha. Nature, 1999. 399(6733): p. 221-229.

44. Fukuhara, N., et al., Conformational variability of nucleo-cytoplasmic transport factors. J Biol Chem, 2004. 279(3): p. 2176-2181.

45. Chook, Y.M. and G. Blobel, Structure of the nuclear transport complex karyopherin-beta2-Ran x GppNHp. Nature, 1999. 399(6733): p. 230-237.

46. Vetter, I.R., et al., Structural view of the Ran-lmportin beta interaction at 2.3 A resolution. Cell, 1999. 97(5): p. 635-646.

47. Bayliss, R., T. Littlewood, and M. Stewart, Structural basis for the interaction between FxFG nucleoporin repeats and importin-beta in nuclear trafficking. Cell, 2000.102(1): p. 99-108.

48. Bednenko, J., G. Cingolani, and L. Gerace, Importin beta contains a COOH-terminal nucleoporin binding region important for nuclear transport. J Cell Biol, 2003.162(3): p. 391-401.

49. Ben-Efraim, I. and L. Gerace, Gradient of increasing affinity of importin beta for nucleoporins along the pathway of nuclear import. J Cell Biol, 2001.152(2): p. 411-417.

50. Pyhtila, B. and M. Rexach, A gradient of affinity for the karyopherin Kap95p along the yeast nuclear pore complex. J Biol Chem, 2003.278(43): p. 42699-42709.

51. Shah, S., S. Tugendreich, and D. Forbes, Major binding sites for the nuclear import receptor are the internal nucleoporin Nup153 and the adjacent nuclear filament protein Tpr. J Cell Biol, 1998.141(1): p. 31-49.

52. Zeitler, B. and K. Weis, The FG-repeat asymmetry of the nuclear pore complex is dispensable for bulk nucleocytoplasmic transport in vivo. J Cell Biol, 2004.167(4): p. 583-590.

53. Gorlich, D., M.J. Seewald, and K. Ribbeck, Characterization of Ran-driven cargo transport and the RanGTPase system by kinetic measurements and computer simulation. EMBO J, 2003. 22(5): p. 1088-1100.

54. Bayliss, R., et al., Structural basis for the interaction between NTF2 and nucleoporin FxFG repeats. EMBO J, 2002. 21(12): p. 2843-2853.

55. Oki, M. and T. Nishimoto, A protein required for nuclear-protein import, Moglp, directly interacts with GTP-Gsp1p, the Saccharomyces cerevisiae ran homologue. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(26): p. 15388-15393.

56. Steggerda, S.M. and B.M. Paschal, The mammalian Mog1 protein is a guanine nucleotide release factor for Ran. J Biol Chem, 2000. 275(30): p. 23175-23180.

57. Nemergut, M.E., et al., Chromatin docking and exchange activity enhancement of RCC1 by his-tones H2A and H2B. Science, 2001. 292(5521): p. 1540-1543.

58. Renault, L., et al., Structural basis for guanine nucleotide exchange on Ran by the regulator of chromosome condensation (RCC1). Cell, 2001.105(2): p. 245-255.

59. Li, H.Y., D. Wirtz, and Y. Zheng, A mechanism of coupling RCC7 mobility to RanGTP production on the chromatin in vivo. J Cell Biol, 2003.160(5): p. 635-644.

60. Kalab, P., K. Weis, and R. Heald, Visualization of a Ran-GTP gradient in interphase and mitotic Xenopus egg extracts. Science, 2002. 295(5564): p. 2452-2456.

61. Bischoff, F.R., et al., RanGAPI induces GTPase activity of nuclear Ras-related Ran. Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91(7): p. 2587-2591.

62. Bischoff, F.R., et al., Co-activation of RanGTPase and inhibition of GTP dissociation by RanGTP binding protein RanBPI. EMBO J, 1995.14(4): p. 705-715.

63. Izaurralde, E., et al., The asymmetric distribution of the constituents of the Ran system is essential for transport into and out of the nucleus. EMBO J, 1997.16(21): p. 6535-6547.

