Влияние внутрисердечного и периферического воспаления на гемодинамические показатели и вариабельность ритма сердца у крыс

Морозова, Мария Павловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние внутрисердечного и периферического воспаления на гемодинамические показатели и вариабельность ритма сердца у крыс
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние внутрисердечного и периферического воспаления на гемодинамические показатели и вариабельность ритма сердца у крыс"

На правах рукописи

сДфН^

МОРОЗОВА МАРИЯ ПАВЛОВНА

ВЛИЯНИЕ ВНУТРИСЕРДЕЧНОГО И ПЕРИФЕРИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕНИЯ НА ГЕМОДИНАМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ И ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ РИТМА СЕРДЦА У КРЫС

03.03.01 - Физиология

2 б ДПР 2072

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2012

005019712

Работа выполнена на кафедре физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова (зав. кафедрой - профессор В.Б. Кошелев).

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Гаврилова Кандидат биологических наук, доцент кафедры

Светлана Анатольевна физиологии и общей патологии факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ: Лукошкова Доктор биологических наук, ведущий научный

Елена Владимировна сотрудник ФГБУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс (РКНПК) Минздравсоцразвития РФ Погодина Кандидат биологических наук, старший научный

Лариса Сергеевна сотрудник кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Манухина Доктор биологических наук, профессор, зав.

Евгения Борисовна лабораторией регуляторных механизмов адаптации

НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН Тарасова Доктор биологических наук, профессор

Ольга Сергеевна кафедры физиологии человека и животных

биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Российский Национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития Российской Федерации Г V

и 1

Защита диссертации состоится 14 мая 2012 года в 15-30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при биологическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, г.Москва, Ленинские горы, д.1, строение 12, биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 14 апреля 2012 года Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Б.А. Умарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Воспаление является неотъемлемой составляющей развития атеросклеротической бляшки, инфаркта миокарда, ишемической болезни сердца, кардиомиопатий. Реализация иммунных реакций в организме, в том числе воспалительного ответа, находится под контролем вегетативной нервной системы, а разрешение определяется взаимодействием парасимпатического и симпатического ее отделов {Rosas-Ballina М, Тгасеу K.J., 2009; Eskandari F., Webster J.I., Sternberg E.M., 2003). Методом анализа вариабельности ритма сердца (ВРС) можно неинвазивно и быстро оценить симпато-парасимпатическое взаимоотношение в регуляции сердечного ритма (Баевский P.M. и соавт, 1999).

У людей с инфарктом миокарда и стенокардией снижение параметров вариабельности ритма сердца: общей мощности спектра, стандартного отклонения интервала RR (SDNN) ниже 50 мс тесно коррелирует с неблагоприятным прогнозом: наступлением острых сердечно-сосудистых событий или смерти (Carpeggiani et al., 2004; Chen et al., 2008). Существуют данные, позволяющие предполагать связь показателей ВРС и интенсивности воспалительного ответа (.Парнес Е.Я., 2010; Ahmad S. et al, 2009; Chen at al., 2008). У пациентов, с так называемыми цитокин-опосредованными заболеваниями (ревматоидный артрит, сепсис, псориаз), наблюдается снижение активности вагуса, которое выявляется методом оценки ВРС {Парнес Е.Я., 2010; Huston J.M.-Тгасеу K.J., 2010).

В последние годы активно изучают возможность использования анализа ВРС в диагностике различных заболеваний сердечнососудистой системы {Парнес Е.Я., 2010). Выявлена положительная корреляция между увеличением содержания медиаторов воспаления, например, С-реактивного белка и IL-6, и снижением вагусной активности у пациентов с коронарными заболеваниями сердца {Sajadieh А. et al, 2004). Практическая ценность таких работ очевидна: с помощью анализа ВРС становится возможным выявление не только группы пациентов с высоким риском развития сердечных катастроф среди больных ишемической болезнью сердца, ревматоидным артритом, гипертонической болезнью, но и выявление лиц со скрытым течением ИБС, а также для контроля эффективности лечения {Парнес Е.Я., 2010).

Для человека существуют стандартные подходы оценки ВРС -холтеровское мониторирование ЭКГ, детально описаны функциональные пробы и нагрузки, с помощью которых можно оценить состояние сердечно-сосудистой системы, однако аналитические возможности при исследованиях человека сильно ограничены. В экспериментальных моделях на крысах можно изучать воздействие на миокард самого воспаления, не осложненного другими патологическими процессами. К тому же известно, что течение миокардита у грызунов во многом сходно с развитием этого заболевания у человека (НиЬег Б., 1997). Но до сих пор для животных, тем более для мелких грызунов, не разработаны стандарты оценки ВРС, не стандартизированны функциональные нагрузки для анализа влияния воспаления на миокард. Для восполнения этого пробела предпринято настоящее исследование.

Цель: исследовать влияние воспаления в миокарде и в регионе, не затрагивающем сердце, на функциональное состояние гемодинамики и параметры вариабельности ритма сердца в фазу максимальной выраженности воспалительной реакции.

В работе решались следующие задачи:

1. Разработать модель аутоиммунного миокардита (АИМ) у крыс и определить сроки максимального воспалительного ответа в сердце.

2. Подобрать модель с периферическим воспалением, не затрагивающим миокард, и определить срок максимальной воспалительной реакции;

3. Изучить влияние миокардита на гемодинамические параметры работы сердца в покое и на фоне предъявляемых фармакологических тестов;

4. У крыс с периферическим воспалением изучить его влияние на гемодинамические параметры работы сердца в покое и на фоне предъявляемых фармакологических тестов;

5. Оценить вариабельность ритма сердца у бодрствующих крыс с миокардитом и периферическим воспалением в покое и после провокационной пробы с Холодовым воздействием;

6. Исследовать чувствительность метода оценки вариабельности ритма сердца у крыс в моделях с воспалением.

Научная новизна полученных результатов.

Сама постановка вопроса о взаимосвязи изменений гемодинамических показателей на фоне воспалительной реакции различной локализации: непосредственно в сердце и на периферии, в лапе, - и оценка вкладов симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы методами анализа вариабельности ритма сердца в этот период является новой и актуальной. Впервые сопоставлены события, происходящие в сердечно-сосудистой системе и в координирующей ее работу вегетативной нервной системе на фоне определенного состояния иммунитета - в фазу максимального воспалительного ответа. Впервые показано, что у наркотизированных животных с аутоиммунным миокардитом и воспалением на периферии изменены показатели гемодинамики в покое; на стимуляцию а- и р-адреномиметиками наблюдали увеличение ответа сосудистого русла и сердца у крыс с внутрисердечным воспалением, и - только реакцию среднего артериального давления у животных с воспалением в регионе, не затрагивающим сердце.

Отдельной, современной, новой стороной работы является применение оценки вариабельности ритма сердца у крыс, а также анализ чувствительности этого метода для тестирования состояния регуляторных систем на фоне воспаления различной локализации. Впервые исследование параметров вариабельности сердечного ритма показало замедление их нормализации у крыс с воспалительным очагом различной локализации по сравнению с интактными животными после холодовой пробы. В частности, в течение 5 минут после холодовой пробы у крыс с миокардитом по сравнению с интактной нормой наблюдалось снижение вклада парасимпатического и увеличение вклада симпатического отделов вегетативной нервной системы. У животных с периферическим воспалением было значимо увеличено влияние симпатического контура регуляции в тот же период.

Практическая значимость работы.

Заключения и выводы, сделанные соискателем по результатам работы, могут способствовать разработке метода анализа вариабельности сердечного ритма у мелких животных, аналогично Холтеровскому мониторированию ЭКГ у людей; дополнить представления о связи между иммунной и вегетативной нервной системами. Методологические подходы, разработанные М.П.

