Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутриклеточные изменения креатинкиназной системы мозга человека при шизофрении

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Внутриклеточные изменения креатинкиназной системы мозга человека при шизофрении"

РГ8 ОД

I)

Министерство Здравоохранения РФ РоссийсхШ Государственный Мехшжский Университет

ч

На правах рукописи

СПУНДЭ Александр Яковлевич Внутриклеточные изменения креатинкжазной системы мозга

человека при шизофрении

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа' выполнена в Научном Центре. Психического Здоровья' РАМН.

Научный руководитель:

х

кандидат биологических наук Клюшник Т.П. 4

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Терентьев A.A. доктор медицинских наук, профессор Пзнченко Л.Ф.

Ведущая организация: Кардиологический.научный центр РАМН.

Защита состоятся "_" 199 г. в "_" часов на

заседании Специализированного Совета Российского Государственного Медицинского Университета,

(Совет N K084.14.05), по адресу: Москва, ул.Островитянова д.1,.

С диссертацией могно познакомиться в библиотеке'университета.

Автореферат разослан "_"_" 1993г.

Ученый секретарь Специализированного Совета N К064.14.05

кандидат медицинских наук

доцент Т.Н.Клушина

о&щач характеристика работы.

Выяснение отологических причин психических расстройств чело. Еека является одной из важнейшее задач нейрооиологт, поскольку прогресс в этой оолэсти способствует не только рзсшрешпо наших знаний о механизмах психической деятельности, но и указывает- новые направления профилактики и терапии ее нарушений.

Актуальность проолемы. удник из методических подходов при поиске оиохимических нарушений, связанных с развптпек заболевания." является сравнительный анализ оелковых спектров оагьагх и здоровых индивидов. Такие исследования ведутся достаточно длительное время, к хотя кардинальных изменений шелкового спектра напдено н- "иле. (Comings et ai, 1987), удалось показать, что интенсивность Оио-. логической функции часто связана не с изменениями ооерго количества оежа, а с регуляцией активности присутствующего в клетке фермента '.Нейфах, Тимофеева, 1977).

Имеются много ч1:сле:шые данные о нарушениях пстреояения глюкозы и регионального кровотока при шизофрении i andreas er. n, 1989;. Нескольку креатинкиназная система играет важную роль в поддержании постоянства концентрации /.ТФ при гипоксии и гипогликемии, несомненный . интерес представляет изучение' функционирования этой системы при пс.илческой цатолегик. Ранее Г.Ш.Буроаэвой и М.В.АхсеноЕСП было показано серьезное сникэнис КФК активности в водорастворимой Фраиги экстрактов лооных долей оолышх шизофренией, подтвержденное кмуунологически (Бурсаега-и соэвт, 198?; 1990; Аксенова, 1 у39) , поэтому актуальным. представляется дальнейшее изучение креь-етнкиназной систем мозга.

Целью данной расотк было изучение внутриклеточных изменений креатижсиназной системы мозга человека, состоящей из нескольких' ¡функционально различапцихся изоферментов, при шизофрении, и поиск причин таких изменений.

Для достюейеия поставленной цели решали следующие задача: 1. очистка В- изоформы креатинфосфокиназы из мозга человека и получение антител к ней.

Измерение К® эктиености е лооных доля?, мозга оольных шизофренией.

а. Определение изоферментного спектра КФК в лооных долях мозга здоровых людей и осльннх шизофренией.

4. Иммунологическое определение изоферментов КФК е различных клеточных фракциях.

5. Изучение внутриклеточного распределения КФК активности в норме и при шизофрении.

б. Определение экспрессии изоформ КФК на уровне мРНК с примене нием синтезированнных ДНК-зондов.

7. Определение влияния на КФК активность мозга крыс лекарств и стрессовых воздействий.

Научная новизна. Количественно охарактеризовано снижение активности и количества КФК в водных экстрактах лооных долей мозга оольных шизофренией, определен изоферментный спектр креатинкиназной активности мозга при шизофрении. Показано, что изменение изо-ферментного спектра при шизофрении вызвано уменьшением в водном экстракте ВВ нзоформы К® за счет перехода этого изсхрермента в мемораноассоцшрованную форму. При сравнении свойств расворимой и мемораноассоцшрованной форм ВВ КФК не найдено существенных различий в степени фосфорилирования. определена экспрессия генов ВВ и' Мит-КФК в лобных долях мозга человека. Исследовано влияние лекарств и стресса на креатинкиназную активность мозга крыс..

Научно-практическое значение. Полученные в рзооте данные оо . изменении внутриклеточной локализации ВВ изоформы 5ФК в мозге, сольных шизофренией расширяют представления :• механизмах нарушения энергообеспечения мозга при этом заболевании, и могут служить основанием для проведения прижизненных исследований кргзтннкиназной реакции методом спектрографии ядерного магнитного резонанса." Полу-

11а1гис.с ттг. МОДИФИЦИРОВАННОЙ ЕНДелеКИЯ ИЗС^ОрИЬ К'1'К ИГПОЛ!—

зуется для создания, совместно с кардиологическим ■-'кбучным центром РАМН, диагностических наборов для иммунетерментксЗ деагностики инфаркта миокарда.