64. Nemergut, M.E. and I.G. Macara, Nuclear import of the ran exchange factor, RCC1, is mediated by at least two distinct mechanisms. J Cell Biol, 2000.149(4): p. 835-850.

65. Mahajan, R., et al., A small ubiquitin-related polypeptide involved in targeting RanGAPI to nuclear pore complex protein RanBP2. Cell, 1997. 88(1): p. 97-107.

66. Matunis, M.J., E. Coutavas, and G. Blobel, A novel ubiquitin-like modification modulates the partitioning of the Ran-GTPase-activating protein RanGAPI between the cytosol and the nuclear pore complex. J Cell Biol, 1996.135(6 Pt 1): p. 1457-1470.

67. Pichler, A., et al., The nucleoporin RanBP2 has SUM01 E3 ligase activity. Cell, 2002.108(1): p. 109-120.

68. Lindsay, M.E., et al., Npap60/Nup50 is a tri-stable switch that stimulates importin-alpha-.beta-mediated nuclear protein import. Cell, 2002.110(3): p. 349-360.

69. Lindsay, M.E., et al., Ran-binding protein 3 is a cofactor for Crm1-mediated nuclear protein export. J Cell Biol, 2001.153(7): p. 1391-1402.

70. DeFranco, D.B., Navigating steroid hormone receptors through the nuclear compartment. Mol Endocrinol, 2002.16(7): p. 1449-1455.

71. Shank, L.C. and B.M. Paschal, Nuclear transport of steroid hormone receptors. Crit Rev Eu-karyot Gene Expr, 2005.15(1): p. 49-73.

72. Picard, D. and K.R. Yamamoto, Two signals mediate hormone-dependent nuclear localization of the glucocorticoid receptor. EMBO J, 1987. 6(11): p. 3333-3340.

73. Picard, D., et al., Signal transduction by steroid hormones: nuclear localization is differentially regulated in estrogen and glucocorticoid receptors. Cell Regul, 1990.1(3): p. 291-299.

74. Simental, J.A., et al., Transcriptional activation and nuclear targeting signals of the human androgen receptor. J Biol Chem, 1991. 266(1): p. 510-518.

75. Ylikomi, T., et al., Cooperation of proto-signals for nuclear accumulation of estrogen and progesterone receptors. EMBO J, 1992.11(10): p. 3681-3694.

76. Savory, J.G., et al., Discrimination between NL1- and NL2-mediated nuclear localization of the glucocorticoid receptor. Mol Cell Biol, 1999.19(2): p. 1025-1037.

77. Freedman, N.D. and K.R. Yamamoto, Importin 7 and importin alpha/importin beta are nuclear import receptors for the glucocorticoid receptor. Mol Biol Cell, 2004.15(5): p. 2276-2286.

78. Black, B.E., et al., DNA binding domains in diverse nuclear receptors function as nuclear export signals. Curr Biol, 2001.11(22): p. 1749-1758.

79. Saporita, A.J., et al., Identification and characterization of a ligand-regulated nuclear export signal in androgen receptor. J Biol Chem, 2003. 278(43): p. 41998-42005.

80. Katagiri, Y., et al., Modulation of retinoid signalling through NGF-induced nuclear export of NGFI-B. Nat Cell Biol, 2000. 2(7): p. 435-440.

81. Itoh, M., et al., Nuclear export of glucocorticoid receptor is enhanced by c-Jun N-terminal kinase-mediated phosphorylation. Mol Endocrinol, 2002.16(10): p. 2382-2392.

82. Liu, J. and D.B. DeFranco, Protracted nuclear export of glucocorticoid receptor limits its turnover and does not require the exportin 1/CRM1-directed nuclear export pathway. Mol Endocrinol, 2000.14(1): p^ 40-51.

83. Yang, J., J. Liu, and D.B. DeFranco, Subnuclear trafficking of glucocorticoid receptors in vitro: chromatin recycling and nuclear export. J Cell Biol, 1997.137(3): p. 523-538.

84. Kino, T., et al., Protein 14-3-3sigma interacts with and favors cytoplasmic subcellular localization of the glucocorticoid receptor, acting as a negative regulator of the glucocorticoid signaling pathway. J Biol Chem, 2003. 278(28): p. 25651-25656.