Морозовой, могут быть полезными при разработке физиологических тест-систем для скрининга фармакологических препаратов.

Апробация диссертации.

Результаты исследования были представлены на Всероссийской (V) конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 100-летию со дня рождения В.Н. Черниговского (Санкт-Петербург, 2007), международной конференции «Biological motility. Achievements and perspectives» (Пущино, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), четвертой всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2008), международной молодежной конференции «Ломоносов-2010» (Москва, 2010), XVI межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2010), VIII всероссийской конференции по патологии клетки (Москва, 2010), международной конференции «Biological motility. From fundamental achievements to nanotechnologies» (Пущино, 2010), VII съезде казахского Физиологического общества с международным участием: «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной - основа здоровья и долголетия», посвященном 100-летию академиков АН КазССР Н.У. Базановой и Ф.М. Мухамедгалиева (Алматы, 2011), пятой всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2012), конференции «Аспирантские и докторантские чтения: Дерзания нового времени - поиск инноваций» Москва, 2012)

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в их числе 3 статьи, из них 2 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 178 страницах текста в компьютерном исполнении. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов,

списка цитированных источников информации. Работа иллюстрирована 47 рисунками. Список литературы включает 141 источник информации, из них 41 - публикации в отечественных журналах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977г. На проведение опытов было получено разрешение комиссии по биоэтике факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова. Исследование проводили на взрослых самцах белых беспородных крыс весом 200-414 г (п = 296).

Структура исследования. Исследование проходило в два этапа: первый включал в себя разработку моделей воспаления в сердце - АИМ - и на периферии - в задней конечности крысы, и определение сроков максимального воспалительного ответа.

Второй этап заключался в оценке функционального состояния сердечно-сосудистой системы на пике воспалительного ответа различной локализации. Исследовали гемодинамические параметры и сократимость миокарда в покое и на фоне фармакологических нагрузок у наркотизированных крыс. Дополнительно методом анализа ВРС оценивали соотношение вкладов парасимпатического и симпатического отделов ВНС на ритм сердца у бодрствующих животных в покое и после холодовой пробы.

Экспериментальные модели. Аутоиммунный миокардит моделировали в двух протоколах. В первом случае внутрисердечное воспаление провоцировали однократной подкожной инъекцией сердечного миозина (400 мкг/кг) в смеси с полным адъювантом Фрейнда (группа М+ПАФ). На 2, 3, 4, 7, 14, 21, 28 сутки после иммунизации производили аутопсию миокарда и крови. Микроскопические исследования миокарда были выполнены совместно с Княженцевой А.К., Земцовой Л.В., Погодиной Л.С. -сотрудниками кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Для световой микроскопии фрагменты ткани миокарда фиксировали в течение 12 часов в 10% нейтральном формалине, обезвоживали по стандартной методике и заключали в парафин. Общую морфологию миокарда оценивали на срезах толщиной 5 мкм, окрашенных

гематоксилином-эозином. Для электронной микроскопии образцы ткани миокарда фиксировали в 4% глутаровом альдегиде на 0.1 М фосфатном буфере, дофиксировали в 1% растворе 0s04, контрастировали 2%-ным уранилацетатом на 70% этаноле, обезвоживали по общей методике и заключали в эпон 812. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца по Рейнолдсу и исследовали на электронном микроскопе JEM 100С (Япония). Морфометрический анализ проводили на полутонких поперечно ориентированных срезах с помощью программы Image Scope (проанализировано не менее 100 клеток для каждого животного).

Определение уровня экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов и iNOS осуществляли в лимфоцитарно-моноцитарной фракции клеток крови и ткани миокарда. Выделение РНК из образцов, ДНКазную обработку, обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной методике (Zhdanov A.V. et al, 2002). Содержание нитритов и нитратов в сыворотке крови крыс определяли по модифицированному методу, предложенному Miranda K.M. и соавт. (2001). В результате проведенных тестов установлены динамика воспалительного ответа и сроки максимального ответа в сердце крыс с АИМ - 14-21 сутки опыта.

Моделирование миокардита по второму протоколу по сходной схеме и заключалось в иммунизации животных сердечным миозином (800 мкг/кг) в смеси с неполным адъювантом Фрейнда и последующим проведении гистологических и биохимических анализов. Однако, в связи с тем, что полноценной картины о развитии воспалительного ответа и формировании максимума мы не получили, подробно останавливаться на результатах опыта по данному протоколу в автореферате не будем.

Воспаление на периферии вызывали однократной в/м инъекцией конканавалина А в дозе 1мг/кг (группа КонА) - лектина, митогена в отношении Т-клеток, активатора тучных клеток - в подпяточную область задней левой лапы. На 1,2, 3, 4, 5, 14 сутки опыта производили забор образцов ткани лапы, сердца и крови. Светооптическое исследование срезов и анализ уровня нитритов и нитратов показали, что в сроки наиболее выраженного воспаления в лапе - 2-3 сутки - у крыс группы КонА гистологические признаки воспаления в сердце не обнаруживались.

Дополнительно исследованы модели периферического воспаления в результате п/к инъекции ПАФ или НАФ. Выявление гистологических признаков воспаления в миокарде животных у животных после иммунизации ПАФ или НАФ заставило отказаться от этих моделей как противоречащих цели исследования.

Исследуемые группы. М+ПАФ - крысы с АИМ (п=20), КонА -крысы с периферическим воспалением в лапе (п=20), ИК -животные без воздействий одного возраста с инъецированными крысами (п=20).

Проведение эксперимента in vivo по оценке функционального состояния сердечно-сосудистой системы.

Опыт проводили на наркотизированных (тиопентал натрия, 75 мг/кг, в/б) с трахеотомией, без искусственной вентиляции легких. В бедренную артерию имплантировали катетер для регистрации системного артериального давления, в бедренную вену - для введения веществ. Давление в левом желудочке сердца регистрировали с помощью миниатюрного датчика давления Millar. Сигнал от датчиков давления оцифровывали с частотой 2 кГц. Для регистрации и расчета параметров среднего артериального давления (АДсред); величин среднего (ЛЖДср), систолического (ЛЖДсист), диастолического давления (ЛЖДдиа), частоты сердечных сокращений (ЧСС), максимальных скоростей увеличения (+dP/dtmax) и уменьшения давления (-dP/dtmax) в левом желудочке использовали программу PowerGraph.

Через 30 минут адаптации животного к условиям эксперимента регистрировали перечисленные параметры в состоянии покоя и в ответ на инфузию в накопительном режиме - по 3 минуты на каждую дозу в течение 15 минут: 1) ацетилхолина в дозах 1, 3, 6, 9, 12 мкг/кг*мин; 2) агониста pi-адренорецепторов добутамина в дозах 1, 2, 3, 4,5, 6 мкг/кг*мин; 3) агониста al-адренорецепторов фенилэфрина в дозах 3, 6, 9, 12, 15 мкг/кг*мин. Временной интервал между введениями составлял 20 минут. Изменения регистрируемых параметров рассчитывали на плато реакции в дельта% от исходного уровня, измеренного непосредственно перед проведением соответствующего фармакологического теста.

Оценка отношения вкладов парасимпатического и симпатического отделов ВНС в регуляцию ритма сердца по ВСР in vivo. За сутки до эксперимента по оценке функционального состояния сердечно-сосудистой системы у крыс регистрировали

ЭКГ в бодрствующем состоянии в покое и после холодовой пробы. Под эфирным наркозом у крыс удаляли шерсть с верхней части спины, накладывали на кожные электроды с помощью пластырного «жилета» и адаптировали к условиям эксперимента в стеклянном кубе с затемненными стенками в течение 1 часа, после чего регистрировали норму ЭКГ во 2-ом отведении в течение 20 минут. Для реализации холодовой пробы (ХП) животных переносили в куб на пакет со снегом (+4°С) на 3 минуты, а затем вновь регистрировали ЭКГ в течение 20 минут в затемненном кубе.