Е'Чзос^^с? полозке"!'?.:

I , тт^^^р-^^щ изс^Ементного состава ИчЧ наид—но, что снп^'г— ние осщей КФК активности связано со снижением активности и содержания ВВ, но не Мит-изофермента. Такое снижение пркэодит к тому, что в ЕсдорэстЕоримой фракции мозга сольных тизофрокией соотношение кзоферкентов реципрокно по сравнению с соотношением - изоферментов в водорастворимой фракции мозга здоровпг людей.

2) Снижен:« активност ЗВ К® связано с переходов оелка в анзима-тически неактивную, мемОраноассоциироЕанну» фор^у. Ранее для Б изофэрмы таксе состояние фермента в мозге человека га описано.

■ 3) Показано совпадение физико-химических свойств нас творимой и

ч

ч мемсраноассощгарованаой фракций К!>К.

4) С использованием синтезированных фрагментов генов ВВ и Мит№К показано, что транскрипция етих генов в лобжй коре не изменяется при шизофрении.

5) Показано, что'воздействие лепонекса, галоперидас? и стрессовое Бездействие не кз^еняот активность креетинкглвзн в мозге крыс.

Апробация диссертационного материала. Результаты исследования были доложена на:

- Всесоюзном совещании "Наследственность человека: белковые продукты экспрессии генов" (Москва, 1989г.).

- Зой конференции Европейского нейрохимического общества (Лейпциг, ГДР, 1990).

- 2ом Всесоюзном совещании "Теоретическая и прикладная молекулярная биология" (Москва, 1991).

- 23ей конференции Американского нейрохимического общества (Хьюстон, США, 1992).

- межлабораторном семинаре ЩПЗ РАМН 16 июня 1993г.

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ в цетральной и зарубежной научной печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 99 страницах машинописного текста и состоит, из 6 разделов, включающих введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, указатель литературы^ Обзор литературы посвящен организации и функционированию креатинкиназной системы в норме и при патологии. Список цитируемых работ состоит из 200 печатных работ в.-отечественной и зарубежной литературе. Диссертация содержит_рисунков и_таблиц, помещенных в тексте.

Содержание работы. I. Материалы и метода исследования. Основам объектом изучения был постмортальный мозг человека. Были исследованы образцы лобной коры 10 человек (7 мужчин и 3 женщины), скончавшихся от острой сердечной недостаточности (контрольная группа), и 9 человек (3 мужчин и 6 женщин), страдавших шизо ; френией (диагноз по 1С1Ь9: 295.4: 295.3). Среднее время от момента

смерти до взятия ткани составляло 5.9 часов в контрольной группе и 7.4 часа е группе больных шизофренией. Из постмортальяого мезга с использованием цитоархнтектонических карт и атласов (Баколюк, 1979,1 выделяли лооную кору (поле 10), замораживали е зшдком азоте и хранили при -70С.

Часть экспериментов выполнена на крысах линий Спрэг и Август, а такке на беспородных оелых крысах (питомник РАМН "Столбовая" ).

определен:;? KiK эктиености проводили по методу Szzsz -;szasz, 1975), ДЛГ ПО методу Hsnry (Henry, 1??4), изоформ ККх ПО метода /.учуг-' (Khuchui. 19s?), сканирование проводили на лазерном денситометре BioMeö. instruments, статистическую обработку проводили программам st?.torar и Sigsi??!^. Для измет^ния кинетики ферментативных реакций использовали многоканальный спектрофотометр Dü-a (Вескпгл), программа Kir.etios.

Денатурирующий электрофорез проводили по Lawly (Laemly, 1970), двумерный электрофорез по О'Фаррелу в модификации (Knoweis, 19S7), белковый олоттинг по Towbin (Towbin, 1979} с применением полусухого переноса на нитроцеллюлозу, нативный к денатурирующий элактрофорез ДсПС и Р'Е, гибридизация нуклеиновых кислот и элицшо геля го Маниатису (Макиатис, 1984), синтез и счистку олиго-нуклеоткдез, пелкмеразную цепную реакию (ПЦР) по (?СР. Technology, Nv 1S39J. Часть форезов проводили в аппарате PhastSystcn (Pharmacia), гизуалпзапия белков с помощью Кумасси R-250 или серебром, нуклеиновые кислот - по окраске бромистым атидием.

Еыд-:л?гт'е ?В Ч4К по кодифицированной методике мШег (Miller, 1985). Отличия состояли в использовании в использовании иных, чем р исходной методике, смол (ЕЕА£-Тоуо?ег1 ь50К, MonoQ), что потребовало изменения услоеий хроматогра$ии, и ь подборе иных условий (pH, элюент) при афинкой хроматограф«* за Голубой

b

Оефарозе. Иьмунизеция кроликов, получение антисыворотки и антител, тестирование специфичности по 'Antiboies,

ййлооилизационное стрессиронание крыс по Салиевои (.Салие-ва, 1988).