85. Holaska, J.M., et al., Calreticulin Is a receptor for nuclear export. J Cell Biol, 2001.152(1): p. 127-140.

86. Qiu, M., et al., Mitogen-activated protein kinase regulates nuclear association of human progesterone receptors. Mol Endocrinol, 2003.17(4): p. 628-642.

87. Cronshaw, J.M., et al., Proteomic analysis of the mammalian nuclear pore complex. J Cell Biol, 2002.158(5): p. 915-927.

88. Rout, M.P., et al., The yeast nuclear pore complex: composition, architecture, and transport mechanism. J Cell Biol, 2000.148(4): p. 635-651.

89. Griffis, E.R., et al., Nup98 is a mobile nucleoporin with transcription-dependent dynamics. Mol Biol Cell, 2002.13(4): p. 1282-1297.

90. Rabut, G., V. Doye, and J. Ellenberg, Mapping the dynamic organization of the nuclear pore complex inside single living cells. Nat Cell Biol, 2004. 6(11): p. 1114-1121.

91. Devos, D., et al., Simple fold composition and modular architecture of the nuclear pore complex. Proc Natl Acad Sci USA, 2006.103(7): p. 2172-2177.

92. Higa, M.M., et al., Molecular characterization of the Ran-binding zinc finger domain of Nup153. J Biol Chem, 2007. 282(23): p. 17090-17100.

93. Handa, N., et al., The crystal structure of mouse Nup35 reveals atypical RNP motifs and novel homodimerization of the RRM domain. J Mol Biol, 2006. 363(1): p. 114-124.

94. Hodel, A.E., et al., The three-dimensional structure of the autoproteolytic, nuclear poretargeting domain of the human nucleoporin Nup98. Mol Cell, 2002.10(2): p. 347-358.

95. Weirich, C.S., et al., The N-terminal domain of Nup159 forms a beta-propeller that functions in mRNA export by tethering the helicase Dbp5 to the nuclear pore. Mol Cell, 2004.16(5): p. 749760.

96. Berke, I.C., et al., Structural and functional analysis of Nup133 domains reveals modular building blocks of the nuclear pore complex. J Cell Biol, 2004.167(4): p. 591-597.

97. Napetschnig, J., G. Blobel, and A. Hoelz, Crystal structure of the N-terminal domain of the human protooncogene Nup214/CAN. Proc Natl Acad Sci USA, 2007.104(6): p. 1783-1788.

98. Drin, G., et al., A general amphipathic alpha-helical motif for sensing membrane curvature. Nat struct Mol Biol, 2007. 14(2): p. 138-146.

99. Isgro, T.A. and K. Schulten, Binding dynamics of isolated nucleoporin repeat regions to importin-beta. Structure, 2005.13(12): p. 1869-1879.

100. Isgro, T.A. and K. Schulten, Cselp-binding dynamics reveal a binding pattern for FG-repeat nucleoporins on transport receptors. Structure, 2007.15(8): p. 977-991.

101. Isgro, T.A. and K. Schulten, Association of nuclear pore FG-repeat domains to NTF2 import and export complexes. J Mol Biol, 2007. 366(1): p. 330-345.

102. Liu, S.M. and M. Stewart, Structural basis for the high-affinity binding of nucleoporin Nuplp to the Saccharomyces cerevisiae importin-beta homologue, Kap95p. J Mol Biol, 2005.349(3): p. 515-525.

103. Denning, D.P., et al., Disorder in the nuclear pore complex: the FG repeat regions of nucleoporins are natively unfolded. Proc Natl Acad Sci USA, 2003.100(5): p. 2450-2455.

104. Denning, D.P., et al., The Saccharomyces cerevisiae nucleoporin Nup2p is a natively unfolded protein. J Biol Chem, 2002. 277(36): p. 33447-33455.

105. Denning, D.P. and M.F. Rexach, Rapid evolution exposes the boundaries of domain structure and function in natively unfolded FG nucleoporins. Mol Cell Proteomics, 2007. 6(2): p. 272-282.

