Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние витаминов на вторичный рост мицелиальных микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние витаминов на вторичный рост мицелиальных микроорганизмов"

РГб од

I /{{^ЩАЯШЗ АКАДЕМИЯ "НАУК РЕСПУБЛИКИ. КАЗАХСТАН Институт микробиологии н вирусологии

На правах рукописи

САДЫКОВА §арида Энидьевна

ВЛИЯНИЕ ВИТАНШОВ НА ВГОРПЧННЯ РОСТ МИЦЕЛЙАЛЫШХ МИКРООРГАНИЗМОВ

ОЗ.00»07 - някробяология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алматы - 1993 г

Работа, выполнена в институте кикрооиологии и вирусологии HAH Республики Казахстан

Цаучшм руководитель: доктор отологических наук,.

профессор Никитина Е-Т-'

Официальные оппоненты: доктор Оиологических наук

Саубенова М.Г>

кандидат биологических наук

Фадеева д.м.

Ведущая организация: Кафедра микробиологии Алма-Атинского медИнститута им.С.Аофендаярова

Защита состоятся "_"_199ЭГ в "_"часов на

заседании специализированного ученого совета KJKB-Dl-'OI Института микробиологии.н вирусологии -НАЛ Республики Казахстан по адреоу:-480100» Алматы, ул.Богенбай батыра, ЮЗ-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института микровиологии и вяруоологии HAH Республики Kass/.c-тан. Автореферат разослан "_"апреля ¿993

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

•С.Махмудова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Вторичный рост закономерно выявляется при удлинении общепринятых сроков выращивания микроорганизмов на синтетических и органичерких средах. Он свидетельствует сб ограничением действия- фактороз, лимитируидих и ингибируюцих рост микроорганизмов разного систематического положения:

Интерес к исследование вторичного роста у иицелиалънах микроорганизмов (ахтиномицетов, грибов) обусловлен возможность») регулярного появления в их культурах при старении автономно активно делящихся клеток с нарупенноЯ дифференциацией (Никитина, Калакуцкий, 1971, 1377; Никитина,' 1975; 1937; 1991 и др).

Уникальность выявлениях объектов, воспроизводимость действия конкурентного механизма мехду дифференцировхой и делением клеток на средах контролируемого состава позволили углубить представления о нетаболических основах вторичного роста. У клеток вторичных- колония выявлена отличия в составе белков, тейхоевых кислот,

различия в

накопления*лилидов, полифосфатов." , в показателях энергетического обмена и функционировании генома С СИегЬу еЪ а1, ^ 1972; Скоблилова и соавт.» 1983; Айтхожина, 1935, 1993; Нуканова,1939; §айн,1992). . . '

- Практическое-значение имеет усиление у культур из вторичных колоний'ферментативной активности» неталлоадсорбции, способности к биосинтезу антибиотиков, а такте образование антибиотиков с измененные компонентный составом и локализацией (Никитина,1975; Шакиев,1984; Игина.1938; Муканоза.1989; РымяйноваД991;Шемвура, 1991; §>айн,1992). В связи с этим выявление факторов, значимых для индукции и селекции клеток вторичных колоний, вехно не только в научном, но и практическом отношении. При нарушениях дифференциации и деления клеток у высших организмов; выраженное влияние оказывает витамины (Шабад,19б9; Кабиев,1975; Рамель,198б; Афанасьев, 1987 и др.).Соответствувцие сведения .о вторичном росте микроорганизмов весьма ограничены.

Цельс исследований по теме было определение влияния витаминов на вторичный рост про и эухариоткых ницелиадъяых микроорганизмов разного систематического пояснения. Конкретные задачи исследования включали:

1. Изучение вторичного роста у представителей прокариотных (роди 31гвр1отусеа,Ц1сгоаюпоерога,Ас11поаайига, Носчг-

¿1а ) и оукариотних (роды РизаПиа, Реп1с1Шша; Ав-

р'ег2Х11из,Тг1сЬоЛсо1и^ яицелиальних микроорганизмов.при внесении витаминов в'среды перед посевом.

2. Исследование влияния витаииноз на формирующиеся вторичные колонии после 4-7 суток роста мицелиальных микроорганизиов.

3. Изучение сочетанного влияния на вторичный рост мицелиальных микроорганизмов витаминов и соединений с канцерогенной активностью.

4. Определение особенностей метаболизма, сопровождавших выраженное влияние "витаминов на вторичный рост мицелиальных микроорганизмов.

Научная "новизна. Впервые выявлено сткиулируюиее и ингибирую-щее действие витаминов на вторичный рост представителей прокариотных (роды 3^ер4ошусеа,ЬЦсгоаопозрога,Асипоаа<1ига, Лосаг'-) и эукариотных (роды^еагАш.РегЦсШХиэДерегеП--1из;'Гг£сИогяес1д1>.- • ):^ицел'Па'Ль>:их-кикросрганизмов;( эффект кокет" быть как однотипный, так и двойственным. Ок зависит от кок- _ центрации_витаминсв з питательных средах, от'типа-клеточной ор-: ганизаиии микроорганизиов, их возрарта к систематического положения. - • • -__

Наиболее значительное стимулирующее влияние на рост вторичных колоний оказывают витамины Р?» п-ЛБК.В-^.В^» когда вносятся в среды перед посевом. На поздних стадиях онтогенеза витамины способны восстанавливать дифференцировку в форми-руюцихся вторичных колониях и нормализовать деление клеток. Нормализующий эффект витамина РР не проявляется в присутствии канцерогена (ДМ5А).Витамины А, Ц Н, В^, а-РР, Д и ли-поевая кислота ослабляют стимулирующее действие дизельного топлива и РЬ СУС>з)2 на вторичный рост.