2. основные резу/ьтаты исследования

Очистка белка, получение антител.

ь ходе проводимых 5 БНЦПЗ АМН СССР работ по поиску белковых мар.-^роь шизофрении Т.П.Клканик и Г.&.Бурбгеьой оыло обнаружено, что при сравнении оелкоЕых двумерных карт отделов постмортального №о~.?<1 больных шизофренией с соответсЕувдими контрольными карта».®

¿¿rc^jjafcyr-.-'j ji—KOTCTI-H^, ГЛ°ЕНН.^ l'^20m КОЛИЧеС'те^ННЫе , отличия, ПО—

¿^дямому яаьгхтеиные для визс-хрении. Было существенное снижение интенсивности содержания оелка с Мг=4СЖД и pi=5.1-5.3. Услоено этот белок был обозначен р40. (Klushnik et al, 1988).

Сопоставление полученных двумерных электрофореграмм с опубликованными белковыми картами мозга (Commings et al, 1982) не позволило определить оелок р40.

Эти результаты . послужили отправной точкой данного исследования. С целью идентификации р40 был препаративно выделен из ткани мозга человека с использованием системы FPLC (Pharmacia) по методике, указанной в Материалах и методах. В процессе выделения ориентирэвалксь на известное значение Иг (SDS ЭФ), проверяя отдельные - фракции 2D ЭФ. Очистка включала дробное высаливание сульфатом атония, анионобменную хроматографию, гель- фильтрацию и хроматография на гидроксилзпатите. Был получен белок высокой степени чистоты ( >98« по SES ЗФ) ; идентичность выделенного оелка и р40 была показана сопоставлением их положения на 2D ЭФ - при внесении выделенного оелка в образец экстракта со сниженным содер-

жзнием р40 нэолюдалось появление пятна в ооласти. соответствущей р40.

Выделенный оелок оыл использоевн для иммунизации кролика по общепринятой схеме (Antibodies, 1988).

Мокно заметить, сто среди известных белков мозга, охарактеризованных по физико-химическим свойствам, сходными с р40 параметрами ооладает-мозговая изоформа креетинфосфокиназы <BE-KCfC) ;оелок состоит кг двух идентичных ОЕ с М.г=<!3 кД и pi—5.3;. Это позеоля."!"1 предположить, что piö является В-изофорлой КФК. Анадаз анзимати-чесхой активности показал, что выделенный р40 ооладает активностью К®, хотя и очень низкой <ю ro/мг) по сравнения с описан-_ но ti в литературе (БОС1—5G0 xtj ' мг ¡, не- вс-* же олишус" высоко:: для зозмолмых примесей.

Для окончательной идентификации р40 препаративное Езделэние оыло повторено в условиях, модифицирование с учетом существующих методик очистки В-К4К. Было апробировано использование иннх, чем в оригинальных статьях (Miller et al, 1?95), носителей для ионосмен-ноа хроматографии «.DxaS-tsk ¿зон и kohoQ), что потребовало оптимизации условий иоЕоокеш:ой хроматографии (pH п ионная сила) и о'шетк™ на Голубой Сефарозе (pH и концентрация ¡ig). (Материалами методы, 2.4.1.1). Стадии выделения проиллюстрированы на рис.1.

В результате был получен белок, гомогсэшй по данным SES-ЭФ '.степень чистоты >985), облздакяций еысокой К£К-сктпеностьй (>в00 Iv/кг) и занимаюсь-ш на 2D ЭФ место p4Q. to антисывортки, полученной при иммунизации крс.ш;з препаратом p4Q, были рыделеш аф^кк^е антитела к ЕВ-1ЖС, кстзрно специфически окрактвалн на белковом блоттинге те ке линии, что что и антнсиЕоротка: одну голосу на SDS- и нативном порезе экстрактов мозга (ь разведении 1:50 -1:500) к глнец (б разведении t: 10 - 1:20). и две практически слива-

ициэся полоса на ses-ЭФ экстракта сердечной ткани (в разведении 1:Ю - 1:50). Эти данные позволяют утверждать, что р40 является В изоформой креатанфосфокиназы (рис. 2).

Анализ водорастворимой фракции. Снижение общей КФК активности. Анализ изофорц.