106. Fahrenkrog, B., et al., Domain-specific antibodies reveal multiple-site topology of Nup153 within the nuclear pore complex. J Struct Biol, 2002.140(1-3): p. 254-267.

107. Lim, R.Y., U. Aebi, and D. Stoffler, From the trap to the basket: getting to the bottom of the nuclear pore complex. Chromosoma, 2006.115(1): p. 15-26.

108. Paulillo, S.M., et al., Nucleoporin domain topology is linked to the transport status of the nuclear pore complex. J Mol Biol, 2005. 351(4): p. 784-798.

109. Hetzer, M.W., T.C. Walther, and I.W. Mattaj, Pushing the envelope: structure, function, and dynamics of the nuclear periphery. Annu Rev Cell Dev Biol, 2005.21: p. 347-380.

110. Casolari, J.M., et al., Genome-wide localization of the nuclear transport machinery couples transcriptional status and nuclear organization. Cell, 2004.117(4): p. 427-439.

111. Ishii, K., et al., Chromatin boundaries in budding yeast: the nuclear pore connection. Cell, 2002.109(5): p. 551-562.

112. Dilworth, D.J., et al., The mobile nucleoporin Nup2p and chromatin-bound Prp20p function in endogenous NPC-mediated transcriptional control. J Cell Biol, 2005.171(6): p. 955-965.

113. Meneghini, M.D., M. Wu, and H.D. Madhani, Conserved histone variant H2A.Z protects euchro-matin from the ectopic spread of silent heterochromatin. Cell, 2003.112(5): p. 725-736.

114. Schmid, M., et al., Nup-PI: the nucleopore-promoter interaction of genes in yeast. Mol Cell, 2006. 21(3): p. 379-391.

115. Vassileva, M.T. and M.J. Matunis, SUMO modification of heterogeneous nuclear ribonucleopro-teins. Mol Cell Biol, 2004. 24(9): p. 3623-3632.

116. Panse, V.G., et al., Unconventional tethering of Ulp1 to the transport channel of the nuclear pore complex by karyopherins. Nat Cell Biol, 2003.5(1): p. 21-27.

117. Zhang, H., H. Saitoh, and M.J. Matunis, Enzymes of the SUMO modification pathway localize to filaments of the nuclear pore complex. Mol Cell Biol, 2002.22(18): p. 6498-6508.

118. Hodge, C.A., et al., Rat8p/Dbp5p is a shuttling transport factor that interacts with Rat7p/Nup159p and Gleip and suppresses the mRNA export defect of xpo1-1 cells. EMBO J, 1999.18(20): p. 5778-5788.

119. Schmitt, C., et al., Dbp5, a DEAD-box protein required for mRNA export, is recruited to the cytoplasmic fibrils of nuclear pore complex via a conserved interaction with CAN/Nup159p. EMBO J, 1999.18(15): p. 4332-4347.

120. Lund, M.K. and C. Guthrie, The DEAD-box protein Dbp5p is required to dissociate Mex67p from exported mRNPs at the nuclear rim. Mol Cell, 2005.20(4): p. 645-651.

121. Fontoura, B.M., G. Blobel, and N.R. Yaseen, The nucleoporin Nup98 is a site for GDP/GTP exchange on ran and termination of karyopherin beta 2-mediated nuclear import. J Biol Chem, 2000. 275(40): p. 31289-31296.

122. Pollard, V.W., et al., A novel receptor-mediated nuclear protein import pathway. Cell, 1996. 86(6): p. 985-994.

123. Blevins, M.B., et al., Complex formation among the RNA export proteins Nup98, Rae1/Gle2, and TAP. J Biol Chem, 2003. 278(23): p. 20979-20988.

124. Faria, P.A., et al., VSV disrupts the Rae1/mrnp41 mRNA nuclear export pathway. Mol Cell, 2005. 17(1): p. 93-102.

125. Matsuura, Y. and M. Stewart, Nup50JNpap60 function in nuclear protein import complex disassembly and importin recycling. EMBO J, 2005. 24(21): p. 3681-3689.

126. Rout, M.P., et al., Virtual gating and nuclear transport: the hole picture. Trends Cell Biol, 2003. 13(12): p. 622-628.