Сигнал с электродов оцифровывали с частотой 2 кГц (РохуеЮгарЬ). Окончательную обработку и обсчет данных выполняли под руководством Лукошковой Е.В. в ее авторской программе. Программа обеспечивала расчет длительности Ш1-интервалов; преждевременные эктопические комплексы и артефакты удаляли. Интервалограммы без артефактов анализировали статистическими методами во временной области; рассчитывали параметры, характеризующие общую ВРС: средний Ю1-интервал мс), стандартное отклонение от среднего

11К.-интервала (Ш1_80, мс), среднюю ЧСС (НК_Аув, уд/мин) и ее стандартное отклонение уд/мин), параметры,

характеризующие вклад парасимпатического отдела ВНС в регуляцию ритма сердца: квадратный корень суммы квадрата разности величин длительности смежных ^-интервалов (ИУ^О, мс), процент последовательных КЫ-интервалов отличающихся от предыдущего более чем на 3, 5, 10 мс (рШЗ, рШ5, рШЮ, соответственно).

Используя быстрое преобразование Фурье, из интервалограмм вычисляли спектральные характеристики: общую мощность спектра (ТР, мс2/Гц), мощности очень низко частотного (УЬБ, мс2/Гц в диапазоне 0-0.2 Гц), низкочастотного (1Л7, мс2/Гц в диапазоне 0.2-0.8 Гц) и высокочастотного (ОТ, мс2/Гц в диапазоне 0.8-2.5 Гц) компонентов, показатель соотношения вкладов 1Л7 и НБ (ЬР/НР) и нормированные показатели Ь¥% и НР%, как вклад низкочастотного или высокочастотного в общую мощность спектра за вычетом УЬР-компонента. Длительность сегмента составляла 50 с; сегменты брали с перекрытием 50% их длительности. Общая продолжительность анализируемых фрагментов составляла 300 с.

Расчет и анализ параметров ВРС проводили по 5-минутным кардиоинтервалам ЭКГ, полученной до и через 1 минуту после ХП.

Статистический анализ. Данные представлены как медиана и 1 и 3 квартили. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ «ЗТАШПСА 6.0». Для независимых выборок применяли попарное сравнение критерием Манна-Уитни; для зависимых - критерий Вилкоксона; различия признавались значимыми при р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Моделирование воспаления в сердце. Иммунизация сердечным миозином в смеси с ПАФ приводила к развитию АИМ у крыс с максимумом воспалительной реакции на 14-21 сутки опыта (Рис. 1). Гистологический анализ миокарда показал мозаичную картину расположения очагов воспаления в миокарде крыс, иммунизированных М+ПАФ, с инфильтацией лимфоидных клеток в ткань и повреждением кардиомиоцитов (КМЦ). Выраженность признаков повреждения нарастала к 14-21 суткам и затухала на 28 день опыта. Электронномикроскопическое исследование КМЦ в областях непосредственно не затронутых воспалением выявило признаки новообразования митохондрий. КМЦ в очагах воспаления несли признаки повреждения: участки пересокращения миофибрилл, просветление матрикса митохондрий, апоптотические изменения в ядре, наличие аутофагосом. Анализ содержания аутоантител к сердечному миозину показал увеличение их уровня на 14-21 сутки после инъекции М+ПАФ. Исследование уровня нитритов и нитратов, конечных метаболитов оксида азота, выявило большую вариабельность этого параметра у крыс и не способствовало уточнению сроков максимального воспалительного ответа. Анализ уровня экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов 1Ь-1р, Т№а и ¡N08 в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови показал угасание их синтеза на 14 сутки развития миокардита по сравнению с 3 сутками, поэтому результаты данного теста не содействовали детекции пика воспаленного ответа. Таким образом, гистологический анализ состояния миокарда и титр антител к сердечному миозину определяют 14-21 сутки опыта как срок максимальной воспалительнйо реакции.

Моделирование периферического воспаления. Инъекция КонА в пяточную область задней левой лапы крысы вызывала воспаление в конечности с максимумом на 2-3 сутки по

ГИСТОЛОГИЧеСКИМ лянимм

Рисунок 1. Гистологическая картина миокарда интактных крыс (А) и крыс с миокардитом (Б, В, Г); В, Г - электронные микрофотографии; ткани задней конечности интактного животного (Д) и крысы после инъекции конканавалина А (Е).

А - миокард интактного контроля Б- миокард крыс с миокардитом на

14 сутки после инъекции М+ПАФ

В - конденсация хроматина в кардиомиоцитах крыс на 14 сутки

Г - контрактуры миофибрилл в кардиомиоцитах крыс с миокардитом

Д - структура ткани конечности интактной крысы

Е - инфильтация лимфоидными клетками ткани лапы крысы на 2-3

Условные обозначения: Я - ядро, Яд - ядрышко, Мф- миофибриллы, Мт -митохондрии, Кт - контрактура миофибрилл, Лф - инфильтрация лимфоидными клетками, П - просвет сосуда, Дт - детрит

У крыс группы КонА гистологические признаки воспаления в сердце в эти сроки и через 14 суток после инъекции КонА не обнаруживали.

Изменение функционального состояния сердечнососудистой системы у крыс с АИМ и животных воспалением на периферии в сроки максимальной воспалительной реакции. В

сроки максимального воспаления в миокарде крыс, иммунизированных М+ПАФ, наблюдали значимое снижение параметров функционального состояния сердечно-сосудистой системы: снижение АДсред на 12%, ЧСС на 9%, ЛЖДсист на 14%, сократительной способности миокарда на 22% по сравнению с ИК. То есть, воспаление в миокарде сопровождалось угнетением функции сердечно-сосудистой системы (Таблица 1). Таблица 1. Значения параметров гемодинамики у крыс с миокардитом и периферическим воспалением в состоянии покоя. Условные обозначения: по

Параметры Экспериментальные группы

ИК КонА М+ПАФ

ЧСС, уд/мин 354; 350; 367 318; 295; 334 323;297; 345 "kick

АДср., мм рт.ст. 144;135;153 134; 127; 149 128;118;140 *

ЛЖДсред., мм рт.ст. 79; 76; 85 78; 66; 93 76; 67; 83

ЛЖДсист., мм рт.ст. 167; 155;177 145; 138; 177 144;136;155 *

+dP/dt ср., мм рт.ст./с 6192;5232; 6404 5232; 4884; 5720 4832; 4594; 4938 ***

-dP/dt ср., мм рт.ст./с -5466;-6095;-5244 -6001;-6468; -4897 -4768; -5890; -4768

снижение только ЧСС.

Возможно, такие изменения гемодинамических параметров у крыс с АИМ связаны со структурным повреждением сердца, сочетающемся с влиянием факторов воспаления, действующих местно на КМЦ, а также попадающих в системный кровоток и размывающихся по сосудистому руслу (Barabé J. et al., 1976; Токтап M.G., Carey K.D., Quimby FW. 1995; Kilbourn R.G., 1995; Linz W., Wiemer G., Schölkens B.A., 1996). У крыс с АИМ снижения

показателя ЛЖДциа не наблюдалось, что говорит о том, что сердце справляется с обеспечением потребностей организма.

У крыс группы КонА на фоне «гистологически сохранного» миокарда снижение ЧСС, скорее всего, связано с присутствием циркулирующих в крови медиаторов воспаления.

Введение ацетилхолина крысам с АИМ выявило статистически значимое менее выраженное уменьшение максимальной скорости сокращения миокарда, чем в группе ИК (на максимальную дозу 12 мкг/кг*мин на -14% в группе М+ПАФ vs на -24% в группе ИК). Остальные параметры гемодинамики во всех экспериментальных группах дозозависимо снижались в равной степени; на максимальную дозу 12 мкг/кг*мин падение АДсред составило 21%, ЛЖДсред - 24%>, максимальная скорость расслабления миокарда

снизилась на 27%.

Диапазон реакций АДсред на вазодилататор у животных с АИМ сохранен и не отличался от ИК, но выявлена повышенная сократительная активность сердца для его поддержания. Возможно, погибшие и поврежденные КМЦ выпали из сокращения, для обеспечения сердечного выброса незатронутые воспалением клетки вынуждены сокращаться в усиленном режиме. Способствовать такой реакции может нарушенная геометрия сокращения и увеличение притока Са2+ в КМЦ по механочувствительным каналам (Павлюченко В.Б. 1984).

Инфузируемые дозы добутамина не влияли на АДсред. Прямая стимуляция деятельности сердца ßl-адреномиметиком у крыс с АИМ выявила незначительный статистически значимый прирост ЧСС (на максимальную дозу 6 мкг/кг*мин на +11% в группе М+ПАФ vs на +7% в группе ИК) и сократительной активности миокарда (на +85% в группе М+ПАФ vs на +67% в группе ИК) (Рис. 3). Колебания значений других параметров не отличались от наблюдаемых в группе ИК: АДсред на -4%, ЛЖДсред на -6%, скорость расслабления миокарда на +19%. Реакции на введение добутамина крысам с периферическим воспалением не отличались от таковых в группе ИК.

Изменение инотропной функции сердца возможно за счет изменения плотности ßl-адренорецепторов, их чувствительности к медиатору или изменения чувствительности на уровне сократительного аппарата КМЦ к Са2+ (Терещенко СЛ., 2001).

А АД сред, дельта% Б +dP/dt max, дельта%

В +dP/dt max нормировано к АДсред

фенилэфрин, мкг/кг"мин

Рисунок 2. А-Б - изменение величин среднего артериального давления (АДсред) и максимальной скорости увеличения давления в левом желудочке в ответ на внутривенную инфузию возрастающих доз агониста al-адренорецепторов

фенилэфрина. В - увеличение сократимости сердца (+dP/dt max) пронормировано на

соответствующее увеличение

системного давления показатель (АДсред)

Рисунок 3. Изменение

максимальной скорости увеличения давления в левом желудочке в ответ на внутривенную инфузию возрастающих доз агониста 01-адренорецепторов добутамина. * - р < 0.05; ** - р < 0.01 для экспериментальных групп по сравнению с интактным контролем £ - р < 0.05; ££ - р < 0.01 для групп КонА и М+ПАФ.

+dP/dt max, дельта%

Известно, что у крыс с АИМ на 21 сутки после иммунизации, выявлено снижение экспрессии мРНК Са2+"АТФазы саркоплазматического ретикулума 2а и Na/Са-обменника, как следствие, накоплению ионов Са2+ в цитозоле (Wakisaka et al, 2004; Ни S.T. et al, 2010); и перестройка Са2+-зависимых регуляторных путей внутри КМЦ {Zarain-Herzberg A., Fragoso-Medina J., Estrada-AviUs R., 2011). Провоспалительные цитокины и оксид азота в очагах воспаления могут паракринно модулировать сократимость КМЦ. Оксид азота в присутствии Р-адреномиметика способен нитрозилировать рианодиновые рецепторы и увеличивать инотропный ответ КМЦ (Хи L. et al, 1998; Sarkar D., Vallance P., Harding S.E., 2001; BalligandJ.L., Cannon P. J., 1997).

У крыс с периферическим воспалением ответ на инфузию добутамина не отличался от ИК.

Инфузия фенилэфрина крысам с АИМ сопровождалась значимо более выраженным увеличением АДсред на всех исследуемых дозах (максимально на дозу 15 мкг/кг*мин на +48% в группе М+ПАФ vs на +24% в группе ИК). Анализ линейных областей графиков показал ускоренное развитие реакции у крыс с АИМ и достижение максимального ответа уже на вторую инфузируемую дозу препарата. Стремительное увеличение АДсред сопровождалось ростом ЛЖДсред (максимально на +67% в группе М+ПАФ vs на +32% в группе ИК), сократительной активности миокарда (максимально на +25% в группе М+ПАФ vs на +6% в группе ИК) (Рис.2).

Нормированный показатель +ёР/с11тах%/АДсрсд% выявил значимое увеличение сократимости сердца крыс с АИМ в стадию быстрого роста АДсред по сравнению с ИК (на дозу 3 мкг/кг*мин составил 0.25 в группе М+ПАФ vs -0.25 в группе ИК). На максимальную дозу нормированный показатель составляет 0,46 и не отличался от группы ИК (Рис.2).

В группе КонА скорость нарастания АДсред на инфузию фенилэфрина занимала промежуточное положение между группами М+ПАФ и ИК (максимально составила +42% в группе КонА vs +24 в группе ИК). ЛЖДсред и +dP/dtmax отличались от ИК и только на максимальной дозе фенилэфрина (ЛЖДсред на +50% и +dP/dtmax на +24% vs 32% и 6%, соответственно, в группе ИК). Значения нормированного показателя на всех инфузируемых дозах одинаковы с ИК. Кроме того, у крыс с периферическим

воспалением в ответ на увеличение постнагрузки наблюдали и увеличение скорости расслабления миокарда, что можно рассматривать как адаптивную к условиям возросшего периферического сопротивления реакцию.

Повышенная реактивность АД сред и +dP/dtmax к al-адреномиметику выражена в равной степени у животных групп М+ПАФ и КонА. В развитии гиперчувствительности к al-адреномиметику, вероятно, существенную роль играют циркулирующие в кровеносном русле факторы воспаления, например в модели подострого нелетального сепсиса (с генерализацией воспалительного ответа) показано увеличение реакции изолированных сосудов на инфузию фенилэфрина {Price S.A. etal, 1999).

Показано, что активация a-адренорецепторов на поверхности эндотелия сосудов приводит к высвобождению N0, дилататора гладкомышечных клеток, и простаноидов, обладающих констрикторным эффектом. У крыс с моделированным подострым сепсисом выявлено снижение NO-генерирующей функции эндотелия сосудов, что изменяет результирующую констрикторную реакцию гладкой мускулатуры в ответ на инфузию фенилэфрина в сторону ее увеличения (Kawabe Т. et al, 2003; Doguet F. et al, 2004). Также показано, что IL-ip самостоятельно снижает эндотелий-зависимое расслабление гладкой мускулатуры сосудов (Loughrey J.P. et al, 2003).

Исследование влияния воспаления в миокарде и на периферии на вариабельность ритма сердца.

Анализ ритма 5 минутных записей ЭКГ, полученных с бодрствующих крыс в состоянии покоя, статистическими методами во временной области у интактных крыс показал, что мода RR_Avg составила 172 мс (HR_Avg: 341,3 уд/мин). RR_Avg крыс с АИМ не отличался от ИК, а у крыс с периферическим воспалением был статистически значимо увеличен на 10%. Между экспериментальными группами в исходном состоянии не было отличий по показателям RR SD (4,7 мс), HR SD (9,5 уд/мин), характеризующим общую ВРС, а также по параметрам RMSSD (2,0 мс), pNN5 (3,4%), pNN3 (19,1%), характеризующим вклад парасимпатического отдела в ВРС (Таб. 2).

Сразу после ХП, в течение 5 минут, наблюдали значимое снижение Ю1_Ау§ во всех экспериментальных группах в среднем на 14-18% относительно исходного уровня.

После ХП показатели БЛ БО и НЯ 80, характеризующие общую ВРС, во всех экспериментальных группах изменялись разнонаправлено, что не позволяет однозначно трактовать результаты провокационного теста. Поэтому заключения относительно изменения общей ВРС мы не выносим. Детальное исследование динамики КМЗББ, р>ПЫ5, р№В показало общее подавление парасимпатического контроля у крыс с АИМ. Так, показатель ГШЗЗО обладал тенденцией к с снижению на 17% (р = 0.056). Показатели р№>15 и рМЧЗ у крыс с миокардитом были значимо снижены на 33% и 26%, соответственно, в первые 5 минут после ХП. У интактных крыс и животных с периферическим воспалением колебаний параметров ЯМЗБО, р№45 и рКЮ не наблюдали.

Таким образом, у крыс групп ИК и КонА вклад парасимпатического отдела ВНС в общую ВРС не изменялся. Тогда как у крыс с миокардитом наблюдали снижение выраженности парасимпатических влияний.

Спектральный анализ интервалограмм у интактных крыс показал, что общая мощность спектра 5-минутных записей исходно составила 13,3 мс2. При этом значения параметров У1Л% и и ОТ, входящих в общую мощность, составили 11 мс , 0,9 мс2 и 1,4мс2, соответственно. ХП у крыс ИК не приводила к значимому изменению УЫ% ЬБ и НБ в течение 5 минут сразу после воздействия. Однако, соотношение симпатовагусных влияний 1Л7НР было значимо увеличено в 2 раза сразу после ХП. Также для этого периода показано снижение нормализованного параметра НБ% на 36% относительно исходного уровня (Таб.2).

У бодрствующих животных с миокардитом и периферическим воспалением в состоянии покоя значения общей мощности спектра и составляющей ее компонентов не отличались от ИК. АИМ приводил к статистически значимому увеличению ЬБ на 33%, и была выявлена тенденция к снижению НБ в 2 раза (р = 0.056), и как следствие - значимое увеличение параметра ЬР/НБ в 2 раза в первые 5 минут после ХП без изменения общей мощности спектра ТР на протяжении всего периода регистрации.

Таблица 2. Значения параметров ВРС, вычисленные по 5 минутным фрагментам кардиоинтервалов, до и через 1 мин после холодовой пробы (ХП). Условные обозначения: отличия до и через 1 минуту после ХП * - р < 0,05; ** - р <0,01; *** . р <0,001; исходное отличие Ю1_Ау§ и HR_Avg в группе КонА от ИК и М+ПАФ: £ - р <0,05.

Параметры ИК КонА М+ПАФ

До ХП После ХП До ХП После ХП До ХП После ХП

172,3; 169,0; 177,5 149,5; 141,4; 161,9*** 189,4;169,7196,5*£ 155,4; 148,8; 164,7** 173,4; 170,7; 179,1 148,8; 139,9; 153,5**

4,7; 3,2; 5,8 5,1 ;3,7; 6,9** 4,2; 3,4; 5,7 5,7; 4,3; 7,1 4,8; 3,6; 5,4 4,8; 4,6; 6,1

HR_Avg 341,3;338,1;355,3 402,4;370,8;424,7*** 317,3;305,7;353,8*£ 387,2;364,4;404,1** 346,1;335,4;352,0 403,9;391,3; 429,3**

1Ш_80 9,5; 6,5; 12,4 14,6; 9,7; 19,6 8,4; 5,3; 11,3 12,0; 10,9; 19,3* 9,3; 6,7; 11,6 14,4; 12,2; 16,7*

имзво 2,0; 1,6; 3,0 1,7; 1,4; 2,7 2,4; 1,7; 2,9 2,5; 2,2; 3,3 3,0; 2,1; 3,4 2,2; 1,7; 3,2#

р№410 0,0;0,0;0,02 0,0; 0,0; 0,1 0,0; 0,0; 0,1 0,0; 0,0; 0,9 0,0; 0,0; 0,3 0,0; 0,0; 0,2

р^5 3,4; 0,3; 10,8 2,2; 0,1; 7,7 5,5; 0,5; 9,2 6,6; 2,6; 13,2 10,8; 2,6; 17,5 2,8; 0,6;12,8*

рШЗ 19,1; 7,5; 37,7 15,0; 4,7; 28,0 21,3; 11,5; 38,0 26,4; 19,9; 35,7 37,3; 17,6; 45,6 20,6; 11,8; 39,8**

ТР 13,7; 7,8; 19,1 17,5; 7,5; 28,3 13,3; 7,6; 17,9 23,1; 9,0; 34,0 13,0; 7,4; 14,6 14,1; 9,5; 25,2

УЬГ 11,0;6,4; 13,8 13,6; 6,0; 21,1* 7,7; 4,8; 14,1 14,3; 4,8; 28,4 8,3; 4,4; 10,7 10,5; 7,2; 17,1

0,9; 0,5; 1,5 1,3; 0,7; 3,3 1,1; 0,4; 2,0 2,5; 1,7; 5,1** 1,2; 0,9; 1,8 1,6;0,8; 2,6*

ьг% 8,1; 5,2; 10,1 9,7; 8,4; 12,8 6,8; 4,5; 12,9 12,9; 9,2; 21,4* 8,6; 8,0; 12,9 11,7; 8,4; 16,2

НР 1,4; 0,9; 4,1 1,2; 0,7; 3,4 2,1; 0,8; 2,8 1,9; 1,4; 3,0 2,8; 1,4; 3,6 1,9;0,7; 2,8#

НР% 16,4; 8,2; 32,0 10,1; 7,4;* 16,0 13,4; 8,9; 23,0 8,9; 4,9; 33,1 22,4; 12,8; 29,5 10,5; 7,3; 14,7**

и/ОТ 0,6; 0,3; 0,9 0,8;0,6; 1,4** 0,5; 0,3; 1,1 0,9; 0,6; 2,9* 0,5; 0,4; 0,7 1,2;1,0; 1,6**

У крыс с периферическим воспалением показано статистически значимое увеличение параметра ЬБ чуть более чем в 2 раза, почти в 2 раза и параметра ЬБ/НР на 80% в первые 5 минут после ХП. Однако, статистически значимых колебаний показателя НБ, НБ% и общей мощности спектра ТР не было получено, вероятно из-за большой вариабельности данных (Таблица 2).

Вероятно, различия в композиции измененных параметров ВРС после ХП для разных экспериментальных групп связаны со скоростью восстановления регуляторных контуров после стрессорного воздействия. Так, у ПК в первые 5 минут после ХП большое число параметров ВРС не отличается от исходного уровня, а колебания отдельных характеристик не однозначны. Тогда как, у крыс с периферическим воспалением, в первые 5 минут после ХП зарегистрированы увеличение вклада только симпатического отдела ВНС; а для крыс с миокардитом - снижение парасимпатического и увеличение симпатического вкладов ВНС в регуляцию ритма сердца. Изменение скорости восстановления параметров ВРС после ХП может быть связано с исходно более хрупким и сложным симпато-парасимпатическим взаимодействием, установившимся в условиях воспаления в лапе или в сердце, но поддерживающим все характеристики покоя на уровне интактной нормы. Дополнительное исследование ВРС 5 минутных фрагментов кардиоинтервалов сразу после ХП спектральными методами анализа согласуется с результатами, показанными методами временной области.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммунизация крыс сердечным миозином в смеси с ПАФ позволила получить воспаление в миокарде. Гистологический анализ состояния сердца и титра антител определили сроки максимального воспалительного ответа - 14-21 сутки. Метод определения конечных метаболитов оксида азота, нитритов и нитратов, оказался не чувствителен к развитию воспалительной реакции в сердце. Определение уровня провоспалительных цитокинов методом ПЦР анализа показало, что их уровень экспрессии не может выступать маркером выраженности воспалительного ответа в сердце. Вероятно это связано с тем, что исследуемые цитокины являются регуляторами раннего

реагирования ткани на повреждение, а затем воспалительная реакция реализуется за счет других регуляторных систем.

Инъекция КонА в стопу приводила к развитию воспаления в лапе с максимальной силой на 2-3 сутки опыта. При этом гистологические признаки иммунной реакции в миокарде у крыс группы КонА отсутствовали.

Оценка функционального состояния сердечно-сосудистой системы у наркотизированных крыс с АИМ показала значимое снижение практически всех параметров гемодинамики и показателей работы сердца. Эксперимент с применением фармакологических нагрузочных тестов у этих животных выявил сниженную реакцию сократительной деятельности сердца на уменьшение постнагрузки, и увеличенный ответ сердечнососудистой системы на предъявление а1- и р1-адреномиметиков.

У крыс с инъекцией КонА с «гистологически сохранным» сердцем наблюдали сходные с группой крыс с миокардитом эффекты АД сред на введение а1-адреномиметика.

Оценка ВРС 5 минутных фрагментов интервалограмм с бодрствующих животных в состоянии покоя не показывала отличий в регуляции ритма сердца у животных разных групп. Однако, после ХП комбинация методов анализа во временной и частотной области показала, что у крыс с АИМ в первые 5 минут после ХП выявляется снижение вклада парасимпатических и увеличение вклада симпатических влияний на ритм сердца. У крыс с периферическим воспалением за тот же период времени показано только увеличение симпатического вклада. У интактных крыс после ХП не наблюдали значимых изменений большинства параметров, за исключением показателя ЬБ/НР. По-видимому, такое различие в составе задействованных параметров ВРС после ХП для разных экспериментальных групп связано со скоростью восстановления вариабельности ритма сердца после стрессорного воздействия. Полученные данные не укладываются в стройную гипотезу, объясняющую изменение регуляции гемодинамики и ритма сердца у крыс с воспалением разной локализации. Однако, результат эксперимента показал, что метод ВРС может быть использован как для фундаментальных исследований механизмов регуляции ритма, так и для включения в тест системы для исследования результатов терапии или действия фармакологических препаратов.

ВЫВОДЫ:

1. Однократная подкожная инъекция крысам сердечного миозина в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) приводила к развитию аутоиммунного миокардита с максимумом воспалительной реакции на 14-21 сутки. Адъюванты ПАФ и НАФ самостоятельно провоцировали развитие воспаления в миокарде.

2. Внутримышечная инъекция конканавалина А (КонА) в заднюю конечность приводила к развитию периферического воспаления, с максимумом воспалительного ответа на 2-3 сутки. При этом гистологические признаки воспаления в миокарде отсутствовали.

3. В стадию наиболее выраженного воспаления у наркотизированных тиопенталом крыс с миокардитом были снижены АДсред, ЧСС, ЛЖДсист, +dP/dt шах по сравнению с интактным контролем. Показано уменьшение реакции индекса сократимости на инфузию ацетилхолина; увеличение ответа сердца (ЧСС и +dP/dt max) на прямую стимуляцию добутамином; повышение параметров АДсред, ЛЖДсист, +dP/dt max на введение фенилэфрина. На фоне увеличенной реакции АДсред на инфузию фенилэфрина выявлен значительный прирост сократительной способности миокарда.

4. У животных с периферическим воспалением в ответ на инфузию фенилэфрина выявлено увеличение АДсред, индексов сократимости и расслабления миокарда по сравнению с интактными крысами.

5. Провокационная проба с Холодовым воздействием у крыс с миокардитом приводила к снижению вклада парасимпатического отдела ВНС в общую вариабельность сердечного ритма и увеличению вклада симпатического отдела ВНС в первые 5 минут после пробы. У крыс с периферическим воспалением холодовая проба вызывала усиление симпатического без изменений вклада парасимпатического контуров регуляции ритма сердца.

6. Оценка вариабельности ритма сердца, особенно при функциональных пробах, может войти в арсенал физиологических тест-систем для скрининга фармакологических препаратов с противовоспалительными свойствами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морозова М.П., Княженцева А.К., Погодина Л.С., Шорникова М.В., Ченцов Ю.С., Гаврилова С.А. Динамика воспаления в миокарде у крыс с экспериментальным аутоиммунным миокардитом // Механизмы функционирования висцеральных систем. Тезисы докладов V Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня рождения В.Н. Черниговского. - Санкт-Петербург, 2007. - С. 212.

2. Pogodina L.S., Shornikova M.V., Knyazhenzeva A.V., Gavrilova S.A., Morozova M.P., Chentsov Yu.S. Mitochondria ultrastructure cardiomyocytes during experimental autoimmune myocarditis // Biological motility. Achievements and perspectives. -Pushchino, 2008. - P. 316-317.

3. Погодина Л.С., Шорникова M.B., Княженцева A.K., Гаврилова С.А., Морозова М.П., Ченцов Ю.С. Изменение митохондриома в кардиомиоцитах левого желудочка сердца крыс при развитии экспериментального аутоиммунного воспаления миокарда // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. - С. 322.

4. Морозова М.П., Княженцева А.К., Погодина Л.С., Шорникова М.В., Ченцов Ю.С., Гаврилова С.А. Воспалительный ответ у крыс с экспериментальным аутоиммунным миокардитом // Четвертая всероссийская с международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения. - Москва, 2008. - С. 67.

5. Морозова М.П. Динамика воспалительного ответа у крыс в модели аутоиммунного миокардита // Международная конференция «Ломоносов-2010». - Москва, 2010.

6. Морозова М.П., Княженцева А.К. Моделирование аутоиммунного миокардита у крыс // XVI Межгородская конференция молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». - Санкт-Петербург, 2010. - С. 130-131.

7. Погодина Л.С., Земцова Л.В., Гаврилова С.А., Морозова М.П., Ченцов Ю.С. Реактивные изменения кардиомиоцитов левого желудочка сердца крыс при развитии экспериментального аутоиммунного миокардита // Сб. науч. трудов VIII Всероссийской конференции по патологии клетки. - Москва, 2010. - С. 194-195.

8. Гаврилова С.А., Морозова М.П., Княженцева А.К., Погодина Л.С., Постников А.Б., Ченцов Ю.С. Динамика развития аутоиммунного миокардита у крыс // Известия РАН. Серия биологическая. - 2010. - №5. - С. 1-13.

9. Gavrilova S.A., Morozova М.Р., Knyazhentseva А.К., Pogodina L.S., Postnikov A.V., and Chentsov Yu.S. Dynamics of development of autoimmune myocarditis in rats // ISSN 1062-3590, Biology Bulletin. - 2010. - №5. - P. 597-609.

10. Morozova M.P., Gavrilova S.A., Zemcova L.V., Pogodina L.S., Chentsov Y.S. The dynamics of inflammatory response in myocardium after cardiac myosin immunization // "Biological motility. From fundamental achievements to nanotechnologies". - Pushchino, 2010.-P. 175-179.

11. Морозова М.П., Гаврилова C.A., Княженцева A.K., Погодина Л.С., Ченцов Ю.С. Моделирование аутоиммунного миокардита у крыс // Материалы VII Казахского Физиологического общества с международным участием: «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной - основа здоровья и долголетия», посвященная 100-летию академиков АН КазССР Н.У. Базановой и Ф.М. Мухамедгалиева. - Алматы, 2011. - С. 185-186.

12. Морозова М.П., Лукошкова Е.В., Гаврилова С.А. Гемодинамические параметры и вариабельность ритма сердца у крыс с аутоиммунным миокардитом // Пятая всероссийская с международным участием школа-конференция по физиологии кровообращения. - Москва, 2012. - С. 108-110.

13. Морозова М.П. Исследование параметров работы сердца в модели аутоиммунного миокардита у крыс // Тезисы конференции «Аспирантские и докторантские чтения: Дерзания нового времени

- поиск инноваций». - 2012. - С. 117-118.

14. Морозова М.П., Гаврилова С.А., Земцова Л.В., Погодина Л.С., Постников А.Б., Ченцов Ю.С. Динамика развития миокардита у крыс, иммунизированных сердечным миозином с неполным адъювантом Фрейнда // Росс. Физиол. Журн. имени И.М. Сеченова.

- 2012. - т.89. - №2. - С. 209-222.

Заказ № 62-П/04/2012 Подписано в печать 12.04.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Морозова, Мария Павловна, Москва

61 12-3/936

московским государственный университет имени м.в.

ломоносова

государственное учебно-научное учреждение

факультет фундаментальной медицины

На правах рукописи

морозова мария павловна

Специальность: 03.03.01 - физиология

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Гаврилова Светлана Анатольевна

Москва-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................8

Регуляция ритма сердца...................................................................................8

Вариабельность ритма сердца, как способ оценки влияния вегетативной

нервной системы на работу сердца...............................................................12

Подходы к обработке интервалограмм...................................................13

Статистические методы во временной области...................................14

Методы частотной области:...................................................................16

Интерпретация параметров ВСР. ...........................................................18

Причины снижения ВСР................................................................................21

Последствия органического поражения.......................................................22

Вегетативная нейропатия...............................................................................24

Повышение активности симпатоадреналовой системы.............................25

Гипотеза нервной изоляции сердца..............................................................26

Воспаление......................................................................................................27

Ограничения клинического исследования, осложняющие исследование

связи расположения очага воспаление с параметрами ВРС......................31

Миокардит, как попытка оценить влияние воспаления в сердце на ВРС.32

Исследование ВРС в экспериментальных моделях на животных.............33

Модель АИМ...................................................................................................36

Актуальность и новизна исследования........................................................37

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ...............................................................................................40

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................41

Содержание животных...................................................................................41

Структура исследования................................................................................41

Экспериментальные модели..........................................................................42

Протоколы экспериментов............................................................................43

Забор биологического материала и его подготовка для дальнейшего

анализа.............................................................................................................51

Порядок проведения гистологических исследований................................52

Порядок проведения биохимических анализов...........................................54

Метод обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-

ПЦР)..............................................................................................................54

Определение титра антител иммуноферментным анализом..............57

Определение уровня нитритов и нитратов в сыворотке крови и

гомогенатах ткани миокарда....................................................................58

Проведение эксперимента in vivo по оценке функционального состояния

сердечно сосудистой системы.......................................................................59

Порядок проведения эксперимента по оценке соотношения влияния

парасимпатической и симпатической нервной системы по ВРС in vivo. .63

Статистический анализ..................................................................................68

Используемые реактивы................................................................................ 69

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................................................70

Исследование динамики воспалительной реакции в миокарде, при

иммунизации крыс сердечным миозином в смеси с ПАФ.........................70

Исследование динамики воспалительной реакции в миокарде, при

» i

иммунизации крыс сердечным миозином в смеси с НАФ.........................84

Исследование воздействия лектинов - КонА и ФГА, инъецированных в

заднюю конечность на миокард....................................................................95

Исследование влияния воспаления в миокарде и на периферии на

функциональное состояние сердечно-сосудистой системы.....................100

Параметры гемодинамики у крыс разных экспериментальных групп в

состоянии покоя........................................................................................100

Изменение фоновых значений гемодинамических параметров в течение

эксперимента................................................................................................102

Параметры системной гемодинамики у крыс в ответ на введение ацетилхолина.............................................................................................106

Результаты нагрузочного теста по стимуляции сократительной активности миокарда и частоты сердечных сокращений с помощью

агониста /31-адренорецепторов добутамина........................................108

Результаты нагрузочного теста по увеличению постнагрузки на миокард с помощью агониста а1-адренорецепторов фенилэфрина... 110 Влияние воспаления в миокарде и периферического воспаления на

вариабельность ритма сердца...................................................................... 114

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...................................................................123

Анализ исследуемых моделей воспаления. ...............................................123

Провокация АИМ с помощью иммунизации сердечным миозином в

смесисПАФ...............................................................................................123

Индукция миокардита с помощью иммунизации сердечным миозином в

смесисНАФ................................................................................................129

Моделирование периферического воспаления с помощью инъекции

лектинов.....................................................................................................134

Анализ чувствительности метода оценки ВРС в зависимости от

длительности анализируемого кардиоинтервала.................................136

Оценка влияния воспаления в миокарде и на периферии на

работоспособность сердца и механизмы его регуляции..........................139

Оценка баланса парасимпатических и симпатических влияний на сердце у крыс с миокардитом и периферическим воспалением методом

анализа ВРС...............................................................................................139

Анализ действия фармакологических тестов на гемодинамические параметры сердечно-сосудистой системы у крыс при воспалении. ..145

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................163

ВЫВОДЫ..........,...............................................................................................166

ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ.................................................................. 168

БЛАГОДАРНОСТЬ...........................................................................................185

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВРС - вариабельность ритма сердца

ИК - интактный контроль

КМЦ - кардиомиоцит

КонА - конканавалин А

НАФ - неполный адъювант Фрейнда

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ФГА - фитогемагглютинин

ЭАМ - экспериментальный аутоиммунный миокардит

ЧСС - частота сокращений сердцап

АД - артериальное давление

АДсред - среднее артериальное давление

ЛЖДсред - среднее левожелудочковое давление

ЛЖДсист - систолическое левожелудочковое давление

ЛЖДдиа - диастолическое левожелудочковое давление

СНС - симпатическая нервная система

ПНС - парасимпатическая нервная система

ВНС - вегетативная нервная система

ЦНС - центральная нервная система

ВВЕДЕНИЕ

Воспаление является неотъемлемой составляющей развития атеросклеротической бляшки, инфаркта миокарда, ишемической болезни сердца, кардиомиопатий. Реализация иммунных реакций в организме, в том числе воспалительного ответа, находится под контролем вегетативной нервной системы, а разрешение определяется взаимодействием парасимпатического и симпатического ее отделов (Rosas-Ballina М., Тгасеу K.J., 2009; Eskandari F., Webster J.I., Sternberg E.M., 2003). Методом анализа вариабельности ритма сердца (ВРС) можно неинвазивно и быстро оценить симпато-парасимпатическое взаимоотношение в регуляции сердечного ритма {Баевский P.M. и соавт, 1999).

У людей с инфарктом миокарда и стенокардией снижение параметров вариабельности ритма сердца: общей мощности спектра, стандартного отклонения интервала RR (SDNN) ниже 50 мс тесно коррелирует с неблагоприятным прогнозом: наступлением острых сердечно-сосудистых событий или смерти (Carpeggiani etal., 2004; Chen et al., 2008). Существуют данные, позволяющие предполагать связь показателей ВРС и интенсивности воспалительного ответа {Парнес Е.Я., 2010; Ahmad S. et al, 2009; Chen at al., 2008). У пациентов, с так называемыми цитокин-опосредованными заболеваниями (ревматоидный артрит, сепсис, псориаз), - наблюдается ; / снижение активности вагуса, которое выявляется методом оценки ВРС {Парнес Е.Я., 2010; Huston J.M.; Тгасеу K.J., 2010).