Результата измерений Ферментативной активности в водной фракции представлены на ряс.З. Полученные результаты свидетельствуют о существенном <ь о-5 раз), статистически достоверном снижении общей ЬМК активности в водорастворимой фракции мозга Осльних шизофренией: с 340-45 iu/r ткани в норме до 100^57 та/т в мозге шизофреников. Для другого цитоплагматического 'фермента - .ЧДГ - также наолк'дается. сниженне активности в водной фракции, но наолюдаемое снижение не превосходит 20 %% и является статистически недостоверным: с 55^3 ID/r до 47—11 IU/r. Данные об изоферментном спектре КФК мозга человека достаточно противоречивы - от указаний на полное отсутствие МитКФК (Hamburg et al, 1990), до работ, где доля МитКФК определяется в 303 (Wevers et al, 1981) Есть статьи, где значительную часть мозговой КФК активности идентифицируют как ММ КОК (Iliadsеу et al, 1978). Для уточнения этого вопроса оыло проведено определение изоферментного состава КФК в изучаемой выборке.

Используешй в работе метод основан на различии в подвижности изоформ КФК при нативном форезе. Аликвоты водных экстрактов разделяли электрофорезом в агарозном' геле при рН=9, ферментативно окрашивали и сканировали в флюориметре. Общая измеренная активность делилась согласно процентному соотношению, определенному при сканировании. Суммирование данные по изоферментному составу водной фракции представлены на рис.4.

Полученные данные позволяют говорить о существенных измене-

Рис.1 Стадии очистки креатин Рис.2. Белковый Олоттинг водорастворимы?"

киназы ВВ из мозга человека. А: экстрактов мозга. 2СМкг Оелка/дор. фракция 45-60; В: после ЮЕАЕ- 1-5:норма; 6-10:шзофрения.' тэх 650«'; С: после Голубой Се- Афинные антитела к БВ1КЖ, меченные

фарозы: Л: после Мспоо.

125J (2.5 млн арт/фильтр).

Рис.3. Результаты измерения Рис.4. Результаты определения-ферментативной активности в пзоферментного состава КФК в

водных экстрактах мозга. А - К®; В - .ИГ.

водных экстрактах мозга. А - ВВ КФК; В - МитКФК.

К

а

ъ----I

о я а

, Засал С73 С-» 52

; га зэ 15 гг зз

НСРМА

: У\ I

ь-

л

ниях в креатинкиназной системе мозга больных шизофренией: в еодо растворимой фракции имеет место 3-7 кратное снижение общей КФК : активности, и это снижение вызвано уменьшением количества ВВ (с 270±39 ги/г в норме до 50±15 io/г при шизофрении) и Мит (с 64±22 iu/г е норме до 5<ЬЗЗ iu/r при шизофрении; КФК. Соотношение изо-ферментсв сукественно изменено: в отличие от нормального мозга, где МитКФК состзЕлет 1Ь-20%% обшей активности, в ■ водорастворимой Фракции мозга Сольннх шизофренией кЯтК-ХК составляет 40-50*?, т.е. соотношение крчгатннфзсфат-синтезирущего (МитКФК) и ¡феатянфосфзт-утнлизирукщего (БВ-КФК) изоферментов изменено на обратное.

Мочевинная экстракция. Факторы, влияющие на солюбилизацию КФК. Меораноассоциированная фракция.

Полученные данные в значительной степени противоречили результатам comings (Comings et al, 1SB2). В этой работе методом 2Д ЭФ очень подробно и на большой выборке (145 образцов) изучали как различия ме«ду отдельными зонами мозгами, так и различия между нормальным ■ шизофреническим мозгом. Столь явно выраженных раз личий, как те, которые были найдены нвми, comings и соавт., не обнаружили. Для сопоставления с результатами этих, авторов нами были использованы столь же жесткие условия солюоилизации: ем мочевина, 1% нР40 в К® ("мечевинная фракция").

Действительно, при использовании мочевинной экстракции различие в содержаний КФК, выявляемое ишунохимически, становится незначите льшм.

Этот результат означает, что уменьшение количества КФК в водорастворимое фракции вызвано не снижением количества КФК в клетке, а уменьиением ее растворимости в низкосолевом фосфатном буфере. Такое явление может отражать переход белка в состояние, известное в биохимии как "мембраноассошшрованное" (иногда называв-

мое также партнкулнрованным или латентным) (обзор Спирин. Рязанов, 1989), и в этом случае представлять несоетенныа биохимический интерес, -ко' можёт отражать и кеспещдаческие влияния. Поэтому следующей задачей стало определение факторов, влияющих на сол»>-

оилизацию КФК.' - .....

Вопрос о влиянии рН, ионнной силы и неионных детергентов на солюоилизацию различных изоформ К® из тканей мозга списан в литературе iJsocbus -it Miller and Wei, 1 ?5r; C^andl-sr et ai, 1937 ), однако влияние s тих факторов на солюоилизашпо KSK иь тканей мозга шизофреников было неясно.

Было исследовано влияние рН, ионной силы, детергентов,, xso-

ТрС'РЧЫУ 5Г^НТЛЕ " ^У"!СТр^ТОс "'Т'К. ~',:1?уЛЬТВ'т'У ЭКСП^рйЗ^НТОВ Пр?Д-стаьлены на рис.5 и.-г;.

Видно, что несмотря на некоторое увеличение выхода КФК при повышении рН (рис 5А) и ионной силы (5В), связанное с солюоили-зацией МитКФК (Chandler et al, 19S7), различие между образцами больных и здоровых людей сохранялось. Это позволяет исключить ионные взаимодействия как причину пераспределения К-КС.

Использование неионного детергента дает- существенное увеличение Еыхода КФК, однако не полностью устраняет разницу в солвбили-зируемой активности мехлу нормой и шизофренией (рис 5С). Кеобхо ч^ димо отметить, что повышение концентрации детергента делает игме-рение активности маловоспроизводимым, еидимо ЕследстЕии мпцелло-образоЕания. Использозние SDS приводило к солюоклизащш энзимати-чески неактивной КФК (белок определялся белковым Слоттингом, но не обладал экзиматической активностью). Характер зекисшости солюои-лизаига; от концентрации детергента позволяет считать, что гздро-фооные взаимодействия существенны для наблюдаемого перераспределения, хотя партикуляция BB-KîK и отличается от описанной для ММ-

400

- --- г

_ 1<V\ 1_

-1-VT-

-в

3i=íl

!

400

200

_ 100 о

П i I i i I

о-------« :

Sz=a

Z'JU OV'J

m¿I pH*

G."--

¿.О

«i а.

Li

- o-

-200

- ICO u й

Szs3

С

O-iii 0.1 '

[Triton Г100] r.r, r/r

400

О

e M

e.

u

200

"3 100

o"

W-ч SzbS

, О

___« I

3 «i. 5 V

b4" * " J' -1*

D

R

U

— j.w Г —i

«

а.

u

220

100

• --о

тп

Sz=3 !

"i о 00 [atf], ШИ

s

K=3

Г -----O--C-Q-

3 200 r o с

А

d loo í-

гз

О---« О---4

5г=3

п i

ю юо

[Сг?]. mil

Рис.5. Определение условий сашЗшшзашш КФК.

й г-

I I

о

2

КФК в сердце (Baskin st al. 1970, Sato et al, 1976, Jacobus 6£a»kin, 1974).

Для ряда бактериальных ферментов описан эффект обратимого связывания с мембранами при снижении концентрации субстрата (Спирин, Рязанов, 1989) Как видно из рис. 52, 5? добавление субстратов КФК не вызывает увеличения солюбилизации КШ ни в норме, ни при шизофрении.

Наиболее полнуъ солглилнзацкю KffiC удалось достичь применением хаотропннх агентов (мочевина, гуанидин тиоцианат) (по данным белкового блоттинга), причем для мочевины путем ее быстрого удаления удалось достичь хорошей ренатурзшш МК-актинности. Хотя измерение активности ^озм^'Ж?***' i* н"оямо'.иэ мочевш^ого экстракта *и^пользу—Mii— для измерения активности образцы разводили в 100-200 раз для попа дания на линейный участок), но учет влияния кинетики ренатурации и примесей затрудняют анализ результатов. Удаление мочевины диализом требует значительного времени (2-4 часа), и результаты ренатурации плохо воспроизводимы. Был предложен способ быстрого удаления мочевины на колонках нар-? (Pharmacia), содержащих Сефадекс G-10. Колонки уравновешивали К® рН=7.0 (10мМ ДТТ) с добавкой 0.05S NP-40, и проводили смену буфера по рекоменцации фирмы-изготовителя в течении 5-Ю минут, образующиеся хлопья водонерэстворимых соединений Ч, удаляли центрифугированием (14 OOOg, 10 мин, +4°С). Эксперименты показали, что степень ренатурации энзиматнческой активности составляет примерно 90% как для каждого из очищенных изоферментоз (ВВ из мозга и МитК® из сердца человека), так и для целого гомогена-та, и ренатурация завершается через 10-15 мин. Критическим для полноты ренатурации оказалось присутствие активатора КФК НАС (N-ацетил-ь-цистеина): в его отсутствие степень ренатурации не превосходит 50-6055, воспроизводимость очень плохая. В дальнейших

расчетах под величиной активности в мочевинной фракции понимается измеренное через 20 минут после удаления мочевины значение, ; разделенное на 0.9 (рис 5Ь).

Полученные результаты позволят считать, что наолвдаемое снижение количества К4К в водорастворимой фракции гомог'ената мозга сольных шизофренией отражает переход части клеточной КК в состояние, известное-как мемораноассоциированное, или партикулированное. Ранее такое перераспределение ЬМй в мозге не было описано, поэтом» появилась необходимость количественно охарактеризовать мемораноас-соцнированную фракцию К® н рассмотреть фактор«, вызывающие наблюдаемое явление.

п'п оснований описанных ьыше экспериментов для дальнейшей ра-Ооты были ьыораны £ буфера: К® буфер (Ог-буф;> (100мЫ фосфата калия, рН=9.0, омМ ЛТТ, 0.2мМ ЭДТА, 0.01$ азида натрия) (йР-буф) для изучения водной фракции и К5Б-мочевинный (КФБ+ 8М мочевина) (сигеа-буф) для изучения тотальной и мембраноассоциированной фракций КФН.

Б опытах по мочевинной экстракции исследовали как целые ткани, так и осадки, образующиеся при центрифугировании водных гомо-генатов. Первую величину рассматривали' как общую кре атиикиназяую актиьность ткани, вторую - как количество "мембраноассоциироЕэн-ного" или "партикулировазного" фермента. Измерения активности сум мированы на рис.6.--Хотя некоторая разница (примерно 30%) мзаду нормой (370+40 1и/г)и шизофренией (310+26 т/г) сохраняется, однако такое различие не достоверно статистически при сравнении с активностью ДДГ.

Подсчет изоферментного состава мочевинной фракции затрудняет то обстоятельство, что анализ наивным форезом после ренатурации не дает четких результатов: еидимо, ренатурация состоит в вое-

Рис.6.

§ 4??

Ь

U

о о

и if;

Я

Ен

3

15

' Иеап : SD 370 310 40 25 зз эю ; 3 45 ;

Г . "ГГГ. * i

4 Г •Ч ч V <\ \ 41 ^

1 ( J i i Ч \ 1 «\ \ Ь \ \ 1 1 \ М Г 1 V \ ч 1 \ — ts. Ч \l i __ V'\) 4 —1 Ч \ 1

DO • t n

I | НОРМА

{WI визоегЕНия

\Т= 1 (\

■>-р<0 01

становлении третичной, но не суоъединичной структуры К®. Но пос кольку Вестерн блотингом с анти-МитКФК AT было показано, что и в норме, и при шизофрении практически вся МитКФК активность солюби-лизк^у'^ся - г.ил%ьр— ^ дл~ дальрйкцп12* р1'"'г""j ^ извл^к^—ма3

осадка активность рассматривалась как 5-КФК (о учетом указанного выше коэффициента ренатурации).

Интересно отметить, что в работе Comings (Comings et al, 1982) среди участков двумерной карты с наиболее часто встречающимися количественными различиями первым указано пятно с координатами 43-5.3, т.е. с характеристиками 3 КФК.

Суммируя результаты, правомерно говорить о возможности существенных нарушений в кре атннфэсфокиназной системе мбзга человека при шизофрении. Наблюдается изменение изоферментного спектра КФК в Ч водорастворимой фракции, что еызвэно перераспределением значительных количеств ВВ изофермента из водной фракции в энзиматически неактивное (мемораноассоциированное) состояние. Такая транслокация специфична для В КФК, и не наблюдается ни для ЛДГ, ни для МитКФК.

Изучение влияния неспецифических воздействий.

Хотя переход Б-нзоформы креатинкиназы ь мемораноассоциирован-ное состояние представляет интерес как отдельное наблюдение, для заключения о связи внутриклеточного переопределения КФК с шизофре-

нней требовалось изучение влияния, неспецифических воздействий.

Поскольку в качестве материала для исследований использован аутопсийный мог? умерших хронических сольных,' прехде всего было определено влияние аутолиза к лекарственной терапии.

Вопрос о*> изменениях К5К актиЕности в постаортальном периоде оыл исследован ранее (Аксенова, 198?), и полученное ранее заключение подтверждено: в течении 1?.-14 часоЕ снижения К1й активности не проколодкт. Для оценки влияния аутолиза на птьерзспределение КФК образцы нормального и шизофренического мозга, поступившие в кратчайшие сроки (4-5 часов после клинической смерти) хранили при комнатной температуре, о-тоирзя через определеннее промежутки времени

.*.Лг|С.о| .ь. д^пи с. ипиоь. в £Ь;Л'*' ГТС'К Ъ Г" , "'Т1*** V- г.-^^с.у } # — * {^ '*''*1" о гс'

интервала не происходит существенного ¡-ераспределенкя КФК ни в нормальном, ни.в шизофреническом мозге. С учетом того, что Есе использованные в раооте образцы отбирались в период 6-14 часов после смерти, влияние фактора Бремени сало отвергнуто.

Изучение историй болезни папиетов с диагнозом "шизофрения" не выявили лекарства, способного вызывать вручаемое ЯЕленке: несмотря на различия в применяемой лекарственной терапии,' аффект снижения КФК активности сохранялся. Однако вопрос представляется не вполне разрешенным: приходится учитывать неполноту Еедеш:я историй болезни нз практике (в частности, не находит письменного отражения назначение снотворных и умеренных се дативных -средств).

Для исключения еозмоеного влияния татзйс препаратов крысам вводили лепонекс е галоперкдол в/м в точении 30 дней в дозах, со ответствующих терапевтическим. Результаты приведены на рис.7. Видно, что существенного, статистически достоверного снижения КС« активности не наблюдается. Эти результаты позволяют с высокой степенью вероятности нс:слючитъ лекарственные средстза кз списка

аз X f

! s.

I

л t-

о о

5 я

l GO r-

Mean SD

340 зго 40 34

?.40 40 " 22tx"

fTTTi ; —

N Ч М

* ч \ 1

Is- 4 \Ч 1

Г\ \ '4 .4 Ч N

К ч'м г. Ч'м

Ч\Ч1 гч Ч 41

k \ \ 1

i4 . \Ч 1

¡УчЧ

К\ч ■ ч ч ^

N ч 4J 14 Ч Ч;

» \

А Ь

I | КОНТРО/ЬНАЯ ГРУППА"

лекарственное воздействие

Рис.7.Влияние лепонекса (А) и галоперидола (В) на коеатинкиназную активность мозга крыс. __

пригни, вызывающее нарушения деятельности КФК системы мозга.

В поисках экспериментальной модели для изучения нарушений системы мозга было решено исследовать влияние стр-сса на енерго-обмен мозга крыс. Б качестве стрессирущего фактора сила выбрана модель "ограничение подвижности", как хорошо охарактеризованная по литературным данным и простая в реализации.

Для работы были взяты крысы линии Спрэг, характеризующиеся высокой стрессоустойчиЕостью, и линии Август, считающиеся лабильными и плохо переносящими стресс (Салиева и.др, 1Э39). Крыс стрес-сировали по общепринятой методике (Судаков и др, 1991), забивали и анализировали ЬМ'К и ДДГ активности в гомогенатах мозга (Рис.о).

i?4 э ■

о> о1-' Ь4

3

V 60 я

* 40

а

а-V

T --О*-

I J.

-О яО

* Зрг«е О AT«nrt

-4 -5

-•a

56

3

2 +0

so ¡- XI

-Ъ >о

-ъ.г

Рис.8. Влияние иммобилизационного стресса на активность ферментов в мозге крыс линий Спрэг и Август.

I Ч/

Можно видеть, что стрессирование не изменяет ДДГ активности мозга крыс оооих линий, наблюдаемое некоторое снижение КФК актив- 1 ности в мозге крыс линии Август статистически недостоверно. Таким образом, эксперименты на животных не выявили фактора, Еызыващего снижение КЖ активности водорастворимой Фракции. Тем самым увеличивается вероятность того, что наблюдаемые в мозге человека изменения являйте* специфическими для психической патологии.

Изучение экспрессии на уровне мРНК. ;

Полученные результаты свидетельствуют о.том, что значительная часть В-КЖ присутсвует в мозге шизофреников в мемораноассоции-рованном состоянии. Переход в такое состояние может быть связан Кс.- с ивнтненйямй структуры оелка, так к с нарушениями экспрессии !

на , стада транскригири. . Для анализа экспрессии на уровне м?НК прежде всего необходимо было получить ДНК зонды для каждой из изо-форм. С этой целью был: синтезированы олигонуклеогида, специфические для генов В К® и. Мит КФК. Из-за высокой степени гомологии ■ внутри семейства крезтинюшаз юслэдова дельности олигонуглеотидов были выбраны по результатам компьютерного анализа таким образом, чтобк они могли служить прайьерами в поликерэзной цепноа реакции (Щр;, не давая перекреста между членам;! семейства. Это позволило определить количество глРКК гибридизацией имиоОидизовагаой РНК с ШР-синтезированныиц фрагментами.

. Синтезированные пра&еры оылк усдеэно использованы для ампли- ■ |

I

фикации фрагментов генов Мит и В КйК. Условия гжтшфЕкацпа Сылк I

оптимизированы (2 стадии аместо стандартно используемых Зх, кон- I

центрация праймеров к матрицы, концентрация и обеспечивали хорошую ылпяирчкеци» фрагмента требуемой длины (410 пар муклео-тидое для Мит КФК и 200 пэр нуклеотидоЕ для,В КФК).

Для - исключения амплкфикашга неспецкфических последователь-

ностей продукта ПП? реакции разделяли ЭФ з агарозком геле, при УФ освещении внрезали полосу геля с фрагментом тиеоуемой длины, элюи— -ровали ДНК из геля с использованием ионооменкика чхаОеа. и проводили Еторичну» амплификации с использованием тех же праймеров и элкированной ДНК.. Полученный при вторичной амплификации фрагмент, не содержащий неспецифических фрагментов, так же элюировали из геля, определяли концентрацию и после мечения с применением рчс-сейнной затравки использовали в слот-гиорндязацаи с РНК '^лькыл и здоровых ладей. Полученный автограф- еканироь^л7.'. ш денситометре 31смм результаты числовой обработка' приведены на

рис.9.

100

I ! ши <\\\ 1 \ NNI

l\\. NJ

"Ч Wi

t\\\!

i\W1 ч v \4

. I ■ i iu ч

t\\41 N444

\\ ч '4 \ Vi

'WM l\\ \ "1

L \ \ vi l\\ \l 'V \\1

» \\ i

( cz1 норма ; <иизоФР£ния

B-K® мРНК МитКФК мРНК

Определение содержания В- и Мит-Kffit мРНК в лобных долях мозга здоровых людей (N=5) и шизофреников (Sz=5).

рис. 9. '

При обработке данных ориентировались на количество нанесенной

на форез РНК согласно Yamguohi (Yan-^uohi et ai, 1?92).

Полученные результаты показывают, что различие содержания Б и

Мит КФК мРНК в норме и при шизофрении не превышает ошибки метода.

Это означает, что переход части В-КФК в мембраноасоциированное состояние ке. связан с изменениями е транскрипции генов КФК.

С-Нзико-химические характеристики.

' Представляется весьма вероятным, что переход части В-гИК в латентное еотояние связан с пострансляционными модификациями фермента. Кг литературы известно, что КФК подвергается фосфорилирова-ни» '.йгп'а'ле'.'ап, 1534), по-видимому протекнккнэгой 0 '.с-гло.'-. гг

•К'с4ор:1лир".'Ьанн£!е производное ЬМ~ при пг-.-лвляются ь

Еиде д=у:с пятен, сдвинутых в кислую область, но имхацих тот- ке Нол ьес.Лля того, чтооы определить -ке связана ли транслокация К5К с изменениями ее фосфоинлирования - на 2Д-5Ф нанесли образцы водного

(по о образца из группы;. Было показано, что отчетливо выраженных отличий в соотношении кислых и основных изоформ КФК между растворимой я мемСраноассоцЕгрсвакысл'формами К5Х нет ни в норме, ни при патологии. Это означает, что переход в мембранозеоциированное состояние ке связан с резкими нарушенная фосфорилиров&Ш1я КФК.

ВЫВОД*

1 .Предложен модифицированный способ очистки Б :тзофор.ш креатинкияэзы из мозга человека, получены антитела к выделенному белку. Подтверждено начичие существенного скитания активности К® и содержания КФК (ентттенз) в водных экстрактах из лобных долей мозга больше шизофренией.

2. Определзн изсфер:.:ени:ый спектр кр^ьтшккнагы в норме и при шизофрении. Найдено, что активность В и Ми-г изоформ снижена в еод-

экстрактах в различной степени, в результате чего соотношение изоферментов ь водорастворимой фракции мозга больных шизофренией изменяется на обратное по сравнению с нормой.

3. Покйзйно, что значительная часть Б-изоформы креатинкиназы мозга сольных шизофренией существует в Еиде энэиматически неактивной мемореноассоциированной формы.

4. Найдено, что физико-химические СЕойства (woл. вес, pi, соотношение фосфорилированной и нефосфэрилкрованноа форм) креатинкиназы из водорастворимой и мембраноэссоцииронанной фракций совпадают.

- • 5. Синтезированы фрагменты генов 5- и 'йт- креатнякиназы. Определено, что при шизофрении уровень экспрессии 5 и Мит м?КК ъ тканях лобной доли мозга совпадет с уровнем экспрессии этих изо-Ф?рм в норме.

Воздействие j~nc>Hrkv4, га.'К/легндо.ча а илвк'ои.чиаацно'.-^йн стресс не изменяют креатинкиназную зктиеность мозга кивсных.

Список публикаций по теме диссертации

1. Выделение и характеристика бежа р40, содержание которого существенно снижено в мозге больных шизофренией. Мат-лы Всес. симпозиума ;"Наследственность человека: белковые продукты экспрессии генов", Москва, 1939, с.32. (Совместно с Клкшник Т.П.)

2. The activity and content^of the CFK isoenzymes in noraal and schisophrenic brains. Abs. ni 5th Gen. .Meeting the European Society for neurochemistry, 1990, Leipzig, DDE, p.32. (Совместно с Клюшник Т.П., Хучуа S.A.)

3. Транслокация креатинкиназы ВВ в мозге больных шизофренией. Мат-лы 2 Всес. совещания "Тееретическая и прикладная молекулярная биология", Москва, 1991, с.56. (Совместно с Клюшник Т.П.)

4. Двумерный электрофорез водорастворимых белков мозга человека: содержание креатинкиназы ВВ существенно снижено в мозге больных

• шизофренией", Нейрохимия, 1991, т.10(N3-4), с.46-52. (Совместно с

Клюшник Т.П., Яковлевым А.Г.)

5. Intracellular alterations of the cretine kinase isoforms in brains of schizophrenic patients. Molecular and chemical neuropathology, > v.15, p.2?1-280. •;Совместно с Клкшник Т.П., Яковлевым А.г., Хучув о.А., Саксом Б.А., Вартанлном М.Е.)

6. Alterations of creatine kinase in schizophrenic brain. Abs. of 23th Gen. Meeting ci the American Society for neuroclieinistrj', 1?:?2, рЧг, Huston, USA. ■; Совместно с Клвшнкк Т.П., Яковлевым А.Т., Брусовам О.С.;