127. Macara, I.G., Transport into and out of the nucleus. Microbiol Mol Biol Rev, 2001. 65(4): p. 570594, table of contents.

128. Nachury, M.V. and K. Weis, The direction of transport through the nuclear pore can be inverted. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(17): p. 9622-9627.

129. Frey, S., R.P. Richter, and D. Gorlich, FG-rich repeats of nuclear pore proteins form a three-dimensional meshwork with hydrogel-like properties. Science, 2006. 314(5800): p. 815-817.

130. Frey, S. and D. Gorlich, A saturated FG-repeat hydrogel can reproduce the permeability properties of nuclear pore complexes. Cell, 2007.130(3): p. 512-523.

131. Strawn, L.A., et al., Minimal nuclear pore complexes define FG repeat domains essential for transport. Nat Cell Biol, 2004. 6(3): p. 197-206.

132. Galy, V., I.W. Mattaj, and P. Askjaer, Caenorhabditis elegans nucleoporins Nup93 and Nup205 determine the limit of nuclear pore complex size exclusion in vivo. Mol Biol Cell, 2003.14(12): p. 5104-5115.

133. Shulga, N., et al., Yeast nucleoporins involved in passive nuclear envelope permeability. J Cell Biol, 2000.149(5): p. 1027-1038.

134. Rich, A., N.R. Davidson, and L. Pauling, Structural chemistry and molecular biology. 1968, San Francisco,: W. H. Freeman. 907 p.

135. Peters, R., Translocation through the nuclear pore complex: selectivity and speed by reduc-tion-of-dimensionality. Traffic, 2005. 6(5): p. 421-427.

136. D'Angelo, M.A. and M.W. Hetzer, The role of the nuclear envelope in cellular organization. Cell Mol Life Sci, 2006. 63(3): p. 316-332.

137. Schirmer, E.C. and R. Foisner, Proteins that associate with lamins: many faces, many functions. Exp Cell Res, 2007. 313(10): p. 2167-2179.

138. Haraguchi, T., et al., Live fluorescence imaging reveals early recruitment of emerin, LBR, RanBP2, and Nup153 to reforming functional nuclear envelopes. J Cell Sci, 2000.113 (Pt 5): p. 779-794.

139. Ohba, T., et al., Energy- and temperature-dependent transport of integral proteins to the inner nuclear membrane via the nuclear pore. J Cell Biol, 2004.167(6): p. 1051-1062.

140. Braunagel, S.C., et al., Early sorting of inner nuclear membrane proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA, 2007.104(22): p. 9307-9312.

141. King, M.C., C.P. Lusk, and G. Blobel, Karyopherin-mediated import of integral inner nuclear membrane proteins. Nature, 2006. 442(7106): p. 1003-1007.

142. Zuleger, N., N. Korfali, and E.C. Schirmer, Inner nuclear membrane protein transport is mediated by multiple mechanisms. Biochem Soc Trans, 2008. 36(Pt 6): p. 1373-1377.

143. Jans, D.A., C.Y. Xiao, and M.H. Lam, Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport? Bioessays, 2000.22(6): p. 532-544.

144. Poon, I.K. and D.A. Jans, Regulation of nuclear transport: central role in development and transformation? Traffic, 2005. 6(3): p. 173-186.

145. Riviere, Y., et al., Processing of the precursor of NF-kappa B by the HIV-1 protease during acute infection. Nature, 1991.350(6319): p. 625-626.

146. Craig, E., et al., A masked NES in INI1/hSNF5 mediates hCRM1 -dependent nuclear export: implications for tumorigenesis. EMBO J, 2002. 21(1-2): p. 31-42.

147. Kaffman, A., N.M. Rank, and E.K. O'Shea, Phosphorylation regulates association of the transcription factor Pho4 with its import receptor Pse1JKap121. Genes Dev, 1998.12(17): p. 26732683.

148. Ferrigno, P., et al., Regulated nucleofcytoplasmic exchange of HOG1 MAPK requires the importin beta homologs NMD5 and XP01. EMBO J, 1998.17(19): p. 5606-5614.