Впервые получены данные, свидетельствующие о роли свободных радикалов при вторичном росте микроорганизмов. Ингибируюший оффект витамина А на вторичный рост объясняется его антиоксидант-ним действием, защищающим клетки от повреждающего действия ра -дикалов.

Практическая значимость.При использовании вторичного роста в селекции.культур микроорганизмов с усиленным проявлением практически полезных признаков предлагается учитывать способность витаминов'повышать частоту образования вторичных колоний. Селек-

циснируппсс действие витаминов, вырезающееся а увеличении размеров вторичных колония, облегчает получение из вторичных колони:) индивидуальных кул ьтур.

Ка защиту выносятся "сложения:

о стинулнрукщем и ингибирующем действии витаминов на вторичный рост ницелиальных микроорганизмов;

о возможности как однотипного, так и двойственного эффекта, зависимого от концентрации витаминов з питательных средах и возраста микроорганизмов;

о способности витаминов ослаблять действие канцерогенов, которая не является универсальной;

об антиоксидантном действии витамина Л, защищающем клетки от повре:-:;дазцего действия свободных радикалов, впервые выявленных при вторичном росте микроорганизмов.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на УН съезде ЕМ0 (Алма-Ата,1985 г), на заседании Всесоюзного биохимического обцестза (Москва,1935 г), на заседаниях Ученого со-ветаГи конференциях^шитит^й-иикробиоЗГогиюг вирусологии-НАН-республики Казахстан (1935-1990 гг).

Публикации. По_ материалам диссертации опубликовано 3 работы.

■ Структура и объём работы.Диссертация изложена на. 133 страницах м'аиинописи, иллвстрирована 16 таблицами, 3 рисунками. Состоит из введения, 9 глаз; заклпчения и выводов. Список использованной литературы включает 270 работ, из них 83 на иностранных языках.

Объекты и методы исследования.

Объектами исследования были мицелиальные прокариотные СStreptonyceo roseoflavua var.roaeofunsinl ШТ.ИМиВ 1128, З.гояэ-

mm Шт S-S7

oflavue ШТ. IPV 1344, S.peucetiJJA„var.caoelus ,„'. " Uicrononospora пр. 0Т-ШиВ 1723Hocardla Ш,- 1МиВ 53I,Actiao-madura sp. DT. ИМиЗ 65 И эукариотные Cpusarlua bulblße-

nua var.blaetlcola ШТ.ИЛиВ 77 .Penlcilliun chrysosenra птзммы BKMF 239 и ШИИА 194 .Aepergillua kanagawaensie ИТ.BKMF 1332, Trichotheclini roeeum шт. BKMF 959JМикроорганизии.

Основной средой для выявления вторичного роста у актино-мицетов была агаризованная среда Придхэма-Готлиба, у грибов -

среда Ридер. Сахара (фруктоза,лактоза,ксилоза) в виде растворов стерилизовали отдельно и добавляли в среды перед посевом культур.

На способность к ингибированип и стимуляции вторичного роста испытывали витамины;» Bj - тиамин (Белгородский витаминный завод),Bg - рибофлавин, В^- пантотеновая кислота, Bg - лиридок-син (Уыаньский витаминный завод), Bjg - цианокобаламин (Таллинский Химфармзавод), Н - 0иотин ( Cheaical Corporation,Los Angeles ), P - биофлавонсиды (объединение "Алтайвитамины"), РР -никотиновая кислота, а РР _ никотинамид (Уианьский витаминный

завод), С-- аскорбкнозая кислота, фолисзая кислота, А - ретинола-ацетат (объединение "Октябрь"). А^ - кальциферол (Уманьокое ПО

"Витамины"), Е - токоферол (Одесское производственное химико-фармацевтическое объединение "Дарница"), Р - линолевая кислота (Львовский завод "Реактив"), К - викасол (Киевское ПХВ объединение имени 60-лет СССР), п-АЕК (витамин Bx,Hj) - пара-аминобен-' зойная кислота (Ереванский завод химреактив), и -метилметионин-

(Йопкарол1шский витаминный.-завод),-хижин хлорид ( seeva kev/-xoiüc ), мезо-инозит (Алтайский .завод химрвактив НПО "Биолар"), • ~ пангамовая кислота (Уфимский витаминный завод). Витамины вносили в среды перед посевом и делали двукратные разведения -(от 0,5 до 0,0015$) в пробирках. Среднее-разведениями витаминов скапивали и засевали суспензиями спор исследуемых микроорганизмов.

Влияние витаминов на вторичный рост исследовали также на поздних стадиях развития. Для этого использовался метод Зриксо-на (Прокофьева-Бельговская,1963). Микроорганизмы выращивали в часках Петри на целлофане, а в четырёх-семисуточном возрасте переносили на свекую среду, модифицированную введением витаминов.

Действие витаминов на вторичный рост микроорганизмов изучали в сочетании с канцерогенами (нитрит ца, дизельное топливо и 9-10-диметил-1,2-бензантрентрацен), солями меди ( CuS04, CuCl2 ) и свинца С РЬ(П0,)2 ).Их вносили в среды также в серии двукратных разведений toT 0,5 до 0,00152), как и витамины.

