Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутриклеточная локализация полирибосом, синтезирующих полипептиды комплекса цитохромов bc1

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Денежкина, Валентина Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I, Молекулярная организация и биогенез комплекса цитохромов Ъсд-.II

1.1. Состав и структура комплекса цитохромов Ье-]-.II

1.2. Биогенез комплекса цитохромов Ъс-^

1.3. Молекулярная организация и экспрессия гена цитохрома Ъ.

Глава II. Топография синтеза митохондриальных белков в цитоплазме и механизма их транспорта в митохондрии.

ЭНСПЕРШЕНТАЛЬШ ЧАСТЬ

Глава III. Материалы и методы

3.1. Материалы и реагенты.

3.2. Выделение комплекса цитохромов Ъс^

3.3. Электрофорез белков

3.4. Спектральный анализ комплекса цитохромов Ъсд-.

3.5. Получение антител против комплекса цитохромов ЪСд

3.6. йодирование белков.

3.7. Получение полирибосом

3.8. Седиментационный анализ полирибосом, синтезирующих компоненты комплекса цитохромов ЪСд

3.9. Трансляция полирибосом в бесклеточных системах

ЗЛО. Выделение и трансляция полисомных РНК

3.II. Анализ рекомбинантных клонов E.'coli, синтезирующих апоцито-хром Ъ

Глава 1У. Характеристика полирибосом, синтезирующих комплекс цитохромов Ъс-j

4.1. Свойства изолированного комплекса цитохромов "bCj и антител к нему

4.2. Связывание анти-ЪС]- -иммуноглобулинов с полирибосомами печени крысы

4.3. Внутриклеточная локализация подири-босом, синтезирующих полипептидные компоненты комплекса цитохромов "bc-j

4.4. Размеры по.лирибосом, синтезирующих полипептиды комплекса цитохромов

4.4.1. Внутримитохондриальные полисомы, синтезирующие апоцитохром Ъ

4.4.2. Картирование гена апоцитохрома Ъ в мтДНК печени крысы

4.4.3. Седиментационный анализ полирибосом цитоплазмы, синтезирующих полипептидные компоненты комплекса Ъс1.

Глава У. Биосинтез полипептидов комплекса цитохромов "bCj в бесклеточных системах

5.1. Идентификация полипептидов комплекса цитохромов Ъср, синтезированных в бесклеточных системах.

5.2. Реконструированные системы транспорта синтезированных в цитоплазме полипептидов Ъед—комплекса в митохондрии . . III

ОБСУВДЕНЯЕ РЕЗУЛЬТАТОВ спжок лшератущ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМПС - полирибосомы, ассоциированные с митохондриями

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

ГТ~ - гуано з ин-5' - трифо с фат

МПС - мембраносвязанные полисомы мтДНК - митохондриальная ДНК мРНК - матричная /информационная РНК/ рРНК - рибосомальная РНК тРНК - транспортная РНК

СПС - свободные полисомы

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

HEHSS ~ N-2 -оксиэтилпиперазин- н»~2 -этансульфониловая кислота

ХЕШ) - N,N,N%ir -тетраметил этилендиамин

- 5

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внутриклеточная локализация полирибосом, синтезирующих полипептиды комплекса цитохромов bc1"

Актуальность проблемы

В последние годы достигнуты большие успехи в изучении генетических функций митохондриальной ДНК /мтДНК/ различных эукарио-тических организмов и молекулярно-генетических аспектов проблемы биогенеза митохондрий (см.обзоры /144,4,6,8,12,13,14,17,20/). Прежде всего, установлено, что формирование ферментных ансамблей митохондрий является результатом координированной деятельности5 митохондриальной генетической системы и хромосомных генов, причем матричные РНК - транскрипты этих двух групп генов транслируются как на митохондриальных, так и на цитоплазматических рибосомах /169,171,189/. В основном, идентифицированы белковые продукты, закодированные в молекулах мтДНК дрожжей. К ним относятся специфические субъединицы ферментных ансамблей внутренней митохондриальной мембраны - цитохромоксидазы, комплекса цитохро-мов Ъс1 и АТю-синтетазы /189,171,192,169/. Картировано положение этих генов на молекуле мтДНК дрожжей и выяснены многие детали их молекулярной организации и экспрессии, а также расшифрована первичная структура ряда регионов дрожжевой мтДНК. В опытах на мтДНК клеток высших организмов также идентифицированы гены, кодирующие полипептидные компоненты ферментных ансамблей внутренней мембраны. В 1981 г. завершена работа по определению полной первичной структуры мтДНК мыши /38/ и человека /27,28,32, 137,150/, в результате которой открыто своеобразие генетического кода митохондрий, отличающегося по информационному смыслу ряда кодонов от "стандартного" кода, считавшегося до этого универсальным способом кодирования в живой природе /32,38,123,68,43/. Доказано также, что основная масса митохондриальных белков кодируется хромосомными генами и синтезируется на рибосомах цито

- б плазмы. Механизм транспорта этих белков в митохондрии интенсивно изучается в последние годы /22,52,168/,

Генетические функции мтДНК и механизмы ядерно-митохоццри-альной интеграции в течение ряда лет систематически исследуются в Лаборатории биохимической генетики НЙИЭМ АМН СССР /12,13,14, 144/. В работах Лаборатории получена существенная информация о молекулярной организации мтДНК животных клеток /8/, о регуляции ее экспрессии /10,15,16/, свойствах митохондриальной мРНК и автономного белоксинтезирующего аппарата митохондрий /3,4/. При изучении топографии синтеза митохондриальных белков в цитоплазме обнаружена специфическая фракция полирибосом цитоплазмы, каким-то образом ассоциированная с наружной мембраной митохондрий и специализированная, по всей вероятности, в синтезе белков для этих органелл /5,71/. В частности, эта фракция цитоплазматичес-ких полисом преимущественно вовлечена в синтез субъединиц цито-хромоксидазы /II/. Однако, ряд аспектов топогенеза митохондриальных белков в животной клетке остается невыясненным. Остаются неизвестными общие закономерности топографии синтеза белков митохондрий в животной клетке, механизмы их специфического транспорта в митохондрии, связь между транспортом и созреванием митохондриальных белков и т.д. Решение этих вопросов представляет существенный интерес с точки зрения биологии животной клетки для понимания тонких механизмов координированной экспрессии ядерных и митохондриальных генов /сцепленных функционально, но разобщенных пространственно/, определяющих структуру субъединиц ферментных ансамблей митохондрий. Выяснение этих механизмов, в свою очередь, необход шло для детального изучения молекулярных основ нарушений биогенеза митохондрий при злокачественных новообразованиях, некоторых наследственных болезнях и других формах: клеточной патологии, при воздействии на организм некоторых антибиотиков.

Цели и задачи исследования:

В качестве модельного объекта для изучения внутриклеточного топогенеза митохондриальных белков представлялось целееообразным избрать комплекс цитохромов Ъс^. Этот комплекс является необходимым компонентом митохондриальной цепи транспорта электронов. Он локализирован во внутренней митохондриальной мембране /47, 157/ и состоит из ряда субъединиц, структура которых определяется как штохондриальными, так и ядерными генами /159,189,192/. Эти субъединицы различаются также по внутриклеточной топографии их синтеза. В опытах на дрожжах доказано, что мтДНК кодирует единственный полипептидный компонент комплекса Ъсх, а именно -апоцитохром Ъ /44/. В то же время вклад двух генетических систем животной клетки в формирование комплекса Ъс^. до последнего времени оставался совершенно неизвестным. Неизученными остаются также закономерности внутриклеточного распределения полирибосом животных клеток, участвующих в синтезе полипептидов этого комплекса, и механизмы транспорта в митохондрии и созревания этих субъединиц.

В связи с этими соображениями цель данной работы в общем виде формулировалась как изучение внутриклеточной топографии синтеза субъединиц митохондриального комплекса цитохромов Ьс^.

В конкретные задачи работы входило: I/ Выделить и охарактеризовать комплекс цитохромов Ьс1 из печени крысы и получить к нему моноспецифические антитела; 2/ С помощью радиоимцунохимического метода изучить внутриклеточную локализацию полирибосом, содержащих насцентные цепи полипептидов - компонентов комплекса Ьс^;

3/ В опытах на реконструированных бесклеточных системах изучить механизмы транспорта в митохондрии новообразованных полипептидов - субъединиц комплекса Ъс1 или их предшественников. Научная новизна работы:

Впервые показано, что субъединицы комплекса Ь^ синтезируются в виде предшественников на двух группах полирибосом цитоплазмы печени крысы - на полисомах, ассоциированных с наружной мембраной митохондрий, и на мембраносвязанных полисомах шероховатого эндоплазматического ретикулума. В опытах на реконструированных бесклеточных системах выявлена специфичность молекуляр-но-весового распределения полипептидов комплекса Ъср синтезируемых на двух группах полисом цитоплазмы. Продемонстрирован синтез высокомолекулярных /возможно, полипротеидных/ предшественников некоторых субъединиц. Синтез компонентов комплекса Ъс^. на полисомах, ассоциированных с наружной мембраной митохондрий, связан с их котрансляционным транспортом внутрь органелл, который сопряжен во времени с ростом полипептидных цепей на полисомах. Субъединицы комплекса Ьс][, синтезируете мембрано с вязанными полисомами шероховатого ретикулума, транспортируются в митохондрии посттрансляционно путем диффузии через цитозол. Научно-практическое значение полученных результатов:

Результаты работы объясняют механизмы специфического транспорта белков, синтезируемых в цитоплазме, внутрь митохондрий и последующей сборки ферментных ансамблей внутренней митохондри-альной мембраны из полипептидных субъединиц. Полученные данные существенны для дальнейшего экспериментального анализа молекулярных механизмов интеграции биосинтеза митохондриальных белков в различных компартментах животной клетки и нарушений биогенеза митохондрий в клетках злокачественных новообразований, йспользованный в работе метод выделения комплекса цитохромов Ьс^. из митохондрий печени крысы может быть применен в практике работы лабораторий, исследующих структуру и биогенез митохондриальных ферментных ансамблей. Обнаруженное в работе высокое относительное содержание мРНК субъединиц комплекса Ъс^ в полисомах, ассоциированных с наружной мембраной митохондрий, представляет интерес для разработки рационального метода препаративного выде-.ления этих мРНК, их обратной транскрипции и клонирования кДНК в бактериальных векторах. Структура диссертации:

Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков, 7 таблиц. Работа включает введение, обзор литературы, главы, освещающие методы и результаты исследований, заключение, вывода и список литературы, содержащий 205 источников.

Положения, которые выносятся на защиту:

1. Полипептидные компоненты комплекса цитохромов Ъ^ печени крысы синтезируются на внутрюштохондриальных полисомах и на полисомах цитоплазмы, ассоциированных с наружной мембраной митохондрий и с мембранами шероховатого эндоплазматического ретикулума.

2. Внутримитохоцдриальные полисомы синтезируют апоцитохром Ъ с молекулярным весом 32 кД. Этот полипептид кодируется структурным геном, который картируется на циркулярной молекуле мтДНК крысы между участком инициации репликации и ближайшим к нему участком узнавания для рестрикционной эндонуклеазы

ВатН1.

3. Синтез полипептидов комплекса Ьст на полисомах, ассоциированных с наружной мембраной митохондрий, сопряжен с их ко-трансляционным транспортом внутрь митохондрий. Компоненты комплекса Ъс1, синтезируемые на полисомах эндоплазматичес-кого ретикулума, высвобождаются в цитозол и посттрансляцион-но поступают в митохондрии.

4. Полипептиды комплекса Ьс1 синтезируются в форме высокомолекулярных предшественников, которые претерпевают внутри митохондрий протеолитическое созревание.

Апробация диссертации:

Апробация диссертации состоялась на научной конференции Лаборатории биохимической генетики НЙЙЭМ АМН СССР 28 декабря 1982 г. Результаты работы были доложены на У1 Конференции биохимиков прибалтийских республик, БССР и Ленинграда /Рига, 1981 г./ и на 1У съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им.Н.И.Вавилова /Кишинев, 1982 г./.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРА Глава I. Молекулярная организация и биогенез комплекса цитохромов bCj I.I. Состав и структура комплекса цитохромов Ъс^

Комплекс цитохромов Ъс^. представляет собой интегральный белок внутренней мембраны митохондрий и является необходимым компонентом цепи переноса электронов. Как известно, дыхательная цепь образована четырьмя мультикомпонентными комплексами, которые в совокупности с растворимыми компонентами цепи /убихиноном и цитохромом с/ катализируют совокупность промежуточных стадий транспорта электронов от субстратов / NADH и сукцината/ до молекулярного кислорода. Энергия окисления, освобождаемая при переносе электронов с участием комплексов 1,111 и IУ, аккумулируется в форме мембранного потенциала и может быть использована для синтеза макроэргических связей АТс? /рис. I/. Цитохромные компоненты дыхательной цепи находятся в молярных отношениях b rc-j. :с-гага^, =2:1:2:2:2. Таким образом, каждый моль комплекса bcj содержит два моля цитохрома Ь и I моль цитохрома Ср В то же время в составе дыхательной цепи на каж- ' дый моль комплекса Ъс^. /комплекса III/ приходятся 2 моля цитохрома с и 2 моля цитохромов аа^ /комплекс 1У/. В таблице I суммированы сведения о составе комплексов дыхательной цепи и их стехиометрии.

Комплекс bCj в изолированной форме при электронной микроскопии представлен частицами сферической Формы, имеющими диа-о метр 70-90 А. /70/. На поверхности частиц в некоторых препаратах обнаруживается впадина диаметром 15 X и глубиной 25 в функциональном отношении полипептидные компоненты комплекса Ъс^ могут быть разделены на электронтранспортные компоненты, которые участвуют в окислительно-восстановительных реакциях комплекса, и ионтранспортные компоненты, участвующие в транспорте катионов.

Таблица I

Молярная стехиометрия компонентов цепи переноса электронов в митохондриях и изолированных комплексах дыхательной цепи /по /I/

Компонент Митохондрии Комплексы

I II III 1У

КА1)-н2 -дегидро-геназа 2 2 тт

Сукцинатдегидро-геназа I — I —

Цитохромы аа^ 6 - - - 6

Цитохром Ъ 3 - - 3

Цитохром с£ I - - I

Цитохром с 2 - - -

Медь 6 - - - 6

Негеминовое железо 18 8 8 2

Кофермент <3 20 - - -

Изолированный комплекс Ьс1 представляет собой белок крас ного цвета, характеризующийся гидрофобными свойствами. Белок, восстановленный дитионитом, имеет максимумы поглощения при 562 нм /цитохром Ь /9 553 нм /цитохром си 429 гол. После окисления белка феррицианидом имеет место снижение поглощения в области 560 нм и 533 нм и появление максимума при 415 нм /96/. Специфическим ингибитором окислительно-восстановительных реакций комплекса Ьст является антимицин А. лтг

Сикциноп iy

ЛТ<Р

-О,

Рис. I. Функциональные комплексы дыхательной цепи митохондрий.

Комплекс I: nad-Hp -Ко q -редуктаза /I/ Комплекс ii: сукцинат- Ко q -редуктаза Комплекс iii: Ко Q-h2 -цитохром с-редуктаза Комплекс 1У: цитохром с-оксидаза

- 14

Комплекс Ьсд. представлен, в основном, димерными /или олигомерными/ формами с молекулярным весом 450000-550000 /163, 200/. Молекулярный вес мономера равен 240000-280000, а с учетом содержания липидов - до 300000 /92,95/.

Литературные данные о составе полипептидов комплекса цитохромов Ъс1 суммированы в таблице 2. Из нее видно, что комплекс Ъс1 имеет сложный субъединичный состав и содержит, по данным разных авторов, от 7 до 12 полипептидов, молекулярный вес которых варьирует в широких пределах.

Таблица 2

Состав полипептидов комплекса цитохромов Ъс^. из различных источников /34,73,75,200/ полипептид :мол.вес, кД индекс гидрофобности

I ?? 55-62

2 белок сердцевины 46-53 0,49

3 цитохром ъ 30-34 0,47

4 цитохром 28-31 0,40

5 Ре,5 -белок 25-27

6 9 17-19 0,50

7 ? 14-16

8 ? 11-13

9 антимицин А- связывающий белок 10

Большинство авторов считает, что комплекс цитохромов Ъс^. образован 6-8 неидентичными субъединицами. Среди них идентифицированы две формы цитохрома Ь, цитохром Ср белок, содержащий серу и негеминовое железо / Fe,S -белок/, белок, связывающий антимицин А, и два вида сердцевинных белков /core proteins /.

Цитохром b - это белок с выраженными гидрофобными свойствами. Он локализован в срединной области мембранного бислоя и, как предполагается, представлен двумя формами с молекулярными весами 17000 и 37000. С дагой стороны, работы Weiss /192/ показывают, что цитохром Ъ является димерным белком, содержащим два гемсвязьтвающих полипептида, с примерно одинаковыми размерами / ~ 30 кД/. По данным спектрофотометрического анализа, дыхательная цепь митохондрий также содержит две функциональные разноввдности цитохрома Ь. Так, сукцинат в присутствии ингибиторов цитохромоксидазы или в анаэробных условиях восстанавливает лишь около 50/э цитохрома Ъ митохондрий, причем максимум поглощения ^ -полосы этой формы локализуется при 561-562 нм. При дополнительной обработке дитионитом восстанавливается весь цитохром Ъ, а о<с -полоса в спектре расщепляется с появлением двух максимумов /565-566 mi и 558 нм/ /96,132,200/, что рассматривается как аргумент в пользу существования двух функционально различающихся форм цитохрома ъ.

Fe,s -белок имеет молекулярный вес 24500, локализуется на цитоплазматической поверхности внутренней митохондриальной мембраны /или вблизи нее/ и пространственно близок с цитохромом Cj. При фракционировании комплекса Ьсх различными способами показано, что этот белок прочно связан с цитохромом Cj и с другим полипептидом комплекса с молекулярным весом 14000 и неиден-тифицированной функцией. Ре,э-белок - компонент комплекса bCj является белком 2pe:2s типа. Он необходим для транспорта электронов от сукцината к цитохрому с /92,187/. В отсутствии антимицина А Fe,s-белок восстанавливает только цитохром Cj, а в условиях антимицинового блока - он восстанавливает оба тди-тохромных кошонента комплекса /ъ и Cj/.

Цитохром Cj - это гидрофильный белок с молекулярным весом 31000. Он расположен на цитоплазматической поверхности внутренней' митохондриальной мембраны /92/. Молекула цитохрома Cj содержит одну ковалентно связанную геминовую группу. В обогащенных препаратах цитохрома Cj обнаруживается также негеминовый полипептид с молекулярным весом 18500, который рассматривается некоторыми авторами как субъединица цитохрома c-j- /164/. По своим спектральным характеристикам цитохром Cj близок к цито-хрому с. В окисленном состоянии он имеет максимумы поглощения при 416, 510 и 560 нм, в восстановленном состоянии- при 418, 523 и 553 нм.

Сердцевинные белки комплекса Ъс-j. исследованы недостаточно. Один из них / core protein I/ имеет молекулярный вес 50000. Этот белок обладает способностью к специфическому связыванию с иодацетамидом, причем в результате связывания подавляется электронтранспортная активность комплекса bcj /74/. Предполагается, что сердцевинный белок I является структурным компонентом комплекса, не несущим определенных каталитических функций, а связывание его с иодацетамидом вызывает вторичные кон-формационные изменения комплекса, ведущие к нарушению транспорта электронов /29/. С другой стороны, тлеются предположения, что этот белок непосредственно участвует в транспорте электронов и что в окислительно-восстановительных реакциях комплекса участвуют его сульфгидрильные группы /74/.

В состав комплекса bcj входит также белок, связывающий антимицин А. Он имеет молекулярный вес I0000-II500 и не содержит простетических групп или негеминового железа.

- 17

Субъединицы комплекса Ъс]. по данным анализа состава аминокислот, характеризуются гидрофобными свойствами, причем наиболее высоким относительным содержанием гидрофобных остатков отличаются субъединицы с молекулярными весами 53000, 17000 и 37000 /200/. В этой же работе было показано, что мономер кош-, лекса Ьс^ содержит по два полипептида с молекулярными весами 53000, 50000, 37000, 28000 и 17000, три полипептида с молекулярным весом 30000 и 5 субъединиц с молекулярным весом 15000.

Взаимная ориентация полипептидов комплекса Ьс^. во внутренней митохондриальной мембране была изучена методом зондирования компонентов комплекса в составе мембран с помощью радиоактивной и флуоресцентной меток или антител /37,46,76,130,145/, а также методом электронной микроскопии мембранных кристаллов /92/. Оказалось, что гидрофобная часть комплекса и Ре,Б -белок расположены внутри липидного бислоя мембраны, а цитохром С|, обладающий амфифильными свойствами - ближе к цитоплазматической поверхности мембраны /рис. 2/. При латеральной диффузии интегральные белки, локализированные на цитоплазматической поверхности мембраны, в частности, цитохром с^, перемещаются вместе с цитохромоксидазой, а белки, расположенные в липидном бислое вблизи матриксной поверхности мембраны, диффундируют независимо от цитохромоксидазы.

1.2. Биогенез компонентов комплекса цитохромов Ъс^.

В биохимических исследованиях, посвященных биогенезу митохондрий и вкладу митохондриальной и цитоплазматической систем в формирование дыхательных ансамблей митохондрий, было получено довольно много данных о природе белков, синтезируемых митохондриями /см. обзоры /2,17,169,171,189/. Прежде всего, в опытах с использованием хлорамфеникола как специфического ингибимез/емемБранное проетранст ¿о нутреннм потри*с

30 А

50 А

ГО А

Рис. 2. Топография комплекса цитохромов bCj комплекса III/ во внутренней мембране митохондрий /92/.

Цифрами обозначены молекулярные массы полипептидов. тора митохондриальной трансляции и циклогексимида как ингибитора трансляции на 80S -рибосомах цитоплазмы, не влияющего на собственно митохондриальный аппарат синтеза белка, была произведена количественная оценка вклада этих двух систем в синтез митохондриальных белков. Соответствующие результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3

Вклад митохондриального аппарата трансляции в синтез белков митохондрий (по /2/)

Объект исследования

Доля циклогексимид-резис-тентного синтеза оелка митохондрий, %

Дрожжи Нейроспора Клетки НеЬа

Летательная мышца саранчи Кора головного мозга крысы

8-10

15

20

15-20 15

Митохондриальная локализация этого остаточного /резистентного к циклогексимиду/ синтеза белка в интактных клетках была подтверждена опытами, в которых остаточный синтез белка полностью подавлялся хлорамфениколом. Таким образом, вклад митохондрий в синтез собственных белков не очень велик /в среднем, 10?о/. В опытах с субфракционированием митохондрий, выделенных из клеток после инкубации с радиоактивными аминокислотами в присутствии циклогексимида было показано, что белковые компоненты автономной /митохондриальной/ трансляции входят в состав внутренних мембран митохондрий, характеризуются специфическим:электрофоретическим распределением и при ¡шглунопреципитации антителами к очищенным ферментным комплексам внутренней митохондриальной мембраны /цитохромоксидаза, кошлекс bc-j., АТФ-синтетаза/ обнаруживаются в иммунопреципитатах /169/. Таким образом, можно заключить, что полипептидные продукты митохондриальной трансляции являются субъединичными компонентами олигомерных мембранных ферментов. Это подтверждается и опытами, в которых проводили выделение ферментных ансамблей и идентификацию их субъединиц, синтезируемых на фоне блока цитоплазматической трансляции циклогексимидом.

Ингибиторный анализ локализации синтеза компонентов комплекса Ъс-j. у дрожжей показал, что в присутствии циклогексимида радиоактивные аминокислоты включаются в единственный полипептид этого комплекса, который по электрофоретической подвижности в денатурирующих условиях идентифицирован как апоцитохром Ь. Синтез остальных субъединиц комплекса Ъс^. подавляется циклогексимидом и, следовательно, локализован на цитоплазматических полисомах /34,97,118,165/.

В последние годы появились работы, выполненные на клетках высших животных, в частности, на изолированных гепатоцитах крысы, в которых подтверждаются результаты, полученные при изучении топографии синтеза субъединиц комплекса bc-j. у одноклеточных эука-риот /77,113,196/. Результаты ингибиторного анализа и опыта с обработкой гепатоцитов низкими концентрациями дигитонина, селективно угнетающими цит о плаз мат шее к ий синтез белка, показали, в частности, что внутри митохондрий синтезируется единственная субъединица комплекса Ьс^, которая идентифицируется как апоцитохром ъ. /77/.

Таким образом, биохимические эксперименты, выполненные на различных эукариотических организмах, свидетельствуют о том, что апоцитохром Ъ синтезируется внутри митохондрий, тогда как остальные полипептиды субъединицы комплекса Ъс^ образуются вне митохондрий. В связи с этим возникают два вопроса: I/ идентификация и карт pipo ваше гена, кодирующего апоцитохром Ь, в молекулах митохондриальной ДНК и идентификация мРШ этого полипептида в составе РНК - продукта транскрипции мтДНК; 2/ детальное выяснение локализации синтеза остальных субъединиц комплекса Ьсх в цитоплазме и механизмов их транспорта в митохондрии и встраивания во внутреннюю митохондриальную мембрану.

1.3. Молекулярная организация и экспрессия гена цитохрома b

В опытах по идентификации и картирован!®) структурных генов, кодирующих полипептидные продукты, большую роль сыграло обнаружение мутантов дрожжей, обозначаемых mit" и характеризующихся селективной недостаточностью определенных компонентов дыхательных ансамблей или системы энергетического сопряжения /50,66,67, 178/. Эти мутанты наследуются по цитоплазматическому типу, но в отличие от классических petite -мутантов, имеющих множественные фенотипические проявления, фенотип мутации mit" как правило, может быть"локализован" на уровне индивидуальных олигомер-ных ферментов или даже их субъединичных полипептидных цепей. Другая группа мутаций, имеющих большое значение в картировании мтДНК дрожжей - это цитоплазматически наследуемая резистентность к антибиотикам и ингибиторам, действующим на различные сегменты дыхательной цепи и на окислительное фосфорилирование /50,183, 188/.

Можно проследить следующие этапы работ по картированию ми-тохондриальных генов дрожжей: I/ получение больших коллекций mit" -мутантов и мутантов с резистентностью к антибиотикам /66,

67,178,183,50/; 2/ генетическое картирование с составлением групп комплементации и определением локализации локуса на циркулярной карте мтДНК /44,67,69,183,188,178/; 3/ биохимический анализ мутантов mit" с характеристикой отсутствующих или аномальных полипептидных продуктов /112,81/; 4/ установление локализации мутантного локуса в идентифицированных рестрикционных фрагментах мтДНК /178,147,141/; 5/ идентификация РНК - транс-криптов индивидуального локуса /138,82,191/; 6/ определение первичной структуры гена и коллинеарности ее по отношению к аминокислотной последовательности полипептидного продукта /170,185, 148,131,124,59/.

Для идентификации и картирования структурного гена апоци-тохрома ъ в мтДНК дрожжей был использован ряд мутантов группы mit"", характеризующихся I/ резистентностью к специфическим ингибиторам комплекса bcj - в частности, к антимицину А, муциди-ну, диурону и фуникулозину /50,67,178,183,188/ или'2/ селективным отсутствием функционально активного комплекса bcj и цитохрома Ь, обнаруживаемого спектроскопическими методами /50,188/. Все эти мутанты, по данным скрещиваний типа mit"x mit" или mlt'xf', картировались в области мтДНК, соответствующей ~ 7080 единиц генетической карты и ограниченной локусами резистентности к олигомицину / oli I и oli 2/. Протяженность этой зоны, обозначенной как локус сов или box, варьировала у разных штаммов дрожжей от 3,1 до 6 тысяч нуклеотидных пар /45/. Эта вариабельность в значительной степени связана с наличием у некоторых штаммов /в частности, у S.cerevisiae KL 14-4Л / протяженной вставки длиной около 3000 пар нуклеотидов /так называемая вставка III/, которая отсутствует у других штаммов /например, D273 -108/ /148/.

При генетическом анализе мутантов с резистентностью к ингибиторам комплекса bcj было обнаружено, что эти мутации распределяются неравномерно по длине области cob/box, а группируются в виде дискретных групп сцепления, рекомбинирующих друг с другом с высокой частотой /порядка нескольких процентов/. Возможность спонтанной реверсии этих мутантов к дикому типу согласуется с представлением, что в их основе лежат единичные аминокислотные замены в апоцитохроме Ъ /67,81,112,178,179,183/.

Вторая группа мутантов, картирующихся в области cob/box, характеризуется отсутствием функционально активного цитохрома Ъ и неспособностью митохондрий к синтезу апоцитохрома Ь, определяемого электрофоретически как полипептид с молекулярной массой 30000. По данным лаборатории Slonimski эти мутанты также неравномерно картируются по длине области box, а могут быть разделены на несколько групп сцепления, ведущих себя как независимые локусы в рекомбинационных тестах /63,177,178/. Они были обозначены как'локусы box 1-7 /рис. 3/. Таким образом, мутации со сходным фенотипом, в основе которого лежат изменения структуры и нарушения синтеза единственного полипептидного продукта с молекулярной массой 30000, картируются по длине протяженной зоны /6000-10000 пар нуклеотидов/ мтДНК. Размеры этой зоны примерно в 7 раз превышают минимальную длину структурного гена, определяющего полипептид с такой молекулярной массой. Такого рода несоответствие между физической протяженностью кодирующего участка мтДНК и размерами полипептидного генного продукта предположительно может быть объяснено двумя альтернативными моделями: I/ множественностью генных продуктов, определяемых областью box или 2/ разорванной структурной организацией гена, кодирующего единственный полипептид. Первая модель, по всей вероятно

ЬохЗ 1 [¿о* 401

У у У \ ч / и ' ч ч У / / \ '4 V / \ шшм

А/ 82 3 ьч

Iох 8 ох9

М 86 оу£

7300пар основании

Рис. 3. Схема области соЬ/Ъох мтДНК дрожжей /63/.

Затушеванные зоны - экзоны /В1 - Вб/, косая штриховка - интроны, транслируемые в фазе с предшествующими экзонами; точки - нетранслируемые участки интронов.

Интроны обозначены буквой 1 (11-15).

- 25 сти, не согласуется с данными детального биохимического анализа мутантов с недостаточностью апоцитохрома Ь, т.к. у этих мутантов ни в одном случае не наблюдалось "сосуществования" аномальных полипептидов - фрагментов апоцитохрома ь /см.ниже/ с нормальным продуктом /30000 дальтон/. Второе предположение может считаться аргументированным большим количеством данных, касающихся тонкого генетического анализа структуры области box, его транскрипционного картирования и изучения элементов первичной структуры мутантных полипептидов, возникающих при дефектах этой области /26,35,54,78,82,84,148,177/. Так, идентифицированы не-сцепленные локусы box 4/5, I и 6, мутации которых выражаются в дефиците апоцитохрома Ъ ив появлении электрофоретически аномальных продуктов митохондриальной трансляции с молекулярной массой меньше 30000.

В работе лаборатории G.Schatz /81/ получены сходные данные о том, что вся область cob/box может быть разделена на пять районов, из которых только три /районы А,С и Е/ определяют структуру апоцитохрома ъ. По данным фингерпринтного анализа аномальных полипептидов, они представляют собой фрагменты апоцитохрома ъ дикого типа /81/. При этом длина аномальных полипептидов коррелирует с положением соответствующей мутации на генетической карте области box.

Так, при мутациях в кластере А молекулярная масса синтезируемого фрагмента составляет I3000-I5000, при мутациях в зоне С - 15000-20000 и при мутациях в зоне Е - 22000-30500. По всей вероятности, эти мутации могут быть идентифицированы как нонсенс-мутации в различных участках кодирующей последовательности мтДНК или как небольшие делеции со сдвигом фазы считывания и ранней терминацией.

- 26

Кроме того, у некоторых мутантов синтезируются аномальные полипептиды с более высоким молекулярным весом, чем таковой апоцитохрома ъ дикого типа. Такого рода аномалии могут объясняться, по-видимому, мутациями терминаторных кодонов или нарушениями процессинга с сохранением в мРНК последовательностей, транскрибированных с интронов /см. ниже/.

Все эти результаты согласуются с моделью разорванного гена, определяющего структуру апоцитохрома ъ дрожжевых митохондрий. В пределах этого гена, имеется 3-6 кодирующих участков, которые разделены некодирующими вставками /интронами/. Один из этих интронов идентичен вставке III, которая имеется не у всех штаммов дрогшей, и характеризуется протяженностью до 3000 пар нук-леотидов. Интересно отметить, что в участках зоны соЪ/Ъоэс,которые по всей вероятности не содержат нуклеотидных последовательностей, кодирующих апоцитохром ь, картируется ряд мутаций, характеризующихся плейотропными фенотипическими аномалиями /25, 54,63,84,170,190/. В частности, мутанты по локусам Ъох-2,3 и 7, наряду с отсутствием функционально активного цитохрома ъ и полипептида апоцитохрома ъ дикого типа /м.в. 30000/, характеризуются гетерогенными наборами аномальных полипептидов, содержащих гомологичные фрагменты с апоцитохромом Ъ дикого типа /81,179/. Кроме того, для этих мутантов характерно отсутствие функционально активной цитохромоксидазы и недостаточность синтеза субъединицы I этого ансамбля, выраженная в различной степени. Синтез субъединицы I цитохромоксидазы и апоцитохрома ъ у некоторых мутантов по этим локусам характеризуется аномально высокой чувствительностью к катаболитной репрессии.

Таким образом, вставочные сегменты разорванного гена апоцитохрома Ъ, не кодирующие его аминокислотной последовательности, не являются инертными в функциональном отношении, а оказывают какое-то воздействие на экспрессию генов апоцитохрома Ъ и субъединиц цитохромоксидазы. Область cob/box на генетической карте дрожжевой мтДНК локализована на значительном расстоянии от локусов, кодирующих субъединицы цитохромоксидазы, в частности, от локуса oxi-З, определяющего структуру субъединицы I. Поэтому интроны гена апоцитохрома b не могут быть кодирующими сегментами /экзонами/ гена субъединицы I. Скорее всего, эти интроны несут какие-то регуляторные функции, существенные для экспрессии этих генов и для координации синтеза компонентов дыхательной цепи. Молекулярные механизмы, ответственные за реализацию такого рода регуляторной функции и за ее нарушения при мутациях вставочных зон области box, не представляются ясными. Предполагалось, что транскрипты вставочных последовательностей могут каким-то образом контролировать процессинг предшественников мРНК, транскрибированных с локуса oxi-3 /44/.

Наиболее интересное и в то же время экспериментально обоснованное предположение о функции интронов гена цитохрома ъ у дрожжей и о механизмах действия интронных мутаций было выдвинуто в работах лаборатории Slonimski /54,94/. Эти авторы предположили, что нуклеотидньте последовательности интронов гена цитохрома Ъ, не имеющие отношения к кодированию первичной структуры данного белка, в то же время определяют аминокислотную последовательность гипотетического белка-фермента, обеспечивающего корректное созревание мРНК цитохрома ъ и некоторых других мРНК митохондрий. Этот гипотетический белок был обозначен как РНК-мату-раза /94,177/. Правомерность этой гипотезы подтверждается следующими фактами: I/ при интронных мутациях нарушается процессинг транскриптов области cob/box и образование зрелой мРНК апоцитохрома b /35,53,82,170,190/; 2/ экзоны В2,ВЗ и В4 и 5»-концевые зоны соответствующих интронов представляют собой единую фазу считывания, вплоть до терминаторов, расположенных в середине интронов /см. рис.3/ /115,116,148,193/; 3/ определение первичной структуры интрона при плейотропных интронных мутациях выявило точковые замены с превращением смыслового кодона в терминатор /115,116,170/; 4/ у таких мутантов в составе продуктов митохондриальной трансляции обнаруживается аномальный полипептид /по-видимому, РНК-матураза/, который в митохондриях клеток дикого типа присутствует в следовых количествах и не выявляется в форме дискретного электрофоретического компонента /177,193, 26,36,45,53/.

Модель дискретной структурной организации митохондриального гена, кодирующего апоцитохром b дрожжей, подтверждена и детальным гибридизационным изучением транскриптов области cob/box /35,54,82,170,190,191/.

Первоначально было показано, что преобладающим транскрип-том этой области является I8S РНК /191/. По всей вероятности, I8S РНК - преобладающий транскрипт области box, может быть идентифицирована как зрелая транслируемая мРНК апоцитохрома Ь. По крайней мере, в опытах с фракционированием РНК дрожжевых митохондрий седиментацией в сахарозном градиенте и трансляцией полученных фракций в бесклеточной системе РНК с коэффициентом седиментации I8S была единственным компонентом РНК, способным к программированию синтеза полипептида с антигенными детерминантами апоцитохрома b /44,191/. Анализ гибридизуемости I8S РНК ■ с ресфрикционными фрагментами мтДНК дрожжей, соответствующими различным участкам области box, показал, что 18 s РНК комплементарна протяженному сегменту мтДНК, размеры которого превышают длину участка ДНК, который мог бы транскрибироваться непрерывно в I8S РНК. Таким образом, эти результаты согласуются с дискретной локализацией кодирующих последовательностей гена апоцитохрома Ъ и показывают, что I8S мРНК должна формироваться путем сплайсинга кодирующих участков пре-мРНК, сопряженного с экс-цизионным удалением ее участков, транскрибированных с интронов /82,191/. Разорванная структура гена апоцитохрома Ъ доказана также и опытами по электронномикроскопической визуализации гибридов 18 s РНК с рестрикционными фрагментами ДНК, представляющими собой отдельные участки области box. Оказалось, что I8S РНК гибридизуется с этими рестриктами не по всей длине, а образует гетеродуплексы, в которых зоны однонитевой ДНК чередуются с гибридными участками, соответствующими, по-видимому, экзонам. Число таких гибридных участков было не менее 5, a Pix длина, измеренная на электронных микрофотографиях, составляла 800, 600, 400 пар нуклеотидов, а также 3 коротких гибридных участка длиной около 100 пар нуклеотидов для каждого. При сравнении гибридов

I8S РНК с мтДНК S.cerevisiae Kb I4-4A /содержит вставку III/ ê и с мтДНК S^carlsbcrgensis ÏTCYC-74 /не содержит этой вставки/ вставка III в действительности состоит из двух интронов /1900 и 1400 пар нуклеотидов/, разделенных коротким кодирующим сегментом /100 пар нуклеотидов/. Кроме того, в мтДНК обоих штатов найдены интроны, разрывающие ген апоцитохрома ъ и имеющие протяженность около 1300 и 600 пар нуклеотидов /191/. При фракционировании митохондриальной РНК высокоразрешающим гель-электрофорезом и последующей гибридизации с радиоактивной ДНК - зондом на отдельные участки области box выявлена множественность транс-криптов этой области, которая, по всей вероятности, отражает многоступенчатый характер процессинга пре-мРНК, включающего стадии сплайсинга /44,82,191/. Так, наряду с преобладающей I8s РНК-транскриптом области box обнаружена 20 S РНК, содержащая, наряду с последовательностями I8S РНК, избыточные последовательности, транскрибированные с интрона длиной 600 пар нуклеоти-дов /см. выше/. Кроме того, идентифицированы и более протяженные транскрипты области box /23S и 27S /, представляющие собой, по-видимому, более ранние интермедиаты процессинга первичного транскрипта, а также относительно низкомолекулярная IOS РНК. Предполагается, что IOS РНК, которая содержится в митохондриях только тех штаммов дрожжей, у которых в мтДНК имеется вставка III, является транскриптом какого-то участка этой вставочной последовательности, высвобождаемым в виде дискретного компонента при сплайсинге и играющим, возможно, регуляторную роль в экспрессии генов апоцитохрома Ъ и субъединицы I цитохромоксидазы /191/.

В связи с успехами в определении нуклеотидных последовательностей мтДНК животных клеток, в частности, с полной расшифровкой последовательностей мтДНК мыши /38/ и человека /27/ появилась возможность картирования структурных генов, кодирующих полипептидные продукты, в геноме митохондрии млекопитающих. Схема такого картирования включает определение открытых рамок считывания, последовательностей кодонов и первичных структур кодируемых полипептидов /с учетом особенностей структуры кодонов в мтДНК/. Оказалось, что мтДНК высших животных кодирует в принципе те же полипептиды, что и дрожжевая мтДНК. Структурная организация митохондриального генома млекопитающих характеризуется компактным взаиморасположением кодирующих локусов, отсутствием межгенных интервалов /некодирующих спейсеров/ и внутригенных вставочных последовательностей /т.е. интронов/. Оказалось также, что нуклеотидная последовательность, коллинеарная первичной структуре апоцитохрома Ь локализуется вблизи участка инициации репликации /области Б-петли/. Структурный ген апоцитохрома Ь фланкирован двумя генами тРНК для глутаминовой кислоты и треонина /27,38,150,151/. При этом позиции гена апоцитохрома Ъ и двух генов тРНК на картах мтДНК мыши и человека оказались идентичными.

- 32

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Денежкина, Валентина Васильевна, Ленинград

1. Гайцхоки B.C. Структурная организация биологическогоокисления и сопряженных процессов. В кн.: "Механизмы интеграции клеточного обмена", Л., Наука, 1967, 103-156.

2. Гайцхоки B.C. Механизмы ядерно-митохондриальной интеграции в клетке. Докт.дисс., Л., ГОШМ, 1972.

3. Гайцхоки B.C. Информационная РНК клеток животных, М.,Медицина", 1980.

4. Гайцхоки B.C., Киселев О.И. Митохондриальная системабиосинтеза белка. Усп.биол.хим. 1977, 18, 71-91.

5. Гайцхоки B.C., Киселев О.И., Климов Н.А., Монахов Н.К.,Муха Г.В., Шварцман А.Л., Нейфах С.А. Интеграция синтеза митохондриальных белков в системе полирибосом цитоплазмы и митохондрий. Докл. АН СССР, 1974, 216, II7I-II73.

6. Гаузе Г.Г. Митохондриальная ДНК, М., Наука, 1977.

7. Киселев О.И. Белоксинтезирующие структуры митохондрий итопография биосинтеза митохондриальных белков. Автореф. докт.дисс. Л., НИЙЭМ АМН СССР, 1979.

8. Нейфах С.А. Генетические функции митохондрий. ВестникАМН СССР 1973, I, 8-18.

9. Нейфах С.А. Механизмы клеточной интеграции в процессебиогенеза митохондрий. В кн.: "Генетические функции органоидов цитоплазмы". Л., Наука, 1974, 58-69.

10. Нейфах С.А. Роль митохондрий в клеточной наследственности.В кн.: "Молекулярная генетика митохондрий", Л., Наука, 1977, 8-18.

11. Нейфах С.А., Пучкова Л.В. Подавление синтеза белка в интактных клетках карциномы Кребс-2 под действием фруктозо-1,6-дифосфата и снятие этого этфекта при воздействии цАМ~. В кн.: "Молекулярная генетика митохондрий", Л., Наука, 1977, 168-174.

12. Нейфах С.А., Пучкова Л.В. О регулирующем влиянии фруктозо-1,6-дифосфата и циклического аденозинмонофосфата на синтез белка и РНК изолированными митохондриями. Мол.биол. 1975, 9, 3, 341-350.

13. Озернюк Н.Д. Рост и воспроизведение митохондрий.М., Наука, 1978.- 140 <

14. Харбоу Н., йнгильд А. Выделение igQ и igA.^ В кн.:Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу". М., Мир, 1977, 200-208.

15. Цымбаленко Н.В., Бабич С.Г., Денепкина В.В. Экспрессиямитохондриальных генов животных в клетках бактерий. В кн.: 1У съезд ВОГкС, Кишинев, 1981, т.1, 260.

16. Шугалий А.В. Организация митохондриального генома. В кн.:Гены эукариот /уникальные гены/. Итоги науки и техники. Серия: Молекулярная биология, М., ВИНИТИ, 1982, т.19, 235-294.

17. Adelman M.R., Blobel G., Sabatini D«D. An improved cellfaction procedure for the preparation of rat liver membrane-bound ribosomes. J.Cell Biol. 1973» 56, 2, 191-205.

18. Ades I.Z. Transport of newly synthesized proteins into mitochondria a rewiew. Mol.Cell.Biochem. 1982, 43, 2, 113-127.v 23. Ades I.Z., Butow R.A. The transport of proteins into yeast mitochondria. Kinetics and pools. J.Biol. Chem. 1980,225, 9925-9935.

19. Ades I.Z. , Butow R.A. The products of mitochondria-boundcytoplasmic polysomes in yeast. J.Biol.Chem., 1980, 255, 20, 9918-9924.

20. Augen J., Power S., Palmer G. Core protein I as an artifact in complex III. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1979, 86, 2, 271-278.

21. Autor A.P. Biosynthesis of mitochondrial manganese syperoxide dismutase in Saccharomyces cerevisiae. Precursor form of mitochondrial superoxide dismutase made in the cytoplasm. J.Biol.Chem. 1982, 257, 5, 2713-2718.

22. Aziz I.E., Chien S.-M. , Patel H., Freeman К. A putativeprecursor of rat liver malate dehydrogenase. PEBS Letters 1981, 133, I, 127-129.

23. Barrell B.G., Bankier А.Т., Drouin J.A. A different genetic code in human mitochondria. Nature 1979, 282, 5735, 189-19 4.- 142

24. Bechmann H., Haid A., Schweyen R.Y. , Mathews s. , Kaudewitz P.Expression of the "split gene" cob in yeast mtDWA. Translation of intervening sequences in mutant strains J.Biol.Chem. 1981, 256, 7, 3525-3531.

25. Bell R.L., Sweetland J., Ludwig B., Capaldi R.A. Labelingof complex III with (s-35) diazobenzenesulfonate. Orientation of this electron transfer segment in the mitochondrial inner membrane. Eroc.Natl.Acad.Sei. USA 1979, 76, 2, 741-744.

26. Bibb M.J. , van Et ten R.A., Wright K. , WalbergM., Clayton D.Sequence and gene organization of mouse mitochondrial DNA. Cell 1981, 26, 167-180.

27. Blobel G., Determinants in protein topology. v Coll.Ges.Biol.Chem. 1979, 30, 102-108.- 143

28. Blobel G. Intracellular protein topogenesis. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1980, 77, 3, 1496-1500.

29. Blobel G., Dobberstein B. Transfer of proteins across membranes. I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma. J.Cell Biol. 1975, 57, 835-851.

30. Blobel G., Dobberstein B. Transfer of proteins across membranes. II. Reconstitution of functional rough microsomes from heterologous components. J.Cell Biol. 1975, 57, 852-862.

31. Boniat S.G., Berlani R. , Coruzzi G., li M., Macino G. ,Nobrega p.G., Nobrega M.P., Thaienfeld B.E., Tzagoloff A. Codon recognition rules in yeast mitochondria. Eroc.Natl.Acad.Sci. USA 1980, 77, 6, 3167-3170.

32. Broome S., Gilbert w. Immunological screening methods todetect specific translation products. Broc.Natl. Acad.Sei. USA 1978, 75, 6, 2746-2749.

33. Butow R.A., Strausberg R.L. Biochemical genetics of mitochondrial biogenesis. Trends Biochem.Sci. 1979, 4, 5j 110-113.

34. Chance B., Williams G.R. Respiratory enzymes in oxidativephosphorylation. II. Difference spectra. J.Biol. Chem. 1955, 217, I, 395-407.

35. Chua ÏT.—H., Schmidt G.W. Transport of proteins intomitochondria and chloroplasts. J.Cell Biol. 1979, 81, 3, 461-483.

36. Churdi G.M., Gilbert W. Yeast mitochondrial intron products required introns for RNA splicing. In: Mobilization and Reassembly of Genetic Information. Proc. Miami Winter-Symp., ÎT.-Y. Acad. Er ess 1980,379-396.

37. Conboy J.G. , Kalousek P., Rosenberg I.E. In vitrosynthesis of a putative precursor of mitochondrial ornithine transcarbaniylase. Et?oc.Natl.Acad.Sci. USA 1979, 76, II, 5724-5727.0i.

38. Conboy J.G,, Rosenberg L*E. Post translation uptake andprocessing of in vitro synthesized ornithine transcarbamylase precursor by isolated rat liver mitochondria. Proc.Nat 1.Acad.Sci. USA 1981, 78, 5, 3073-3077.

39. Coruzzi G., Tzagoloff A. Assembly of the mitochondrialmembrane system. DNA sequence of subunit 2 of yeast cytochrome oxidase. J.Biol.Chem. 1979, 254, 18, 9324-9330.

40. Cote C., Solioz M., Schatz G. Biogenesis of the cytochrome bCj- complex of yeast mitochondria. A precursor form of the cytoplasmically made subunit V. J.Biol.Chem. 1979, 254, 5, 1437-1440.

41. Diatewa M. , Stahl A.J. Biosynthesis and transport ofyeast• mitochondrial phenylalanyl-tRNA synthetase. Nucl. Acids Res. 1981, 9, 23, 6293-6304.

42. Dujon B. Mitochondrial genetic and functions. In: Molecular Biology of th Yeast Saccharomyces. life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor lab., 1981, 505-635.

43. Eipper B.A., Mains R.E. Analysis of the common precursor to corticotropin and endorphin. J.Biol.Chem. 1978, 253, 16, 5732-5744.

44. Enequist H.G., Hirst T.R., Harayama S., Hardy S.J.S.,Randall L.l. Energy is required for maturation of exported proteins in Escherichia coli. Eur.J.Biochem. 1981, Il6, 2, 227-233.

45. Foury P., Tzagoloff A. Assembly of the mitochondrialmembrane system. XIX. Genetic characterization of mit mutants v/itn deficiencies 111 cytochrome oxidase and coenzyme QHg-cytochrome c reductase. Mol.Gen.Genet. 1976, 149, I, 43-50.

46. Foury P., Tzagoloff A. Assembly of. the mitochondrialmembrane system. Genetic complementation of mit" mutations in mitochondrial DITA of Saccharomyces cerevisiae. J.Biol.Chem. 1978, 253,11, 3792-3797.

47. Pry M., Green D.E. Resolution of complex III of mitochondrial electron transfer chain into 2 component complexes. Proc.Natl.Acad.Sei. USA 1978, 75,11, 53775381.

48. Gasser s.M. » Ohashi A., Daum G., Bohni P., Gibson J.,Reid G.A., Yonetani T., Schatz G. Imported mitochondrial proteins cytochrome b£ and cytochrome c^. are processed in two steps. Proc.Natl.Acad.Sei. USA 1982, 79, I, 267-271.

49. Gellerfors P., Johansson T., Nelson B.D. Isolation ofthe cytochrome bc^. complex from rat-liver mitochondria. Eur.J.Biochem. 1981, 115, 2, 275-278.

50. Gellerfors P., Lunden M., Nelson B.D. Evidence for afunction of core protein in complex III from beef-heart mitochondria. Eur.J.Biochem. 1976,67, 463-468.- 147

51. Gellerfors P., ITelson B.D. Analysis of the peptide composition of purified beef-heart complex III by dode-cylsulfate electrophoresis. Eur .J.Biochem. 1975» 52, 433-443.

52. Gellerfors P., Nelson D. Topology of the peptides infree and membrane-bound complex III (ubiquinon-cytochrome c reductase) as revealed by lactoperoxidase35and p-diazoniumbenzene ^S-sulfonate labeling. Eur. J .B iochem. 1977, 80, 275-282.

53. Gellerfors P., Nelson B.D. Biogenesis of the cytochromebc-j. complex in isolated rat hepatocytes. Biochem. Biophys.Res.Commun. 1981, 99,, I, 170-175.

54. Greenawalt J.W. The isolation of outer and inner mitochondrial membranes. Methods in Enzymol., Acad.Press, IT.Y., 1974, 31, 310-323.

55. Haas R., Heinrich P.C. The localization of an intracellular membrane-bound proteinase from rat liver. Eur.J. Biochem. 1978, 91, I, 171-178.

56. Haid A., Schweyen R.Y. , Beckmann ff., Kaudewitz P., SoliozM., Schatz G. The mitochondrial COB region in yeast codes for apocytochrome b and is mosaic. Eur.J. Biochem. 1979, 94, 3, 451-464.- 148

57. Halbreich A., Pajot P., Poucher M., Grandchamp C., SlonLmslci P. A pathway of cytochrome b mRITA. processing in yeast mitochondria: specific splicing steps and intro-derived circular RNA. Cell 1980, 19, 2,321-329.

58. Hallermayer G., Zimmermann R., Neupert W. Kinetic studieson the transport of cytoplasmically synthesized protein into mitochondria in intact cells of Neurospora crassa. Eur.J.Biochem. 1977, 81, 523-532.

59. Hanson D.K., Miller D.H., Perlman P.S. Regulatory interaction "betv/een mitochondrial genes. II. Detailed characterization of novel mutants mapping within one cluster in the cob2 region. J.Biol.Chem. 1979, 254, 7, 2480-2 490.

60. Harmey M.A. , Halleimayer G., Korb H. , Neupert W. Transport of cytoplasmically synthesized proteins into the mitochondria in a cell free system from Neurospora crassa. Eur.J.Biochem. 1977, 81, 3, 533-544.

61. Harmey M.A., Neher E.H., Zimmermann R., Neupert W. Assembly of mitochondria: synthesis and intracellular transfer of mitochondrial proteins. BioSystems 1980, 12, 3-4, 283-287.

62. Hayashi H., Katunuba N., Chiku K., Endo Y. , Natori Y.Cell-Free synthesis of ornithine aminotransferase of rat liver. J.Biochem. 1981, 90, 4, 1229-1232.

63. Heijne G. Trans-membrane translocation of proteins. A detailed physico-chemical analysis. Eur.J.Biochem. 1980, 103, 431-438.

64. Heinrich P.C., Northemann W., Schmelzer E. Proteolyticprecursor processing in the biosynthesis of mitochondria. Acta biol. et med.germ. 1981, 40, 10-II, I45I-I463.

65. Hovmoller S., KarlssonB., Leonard K. , Li J., \7eiss H.The structure of mitochondrial cytochrome reductase. Ill Soviet-Swedish Syrap. on physico-chemical biology, Tbilisi 1981, 21-2 2.

66. Jagow G., SchSgger H., Riccio P., Klingenberg M., KoVb H.J.bCj complex from beef heart: hydrodynaraic properties of the complex prepared by a refined hydroxyapatite chromatography. Biochim.Biophys.Acta 1977, 462, 549-558.

67. Katan IvI.B. , Poot L., Groot G.S. The cytochrome bc.j. complexof yeast mitochondria. Isolation and partial characte- 150 rization of the cytochrome bc^ complex and cytochrome b. Eur. J. Bio chem. 1976, 65, I, 95-105.

68. KatanM., Van Harten-Loosbroek N., Groot G. The cytochrome bCj complex of yeast mitochondria. Site of translation of the polypeptides in vivo. Eur.J. Biochem. 1976, 70, 409-417.

69. Kasalcova T.B., Babich S.G. , Mel'nikova M.P., TzimbalenkoN.V., Braga E.A., Nosikov V.V. physical and functional mapping of rat-liver mitochondrial DNA. Mol.Cell.Biochem. 1980, 35, I, 39-47.

70. Kazakova T.B., Babich S.G., Golovina G.I., Mel'nikova M.P. ,Tzimbalenko N.V. Replication of plasmid chimera pBR-mtB-A containing rat liver mtDI'IA fragment in polA cells. Plasmid 1982, 8, I, 1-8.

71. Kellems R.E., Butow R.A. Cytoplasmic type 80S ribosomesassociated with yeast mitochondria. III. Changes in the amount of bound ribosomes in response to changes in metabolic state. J.Biol.Chem. 1974, 249, 10, 3304-3310.

72. Keyhani E. Ribosomal granules associated with outer mitochondrial membrane in aerobic yeast cells. J. Cell Biol. 1973, 58, 2, 480-484.

73. Kilaichi G., Hayashi it. Regulation by heme of synthesisand intracellular translocation of S -aminolevuli-nate synthase in the liver. Mol.Cell.Biochem. 1981, 37, I, 27-41.

74. Kita T., Inoue A., Nakanishi S., Numa S. Purificationand characterization of the messenger RNA coding for bovine corticotropin ( ß -lipotropin precursor). Eur.J.Biochem. 1979, 93, 2, 213-220.

75. Koike K., Kobayashi M., Yaganuma K., Taira M., Yoshida E. ,1.ai M. Nucleotide sequence and evolution of the rat mitochondrial cytochrome b gene containing the ochre termination codon. Gene 1982, 20, 2, 177-185.

76. Korb H. , Neupert W. Biogenesis of cytochrome c in Neurospora crassa. Synthesis of apocytochrome c. Transfer to mitochondria and conversion to holocytochrome c. Eur.J.Biochem. 1978, 91., 2, 609-617.

77. Kraus J.P., Conboy J.G., Rosenberg L.E. Pre-ornithinetranscarbamylase. Properties of the cytoplasmic precursor of a mitochondrial matrix enzyme. J.Biol. Chem. 1981, 256, 21, 10739-10742.152

78. Kreibich G., Ulrich B.L., Sabatini D.D. Proteins ofrough microsomal membranes related to ribosome binding. I. Identification of ribophorins I and II, membrane proteins characteristic of rough microsomes. J. Cell Biol. 1978, 77, 2, 468-487.

79. Kuzela s., Wielburski A., Nelson B.D. Translation ofmitochondrial proteins in digitonirutreated rat hepa-tocytes. PEBS Letters 1981, 135, I, 89-92.

80. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during theassembly of bacteriophage T4. Nature 1970, 227, 680-685.

81. Lazowska J., Jacq C., Slonimski P.P. Sequence of intronsand flanking exons in wild-type and box 3 mutants of cytochrome b reveals an interloced splicing protein coded by in intron. Cell 1980, 22, 333-348.- 153

82. Lasowska J., Jacq C., Sloniraski P.P. Splice points of thethird intron in the yeast cytochrome b gene. Cell 1981. 27, I, 12-14.

83. Lin L.-P.H., Clejan L., Beattie D.S. The synthesis ofcytochrome b on mitochondrial ribosomes in baker's yeast. Sur.J.Biochem. 1978, 87, I, 171-179.

84. Lingappa V.P., Lingappa I.p., Blobel G. Chicken ovalbumincontains an internal signal sequence. Nature 1979, 281, 5727, II7-I2I.

85. Lustig A., Levens D., Rabinowitz M. The biogenesis andregulation of yeast mitochondrial RNA-polymerase. J.Biol.Chem. 1982, 257, 10, 5800-5808.

86. McAda P.B., Douglas M.G. A neutral metalloendoproteaseinvolved in the processing of an P^-ATPase subunit precursor in mitochondria. J.Biol.Chem. 1982, 257, 6, 3177-3182.

87. Maccecchini Il.-L., Rudin Y., Blobel G., Schatz G. Importof proteins into mitochondria: precursor forms of the extramitochondrially made F^-ATPase subunits in yeast. Proc.Natl.Acad.Sei. USA 1979, 76, I, 343-347.

88. Macino G., Coruzzi G., Nobrega P.G., Li M., Tzagoloff A.Use of the UGA terminator as a tryptophan codon in- 154 yeast mitochondria. Proc.ITatl.Acad.Sci» USA 1979, 76, 8, 3784-3785.

89. Macino G., Tzagoloff A. Assembly of the mitochondrialmembrane system. The DITA sequence of a mitochondrial ATPase gene in Saccharomyces cerevisiae. J.Biol. Chem. 1979, 254, II, 4617-4623.

90. Marra E., Doonan S., Saccone C., Quagliariello E. Selective permeability of rat liver mitochondria to purified aspartate aminotransferases in vitro. Biochem.J. 1977, 164, 3, 685-691.

91. Marra E., Passarella S., Doonan S., Quagliariello E.,Saccone C. Protease resistance of aspartate aminotransferase imported in mitochondria. FEBS Letters 1980, 122, I, 33-36.

92. Marx J. Newly made proteins zip through the cell.Science 1980, 207, 4427, I64-I67.

93. Mathews M.B. Eukaryotic messenger RNA. Essays in Biochemistry 1973, 9, 59-102.

94. Mendel-Hartvig I., Nelson D. Labelling of complex IIIpeptides in beef heart mitochondria and submitochondrial particles by diazonium benzene 35 c. sulfonate. FEBS Letters 1978, 27, I, 36-40.- 155

95. Mensgens L.A.K., Grivell L.A., Borst P., Bos I.L.Nucleotide sequence of the mitochondrial structural gene for subunit 9 of yeast ATPase complex. Proc.Nat.Acad.Sei. USA 1979, 76, 4, I669-I667.

96. Michel B., Purnelle B., Faber A., Goffeau A. Identification of three distinct spectral species of yeast mitochondrial cytochrome b using a combination of respiratory inhibitors. Biochim.Biophys.Acta 1981, 638, I, II6-II9.

97. Michel R., Wächter E. , Sebald W. Synthesis of a larger precursor for the proteolipid subunit of the mitochondrial ATPase complex of Neurospora crassa in a cellfree wheat germ system. PEBS Letters 1979, 101, 2, 373-376.

98. Mihara K., Blobel G. The four cytoplasmically made subunits of yeast mitochondrial cytochrome c oxidase are synthesized individually and not as a polyprot ein. Proc.Natl.Acad.Sei. USA 1980, 77, 7, 4l60-4l64.

99. Miralies Y. , Pelipo V. , Ilernandez-Jago J. , Grisolia S.Cell-free synthesis and processing of a large precursor of glutamate dehydrogenase of rat liver. Biochem. Biophys.Res.Communs 1982, 107, 3, 1028-1036.- 156

100. Montoya J., Ojala D., Attardi G. Distinctive features ofthe 5'-terminal sequences of the human mitochondrial mRNAs. Nature 1981, 290, 465-470.

101. Moorman A.P.M., Van Ommen G., Grivell L.A. Transcriptionin yeast mitochondria: isolation and physical mapping of messenger RNAs for subunits of cytochrome c oxidase and ATBase. Mol.Gen.Genet. 1978, 160, I, 13-24.

102. MoriM., Miura S. , Tatibana M., Cohen P.P. Cell-freesynthesis and processing of a putative precursor for mitochondrial carbamyl phosphate synthetase I of rat liver. Proc.Nat.Acad.Sci. USA 1979, 76, 10, 5071-5075.

103. MoriM., Miura S., Tatibana M., Cohen P.P. Characterization of a protease apparently involved in processing of pre-ornithine transcarbamylase of rat liver. Proc.Nat.Acad.Sci. USA 1980, 77, 12, 7044-7048.

104. Morimoto R., Lewin A., Rabinowitz M. Physical mappingand characterization of the mitochondrial DNA and RNA sequences from mit mutants defective in cytochrome oxidase peptide I (0X1 3). Mol.Gen.Genet. 1979, 170, I, 1-9.

105. Mostov K.E., DePoor P., Fleischer S., Blobel G.Co-translational membrane integration of calcium pump protein without signal sequence cleavage. Nature 1981, 292, 5818, 87-89.

106. Murphy E., Kopchick R.B., Watson K.F. , Arlinghaus R.B.Cell-free synthesis of a precursor polyprotein containing both gag and pol gene products by Rauscher- 157 murine leukemia virus 35S RNA. Cell 1978, 13, 2, 356-369.

107. Neifakh S.A. Mitochondrial genes and cell heredity,Mol.Cell.Bioehem. 1977, 14, 1-3, 5-10.

108. Nelson B.D., Mendel-Hartvig H. Immunological studies onbeef-heart ubiquinonecytochrome c reductase (complex III). Eur.J.Biochem. 1977, 80, I, 267-274.

109. Nelson N., Schatz G. Energy-dependent processing of cytoplasmically made precursors to mitochondrial proteins. Ital.J.Biochem. 1979, 28, 5, 414-415.

110. Nobrega F.G., Tzagoloff A. Assembly of the mitochondrialmembrane system, complete restriction map of the cytochrome b region of mitochondrial DNA in Saccha-romyces cerevisiae D273-I0B. J.Biol.Chem. 1980, 255, 20, 9821-9827.

111. Nobrega F.G., Tzagoloff A. Assembly of the mitochondrialmembrane system. DNA sequence and organization of the cytochrome b gene in saccharomyces cerevisiae D273-IOB. J.Biol.Chan. 1980, 255, 20, 9828-9837.

112. Northemann W., Schmelzer E., Heinrich P.C. The size anddistribution of cytochrome c oxidase subunit IV mRNA between free and membrane-bound polyribosomes. Eur.J.Biochem. 1981, 119, I, 203-208.

113. Ojala D., Merkel C., Gelfand R., Attardi G. The tRNAgenes punctuate the reading of genetic information in human mitochondrial DNA. Cell 1980, 22, 2, Part 2, 393-403.- 158

114. Ojala D., Montoya J., Attardi G. tRNA punctuation modelof RNA processing in human mitochondria. Nature 1981, 290, 470-474.

115. Ouchterloni 0. Antigen-antibody reactions in gels.Acta pathoi. med. Scand. 19 49, 26, I, 4-12.

116. Palmiter R.D., Gagnon J., V/alsch K.A. Ovalbumin: a secreted protein without a transient hydrophobic leader sequence. Proc.Nat.Acad.Sci. USA 1978, 75,1, 94-98.

117. Perry R., La Torre J., Kelley D., Greenberg J.R. On the lability of poly(A) sequences during extraction of messenger RNA from polyribosomes. Biochim.Biophys. Acta 1972, 262, 2, 220-226.

118. Pierre J.W., Ernster L. Enzyme topology of intracellularmembranes. Ann.Rev.Biochem, 1977, 46, 201-262.

119. PoytonR.O., McKemmie E. A polyprotein precursor to allfour cytoplasmically translated subunits of cytochrome c oxidase from Saccharomyces cerevisiae. J.Biol. Chem. 1979, 254, 14, 6763-6771.- 159

120. Poyton R.O., McKemmie E. Post-translational processingand transport of the polyprotein precursor to sub-units IV to VTI of yeast cytochrome c oxidase. J.Biol.chem. 1979, 254, 14, 6772-6780.

121. Raymond Y., Shore G.C. Processing of the precursor forthe mitochondrial enzyme, carbamyl phosphate synthetase. Inhibition by p-aminobenzamidine leads to very rapid degradation (clearing) of the precursor. J.Biol.Chem. 1981, 256, 5, 2087-2090.

122. Reisner A.H., Askey C., Aylmer C. Determination of sedimentation coefficients and polyribosomal size in nonisokinetic density gradient centrifugation. Anal.Biochem. 1972, 46, 2, 365-374.- 160

123. Ross E., Schatz G. Cytochrome c-j. of baker's yeast.

124. Isolation and properties. J.Biol.Chem. 1976, 251, 7, I99I-I996.

125. Sannia G., Abresela p., Colombo M., Giardina p., Marino G.1. vitro synthesis of precursor forms of pig heart aspartate aminotransferase isozymes. Biochem. B io phy s. Res. Commun. 1982, 105, 2, 444-449.

126. Schatz G. How mitochondria import proteins from thecytoplasm. FEBS Letters 1979, 103, 2, 203-211.

127. Schatz G., Mason T.L. The biosynthesis of mitochondrialproteins. Ann.Rev.Biochem. 1974, 43, 51-87.

128. Sebald V7. Biogenesis of mitochondrial ATPase. Biochim.Biophys.Acta 1977, 4§3, I, 1-27.

129. Shih D.S., Shih C.T., Kew 0., Pallansch M. , Rueckert R.,Kaesberg P. cell-free synthesis and processing of the proteins of poliovirus. Proc.Nat.Acad.Sci. USA1978, 75, 12, 5807-5811.

130. Shore G.C. Synthesis of intracellular membrane proteinsin vitro. Relation between rough endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane. J. Cell Sci.1979, 38. 137-153.

131. Sonderegger P., Jaussi R., Christen P. Cell-free synthesis of a putative precursor of mitochondrial aspartate aminotransferase with higher molecular weight. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1980,94, 4, 1256-1260.

132. Strasberg P.M., Webster K.A., Patel H.V., Freeman K.B.Binding of mitochondrial malate dehydrogenase to mitoplasts. Can.J.Biochem. 1979, 57, 6, 662-665.

133. Subik J., Takacsova G. Genetic determination of ubiquinone-cytochrome c reductase. Mitochondrial locus muc 3 specifying resistance of Saccharomyces cere-visiae to mucidin. Mol.Gen.Genet. 1978,I6l, 99-108.

134. Tata J.R. The expression of the vitellogenin gene.Review, cell 1976, 9, I, I-14.

135. Thalenfeld B., Tzagoloff A. Assembly of the mitochondrial membrane system. Sequence of the Oxi 2 gene of yeast mitochondrial DNA. J.Biol.Chem. 1980, 255, 13, 617 3-6180.

136. Trumpower B.L., Edwards C.A. Purification of a reconstitutively active iron-sulfur protein (oxidation" factor) from suecinat-cytochrome c reductase complex of bovine heart mitochondria. J.Biol.Chem. 1979, 254, 17, 8697-8706.

137. Trumpawer B.L., Edwards C.A. Identification of oxidationfactor as reconstitutively active form of the iron-sulfur protein of the cytochrome bc-j- segment of the respiratory chain. FEBS Letters 1979, 100, I, 13-18.

138. Tzagoloff A., Foury F., Akai A. Assembly of the mitochondrial membrane system. XVIII. Genetic loci on mitochondrial DNA involved in cytochrome b biosynthesis. Mol.Gen.Genet. 1976, 149, I, 33-42.

139. Tzagoloff A., Macino G., Sebald W. Mitochondrial genesand translational products. Ann.Rev.Biochem. 1979, 48, 419-441.

140. Van Ommen G.J.B. , Boer P.H., Groot G.S.P.» De Haan M.,Roosendaal E., Grivell L.A., Haid A., Schweyen R.J. Mutations affecting RNA spicing and the interaction of gene expression of the yeast mitochondrial loci cob and oxi 3. Cell 1980, 20, I, 173-183.

141. Van Ommen G.J.B., Groot G.S.P., Grivell L.A. Transcription maps of mtDNAs of two strains of Saccharomyces: transcription of strain-specific insertions; complex RNA maturation and splicing. Gell 1979, 18, 2, 511-523.

142. Weiss H. Subunit composition and biogenesis of mitochondrial cytochrome b. Biochim.Biophys.Acta 1976, 456, 3/4, 291-313.

143. Weiss-Brummer B., Rodel G., Schweyen R.J., Kaudewitz P.Expression of the split gene cob in yeast: evidence for a precursor of "maturase" protein translated from intron 4 and preceding exon. Cell 1982, 29,2,527-536.

144. Wickner W. The assembly of proteins into biological membranes: the membrane trigger hypothesis. Ann.Rev. Biochem. 1979, 48, 23-45.

145. William-Angus C., Lane D., Rosenfeld P.J., Kelley T.1.crease in translatable mRNA for mitochondrial pyruvate carboxylase during differentiation of 3T3 pre-adipocytes. Biochem. Biophys.Res. Commun. 1981, 103, 4, I2I6-I222.165

146. Wilson G., Hodges R., Hare J.F. Site of the synthesisof the mitochondrial cytochromes in hepatocyte cultures. J.Biol.Chem. 1981, 256, 10, 5197-5203.

147. Zimmermann R., Neupert W. Transport of proteins intomitochondria, posttranslational transfer of ADP/ATP carrier into mitochondria in vitro. Eur.J.Biochem. 1980, 109, I, 217-229.

148. Zimmermann R., paluch U., Neupert W. Cell-free synthesis of cytochrome c. PEBS Letters 1979, 108, I, 141-146.

149. Zimmermann R., Palich U., Sprinzl M., Neupert 7/. Cellfree synthesis of the mitochondrial ADP/ATP carrier protein of Neurospora crassa. Eur.J.Biochem. 1979, 99, 2, 247-252