149. Kuge, S., et al., Regulation of the yeast Yaplp nuclear export signal is mediated by redox signal-induced reversible disulfide bond formation. Mol Cell Biol, 2001. 21(18): p. 6139-6150.

150. Kudo, N., et al., A novel nuclear export signal sensitive to oxidative stress in the fission yeast transcription factor Pap1. J Biol Chem, 1999. 274(21): p. 15151-15158.

151. Zhu, J. and F. McKeon, NF-AT activation requires suppression of Crm1-dependent export by calcineurin. Nature, 1999.398(6724): p. 256-260.

152. Beg, A.A., et al., / kappa B interacts with the nuclear localization sequences of the subunits of NF-kappa B: a mechanism for cytoplasmic retention. Genes Dev, 1992. 6(10): p. 1899-1913.

153. Traenckner, E.B., S. Wilk, and P.A. Baeuerle, A proteasome inhibitor prevents activation of NF-kappa B and stabilizes a newly phosphorylated form of I kappa B-alpha that is still bound to NF-kappa B. EMBO J, 1994.13(22): p. 5433-5441.

154. Li, S., et al., Identification of a novel cytoplasmic protein that specifically binds to nuclear localization signal motifs. J Biol Chem, 1998. 273(11): p. 6183-6189.

155. Matheny, S.A., et al., Ras regulates assembly of mitogenic signalling complexes through the effector protein IMP. Nature, 2004. 427(6971): p. 256-260.

156. Almazov, V.P., et al., Construction of chimeric tumor suppressor p53 resistant to the dominant-negative interaction with p53 mutants. Mol Biol (Mosk), 2002. 36(4): p. 664-671.

157. Stommel, J.M., et al., A leucine-rich nuclear export signal in the p53 tetramerization domain: regulation of subcellular localization and p53 activity by NES masking. EMBO J, 1999.18(6): p. 1660-1672.

158. Fineberg, K., et al., Inhibition of nuclear import mediated by the Rev-arginine rich motif by RNA molecules. Biochemistry, 2003. 42(9): p. 2625-2633.

159. Chan, C.K. and D.A. Jans, Synergy of importin alpha recognition and DNA binding by the yeast transcriptional activator GAL4. FEBS Lett, 1999. 462(1-2): p. 221-224.

160. Forwood, J.K., V. Harley, and D.A. Jans, The C-terminal nuclear localization signal of the sex-determining region Y (SRY) high mobility group domain mediates nuclear import through importin beta 1. J Biol Chem, 2001. 276(49): p. 46575-46582.

161. Argentaro, A., et al., A SOX9 defect of calmodulin-dependent nuclear import in campomelic dysplasia/autosomal sex reversal. J Biol Chem, 2003.278(36): p. 33839-33847.

162. Hopper, A.K. and E.M. Phizicky, tRNA transfers to the limelight. Genes Dev, 2003.17(2): p. 162180.

163. Culjkovic, B., et al., elF4E is a central node of an RNA regulon that governs cellular proliferation. J Cell Biol, 2006.175(3): p. 415-426.

164. Kay, R.A., et al., The expression of migration stimulating factor, a potent oncofetal cytokine, is uniquely controlled by 3'-untranslated region-dependent nuclear sequestration of its precursor messenger RNA. Cancer Res, 2005. 65(23): p. 10742-10749.

165. Hwang, H.W., E.A. Wentzel, and J.T. Mendell, A hexanucleotide element directs microRNA nuclear import. Science, 2007.315(5808): p. 97-100.

166. Kohler, A. and E. Hurt, Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007. 8(10): p. 761-773.

167. York, J.D., et al., A phospholipase C-dependent inositol polyphosphate kinase pathway required for efficient messenger RNA export. Science, 1999.285(5424): p. 96-100.

168. Hubner, S., C.Y. Xiao, and D.A. Jans, The protein kinase CK2 site (Ser111/112) enhances recognition of the simian virus 40 large T-antigen nuclear localization sequence by importin. J Biol Chem, 1997. 272(27): p. 17191-17195.

169. Komeili, A. and E.K. O'Shea, Roles of phosphorylation sites in regulating activity of the transcription factor Pho4. Science, 1999. 284(5416): p. 977-980.