Посевы выдерживали в термостате при температуре 28-30°С четыре недели. При переодичсских просмотрах учитывали сроки появления, частоту образования вторичных колоний, а также их типы (Никитина, Каяакуцкий,1977) и вес.

Об ингибирущем действии витаминов судили по отсутствии вторичных колоний, уменьшении их числа и размеров. Увеличение

частоты образования вторичных колоний, их размеров и веса оценивалось как стимуляция. Отмечали также культурально-нсрфологичес-кие особенности культур, использовали икалу цветов А.С.Бондар-цева (1954). .

.Микроскопические наблидения и фотографирование проводили на микроскопе МЕИ-б, используя фотокамеру "Зоркий-^".

Методом электронного парамагнитного резонанса определяли наличие свободнорадикпльних соединений з клетках первичного и вторичного роста. Их экстрагировали из биомассы в течение 2 часов 50,» метанолом. Осадок отделяли центрифугированием. Экстракт лиофилизировали и перерастворяли в налом объёме 50^ метанола (I объём на I г сирой биомассы). В спектрометр РЭ 1306 ЭП? помечали экстракта и ^ 0,1 И к,?е(сЯ)д.

Для определения витаминоз в'питательных средах при наличии и отсутствии вторичного роста использовали микробиологический 1!етод (Одинцова,1959) с применением витаминозависимих культур:' Р1сЫа Гегпег^апз В1М-1375, дефицитную по витамину В|, ЗассЬа-готусва

гаусса а1врогивВКМ-1034, дефицитнуп по.витамкпуВ^ РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Влияние витаминов на вторичный рост грибов . Как_видно из данных таблицы I, витамин'«," алешшие в среды перед посевом, способны ингибировать и стимулировать вторичный рост грибов. Эффект может быть однотипным, но чепе он двойственный, зависимый от концентрации: высокие концентрации ингк-бируит вторичный реет, низкие - стимулируют.

Хотя витаминам приписывают (Ленккжер,197'); Алекперов, 1939) самые высокие индексы универсальности действия, необходимо отпятить различия в характере влияния их на вторичный рост грибов разного систематического полояения.

Так витамин В^- и Ъ^ оказывает выраженное влияние на вторичный рост только у Р. ЬиаЫсепска Уаг.МавиооХа. Однотипное стимулирующее действие витаминов В^, я фоллевой кислоты не является универсальным для всех исследованных грибов. То ке мояно отметить для ингибирувцего действия зчтачи-нов Д и К.

Не обнаружилось выраженного влияния на зторячнмЯ рост грибов у витаминов А,Е, холина и инозита, поэтому они не значатся в таблице I.

K o tí t-

o cN

Cí H •

« fí u a a R cj 5M

sj «

fr«

o

a s

Cj a. « >

« ai

o a

o O1

ta cp

o CV

£ i

5-

e*

CJ

oí"

a

s

o aJ

n S) al --Í o

r >

3

c

o U

■H

x¡

zt

n

^»aJ s ~

S S)

E-*

a

o

3 3

«s H

« 4

eJ ra §

b

w SI

■s a. >>

H a

a

I

3

K

IA

f-< IA t- IA

O P H-f

O Q ci; o

íS o

o a

i m ! IA a i

W Ul ca Ut

o Ó O O

i i

i i

O CVJ

p o

o . i 1A

a

o

CU

a

?

t l in

IA in t-J O O O

tr» 0

, ° ? I cpg ,

IA O .

' m *

O o

fies

A

cu d

m

CU

Q m

I •

in o cu

I 1 I

inca

m

a.

ó I ■

IA CU 1-t

o

lililí

IA

IA tr!

3 8

o 1 1 ?

IA IA

d d

1 I I

IA

o

IA »

I UV CU

IA

0 I

1

IA

I I r

o

—o-

O'-I I -

IA

M

O . d

IA &

'Í'

OJ

ó

• I

0

1 •

IA

o

o o

r»

o

-o •

I I I I I

l~ I

un §

0

1

IA

lili

o o

ó 1 L I

IA CU

O 1 t

IA '

OJ

>-H

d

i i

8 —

? i

IA CU

Ó

IA '

vw

8 . «

0 l

1

IA CU

, 8

o , ?

m «

o

tA

- o

0 I

1 cu

IA \Q CU O

3?

LA CU

O O

IA ÍU

O O

IA

IA O y-1 O

O

o

0

1

o o

ó d

o

o *

0

1

o o

d

o o

• IA

0 «

1 o

ITl

O Q

O O

■ *

0 o

1 I

A U->

o d

o o

0 o

1 t

IA IA

O O

0

1

IA

3 d

OJ

3

d i

IA

1 I I 1 I 1 I

t--

3 O

IA

0

d

1

z> o

o

0

d

1

i i i

s

3

0

d

1

IA

O

IA O (

o

° &

d s

¿ d

O CU 1 IA

d o

IA

i—I CU \0 t—i

« ra .-^o

CM

Pj a, o<

83«*

om

■91

ts-3 u-\t¡s _ •ISmW3

QJ^-» I OO C

« 5J

n

o

tí

a 5J P) H

O

H >»

O f» o

o

a<

X a,

0

R

1

-I*

a y

to .E X

E3

I

I

К особому типу влияния витаминов ка зторичныЯ рост грибов следует отнести результаты опытов, в которых, витания у вносили з среды для культивирования А.кэг.а;;отавпз1п ит.1332. В контроле вторичные колонии били мельче по размерам, имели мягкую консистенцию. Они состояли из дрозосеподойных клеток з легко распадавшихся скоплениях. 3 присутствии витамина У зто-ричных колония образуется приблизительно столько не, кгл*. в контроле, но они имеют более крупные размеры, ягсткуп консистенция, поверхность их образована спороносячим воздушшм мицелием. Следовательно, витамин и избирательно восстанавливает диффе-ренцнровку во зторичшгх' колониях А.Ьшаса'л-аяпрХа Характер действия витамина и не меняется в присутствии ингибируйг,ей концентрации-витамина К.

2. Влияние витаминов на вторичный рост акгиномицетол

Характер влияния витаминов на вторичный реет с.ктпномице-тов при внесении в среди перед посевом (табл.2,3) отражает те ге--законсмерноститткотор«^1и!^зш:з^екы-в-опытах-о-грибами. -Универсальности-действия не "обнаружено. Показана возможность как однотипного, так и двойственного эффекта. Различие в чувствительности к витаминам у грибов_ и аг.тиномицетов выражается в тон, что однотипное действие на прокариота оказывают другие витамины: только ингибирувцее действие выявлено у витамина А и липоевой кислоты, только стимулирующее - у холина и инозита. Все остальные витамины оказывают двойственное , зависимое от концентрации, действие: высокие концентрации ингибируэт вторичный рост, низкие - стимулируют.

Многие витамины, в высоких концентрациях подавляют первичный рост стрептомицстов (табл.2) и представителей редких родов актиномицетов (табл.3).'

На вторичный рост стрептомицетов не оказывает влияния витамины Н, а-РР, К и холин.

Данные таблицы. 2 даст основание отметить различие чувствительности к витаминам дше у культур одного вида - з.гоовсСХа-лю. Преобладавшим типом действия витаминов на зторичтШ рост продуцента розеофунгина (птани 1123) является кнгибирупний оффект. У продуцента флавомицинз (штамм 13<й) о нестойкими нарусенияни дифференцировки и деления клеток преобладает отинулирувяий '¿[фе^т (у II витаминов из 15, указанных з таблице). Отмеченные различия, вероятно, связана с тем, что у птамма 1129 нарушения дк^е-

t--G a>

a.

t*

a'

■zs n

"J, tr>

'il i

—•

2 «

¡rl

C- o

m

1 C3

in

•

a Q.

S) •

1} w

Z)

o

—<

O i)

o

3

o

c. -J a.

c* •

•

w O

b

-n

n

X

H '

cr 3 n

C^l

n o

H J

a 3

a •

„ => o.

D n •

3 CO «

N <=t

~CJ o

M

VI

o j

o

u ■n

o

"J

» >»G

03 o

H

_ O

"Z

5

•

=; a.

>> -

CO

CvJ •s

t—1

i—4 o

t-

a X

„ 3

A a.

> TJ •

Cj -=£ si

r-! o

<H

O ' -«—*

tj

O

o SI

r-« •

i> a,

•

■>»c

a

b

H

H

cn

in d

Q S3

8d

- o

O I

I . in

in CM ft

o o

o 3

o t

t--s

d in

l-l *

a t

m o

0

3

q

1

in

3 «*

0

M O

d

1

n o

8 o . i

O PJ

in .S d d in

CM

in m in in

in t-M M i—f

o l-H o a 8

o o o o

o

Ci o I—1 d d

1 ? I i i i

M 1 1 l m 1 1 1 o i—i in

c\ in. CM m CM

o CM M in Q o n

O in o ■Q ti o O

in o

f» in <-( o

I

\ /

in CM

3 s

0

1

en

3 d m

C\J

in d

? ?

m m o o

in d

0

1

C-l

a

m

CM

i d i

in

in

CM

d t

in

0 o o o

1 I I

-III

C? in

O kH

dS

I o

CM I

vp in O C\J

d o in

CM

t-< J

d I

in

I I I

in in in in in in

ft

o o o o o o

in

'—t in m

3 in f-1 o in v-f in m )-) n

o § o 3 o 8 8

i ft o • d 1 1 ft ft

en o i o i o o

a 1 tn 1 in l 1

o u^ CM in CM in in

o O o o o 3 o

IA in

888 i —. « .

a o o i i i

in m in

odd

in

C\J

Q I

in d

0 a

d

1

in

CM

; f T f

I -n I d

m o

>-( o

0 «

3 o

d in

1 CM

in 1—1

I T;n^r T. T d

till

r\

3

d i

m

t 1

i -i

i i - i

?

in

t- in f-H

o

o C— o

d s .d

T in —¡nrr-f O - in

1 o CM

o in •-H

d d o

in m

n >—i CM

p m

o O i d

d "o 1 i in

i J

in m o

o o tn in

1—1 1-H

o o

o o

o o

1 i t in I OJ

>-i o ^

d d

o

o

i Q.

>3

3

?

Ci.

o

H

1 n

V

a.

s

PI

H

« H

o

in a at

M o ut

8 a. »t

»X 0)

o g

i tq

in ? EH

« s O

Q H

Q,

u> O

r t

I I

o o

I I

I I I I I

in

I ft I

o

""x

m in 8 o in

i (-1 o >-1

O o m o

o o o o d 3 C\i o

i i

0 1 0 1 O 1 in HH m 1—i 0 1 o 0 1

in in in o o in in

O o 3 3 o o o

8 3

d d

i i

in m

o 3 o

in

CM

0 I

1

CM o-. t

ej

ex, c.v<

^ fs

w

cr

ejd iniq

, no to 1 cf; s S

rxr-1 a

s

u)

fc:

i

i i

i i

O I I

: i

Таблица 3 Концентрации (А) .витаминов, влияющих на представителе! редко встречаиадхся _родов актинокдцетов_

¿Лсгопоповрога, ИТ.1723

о гсутс1лле1аодаьлеьле! стимуляция

Ас1;1псв1ас1ига, щт.б5

итсутстие! Цода-влекие* стимуляция

и.р.

•„¿л

п. р.

Носогсиа, шт.531

оТс утотдие ¿подавление!стимуляция п.р. •' п.р. ^ д.а.

0.5

0,015-0,0015

0,5-0.0015 0,5-0,125 0,0С2-0,0015 0,5

0,5-0,0015 0.007-0,С015 0.5-0,125 0.0С2-С.015 0,5

0.5-«,125 ' 0,5-0,007 0,5-0,015 0,015-0,0015

0,5

Зг

J3

-V,

-12 С

И

?

РР й_?р

0,5 0,25-0,0015

А3 - 0,5-0,0015

Д - 0,25-0,0015

2 0.5 0,25-0,0015 Ш2ШЯ> о,5-о.огг 0,031

холил 0,5 - 0,031-0,0015 , р.5

а-Ш 0,3-0,125 0,125-0,0015 -

и - 0,5-0.0015 - |-

0,5-0,031 0,5

0125

0,5

0,5-0,007 \0.00I5 0,5-0,0015 \ 0,25-0,031 - 0^25-0,003

0,5-0,25

0,125-0,015 -0,003-0,0015 - 0,5-0,062

0,5-0,0015 ' -- 0,062-0,003 0,25-0,125 -

0,5 , 0,25-0,003 -- 0,2.5-0,003 -

0.5-0;015 0;0|7-0,0015 - 0,5-0.125 0,062.-0,031 „•?

' 0,015-0,0015 0,5 ■' vj.03L-ti.00T-

0,5-0,125 0,062-0,0015 -

0.г5-0,25 0,125-ф0К

Примечание: и.р.-п^рвачнил рост, в.р.-вторичши рост, - отсутствие действия

ренцировки и деления клеток при вторичном росте имеют стойкий.наследуемый характер. Нормализующее действие витаминов эффективно именно при отом,наиболее глубоком типе нарушений. Это косвенно свидетельствует, что действие витаминов проявляется на генетическом уровне. '

У представителей родов М1сготововрога, НосакЦа ■ преобладающим типом влияния витаминов является ингибирование вторичного роста (табл.3). Стимуляция характерна только для холима и ви-вамина и ..

^з. всех исследованных мицелиальных микроорганизмов наименьшая чувствительность к наличию йитвиинов в средах проявилось у вторичного ростаАсипотас1ига ар. шт.65. Только два витамина (а-РР и липоевая кислота) его ингибируют, а три (Н.а-РР и холин) стимулируют.

Стимулирующее влияние витаминов на рост мицелиальных микроорганизмов было сопоставлено по весовым показателям, которые суммируют влияние витаминов как на частоту индукции вторичных колоний, так и на селекцию их клеток, что отражается в размерах вторичных колоний. .

Наиболее значительное увеличение веса вторичных колоний достигнуто у грибов родовРеп1с 111-1 ит и Аврег^Шив . У Р.сЬгуво-genum шт.239 на среде с витамином РР биомасса вторичных колоний в 37 раз превосходит контрольный вариант, с п-АБК--в 21,^с витамином - в 17'раз. У Р.сЬгуаоевпит шт.194 подобным действием обладают биотин- в 12 раз и РР - в 7 раз. УА.1сапаБа«агде1а увеличение биомассы вторичных колоний достигается витаминами 15 раз), Н (в II раз), В^ и никотинамидом (в Ю раз), В^ и Р (в 8 раз). С (в б раз).

На культурах прокариот весовые показатели наиболее высоки при наличии в средах витаминов В^ и Вес биомассы вторичных колоний увеличивается в 2-1 раза.

Следовательно, в селекционных исследованиях с мицелиаль-ными про и оукариотами целесообразно использовать витамины, т.к. они способны многократно увеличивать накопление биомассы клеток со структурными и метаболическими особенностями.

3. Влияние витаминов на вторичный рост микроорганизмов на поздних стадиях онтогенеза При переносе Р.Ьи1ЫБвпит var.blasti.cola на среды с витаминами В2 и С в 7-суточком возрасте вторичные колонии формируются в меньшем количестве и резко отличаются от вторичных коло-

ний в контроле. Общим их признаком являются утрата тенденции к кно-гослойности роста и жесткая консистенция. При микроскопировании у них выявлено нитевидное строение, что свидетельствует о нормализации деления клеток.

Особенность действия витамина РР состояла.в том, что его наличие в среде, начиная с '?~х суточного и с 7-суточного возраста, не только ингибирует образование вторичных колоний, но и полнооты) нормализует развитие гриба. Он формирует белый воздукный мицелий с множественными типичными макро и микроконидиями.

У А.ка1ада"лгаепа1з шт.1332 ослабляется стимуляциониый ¡эффект витамина Н, меняется на противоположный (стимулирующий на ингиби-рующий) эффект витамина В^, проявляется ингибирувщее действие фо-лиевой кислоты, витании С не ингибирует первичный рост.

у p.chгysogonuIa шт.239 выявился отимуляциошшй эффект витаминов. й % и ингибирующий В^.

Связанное с возрастом изменение чувствительности к витаминам обнаружено и у прокариот.

Влияние витаминов на вторичный рост микроорганизмов в сочетании о канцерогенами"

Показано, что витамины могут полноотап па^^гжгпг'клп ослаблять действие такого сильного канцерогена", каким является дизельное топливо. Зто наблюдается у Р. сЬгувовйпшп -шт.239 з присутствии витаминов и и липоевой кислота, у Э.говеоЛптиа уаг;гозео?ип£1п1 А и У Шсгоиопозрога 5р, шт.1723 витамины II и В^ и а-РР вторичный рост з присутствии дизельного топлива не нкгибируот, но поникают частоту образования вторичных колоний( табл. ¡\ ).

Влияние ДМБА на вторичный рост г.Ьи1Ъ1яепия var.blaBti.cola выражается в увеличении частоты образования вторичных колоний на 23!(£ по сравнению с контролем (Есенова.1988). В нашей работе ДМБА испытивался в концентрации 5 гесг/мл в сочетании с витамином РР (0,252) после сенисуточного выращивания гриба на средо без витамина. Было показано, что действие канцерогена язляется более сильным. Оно снимает нормализующий эффект витамина РР.

Ранее М.Э.Файн (1992) установила, что ?Ъ(Ж>3)2 в широком диа-логоне концентраций (0,001-1,0^5 стимулирует вторичный рост Р. <Жгу-соБвпша ИТ.239 и Т. гоееия шт.959. 8 присутствии витаминов этот эффект подавляется: у ?• сйгувозепит пт.239 в присутствии витамина и и липоевой кислоты, у Т. гозеил - витамина Д.

Витамины кок с двойственным (В^ в опытах с з.гопеоПагиз ит. IЗЩ. В(5- в опытах с 3 .гозеоПауиз уаг.гоаооГиаяЗл! ).так и с однотипным ингибирующим характером действия в большинстве

Таблица 4

Оочетаняое действие витаминов и дизельного топлива на кицелиальные микроорганизмы

Хульгура ¡испытуемые ! Концентрация. %

;соединения 0.5 0.25 ! 0.125 0.062 0.031 0.015 i0.007i0.003 !0.0015!Контроль

Дизельное 4 5 12 13 10 1Б -II б 10

топливо

?. сги-^ -

дизельное

ЯОЯ'-'ПЧЯ топливо

нит. У н.в.к. н.в.к. Н.И.К. н.в.к. н.в.к. 2 10 9 8

¡¡Х1«М '¿39 дизельное

тоаливо+ли- 1

цо евая к-та Н.В.К, н.в.к. н.в.к; 8 3 7 7 8 10 3

.Гсзео-1/ца таг. дизельное ТОПЛИВО дизельное топливо* вит-А 23 н.в.к. 35 н.в.к. 42 10 31; 181 35 15 36 16 35 16 38 20 38 1 » ГО 20

'•••*ео£иг.к1.п3.дизельное х128 топливо+вит.

Вв н.в.к. 28 г .14,1 18 20 24 23 16 30

дизельное ГП20ПО- ТОПЛИВО Ц 13 14 18 19 . 28 46 37 21

дизельное гопливо+а-рр н.р. н.р. н.р. н.р н.р. 19 24" 18 19

ам(ц723 Дизельное топливо* вит.Н н.р. н.р. н.р. 10 10 II 12 15 15

Дизельное ТОПЛЯЕО+ДИТ.В- н.р. о н.р,- н.р. 'н.р; 6 18 13 16 15 27

Примечание : н.в.к. -нет втори ■шых колонии, н.р. - нет роста,

вит. - витамин

' -13- .

гспнтанных концентраций иигибирувцей активности на.вторичный рост ст-рептгницетоз з присутствии ^¿цо не проявляет.,

5. Метаболические особенности иицелкалыых микроорганизмов при наличии и отсутствии вторичного роста •

В дополнение к ранее известным сведениях представлялось ветоши выявить те особенности метаболизма, которое кино было бы привлечь к объяснению последствия влияния витаминов на вторичный рост, микроорганизмов.

Впервые были получены данные о связи наличия в культурах микроорганизмов вторичного роста и образования свободных радикалов, но эта закономерность не является универсальной.'Свободиорадикиль-вые-гоеди-ненкя выявлены (рис Л) у прокариот (роды з^8?1слусе:ьАсипс=:аздгз,

Щсготопоарога 3« 110 нз обнаружены з экстрактах клеток грибов, у которых витамины А и Е. не иигнбирувт "вм'рйчныЯ'ро'б*.. 7

3 спектре ЗПР препаратов'клеток З.гоаеоПагцз упг «говёоГ ивгШ 1128 со стабильными нарушениями дкффереицирезки и деления клеток при вторичном росте обнаружен секстет линий, обусловленный нитрэксильшш свободным радикален с парамагнитным центром типа; углевод - ^ "(рис. 1а). "35-

Этот сигнал не обнаруживается у З.гозеоПа-ша эт,- П28'~' ¿"условиях, исключавших появление вторичного роста* (на среде с дрожхевйм экстрактом), и у ревертантсв клеток вторичных колоний (Впнюксз с соззт., 1936). Они не" зыязленн нами также з препаратах клеток _яторичнах_г:<шь ниП З.гозеоПау'иа стДЗ^ с нестабильным фенотипом. Ото"" у^гОй.'-^ зает па значимость выявленного радикала з индукции стойких нарушения дкфферекцирозки и деления клеток. Ослаблений сигнала при наличии з питательной среде зитакииа А, ингибирувдего вторичный рост таг, ,.'ах,.гооао^изр1ш'дает основание считать, что, как. и у лыссих организмов, он действует как антноксидант, за'днцаюс'ий клетки от повреждающего действия радикала.

СинглетныП сигнал при исследовании ПП? препарата -слеток жоаоорога пт.1723 (рлсДб) при !шкчяк з среде у/.самхяа У т/.пич;-ц для делоколизованного неспасенного олектрона и происходит, по-ипгимечу, от конденсированных структур меланинов, что соответствует темной пигментации, сопровождавшей появление вторичных колоний. Отсутствие сиг-гала в скстрактах биомассы серзпчного и вторичного р-:ета ?, контроле (на средах бег зитакннов) указывает на выявленного сигнал.", о

валянием в среде витрина и .

Секстет л:кгиЛ на спектре ЗПР пропаретов я» кьегк; АсЯясйлЛлг-.

"î'

a.

iL

ê.

Рис Л. Спектр ^'¡F преппртов, полученных клеток:

0 _ ¿.г ••с-; '."v......- « " Ц-'.Чсл; г

- . с г Л "-'с ? : , - «,-.

шт.65 (рисДв) в" сравнении'с секстетом"линий спектра ЭПР препаратов ИЗ клеток З.гозеоПауия гаг.гоееоГл^Хп! ыт.1128,демонстрирует значительно меныгие константы свергонксго взаимодействия. Он не мо-зат быть однозначно отнесен к нитроксильным радикалы).Предполагается, что соседство нитроксильноя и ненасыщенной группировки может привести к подобной модификации сигнала. Отсутствие сигнала з экстрактах биомассы в контроле указывает» на связь выявленного сигнаШ'с'ЪзШпГеи витамина Вр обладавшего мутагенной активностью. УЗ.реисеииз уаг.са-

еа1из слабый сигнал выявлен только в. присутствии 0,062$ фолие-вой кислоты, стцмулирувдаей вторичный рост.

У преобладающего числа исследуемых микроорганизмов (грибов и ек~ тиномицетоз) вторичный рост сопровождается секрецией витаминов В^ и Вб а питательные среды, что обусловливает рост витаминозависимых культур Я.сегеу1з1ав и з.сЦярогив • Мсгно предположитъ, что при отсутствии секреции витамины находятся в' биокассе исследованных культур в связанном состоянии. Вероятно, это способствует нормальному прохождении цикла развития и вторичный рост не возникает.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.. В, результате выполненных исследований вкяз л ено стимул и пгвие а_ я ингибнрующее действие витаминов на вторичный рост мицелиолыси. микроорганизмов разного систематического положения. Как и у выспах организмов при новообразованиях, витамины- оказывают двойственный эффект при нарушениях дифференцировки и хлгточнбго деления -микроорганизмов. Только у двух, витаминов .(А и-К) выявлено однотипное ингибируюцее действие, у двух (холин и инозит) - только стимулирующее.

Дзойственкссть биологического действия витаминов получила объяснение в генетических исследованиях. У витаминов А,С,Е обнаружена антимутагенная активность (Слепян,1973;Алекпероз и др.,1977;Шигаева, [ Ахматулина, 1983¡Алекперов, 1959 а,б; Зесух:1«а,Чег:г:капгили,1991), у С,В1,РР - мутагенная (Орлова, 1972;ЗисЬ et а1.,197б;Хардеи,Браун.1931; • Богданова,193*»). Эти сведения О витаминах могут быть привлечены для объяснения результатов наппХ экспериментальных исследований. Но ¡таи данные дают основание предполагать наличие мутагенной и антимутагенной активности у более пирокого круга витаминов, в частности антимутагенной - у витаминов 32, В12,РР и С . способных восстанавливать дифференцировку и нормализовать деление клетс*: з формирующихся вторичных колониях шщедиалышх микроорганизмов.

На основании данных о связи явлений мутагенеза и канцерогенеза (Никифоров,1965; Раппопорт и др.,1970; Дубинин,197б;Рамзль,1336) и наличия у вктачинов мутагенной и аитимутагениой активнсстн объясняет-

ся различие эффектов, оказываемых . витаминами при канцерогенезе._В_ частности витамин С считается активным противоопухолевым агент_омь_кр^ он фпособен тоххе стимулировать размножение опухолевых клеток растер ний (Слепян,1973) и человека (Гольптейн,1931). При сочетанием использовании витамин С лиаает метотрексат всякой противоопухолевой активности, но в 5 раз усиливает действие 5 -фторурацкла на клетки нейро-бластсьш(Праоад,1979). '

Аналогичное влияние витамины могут оказывать на ингибирувцую активность противоопухолевых соединений при вторичном росте микроорга-низмов(Есенова,1983;Никитииа и др.,1991). В присутствии витаминов РР,

и ^ У циклофосфана, тиофосфамида и аспарагиназы. усиливается способность подавлять вторичный рост У 3?,Ъи1Ыкедиа Уаг.Ъ1аяг1ооХа. Но витамины РР и В^ полностью лишают ингибируюцей. активности антибиотики- оливомицин и рубомиции. На основании полученных нами данных этот аффект иожет быть объяснен стимулирующим влиянием витаминов РР и В^ на вторичный рост гриба.Причем ото влияние.оказывается более' сильным, превосходящим ингибируюггсе действие антибиотиков оливомици-на и рубомицина'.

Витамины продолжазт использоваться в комплексной терапии:опухо-"лышхГ§йболевышй. Возможность получения противоречивых-'результатотг— и вероятность снижения, в присутствии витаминов оффективности применяемых противоопухолевых препаратов' порождь ту сложность, из-за которой витаминизация остаётся малоизученных направлением химиотерапии опухолей (Гирин,1930).

Наличие аналогий в характере действия витаминов при новообразованиях еыссих организмов и вторичном росте микроорганизмов должно •привлечь внимание. Использование микробных объектов, более доступных для изучеииклонсхет понять ход окислительно-восстановительних процессов, сопровождающихся накоплением свободных радикалов, а также объяснять двойственность действия витаминов, связаннув с возрастом и типом клеточной организации объекта. Сравнительное исследование культур, по разному реагирующих на присутствие витаминов в питательных средах, даст возможность выявить та особенности метаболизма, при которых на-рупгнке дифферанцировки и деления клетох могут стимулироваться и ин-гибнроваться витаминами,' ВЫВОДЫ

I. Витамины способны стимулировать и ингибировать вторичный рост у прокариотны* (роди 31гер'.оВ1уеег,'.Цсготопосрс1 -.Ас!.;;,о:¡п.;л-., '¡.•"•гтиа ) И эукчрИОТИЫХ (роды Гц-лЧшМ ?»1г.Ш« ии.А.-р- - -

gilluз1 Тг1сЬо1йес1иш ) мицелиальных микроорганизмов.Ко-

нечный эффект зависит от концентрации витаминов з питательных средах, от типа клеточной организации микроорганизмов, их возраста и систематического положения.

2. При стимулирующем действии на вторичный рост'витамины усиливают индукции и селекции 'клеток вторичных колоний, что выражается в увеличении их числа и размеров. Наиболее значительное увеличение веса биомассы вторичных колоний выявлено при введении з среды витаминов

' РР(в 37 раз), пАБК (в 21 раз), В12(в 17 раз), В15 (в 15 раз). .

3. ИнгибируЬций эффект витаминов зарекается в полном подавлении вторичного роста, з снижении частоты образования вторичных колоний

и уиеньсении их размеров.

У большинства испытанных витаминов выявлена зависимая от концентрации двойственность действия: высокие концентрации ингибируют вторичный-рост, низкие - стимулируют» однотипное ингибирувцее действие характерно только для витаминов А и К, стимулирующее - для холина и инозита. -5.-Двойственный характер влияния витаминов 'на-вторичный-рос-т-иадге-лиалышх микроорганизмов может быть обусловлен возрастным- изменением их чувствительности. Наличие витаминов З2, В^.РР.С з средах в период прохождения всего жизненного'цикла стимулирует вторичный рост р.ЬиШаеаиа уаг.Маа«со1а- .' На поздних стадиях'онтогеие-заСпосле 7 суток) эти-витамина восстанавливают дифференцировку и нормализуют деление клеток в фориирувяихся вторичных колониях гриба.

6. При совместном внесении в среды витамины (А, и .В^.Н.В^, а-РР, Д и липоевая кислота') подавляют стимулирующее действие на вторичный рост мицелиальных микроорганизмов-дизельного топлива и рь(к^)2' Нормализующее дифференцировку и деление клеток действие витамина РР не проявляется в присутствии 9,10-диизтил-1,2-бензантрентрацена.

7. У больиинства исследованных мицелиалышх микроорганизмов наличие вторичного роста сочетается с усилением секреции витаминов ^ и В^ в среды.

8. Появление наследуемых нарушений дифференцировки и целения у з.госэ-

оПауив уаг.гооеоГш^хт связано с накоплением з клетках исходной культуры и вторичных колоний свободных радикалов нитроксиль-ного типа. Гашение выявленного сигнала в спектре ЭПР при наличии в средах витамина Л свидетельствует об антиоксидантной природе его ингибнрующего вторичный рост действия.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1.Myr.anoBa Г.С..Сивсрцева В.Д. .Садикоза 5.3. .Иванова H.A. Влияние витаминов на вторичный рост у микроорганизмов// Тез.докл.УП съезда

' ВУ.О.-Алма-Ата,1935.-Т.2.-С.101.

2.Садыкова Ф.Э..Мукапова 2.С; (Сиверцсва З.Д. Вторичный рост при наличии в средах витаминов //Естественная и индуцированная изменчивость микроорганизмов.-Алма-Ата,1938.-Т.33. _С .116-120.

3.Садикова Ф.З.,Айтхогина Н.А ,.Никитина Е.Т. Вторичный рост микроорганизмов на питательны* средах о витаминами //Известия АН КазССГ.

' серия биол.-1989.-#1.-С.34-38.