В последние годы активно изучают возможность использования анализа ВРС в диагностике различных заболеваний сердечно-сосудистой системы {Парнес Е.Я., 2010). Выявлена положительная корреляция между увеличением содержания медиаторов воспаления, например, С-реактивного белка и IL-6, и снижением вагусной активности у пациентов с коронарными заболеваниями сердца- {Sajadieh А. et al, 2004). Практическая ценность таких У работ очевидна: с помощью анализа ВРС становится возможным выявление

не только группы пациентов с высоким риском развития сердечных катастроф среди больных ишемической болезнью сердца, ревматоидным артритом, гипертонической болезнью, но и выявление лиц со скрытым течением ИБС, а также для контроля эффективности лечения (Парнес Е.Я., 2010).

Для человека существуют стандартные подходы оценки ВРС -холтеровское мониторирование ЭКГ, детально описаны функциональные пробы и нагрузки, с помощью которых можно оценить состояние сердечнососудистой системы, однако аналитические возможности при исследованиях . человека сильно ограничены. В экспериментальных моделях на крысах \ можно изучать воздействие на миокард самого воспаления, не осложненного другими патологическими процессами. К тому же известно, что течение миокардита у грызунов во многом сходно с развитием этого заболевания у человека\Huber 1997). Но до сих пор для животных, тем более для мелких грызунов, не разработаны стандарты оценки ВРС, не стандартизированы функциональные нагрузки для анализа влияния воспаления на миокард. Для восполнения этого пробела предпринято настоящее исследование.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Регуляция ритма сердца.

Частота ритмических сокращений сердца задается ритмоводителем, которым в норме служит синоатриальный узел (САУ). Частота генерации импульса пейсмейкера определяется скоростью медленной диастолической деполяризации (определяемой взаимодействием входящих токов /f и /Са и выходящего тока /к), в результате которой клетка водителя ритма достигает порогового значения мембранного потенциала и реализует ИД. Каждый момент времени работа сердца приспосабливается для обеспечения изменяющихся потребностей организма с помощью регуляторных воздействий вегетативной нервной системы.

Влияние парасимпатического отдела ВИС на сердце опосредуются высвобождением ацетилхолина окончаниями ветвей блуждающего нерва. Активация мускариновых ацетилхолиновых рецепторов приводит к увеличению проводимости клеточной мембраны для ионов К+ с последующей гиперполяризацией мембраны, уменьшением крутизны медленной диастолической деполяризации и, как следствие, замедлением частоты сердечных сокращений (Камкин А.Г., Киселева И. С., 2012; Баевскый, P.M. и соавт., 2001).

По классическим представлениям влияние симпатического отдела ВНС на сердце опосредуются высвобождением норадреналина и активацией [3-адренергических рецепторов (эффекты медиаторов нейропептида Y и АТФ, локализующихся совместно с норадреналином в везикулах, мы здесь не рассматриваем). Это приводит к запуску каскадов вторичных внутриклеточных медиаторов, сопровождающихся накоплением цАМФ и стимуляцией цАМФ-опосредованного фосфорилирования мембранных белков и усилению токов /Саь и /f. Конечным результатом влияния симпатической нервной системы является повышение частоты сердечных сокращений преимущественно за счет увеличения крутизны медленной

диастолической реполяризации {Камкин А.Г., Киселева КС., 2012; Баевский, P.M. и соавт., 2001).

Таким образом, Холинэргическое управление ритмом сердца, из-за l большого содержания холинэстеразы в САУ, является быстрым, точным и дискретным, а адренергическое - более медленное и генерализованное (положительный инотропный эффект катехоламинов развивается медленно и действует в течение нескольких кардиоциклов) (Хаспекова Н.Б., 2003).

Баевский P.M. предлагает представлять систему регуляции деятельности САУ в виде двух взаимосвязанных контуров: «центрального» и «автономного» с прямой и обратной связью {Баевский P.M. и соавт., 2001). К рабочим структурам «автономного» контура он относит САУ, блуждающие нервы и их ядра в продолговатом мозгуй (контур парасимпатической V регуляции), при этом дыхательная система рассматривается как элемент обратной связи в «автономном» контуре регуляции ритма сердца. Деятельность «центрального» контура регуляции идентифицирует с 7 симпатоадреналовыми влияниями на ритм сердца и связывает с недыхательной синусовой аритмией/проявляющейся в медленноволновых колебаниях ритма (колебания ритма сердца с периодами выше 6-7 с, ниже

0,15 Гц). Прямая связь между «центральным» и «автономным» контурюв " (/ < «

осуществляется через нервные (преимущественно симпатические) и гуморальные связи, а обратная связь - через афферентные сигналы с барорецепторов сердца и сосудов, хеморецепторов и других рецепторных зон различных органов и тканей {Баевский P.M. и соавт., 2001).

В условиях покоя «автономная» регуляция проявляется наличием 7 характерной дыхательной аритмии на кардиоинтервалограмме; особенно дыхательные волны усиливаются во время сна, когда уменьшаются «центральные» влияния на «автономный» контур регуляции. Различные нагрузки на организм сопровождаются включением в процесс управления ритма сердца «центрального» контура и ведут к ослаблению дыхательного компонента синусовой аритмии и усилению недыхательного компонента.

Таким образом, «центральный» контур регуляции ритма сердца включает в себя многоуровневую систему нейрогуморальной регуляции физиологических функцийот подкорковых центров продолговатого мозга до >/

гипоталамо-гипофизарного уровня вегетативной коры и коры головного

о-том

мозга. Причем/ уровни представляют собой функциональные системы, /

работа которых направлена на организацию взаимодействия организма с

„ ку/ j

внешней средой, на установление равновесия /различных' систем^организма су

между собой.. и обеспечивает межсистемный гомеостаз, а также

внутрисистемный гомеостаз, в частности, внутри сердечной системы

(Баевский P.M. и соавт., 2001).

Парасимпатическая и симпатическая нервные системы находятся в

определенном взаимодействии (на всех уровнях регуляции), а также под

влиянием центральной нервной системы и ряда гуморальных и

рефлекторных факторов. Симпато-парасимпатические отношения тонически

и фазически модулируются взаимодействием трех основных" способов: -

центральными! нервными влияниями; механизмам^" периферического (у

тормозного рефлекса (с отрицательной обратной связью) и периферического

возбуждающего механизма (с положительной обратной связью) (.Malliani А.,

1987). В общем виде, в результате активации одного отдела ВНС

наблюдается снижение эфферентной активности другого, так что наблюдается реципрокное взаимодействие между влияниями парасимпатического и симпатического отделов ВНС {Malliani A. et al, 1991).

Таким образом, разряды вагуса и эфферентов симпатического отдела ВНС, направленные на САУ. синхронизируются с каждым сердечным циклом и модулируются центральными (например, вазомоторным и дыхательным центрами) и периферическими (колебаниями артериального давления и дыхательными движениями) осцилляторами (Malliani А., 1991). Кроме того, деятельность ВНС зависит и от ряда гуморальных влияний— изменение парциального давления углекислого газа и кислорода, изменений кислотно-основного состояния. В продолговатом мозге расположен

сердечнососудистый центр, объединяющий парасимпатический, симпатический и сосудодвигательный центры. Регуляция этих центров осуществляется подкорковыми узлами и корой головного мозга.

С^е^пХСК^Л^ Л;

Обеспечением/работы сердца к изменяющимся гемодинамическим

потребностям включает миогенные (механизмы)(закон Франка-Старлинга) и

нейрогенныею участием внутрисердечной нервной системы. В естественных I/

условиях внутрисердечная нервная система подчиняется вышележащим

регулирующим системам. Но после экстракардиальной денервации

(например, при трансплантации сердца) именно внутрисердечные рефлексы

совместно с миогенными механизмами обеспечивают приспособление

работы сердца к изменяющимся гемодинамическим потребностям организма

(Камкин А.Г., Киселева И.С., 2012). Например, известно, что клетки САУ

способны отвечать на механическое растяжение мембраны ускорением

пейсмейкерной деятельности {Мухина КВ., Дворников A.B., Камайданов