170. Smith, W.A., et al., Arginine methylation of RNA helicase a determines its subcellular localization. J Biol Chem, 2004.279(22): p. 22795-22798.

171. Trotman, L.C., et al., Ubiquitination regulates PTEN nuclear import and tumor suppression. Cell, 2007.128(1): p. 141-156.

172. Plafker, S.M., et al., Ubiquitin charging of human class III ubiquitin-conjugating enzymes triggers their nuclear import. J Cell Biol, 2004.167(4): p. 649-659.

173. Nikolaev, A.Y., et al., Pare: a cytoplasmic anchor for p53. Cell, 2003.112(1): p. 29-40.

174. Tago, K., et al., Regulation of nuclear retention of glucocorticoid receptor by nuclear Hsp90. Mol Cell Endocrinol, 2004. 213(2): p. 131-138.

175. Lixin, R., et al., Novel properties of the nucleolar targeting signal of human angiogenin. Blo-chem Biophys Res Commun, 2001.284(1): p. 185-193.

176. Briggs, L.J., et al., Novel properties of the protein kinase CK2-site-regulated nuclear- localization sequence of the interferon-induced nuclear factor IF116. Biochem J, 2001.353(Pt 1): p. 6977.

177. Efthymiadis, A., L.J. Briggs, and D.A. Jans, The HIV-1 Tat nuclear localization sequence confers novel nuclear import properties. J Biol Chem, 1998. 273(3): p. 1623-1628.

178. Marg, A., et al., Nucleocytoplasmic shuttling by nucleoporins Nup153 and Nup214 and CRM1-dependent nuclear export control the subcellular distribution of latent Statl. J Cell Biol, 2004. 165(6): p. 823-833.

179. Fang, X., et al., Developmental regulation of the heat shock response by nuclear transport factor karyopherin-alpha3. Development, 2001.128(17): p. 3349-3358.

180. Nachury, M.V., et al., Cloning and characterization of hSRP1 gamma, a tissue-specific nuclear transport factor. Proc Natl Acad Sci USA, 1998.95(2): p. 582-587.

181. Kohler, M., et al., Cloning of two novel human importin-alpha subunits and analysis of the expression pattern of the importin-alpha protein family. FEBS Lett, 1997. 417(1): p. 104-108.

182. Kohler, M., et al., Evidence for distinct substrate specificities of importin alpha family members in nuclear protein import. Mol Cell Biol, 1999.19(11): p. 7782-7791.

183. Timney, B.L., et al., Simple kinetic relationships and nonspecific competition govern nuclear import rates in vivo. J Cell Biol, 2006.175(4): p. 579-593.

184. Yang, W. and S.M. Musser, Nuclear import time and transport efficiency depend on importin beta concentration. J Cell Biol, 2006.174(7): p. 951-961.

185. Dahl, E., et al., Molecular profiling of laser-microdissected matched tumor and normal breast tissue identifies karyopherin alpha2 as a potential novel prognostic marker in breast cancer. Clin Cancer Res, 2006.12(13): p. 3950-3960.

186. Winnepenninckx, V., et al., Gene expression profiling of primary cutaneous melanoma and clinical outcome. J Natl Cancer Inst, 2006. 98(7): p. 472-482.

187. Kim, I.S., et al., Truncated form of importin alpha identified in breast cancer cell inhibits nuclear import Of p53. J Biol Chem, 2000. 275(30): p. 23139-23145.

188. Frieman, M., et al., Severe acute respiratory syndrome coronavirus ORF6 antagonizes STAT1 function by sequestering nuclear import factors on the rough endoplasmic reticulum/Goigi membrane. J Virol, 2007. 81(18): p. 9812-9824.

189. Reid, S.P., et al., Ebola virus VP24 binds karyopherin alphal and blocks STAT1 nuclear accumulation. J Virol, 2006.80(11): p. 5156-5167.

190. Kau, T.R., J.C. Way, and P.A. Silver, Nuclear transport and cancer: from mechanism to intervention. Nat Rev Cancer, 2004. 4(2): p. 106-117.

191. Glarre, M., et al., Patterns of importin-alpha expression during Drosophila spermatogenesis. J Struct Biol, 2002.140(1-3): p. 279-290.

192. Mason, D.A., R.J. Fleming, and D.S. Goldfarb, Drosophila melanogaster importin alphal and alpha3 can replace importin alpha2 during spermatogenesis but not oogenesis. Genetics, 2002.161(1): p. 157-170.

193. Geles, K.G., et al., A role for Caenorhabditis elegans importin IMA-2 in germ line and embryonic mitosis. Mol Biol Cell, 2002.13(9): p. 3138-3147.

194. Gasca, S., et al., A nuclear export signal within the high mobility group domain regulates the nucleocytoplasmic translocation ofSOX9 during sexual determination. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(17): p. 11199-11204.

195. Tekotte, H., et al., Dcas is required for importin-alpha3 nuclear export and mechano-sensory organ cell fate specification in Drosophila. Dev Biol, 2002. 244(2): p. 396-406.

196. Wu, X., et al., Disruption of the FG nucleoporin NUP98 causes selective changes in nuclear pore complex stoichiometry and function. Proc Natl Acad Sci USA, 2001.98(6): p. 3191-3196.

197. Cai, Y., et al., Characterization and potential function of a novel testis-specific nucleoporin BS-63. Mol Reprod Dev, 2002. 61(1): p. 126-134.

198. Under, B., et al., Expression pattern and cellular distribution of the murine homologue of AF10. Biochim Biophys Acta, 1998.1443(3): p. 285-296.

199. De Souza, C.P., et al., Partial nuclear pore complex disassembly during closed mitosis in Aspergillus nidulans. Curr Biol, 2004. 14(22): p. 1973-1984.

200. Makhnevych, T., et al., Cell cycle regulated transport controlled by alterations in the nuclear pore complex. Cell, 2003.115(7): p. 813-823.

201. Chan, G.K., S.T. Liu, and T.J. Yen, Kinetochore structure and function. Trends Cell Biol, 2005. 15(11): p. 589-598.203.204.205.206.207.208.209.210. 211. 212.213.214.215.

202. Xu, X.M. and I. Meier, The nuclear pore comes to the fore. Trends Plant Sci, 2008.13(1): p. 2027.

203. Blower, M.D., et al., A Rae1-containing ribonucleoprotein complex is required for mitotic spindle assembly. Cell, 2005.121(2): p. 223-234.

204. Enninga, J., et al., Role of nucleoporin induction in releasing an mRNA nuclear export block. Science, 2002. 295(5559): p. 1523-1525.

205. Gustin, K.E., Inhibition of nucleo-cytoplasmic trafficking by RNA viruses: targeting the nuclear pore complex. Virus Res, 2003. 95(1-2): p. 35-44.

206. Olsson, M., S. Scheele, and P. Ekblom, Limited expression of nuclear pore membrane glycoprotein 210 in cell lines and tissues suggests cell-type specific nuclear pores in metazoans. Exp Cell Res, 2004. 292(2): p. 359-370.

207. Fan, F., et al., cDNA cloning and characterization of Npap60: a novel rat nuclear pore-associated protein with an unusual subcellular localization during male germ cell differentiation. Genomics, 1997. 40(3): p. 444-453.

208. Galy, V., et al., Nuclear retention of unspliced mRNAs in yeast is mediated by perinuclear Mlp1. Cell, 2004.116(1): p. 63-73.

209. Kubitscheck, U., et al., Nuclear transport of single molecules: dwell times at the nuclear pore complex. J Cell Biol, 2005.168(2): p. 233-243.

210. Rout, M.P. and S.R. Wente, Pores for thought: nuclear pore complex proteins. Trends Cell Biol, 1994. 4(10): p. 357-365.

211. Nehrbass, U., et al., Analysis of nucleo-cytoplasmic transport in a thermosensitive mutant of nuclear pore protein NSP1. Eur J Cell Biol, 1993. 62(1): p. 1-12.

Информация о работе

Чумаков, Степан Петрович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Внутриклеточные перемещения белков антиоксидантного комплекса. Новая система локализационных репортеров - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы