Влияние условий культивирования на термотропное поведение липидов Pseudomonas putida и Yersinia pseudotuberculosis

Попова, Ольга Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние условий культивирования на термотропное поведение липидов Pseudomonas putida и Yersinia pseudotuberculosis
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние условий культивирования на термотропное поведение липидов Pseudomonas putida и Yersinia pseudotuberculosis"

На правах рукописи

003467035

ПОПОВА ОЛЬГА БОРИСОВНА

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ТЕРМОТРОПНОЕ ПОВЕДЕНИЕ ЛИПИДОВ PSEUDOMONAS PUTIDA И YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 G -

Владивосток - 2009

003467035

Работа выполнена в Отделении биохимии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Санина Н.М.

доктор биологических наук, профессор Васьковский В.Б.

доктор биологических наук, в.н.с. Бузолева Л.С.

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и

биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Защита состоится «28» апреля 2009 г. в 10°"часов на заседании Диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 -лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан «25» марта 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

д.х.н., с.н.с. JjJjU^f^ Авилов С .А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Выяснение роли липндов в молекулярных механизмах адаптации бактерии является важной задачей современной физико-химической биологии. Мембраны бактерий обеспечивают первичный контакт клеток с окружающей средой и являются одной из универсальных систем передачи информации. Известно, что поддержание определенной жидкокристаллической структуры мембран является необходимым условием для активной жизни бактерий, их устойчивости к воздействию различных факторов окружающей среды. Клетки часто отвечают на эти влияния, изменяя количественно, а иногда и качественно, состав их мембран. Этот феномен называется гомеовязкостной адаптацией, п впервые был изучен на лииидах Escherichia coli (Synensky, 1974). Наряду с этим термином в последнее время используется более конкретное понятие «гомеофазная адаптация», подчеркивающее важность поддержания определенного фазового состояния мембран, а именно ламеллярной жидкокристаллической фазы. Несмотря на широкую известность этого феномена, немногочисленные работы по гомеовязкостной/гомеофазной адаптации бактерий выполнены лишь на нескольких видах (Morein et al., 1996; Hartig et al., 2005; Baysse, O'Gara, 2007).

Структурные и динамические характеристики липидного матрикса могут меняться под влиянием таких факторов как температура, давление, питательные вещества, рН, ионы, ксенобиотики, а также фазы роста культур бактерий (Beney, Gervais, 2001; Baysse, O'Gara, 2007). Поэтому изучение влияния внешних факторов на липидный матрикс мембран, как ключевых элементов взаимосвязи между внешней средой и внутриклеточными ответами микроорганизма, может прояснить вопросы резистентности, или, наоборот, уязвимости бактерий. Два вида различных семейств грамотрицательных бактерий, Yersinia pseudotuberculosis и Pseudomonas putida, характеризуются большим разнообразием условий обитания и, следовательно, обладают хорошими адаптационными возможностями, быстро приспосабливаясь к изменениям в окружающей среде (Бахолдина и др., 2001; Бузолева, 2000; Regeard et al., 2000; Spiers et al., 2000), поэтому представляют собой удобные модели для сравнительного изучения влияния абиогенных факторов на физико-химические свойства лигшдного матрикса бактериальных мембран. Выяснение молекулярных механизмов адаптации этих бактерий позволит целенаправленно регулировать биологические свойства бактерий, а, следовательно, эффективно использовать металлорезистентные штаммы Pseudomonas putida при биоремедиации морских акваторий и воздействовать на вирулентность распространенной энтеробактерии Yersinia pseudotuberculosis.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было комплексное изучение состава и термоипдуцированных фазовых переходов гель - жидкий кристалл липидов двух различных видов грамотрицательных бактерий Yersinia pseudotuberculosis и Pseudomonas putida, культивированных при различных условиях. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ влияния ионов Си2+ и Cd2+ на состав липидов двух штаммов Pseudomonas putida IB28 и IB 13 при различных температурах культивирования.

2. Изучить влияние ионов Си2+ и Cd2+ и их комбинированного действия с температурой культивирования на термотропное поведение липидов Pseudomonas putida IB28 и IB13.

3. Выяснить роль физико-химических свойств липидов Pseudomonas putida в изменении проницаемости мембран бактерий под действием ионов тяжелых металлов.

Сокращения, используемые в работе: БЛМ — бислойные липидные мембраны, ГЖХ — газожидкостная хроматография, ДФГ - дифосфатидилглицерол, ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия, ЖК - жирные кислоты, ИН - индекс ненасыщенности, КС -кулыуральная среда, МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот, НЛ - нейтральные липиды, ОЛ -общие липнды, ПБ — питательный бульон, ТСХ - тонкослойная хроматография, ФГ -фосфатидилглицерол, ФИ - фосфатидилннозитол, ФЛ - фосфолшшды, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, Ттах — температура фазового перехода, соответствующая максимуму теплопоглощеиия фазового перехода, С1с- глюкоза, 17:0ср- 17:0 циклопропановая жирная кислота.

4. Исследовать влияние глюкозы и режима аэрации на термотропное поведение липидов Yersinia pseudotuberculosis, культивированной при разных температурах.

5. Исследовать эффект термоадаптацнонных изменений в липидах Yersinia pseudotuberculosis на конформацига OmpF-подобного порина (иерсинина).

Положения, выносимые па защиту:

1. Культивирование штаммов Pseudomonas putida 1В28 и IB 13 в присутствии ионов тяжелых металлов (Си2+ и Cd2+), особенно при повышенной температуре, приводит к увеличению доли кислых фосфолипидов.

2. Ионы тяжелых металлов сорбируются преимущественно кислыми фосфолипидамн псевдомонад.

3. Причиной повышенной проницаемости мембран бактерий при действии ионов тяжелых металлов является фазовое разделение липидов.

4. Адаптация штаммов Pseudomonas putida IB28 и IB 13 к высоким температурам и толерантность к ионам тяжелых металлов обеспечивается двумя общими механизмами: насыщением и метилированием ненасыщенных ЖК.

5. Понижение температуры и добавление глюкозы в среду культивирования в условиях аэрации аддитивно снижают температуру фазовых переходов липидов Yersinia pseudotuberculosis.

6. Повышение температуры фазовых переходов липидов Yersinia pseudotuberculosis при отсутствии аэрации и глюкозы сопровождается увеличением содержания лизофосфатидилэтаноламина.

7. Липиды Yersinia pseudotuberculosis с разным содержанием лизофосфатидилэтаноламина, полученные в результате культивирования при 37°С и 8°С, в разной степени влияют на конформацшо мономерной и олигомерной форм иерсинина.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено комплексное исследование состава липидов и термотропного поведения двух штаммов Pseudomonas putida и Yersinia pseudotuberculosis при адаптации к различным внешним условиям (различные температуры, присутствие ионов тяжелых металлов и глюкозы в среде культивирования, разлные режимы аэрации аэрации). Впервые показан различный эффект липидов Yersinia pseudotuberculosis, адаптированной к низкой и высокой температуре, на конформацию OmpF-подобного порина (иерсинина). Впервые установлен липидный состав двух металлорезистентных штаммов P. putida IB28 и IB 13 и показано, что причиной повышенной проницаемости мембран бактерий при действии ионов тяжелых металлов (Си2+ и Cd2+) является фазовое разделение липидов, к которому приводит связывание кислых липидов с ионами металлов. Полученные результаты имеют не только фундаментальное значение для развития физико-химических биологии и экологии микроорганизмов, но и для решения практических задач, связанных с биоремедиацией морских акваторий, с регуляцией вирулентности бактерий под воздействием факторов окружающей среды, с разработкой мер профилактики инфекции, а также технологии переработки и хранения пищевых продуктов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции «BioScience2004», Glasgow, Scotland, 2004; III съезде биофизиков России, Воронеж, 2004; 3rd EuroFedLipid Congress, Edinburgh, Scotland, 2004; 7lh International Marine Biotechnology Conference, St. John's, Newfoundland and Labrador, Canada, 2005; 13lh International Biodeterioration and Biodégradation Symposium, Madrid, Spain, 2005; 9"' International Symposium on Yersinia, Lexington, USA, 2006; Второй Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями», Санкт-Петербург, 2006; II Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», Владивосток, 2006; XI Международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, МЭС ТИБОХ, 2007; Международной научно-практической конференции «Морская экология-2007", Владивосток.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 3 статьи в реферируемых изданиях.

Структура п объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и нх обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 211 цитируемых работ. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 5 рисунков.

Автор выражает глубокую и искреннюю признательность научному руководителю д.б.и., профессору Саниной II.M. за критику и внимание при выполнении работы, к.б.н. Бахолднной С.И за неоценимую помощь в проведении экспериментов и цепные советы, и к.б.н. Безвербной И.П., предоставившей металлрезнстентные штаммы псевдомонад. Особая благодарность профессору университета Техаса в Хьюстоне Богданову М.В. и сотрудникам лаборатории под руководством ' профессора В. Доухана. Сотрудникам Лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН, и особенно с.н.с., д.х.н. Новиковой О.Д. Особая благодарность н.с. Лаборатории биоиспытаний и механизма действия биологически активных веществ ТИБОХ ДВО РАН, к.ф.-м.н. Лихацкой Г.Н. за определение проницаемости бислойных липидных мембран и ценные советы по оформлению работы. Автор благодарен за помощь при выполнении отдельных разделов работы сотрудникам ДВГУ: инженеру ИХПЭ Веланскому П.В. за проведение ГЖХ анализа, инженеру Лаборатории спектроскопических методов анализа ИХПЭ Блохину М.Г. за проведение атомно-адсорбциониого анализа липидов мембран.

Работа выполнена при финансовой поддержке US CRDF и МОИ РФ (фанты RUX0-003-VL-06/BP2M03 и ВР4М03 и РНП.2.1.1.2641), NATO Collaboration Linkage Grants (CLG № 978844, NR CLG 980842), РФФИ (грант № 06-04-96056-р_восток_а) и проекта МОН РФ №603 в рамках АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы на 2009/2010 гг.»

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы

Штаммы Pseudomonas pulida 1В13 (EF581813, GenBank) и Pseudomonas putida IB28 (EF581812, GenBank) были изолированы из морской воды бухты Золотой Рог (залив Петра Великого, Японское море) и охарактеризованы как штаммы, проявляющие множественную высокую резистентность к различным тяжелым металлам (Си, Cd, Zn, Со). Штамм KS 3058 Yersinia pseudotuberculosis серовара 0:1b был получен, как описано в работе (Шовадаева и др., 1991), был типичен по своим морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам и не содержал плазмид. Культивирование штаммов Pseudomonas putida ID 13 и IB28 проводили при 4'С и 24'С на модифицированной питательной среде с добавлением хлоридов меди или кадмия в концентрациях 300 и 80 мг/л соответственно. Бактерии Yersinia pseudotuberculosis культивировали на питательном бульоне (Махачкала, Россия) и питательном бульоне с добавлением 0,5% глюкозы (ПБ+Glc) в аэробных условиях в колбах объемом 1 л на качалке (180 об/мин), либо в таких же колбах в аэробных условиях без перемешивания.

Общие липиды экстрагировали по методу Фольча (Folch et al., 1957). Фосфолипидный состав анализировали двумерной ТСХ (Vaskovsky, Terekhova, 1979). Состав ЖК определяли методом ГЖХ на капиллярных колонках Carbowax 20М, газ-носитель - гелий (Не), температура - 200°С. МЭЖК готовили но методу Карро и Дубак (Carreau, Dubacq, 1978) Термотроиное поведение ОЛ бактерий определяли методом ДСК. Проницаемость БЛМ, полученных методом Мюллера (Mueller et al., 1962), анализировали регистрацией тока с помощью хлорсеребряных электродов в режиме фиксации потенциала на мембране. Количественный анализ содержания тяжелых металлов в липидах бактерий проводили с использованием атомно-адсорбционного спектрофотометра Schimadzu 6601F (Япония).

Конформационные изменения белков изучали методом электрофореза полиакриламидном геле (Bio-RAD Laboratories) по стандартной методике Лэммли (Laemmli 1970). Идентификация белков была выполнена методом иммуиоблоттинга (Bogdanov et al. 2009).

2. Результаты и обсуждение

2.1. Влияние нонов тяжелых металлов и температуры культивирования на термотропное поведение липидов металлорезистептных штаммов Pseudomonas putida Известно, что металлорезистентньге бактерии являются эффективным и экономичным биоматериалом для извлечения тяжелых металлов из загрязненных вод. Но для их широкого использования в бноремеднации необходимо четкое понимание механизмов сорбции нонов бактериальными клетками, а также молекулярных механизмов их адаптации к высоким концентрациям токсичных металлов. В связи с этим было проведено комплексное исследование состава и термотропного поведения общих липидов, выделенных из двух штаммов морской бактерии P. putida 1В28 и IB 13, характеризующихся высокой устойчивостью к различным тяжелым металлам, для выяснения физико-химических свойств липидов, позволяющих бактериям выживать в условиях предельных концентраций Си2+ и Cd2+ при разных температурах окружающей среды.

2.1.1. Сравнительная характеристика роста н общего липндпого состава штаммов Pseudomonas putida IB28 и IB13

Как видно из таблиц 1 и 2, низкая температура и ионы тяжелых металлов заметно влияют на рост P. putida IB28 и 11313. Понижение температуры с 24°С до 4°С вызывало снижение бактериальной массы P. putida IB28 и IB 13 в 1,4 и 2 раза соответственно. Добавление в культуральную среду ионов Си2+ и Cd2+ усиливало эффект понижения температуры: биомасса снижалась в 2,5 и 5,5 раза для P. putida IB28. В P. putida IB13 подобный эффект наблюдался для ионов Си2+ - биомасса снижалась в 2,8 раза, тогда как добавление Cd2+ не оказывало дополнительного влияния. Таким образом, снижение температуры и включение тяжелых металлов в культуральную среду, в основном, аддитивно ингибнруют рост штаммов P. putida.

Таблица 1

Эффект температуры культивирования и ионов тяжелых металлов (Си2' н Cd2+) в составе

Показатель 4°С 24 °С

КС КС+Си2+ KC+Cd2+ КС КС+Си2+ KC+Cd2+

Биомасса (мг/л) 890,0 496,0 226,1 1246,0 1166,0 509,0

Содержание липидов (% от сухого веса бактерий)

Общие липиды Фосфолипиды Нейтральные липиды ФЛ/НЛ 3,3 2,6 0,7 3,7 3.6 1,9 1.7 1,1 4,7 3,7 1,0 3,7 3.7 1,9 1.8 1,1 5,1 4,7 0,4 11,7 5,9 4,5 1,4 3,2

Примечание: Стандартное отклонение составляло менее 0,8% для трех повторностей

Отмеченные изменения биомассы бактерий сопровождались следующими перестройками в липидном составе. Одновременно с ростом бактерий Р. putida IB28 при повышении температуры возрастал процент общих липидов (в 1,1 раза). Эффект усиливался при комплексном действии с Си2+ и особенно с Cd2+ (в 1,5 и 1,8 раза соответственно).

Таблица 2

Эффект температуры культивирования н ионов тяжелых металлов (Си21 и Cd2+) в составе культуралыюи среды на биомассу и содержание липидов Pseudomonasputida 11313

4°С 24°С

КС КС +Си2+ КС +Cd2+ КС КС +Си2+ КС +Cd2+

Биомасса (мг/л) 497,0 353,0 490,0 994,0 794,0 404,0

Содержание липидов (% от сухого бактериального веса)

Общие липиды 7,0 11,3 9,8 4,2 8,6 8,9

Фосфолипиды 3,9 5,2 7,3 3,1 5,6 2,1

Нейтральные липиды 4,1 6,1 2,5 1,1 3,0 6,8

ФЛ/НЛ 0,9 0,8 2,9 2,8 1,9 0,3

Примечание: Стандартное отклонение составляло менее 0,8% для трех повторностен

Содержание фосфолипидов обоих штаммов психротрофной P. putida подобно пснхрофилыюй Yersinia pseudotuberculosis, а также другим ранее изученным бактериям (Medeot et al., 2007) повышалось (в 1,3-1,4 раза) при понижении температуры. Тяжелые металлы также стимулировали синтез фосфолипидов при постоянной температуре, за исключением КС+Си2+ при 4°С (ID28) и KC+Cd2+ при 24°С (IB13). Причем, под влиянием ионов тяжелых металлов уровень фосфолипидов P. putida IB28 заметнее повышался при 24°С. Повышение уровня фосфолипидов P. putida IB 13 под действием тяжелых металлов было, наоборот, более выраженным при пониженной температуре. Вероятно, увеличение содержания фосфолипидов можно рассматривать как один из общих механизмов резистентности бактерий к Си2+ и Cd2+, зависимость которого от температуры реализуется по-разному у исследованных штаммов P. putida.

В соотношении фосфолипиды/нейтральные лшшды отмечалась более сложная зависимость. Так, соотношение ФЛ/НЛ для P. putida IB28 снижалось более чем в 3 раза при повышении температуры культивирования. При низкой температуре добавление Cd2+ не влияло на соотношение ФЛ/НЛ, а ионы меди вызывали существенное снижение соотношения ФЛ/НЛ с 3,7 до 1,1. Наоборот, при 24°С соотношение ФЛ/НЛ увеличивалось при добавлении обоих ионов, но особенно резкое, десятикратное повышение отношения ФЛ/НЛ вызывали ионы меди. Увеличение доли фосфолипидов, вероятно, способствует формированию клеточных мембран и противостоянию токсичному действию ионов меди при 24СС, что выражалось в сравнительно небольшом снижении биомассы P. putida 1В28 при данных условиях культивирования по сравнению с чистой КС. И, наоборот, уменьшение соотношения ФЛ/НЛ более чем в 3 раза под влиянием Си2+ при низкой температуре сопровождалось двукратным снижением биомассы бактерий. Для ионов кадмия подобная зависимость между соотношением ФЛ/НЛ и биомассой бактерий не прослеживалась.

Для P. putida IB13 соотношение ФЛ/НЛ как при 4°С, так и при 24°С свидетельствовало о том, что клетки данного штамма, как правило, не способны адекватно реагировать на повреждающее действие тяжелых металлов повышением синтеза фосфолипидов относительно синтеза нейтральных липидов. Интересно также отметить, что в отличие от штамма IB28 наблюдалось трехкратное снижение, а не повышение соотношения ФЛ/llJI при понижении температуры культивирования. В результате биомасса P. putida IB 13 снижалась резче по сравнению со штаммом IB28 (в 2 и 1,4 раза соответственно).

2.1.2. Сравнительная характеристика фосфолшшдиого состава штаммов Pseudomonas putida IB28 и 1В13

Изучепне состава мембранных фосфолипидов очень важно для понимания молекулярных механизмов адаптации к действию тяжелых металлов, так как фосфолипиды

могут выполнять функции мессенджеров, передающих информацию внутрь клетки об изменениях окружающей среды (Vigh et al., 2007), а также участвовать в сорбции ионов металлов на уровне мембран за счет наличия отрицательно заряженных групп (Wang et al., 2006).

В ходе работы были идентифицированы четыре фосфолипида мембран штаммов Р. pulida IB28 и Р. pulida IB 13: ФЭ, ФГ, ДФГ, ФИ (таб. 3, таб. 4). Важно отметить, что ФИ в бактериях рода Pseudomonas ранее не идентифицировался, за исключением P. syringae (Kozloff et al., 1999). Обнаружение значительных количеств ФИ (от 9.0 до 19.5% от общих фосфолипидов) в P. putida IB28 и ÍB13 может быть связано с условиями существования штамма.

Как видно из таблиц 3 и 4, суммарный уровень кислых фосфолипидов (ФГ, ДФГ" и ФИ) был значительно ниже при 4°С, чем при 24°С, тогда как добавление в среду металлов вызывало его увеличение. Увеличение уровня кислых фосфолипидов, возможно, способствует росту бактерий при высоких температурах, так как ранее была показана прямая зависимость между низким содержанием кислых фосфолипидов и чувствительностью роста бактерий к низкой температуре (Shiba et al., 2004). Вероятно, что это еще свидетельствует и об инициации адаптивных механизмов к действию тяжелых металлов, так как известно, что заряженные фосфолипиды обладают высокой сорбциоинон способностью (Barton, 1968; Wang et al., 2006).

Таблица 3

Эффект температуры культивирования и ионов тяжелых металлов (Cu2t и Cd2+) в составе культуралыюй среды на фосфолипидный состав Pseudomonas putida 1В28 (% от суммы ФЛ)

4°С 24°С

Показатель кс кс+сц,+ кс +Сср кс KC+Cu^ КС +Cd2t

ФЭ 67,3 62,4 56,1 64,5 54,0 54,0

ФГ 8,4 13,0 17,1 12,0 14,8 11,2

ДФГ 13,7 13,4 14,6 14,5 19,2 15,3

ФИ _10,6 11,2_12,2 9,0 12,0 19,5

ФГ+ДФГ 22,1 26,4 31,7 26,5 34,0 26,5

ФГ+ДФГ+ФИ 32,7 37,6 43,9 35,5 46,0 46,0

ФЭ/ ФГ+ДФГ+ФИ

2,0 1,7 1,3 1,8 1,2 1,2

Примечание: Стандартное отклонение составляло менее 0,8% для трех повторностей

Таблица 4

Эффект температуры культивирования и нонов тяжелых металлов (Си21 и Cd2+) в составе культуралыюй среды на фосфолипидный состав Pseudomonas putida 1В13 (% от суммы ФЛ)

_гт 4°С 24 °С

показатель — jT^r^ КС +Cd" КС КС +Си" КС +Q12'

ФЭ 80,0 61,7 68,8 48,1 55,2 52,3

ФГ 16,7 35,6 24,0 21,6 23,1 25,6

ДФГ 2,2 1,4 5,8 18,7 3,9 13,4

ФИ 1,1 1,3 1,4 11,6 17,8 8,7

ФГ+ДФГ 18,9 37,0 29,8 40,3 27,0 39,0

ФГ+ДФГ+ФИ 20,0 38,4 31,2 51,9 44,8 47,7

ФЭ/ 4,0 2,0 2,2 0,9 1,2 1,1

ФГ+ДФГ+ФИ

Примечание: Стандартное отклонение составляло менее 0,8% для трех повторностей

Содержание ФИ немного увеличивалось под действием металлов нри низкой температуре, а при высокой температуре эта тенденция усиливалась, отчетливее проявлялось стимулирующее действие Cd2t по сравнению с Си2+, что, вероятно, соответствует активации фосфоинозитидной сигнальной системы.

2.1.3. Сравнительная характеристика жнрнокислотпого состава штаммов Pseudomonas putida Ш28 и 11)13

В лшшдах бактерий обоих штаммов были идентифицированы четыре доминирующие кислоты (16:0, 16:1п-7, 18:1п-7 и 17:0ср), содержание которых в сумме составляло 74-95% (Табл. 5 и 6). В лшшдах Р. putida IB28 сумма ненасыщенных ЖК была в 1,5-3,9 раза выше, чем сумма насыщенных ЖК, тогда как в лшшдах штамма IB13 преобладание ненасыщенных ЖК наблюдалось только при низкой температуре.

Уровень насыщенных ЖК, который практически полностью определялся содержанием пальмитиновой кислоты, падал при понижении температуры, приблизительно, в 1,5-2 раза в лшшдах обоих штаммов. В противоположность этому, в 1,2-2 раза увеличивалась сумма ненасыщенных ЖК в основном за счет увеличения уровня 16:1 п-7 в 1,8 и 6,5 раза.

Таблица 5

Эффект температуры культивирования и ионов тяжелых металлов (Си2+ и Cd2+) в составе культуралыюй среды на состав жирных кислот общих липидов Р. putida IB28 (% от суммы

ЖК)

4°С 1 24°С

ЖК* КС KC+Cu2+ KC+Cd2t КС KC+Cu2+ KC+Cd2+

16:0 17,9 20,5 16,9 26,1 28,6 30,0

16:1п-7 43,9 42,9 43,2 24,9 25,2 18,8

17:0 ср 2,7 1,8 1,1 6,2 8,2 15,9

18:1п-7 30,9 29,5 30,9 34,6 31,4 25,9

Е нас. ЖК 19,6 21,9 20,7 28,4 31,2 33,2

2 ненас. ЖК 77,3 75,5 76,7 64,9 59,9 49,5

ненас./нас.ЖК 3,9 3,4 3,7 2,3 1,9 1,5

Примечание: Стандартное отклонение составляло менее 0,8% для трех повторностей. ЖК, составляющие менее 3%, в таблицу не включены

Таблица 6

Эффект температуры культивирования и ионов тяжелых металлов (Си2+ и Cd2+) в составе культуралыюй среды на состав жирных кислот общих липидов Р. putida 1В13 (% от суммы ЖК) '__

4°С 24°С

ЖК* КС KC+Cu2+ KC+Cdz+ КС KC+Cu2+ KC+Cd¿+

16:0 20,6 21,4 21,1 34,5 33,6 32,8

16:1п-7 45,6 44,2 42,8 7,0 14,0 11,4

17:0ср 4,1 5,9 5,7 20,7 25,5 22,1

18:0 0,3 0,8 0,5 3,8 1,0 2,4

18:1п-9 0,5 1,1 0,5 3,4 0,6 1,4

18:1 п-7 25,1 22,6 25,7 11.5 18,4 20,2

£ нас. ЖК 21,3 23,3 21,9 42,1 35,7 36,0

Х ненас. ЖК 73,5 70,4 70,9 33,2 35,3 39,0

ненас./нас.ЖК 3,5 3,0 3,2 0,8 1,0 1,1

В результате соотношение ненасыщенные/насыщенные ЖК было заметно выше при 4°С, чем при 24°С, что является классическим гомеовязкостным ответом бактериальных клеток (Beney et al., 2004) и других эктотермных организмов (Sanina, Kostetsky, 2002; Sanina et al., 2008) на понижение температуры окружающей среды. Одновременно, более чем в 2 н 5 раз снижалось содержание 17:0ср в липидах P. piitida 1В28 и НИЗ соответственно, что также способствует разжижению липидного бнслоя, поскольку циклопропановые ЖК, образующиеся путем метилирования ненасыщенных ЖК, в значительно меньшей степени снижают Тта\ фосфолипидов, чем ненасыщенные кислоты (McGarrity, Armstrong, 1981).

При 24°С тенденция увеличения насыщенности ЖК штамма 1В28 под влиянием тяжелых металлов усиливалась, причем эффект Cd2' был более выраженным по сравнению с эффектом Си2+. В ряду KC<KC+Cu2+<KC+Cd2+ также происходило увеличение уровня 17:0ср, особенно при добавлении Cd2+ в культуральную среду. Таким образом, присутствие обоих ионов тяжелых металлов в КС усиливало эффект высокой температуры как на уровень 17:0ср, так и насыщенность жирных кислот, что способствует большей стабильности липидного бнслоя. Однако при низкой температуре реализуется только один из этих механизмов -увеличение насыщенности жирных кислот, но в сравнительно меньшей степени, чем при 24°С.

Противоположный эффект катионов тяжелых металлов наблюдался при низкой температуре культивирования бактерий штамма 1В13: уровень 17:0ср повышался, а ненасыщенность ЖК снижалась (Табл. 6), что препятствует механизму поддержания жидкостности мембраны, и, тем самым, снижает способность бактериальных клеток адаптироваться к низкой температуре. При 24°С эффект ионов тяжелых металлов па насыщенность жирных кислот также был противоположным по сравнению с действием на штамм 1В28.

2.1.4. Фазовые переходы общих лнпидов штаммов Pseudomonas patilla IR28 и IB13

Изменения в составе липидов и их жирных кислот влияют на термодинамические параметры фазовых переходов гель - жидкий кристалл (Abbas, Card, 1980), которые позволяют оцепить эффективность меж- и внутримолекулярных адаптационных преобразований в липидах (Hazel, Williams, 1990), направленных на поддержание жидкокристаллического состояния, необходимого для нормального функционирования мембран. Термограммы фазовых переходов липидов P. putida, полученные методом дифференциальной сканирующей калориметрии, располагались в интервале температур от -22 до 34°С для P. putida IB28 (Рис. 1) и от -14 до 42°С для P. putida IB13 (Рис. 2).

Ттах общих липидов P. putida 1В28, культивированной при 4°С, приходилась на середину температурного интервала и была близка температуре культивирования бактерий. Отмеченное положение Ттах является обычным для бактериальных лнпидов (Ивков, Берестовский, 1981). При этом бактерии как бы существуют «внутри фазового перехода», хотя это правило не является обязательным. Добавление ионов металлов мало влияло на интервал фазового перехода, но заметно усложнялся профиль термограмм, что обусловлено фазовым разделением липидов. Наиболее выраженное фазовое разделение наблюдалось в липидах бактерий, выращенных в присутствии ионов меди. В результате, доля площади термограммы, приходящейся на температуры ниже температуры культивирования бактерий, оставалась низкой (10-18%). Следовательно, причиной небольшой биомассы P. putida IB28 при низкой температуре, вероятно, является то, что при этой температуре лишь небольшая часть липидов находится в оптимальном для функционирования жидкокристаллическом состоянии. Фазовое разделение липидов также может быть причиной ухудшения роста бактерий под влиянием ионов тяжелых металлов, поскольку приводит к увеличению проницаемости мембран (Williams, 1990).

Температура, 'С

Рис. 1. Термограммы фазовых переходов общих лннпдов, выделенных из Р. pulida IB28, культивированных при 4°С (Л) и 24°С (Б), в присутствии меди (- - -), кадмия (—) или без металлов (—). По оси ординат - теплоиоглощение. Соотношение между линидамн и смесыо вода: этнленглпколь (1:1, об/об) составляло 1:2, rio весу. Скорость сканирования: 16°С/мии. Масса липидов в образцах: 5 мг

С повышением температуры культивирования до 24°С температурные интервалы и Ттах фазовых переходов липидов Р. pulida IB28 мало изменялись, но происходило резкое увеличение доли площади термограммы (до 92%), приходящейся на температуры ниже температуры культивирования. Таким образом, при более высоких температурах обитания фазовое состояние лшшдов нсевдомонад штамма 1В28 в большей степени отвечает оптимальному функциоипровашио мембраны. Это согласуется с более интенсивным ростом псевдомонад при 24°С. Эффект иопов Си и С<12+ был сходным с тем, что наблюдался при низкой температуре.

-за -а -« о ю я х w so ао

Температура, °С

Рис. 2. Термограммы фазовых переходов гидратированных общих липидов, выделенных из Р. pulida 1В13, культивированных при 4°С (А) н 24°С (Б), в присутствии меди (- - -), кадмия (—) или без металлов (—). По осн ординат - тенлопоглощение. Соотношение между лнпидами и смесыо вода: этиленгликоль (1:1, об/об) составляло 1:2, по весу. Скорость сканирования: 16°С/мин. Масса липидов в образцах: 5 мг

Те же тенденции отмечались в термотропном поведении липидов штамма IB13 (Рнс. 2). В основе фазового разделения липидов может лежать как непосредственное связывание ионов тяжелых металлов с кислыми липндами и образование более ригидных кластеров, так и изменения в составе липидов. Фазовое разделение липидов, которое возникает в присутствии ионов тяжелых металлов, вероятно, может служить в качестве адекватного объяснения токсического действия меди и кадмия на клетки Р. putida.

2.1.5. Анализ сорбцнонпой способности липидов Pseudomonas putida IB28 и НПЗ

Для установления причины фазового разделения и роли фосфолипидов в механизмах аккумуляции металлов общие липиды и их фракции (ФЭ и ФГ+ДФГ+ФИ), выделенные из Р. putida IB28 и IB13 после культивирования бактерий в КС, KC+Cu и KC+Cd21, были исследованы методом атомно-адсорбционного анализа. Как видно из таблицы 7, ионы меди и кадмия в различной степени аккумулируются в общих липидах, цвиттернонном ФЭ и анионных липидах ФГ+ДФГ+ФИ.

При 24°С количество нонов меди, связанных с общими липидамн Р. putida IB28 и 1В13 и их фракциями, было в 12,5-50 раз больше, чем ионов кадмия, что, вероятно, связано с большей константой ассоциации фосфатных групп фосфолипидов с Си , чем с Cd2+ (Barton, 1968). В результате, ионы меди индуцировали более выраженное фазовое разделение липидов Р. putida по сравнению с ионами кадмия (Рис. 1 и 2). Интересно отметить, что менее резистентный к тяжелым металлам штамм 1В13 отличался более высокой сорбционнои способностью общих липидов, особенно для ионов меди. С другой стороны, суммарные фракции анионных липидов ФГ, ДФГ и ФИ обоих штаммов отличались более высокими сорбционными свойствами для Cu2f и Cd2+, чем фракции ФЭ.

Таблица 7

Концентрация ионов меди и кадмия в липидах Pseudomonas putida IB28 и IB13, выращенных в культурапыюи среде в присутствии Cu2+ (KC+Cu2+) или Cd2+ (KC+Cd2t) при различной температуре, мкг/мг липида

Состав исследуемых фракций Штамм 1В28 Штамм 1В13

4°С 24°С 24°С

KC+Cu2+ KC+Cu2+ KC+Cd2+ KC+Cir KC+Cd

Общие липиды 3,8 0,1 10,0 0,2

ФЭ 4,2 6,6 0,2 2,5 0,2

ФГ+ДФГ+ФИ 6,0 17,0 0,9 8,0 0,4

* - измерения не производились

Следовательно, наблюдаемое усложнение профилей термограмм общих липидов Р. putida является результатом сорбции ионов тяжелых металлов, прежде всего кислыми фосфолипидами. Известно, что именно кислые ФЛ, связываясь с двухвалентными ионами, уплотняются, образуя более ригидные домены (Lee, 1977).

2.1.6. Анализ проницаемости бнслоипых липидных мембран на основе липидов Pseudomonas putida IB28

Для выяснения взаимосвязи между фазовым разделением липидов и ионной проницаемостью мембран бактерий, выращенных в присутствии Си2+ и Cd2', методом БЛМ были изучены три суммарные лнпидные фракции Р. putida IB28, культивированной в среде без нонов тяжелых металлов (фракция №1) и в присутствии Си2+ (фракция №2) или Cd2 f (фракция №3) при 24°С. Фоновая проводимость глинеролмоноолеиповых БЛМ составляла 924 пСм.

При добавлении исследуемых фракции в формирующий раствор проводимость БЛМ изменялась и составила 42-72 пСм для фракции №1, 600-780 пСм для фракции №2 и 240-440

пСм для фракции №3. При включении в БЛМ лнппдных фракций P. putida Ш28, особенно №2 и №3, потенциал пробоя лшшдпых бислоев уменьшался с 210 до 150 и 100 мВ соответственно. Это может свидетельствовать о дестабилизации мембран под действием попов тяжелых металлов, присутствие которых подтверждено во фракциях №2 и №3. Уменьшение потенциала пробоя мембран отражает снижение стабильности мембран в присутствии тяжелых металлов в зависимости от мембранного потенциала. Причем проницаемость К JIM в большей степени (в 2-3 раза) понижалась при включении общих лнпндов, выращенных в присутствии Си2*. Таким образом, существует прямая связь между степенью фазового разделения лнпндов и ионной проницаемостью БЛМ на их основе.

Полученные данные позволяют предположить, что сорбция двухвалентных металлов приводит к усилению биосинтеза кислых фосфолиппдов, что можно рассматривать как защитный механизм бактерий от токсичных металлов, но увеличение содержания кислых фосфолиппдов в мембране, в свою очередь, может инициировать два противоположных процесса. С одной стороны, усиление сорбции тяжелых металлов и, следовательно, фазового разделения липидов способствует увеличению проницаемости мембран п проявлению токсичности Си2+ н Cd2+. По с другой стороны, известно, что увеличение потенциала мембран приводит к закрытию таких ионных каналов, как пориновые (Basle et а!., 2004), то есть способствует резистентности бактерий. От сбалансированности этих процессов зависит, вероятно, степень проникновения попов тяжелых металлов в бактериальные клетки п их повреждающего воздействия на внутриклеточные мишени.

2.2. Влияние условии культивировании на тсрмотроипос поведение лнпндов Yersinia pseudotuberculosis У. pseudotuberculosis, каузативный агент псевдотуберкулеза, широко распространена в большинстве стран с холодным климатом. Эта грамотрицательная бактерия обитает, подобно P. putida, в различных экологических шинах, но обладает большей способностью адаптироваться к низким температурам. Бактерии псевдотуберкулеза могут расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях (Сомов и др., 1990), используя глюкозу, которая в большом количестве находится в крови п тканях хозяина. В природе ее основным резервуаром являются зеленые растения.

2.2.1. Влияние температуры, условии аэрации и глюкозы на лншщпып состав Yersinia pseudotuberculosis Был изучен липидный профиль У. pseudotuberculosis, выращенной на питательном бульоне и на питательном бульоне с добавлением глюкозы при перемешивании и без перемешивания. Исследование проводили при двух температурах - 8 и 37°С, соответствующих сапрофнтическон и паразитической фазам существования бактерий.

Рост Y. pseudotuberculosis в большей степени зависел от температуры и условий аэрации, чем от глюкозы (Табл. 8). Низкие температуры являлись предпочтительными для роста этих бактерий. Глюкоза ннгибировала рост клеток, особенно, при высокой температуре культивирования без перемешивания и при перемешивании на холоду.

Такая же тенденция наблюдалась н в отношении общих липидов и фосфолиппдов )'. pseudotuberculosis, содержание которых возрастало с падением температуры. Присутствие глюкозы в питательном бульоне ингнбнровало синтез фосфолиппдов при обеих температурах н различных режимах аэрации, но максимальный эффект наблюдался при 37°С. Уровень фосфолиппдов в этих клетках падал почти в 2 раза, а уровень нейтральных липидов, наоборот, повышался во столько же раз в присутствии глюкозы. Таким образом, присутствие глюкозы в среде смещает синтез в сторону накопления запасных липидов.

Качественный состав фосфолиппдов }'. pseudotuberculosis сохранялся независимо от условий культивирования. Все четыре идентифицированных фосфолипида (ФЭ, ЛФЭ, ФГ и ДФГ) присутствовали в значительных количествах.

Таблица 8

Выход биомассы и состав общих лииидов (% ог сухой бактериальной массы) и фосфолипидов (% от суммы фосфолипидов) Yersinia pseudotuberculosis в зависимости от температуры, режима аэрации и присутствия глюкозы в питательном бульоне_

Показатель 8°С 37°С

180 об./мнн без перемеш. 180 об./мин без перемеш.

ПБ ПБ+GIc ПБ ПБ+Glc ПБ ПБ+Glc ПБ ПБ+Glc

Биомасса (мг /л) 978,0 669,1 253,3 287,0 260,8 216,0 215,1 120,7

Выход (% на сухой вес бактерий)

Общие липиды 7,2 5,5 7,0 5,8 5,1 4,2 5,0 6,0

Фосфолипиды 6,8 5,0 2,1 3,1 4,0 2,1 3,6 1,4

Нейтральные 0,4 0,5 4,9 2,7 1,1 2,1 1,4 4,6

липиды

Содержание (% от суммы ФЛ)

ФЭ 79,6 79,4 22,7 27,2 73,6 50,8 71,6 48,0

ЛФЭ 2,1 7,7 33,2 45,6 3,1 23,3 3,5 13,0

ФГ 7,9 5,1 12,1 8,3 5,8 1,3 6,8 4,7

ДФГ 8,7 7,9 14,9 16,5 17,5 22,9 18,1 25,7

МеФЭ* 1,7 - 4,8 2,4 - - - -

X - - 8,4 - - 1,7 - 3,8

х,+х2 - - - - - - - 4,7

ФЭ+ЛФЭ/ 5,3 6,7 2,1 2,9 3,3 3,1 3,0 2,4

ФГ+ДФГ

Примечание: МеФЭ - монометпловый эфир ФЭ. Стандартное отклонение составляло менее 0,8% для трех иовторностей.

В большинстве «холодных» вариантов также содержался монометпловый эфир ФЭ (МеФЭ). Количественный состав фосфолипидов менялся под действием всех трех факторов культивирования бактерий. Как правило, доминирующим фосфолипндом был ФЭ. Но его количество при культивировании без перемешивания питательного бульона при низкой температуре падало в 2.9-3.5 раза и не превышало 30%. Одновременно, уровень ЛФЭ резко возрастал до 33,2-45,6% по сравнению с 2,1-7,7% при перемешивании культуральной среды. Повышению уровня ЛФЭ также способствовало добавление в питательный бульон глюкозы, особенно при 37°С, когда одновременно с увеличением содержания ЛФЭ в 3,7-7,5 раза происходило уменьшение количества ФЭ в 1,5 раза как при перемешивании, так и без него. Полученные результаты свидетельствуют о том, что накопление ЛФЭ является ответом К. pseudotuberculosis на присутствие глюкозы и стресс, вызванный недостатком кислорода в культуральной среде, тогда как высокая температура, как правило, не является индуктором повышенного содержания ЛФЭ в этой бактерии.

2.2.2. Влияние температуры, условий аэрации и глюкозы на жнршжпелотпын состав Yersinia pseudotuberculosis Набор ЖК в клетках Y. pseudotuberculosis (Табл. 9) был характерным для данного вида (Krasikova et al., 1995; Дзадзиева и др., 1999) и мало изменялся в зависимости от условий культивирования в огличие от количественного состава.

При низкой температуре ненасыщенные жирные кислоты преобладали, примерно, в 1,5-2 раза, за исключением лшшдов бактерий, культивированных без перемешивания, но в присутствии глюкозы.

Таблица 9

Влияние различных условии культивирования на состав жирных кислот Yersinia pseudotuberculosis (% от суммы ЖК)__

8°С 37°С

I[оказатель 180 об./мпн без иеремеш. 180 об./мип без перемеш.

ГШ ПБ+Glc И Б ПБ+Glc ПБ ПБ+Glc ГШ ПБ+Glc

14:0 0,8 2,6 1,6 3,1 7,1 5,1 5,9 3,9

16:1 п7 32,0 35,2 32,4 16,7 5,6 7,1 6,7 5,2

16:0 24,1 27,3 30,7 35,6 41,7 40,2 41,0 41,4

17:0ср 15,4 9,3 3,8 4,8 39,9 33,8 39,1 41,4

18:1п9 1,6 2,1 5,4 16,5 1,9 5,5 2,3 2,1

18:1 п7 21,7 17,5 18,2 10,6 1,4 2,0 1,9 2,4

18:0 2,2 2,6 6,4 10,5 2,3 4,0 3,1 2,7

Z ненас. ЖК 55,3 57,6 55,9 43,7 8,9 14,6 10,9 9,7

2 нас. ЖК 29,4 33,1 40,3 51,6 51,2 51,7 50,0 49,0

£ ненас./S нас. ЖК 1,88 1,74 1,39 0,85 0,17 0,28 0,22 0,20

Примечание: ЖК менее 3% в таблицу не включены. Стандартное отклонение составляло менее 0,8% для трех повторностеи

При повышении температуры содержание ненасыщенных жирных кислот, а также соотношение ненасыщенные/насыщенные ЖК резко падало в 4-6 и 4-11 раз соответственно, независимо от условий аэрации и наличия глюкозы в питательном бульоне. Одновременно количество единственной циклопропанов«"! кислоты 17:0ср значительно возрастало - в 2,610,3 раза, что сопровождалось понижением содержания основной моноеновой кислоты 16:1п-7 в 3,2-5,7 раза. Такое адаптивное изменение пенасыщенности жирных кислот мембранных липндов в ответ на изменение температуры среды является обычным для многих бактерий, в том числе и энтеробактерий (Abbas, Card, 1980; Nagainachi et al., 1991) и представляет собой компенсаторный механизм, направленный на поддержание такой степени жидкостностн мембран, которая была бы достаточной для функционирования бактериальных клеток (Beney, Gervais, 2001).

Изменение условий питания в значительно меньшей степени, чем температура, влияло на на количественный состав ЖК )'. pseudotuberculosis. При 8°С без перемешивания культуральнои среды добавление глюкозы приводило к снижению соотношения ненасыщенные/насыщенные ЖК в 1,6 раза. Еще меньшее снижение этого параметра наблюдалось в условиях перемешивания питательного бульона при этой же температуре, но содержание 17:0ср уменьшалось в 1,7 раза. При 37°С добавление глюкозы в питательную среду, наоборот, повышало соотношение ненасыщенные/насыщенные ЖК в 1.6 раза при перемешивании среды, но практически не влияло без перемешивания.

Изменение режима аэрации воздействовало на содержание ЖК также в основном при низкой температуре и отражалось на уровне почти всех жирных кислот. В целом, пониженная аэрация культуральнои среды и добавление в нее глюкозы действуют на жирнокнелотнмй состав липидов Y. pseudotuberculosis одноиаправлено, повышая при низкой температуре культивирования насыщенность жирных кислот, что, вместе с увеличением содержания ЛФЭ, может стабилизировать мембрану при этих стрессовых условиях. По-видимому, в условиях культивирования бактерий без перемешивания питательной среды возникает лимит по кислороду, что и подавляет активность десатураз (Кржечковская и др., 2004).

Интегральный эффект различных изменений в липидном составе, особенно, в составе жирных кислот выражается в термодинамических параметрах фазовых переходов гель -жидкий кристалл. Эти термопереходы позволяют оцепить эффективность внутри- и межмолекулярных перестроек в липидном матриксе мембран при адаптации бактерий и других эктотермных организмов к меняющимся условиям окружающей среды (Abbas, Card, 1980; Hazel, Williams, 1990).

2.2.3. Влияние температуры, условий аэрации и глюкозы на фазовые переходы лшшдов Yersinia pseudotuberculosis Были изучены калориметрические фазовые переходы гель - жидкий кристалл общих липндов Y. pseudotuberculosis, выращенной при различных режимах аэрации, а также при разной температуре в присутствии или без глюкозы в питательном бульоне (Рис. 3).

-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50

Температура, 'С

Рис. 3. Термограммы общих липидов, выделенных из Yersinia pseudotuberculosis, культивированной при 8°С (А, Б) и 37°С (В) в отсутствии (А) и присутствии глюкозы (Б, В), с перемешиванием среды ( - - - ) и без перемешивания среды ( —). Линия —•—•— (В) -культивирование с перемешиванием среды в отсутствии глюкозы при 37°С. Соотношение между лшшдом н смесью вода-этиленгликоль (1:1, по объему) было (1:2, по объему). Вертикальная линия соответствует 25 мВт. Скорость сканирования: 16°С/мин. Вес липида: 5 мг. Каждый липпдный образец сканировали как минимум в трех повторах

Понижение температуры и добавление глюкозы в культуральную среду аддитивно влияли на термотропное поведение липидов бактерии. При высокой температуре выращивания и в отсутствие глюкозы (Рис. ЗВ), фазовый переход располагался в пределах от 26 до 56°С, Tnm составляла 50°С. Судя но площади термограммы, приходящейся на температуры ниже температуры роста, 37°С, можно предположить, что при этих условиях лишь небольшая часть липидов будет находиться в оптимальном для функционирования

мембран жидкокристаллическом состоянии. Это согласуется со сравнительно низким накоплением бактериальной массы при этих условиях культивирования.

Добавление глюкозы в питательный бульон при 37°С вызывало заметный сдвиг Tma„ а также всей температурной области калориметрического перехода. TmaN снижалась на 26°С, а температурная область фазового перехода смещалась до 6-42°С. В результате липиды при температуре культивирования, в основном, находились в жидкокристаллическом состоянии. Однако добавление глюкозы не стимулировало накопления биомассы бактерии. Возможно, смещение главного фазового перехода гель - жидкий кристалл в низкотемпературную область сопровождается понижением температуры мезофазпого перехода ламеллярная -неламеллярная фаза (Morein et al., 1996), что неблагоприятно сказывается на росте бактерий при высокой температуре. Молекулярный механизм изменений, наблюдаемых в калориметрическом переходе лшшдов )'. pseudotuberculosis под влиянием глюкозы при 37°С можно объяснить действием ЛФЭ, содержание которого резко увеличивалось с 3,1% до 23,3%, на липиды с повышенной насыщенностью ЖК, а также небольшим увеличением соотношения ненасыщенные/насыщенные ЖК и снижением уровня 17:0ср

Но наибольший эффект наблюдался в фазовых переходах при изменении температуры культивирования. Без глюкозы, снижение температуры с 37°С до 8°С приводило к палсшпо Ттач с 50°С до 8°С, то есть до температуры культивирования (Рис. ЗА и ЗВ). Температурная область калориметрического перехода также резко сдвигалась с 26-56°С до -20-16°С. В результате, большая часть термограммы располагалась при температурах ниже температуры культивирования - 8°С, что соответствует известной концепции гомеовязкостнон адаптации (Sinensky, 1974). Основной причиной резких изменений в термотропном поведении лшшдов )'. pseudotuberculosis являлось значительное повышение ненасыщенпостн ЖК и снижение уровня 17:0ср. В результате бактериальная масса увеличивалась почти в 4 раза. Последующее понижение Traas на 16°С, которое наблюдалось после добавления глюкозы в культурапьную среду, скорее связано с понижением уровня 17:0С1„ чем с ненасыщешшстыо жирных кислот.

Таким образом, молекулярные механизмы реагирования )'. pseudotuberculosis на изменение температуры и присутствие глюкозы в культуральной среде сходны. Оба фактора влияют на фазовое состояние липндного матрикса мембран через изменение насыщенности жирных кислот и уровня циклопропановых жирных кислот. Наши результаты позволяют предположить, что глюкоза активизирует термоиндуцнруемые гены десатураз, что согласуется с литературными данными (Inaba et al., 2003).

Уникальный эффект на фазовые переходы липидов Y. pseudotuberculosis оказывали условия выращивания бактерий без перемешивания культуральной среды. Независимо от температуры и наличия глюкозы в питательной среде термограммы общих липидов бактерий, выращенных без перемешивания, характеризовались примерно одинаковыми, высокими значениями Ттщ: 32 - 36°С (Рис. ЗА-В). Поддержанию высокой температуры фазового перехода липидов и, вероятно, большей стабильности мембран у бактерий, растущих на холоду при низкой аэрации среды, мог способствовать ЛФЭ, накапливающийся в данных условиях. ЛФЭ, форма молекулы которого прямо противоположна ненасыщенному ФЭ, может не только «выпрямить» и стабилизировать бнелой (Epand, 1998), но и привести к более плотной упаковке лшшдов, а, следовательно, повысить Тпш- Еще одной причиной стабилизации мембран может быть повышение суммарного содержания кислых фосфолипидов ФГ н ДФГ (Табл. 8), которые при физиологических условиях имеют тенденцию к образованию ламеллярной фазы (Lewis, McElhancy, 2000), а также увеличение насыщенности жирных кислот.

Причиной высокой температуры фазового перехода липидов бактерий, выращенных при 37°С без перемешивания среды, скорее является сравнительно высокая насыщенность липидов, чем присутствие хотя и намного меньшего, но все же значительного количества ЛФЭ. Можно предположить, что при температуре культивирования 37°С, когда активность десатураз, а следовательно уровень ненасыщенности жирных кислот низкие, отсутствует необходимость в использовании такого фактора стабилизации мембраны, как ЛФЭ.

Дополнительной причиной высоких значений Ттж липидов бактерий, выращенных при этих условиях, может быть высокое содержание циклопропановой кислоты 17:0ср, так как они образуются при метилировании ненасыщенных жирных кислот.

Интенсивная аэрация питательной среды приводит к сдвигу термограмм липидов бактерий в сторону более низких температур (Рис. ЗА-В). Особенно резкое смещение наблюдается при выращивании бактерий при 8°С. Так, в результате культивирования бактерий на питательном бульоне без глюкозы (Рис. ЗА) Ттах общих липидов понижается с 36 до 6°С, а в присутствии глюкозы наблюдается аддитивный эффект, выражающийся в более резком скачке Ттю с 34 до -10°С (рис. ЗБ). Следует отметить, что при культивировании бактерий без перемешивания, в отличие от культивирования с перемешиванием, добавление глюкозы не оказывает существенного влияния на Тщц (Рис. ЗА, Б). Таким образом, установленный нами эффект существенного снижения Ттж общих липидов бактерий, культивируемых в среде с глюкозой при 8°С возможен только в условиях интенсивной аэрации питательной среды.

Влияние аэрации на термотропное поведение липидов у бактерий, культивируемых при 37°С, было менее выраженным (Рис. ЗВ). Так, аэрация питательного бульона, содержащего глюкозу, хотя и приводит к существенному снижению Tmlx (на 10°С) общих липидов бактерий (Рис. ЗВ), но этот эффект, примерно, в 4 раза слабее по сравнению с таковым при низкотемпературном культивировании клеток (Рис. ЗБ).

Уменьшение площади термограмм под калориметрической кривой, у бактерий, культивируемых при низкой температуре в условиях перемешивания питательной среды, в сравнении с таковыми у культур, выращенных в условиях без перемешивания питательной среды, происходит, прежде всего, за счет повышения соотношения между ненасыщенными и насыщенными жирными кислотами (Табл. 9). Следовательно, одной из причин понижения температуры фазовых переходов общих липидов бактерий под влиянием аэрации является активизация десатураз жирных кислот (Los, Murata, 2004).

2.2.4. Влияние адаптационных изменений в содержании

лпзофосфатндплэтаполамина липидов Yersinia pseudotuberculosis на копформацшо OmpF-нодобного норипа (нерсинина)

Влияние адаптационных изменений в лнпндах Y. pseudotuberculosis на олигомеризацию темиературно-денатурированной мономерной формы нерсинина исследовали при двух значениях температур (4°С и 75°С) и различном липидном составе везикул (Рис. 5). Для формирования везикул нспользовалн липиды Y. pseudotuberculosis с разным содержанием ЛФЭ (12,6% и 44,3% соответственно), полученные в результате термоадаптации бактерии при 37°С и 8°С.

Как видно из рисунка 4, мономерная форма нерсинина в растворе додецилсульфата натрия находилась в динамическом равновесии с олигомерными формами. При инкубации мономерной формы белка с липидными везикулами различного состава при 4°С наблюдается общее снижение интенсивности соответствующего пятна на иммуноблоте по сравнению с исходным белком без липида, что, вероятно, связано с экранированием соответствующих антигенных детерминант мономера при его встраивании в бислой лшшдных везикул. Подтверждением этому может быть слабый эффект чистого ЛФЭ, который, как известно, не формирует бислой.

Интересно, что эффект «тепловых» липидов был сильнее по сравнению с «Холодовыми», но при этом пятна, соответствующие олигомерным формам, наоборот, были более выраженными при обработке порина «Холодовыми» лнпидами. Вероятно, отмеченные эффекты исследованных липидов связаны с их различным влиянием на антигенную структуру, и, следовательно, на конформацию мономерной формы порина и его олигомеризацию.

Рис. 4. Иммуноблотинг порина с поликлональными антителами против мономера иерсинина после инкубации при температурах 4°С (А) и 75°С (Б) в присутствии липидов Yersinia pseudotuberculosis с разным содержанием лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) и индивидуального ЛФЭ (100%). (0) - контроль (только иерсинин)

Важно, что именно «холодовой» липид в большей степени, чем «тепловой», способствует образованию олигомеров и, тем самым, оптимизирует функцию порина как мембранного канала при 4°С. При повышении температуры до 75°С происходят прямо противоположные изменения конформации мономера и наличия олигомерных форм в зависимости от содержания ЛФЭ в липидах Y. pseudotuberculosis. То есть, терморегуляция содержания ЛФЭ в липидах Y. pseudotuberculosis связана с шаперонными свойствами ЛФЭ, направленными на поддержание функциональной формы порина независимо от температуры культивирования бактерии.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что повышение температуры культивирования и присутствие в среде ионов тяжелых металлов (Си2+ и Cd2t) аддитивно действуют на состав липидов исследованных штаммов Pseudomonas putida, вызывая увеличение содержания кислых липидов, насыщенных и циклопропановых жирных кислот.

2. Установлено, что одной из причин токсичного действия ионов меди и кадмия на штаммы Pseudomonas putida IB28 и IB 13 является фазовое разделение липидов в результате преимущественной сорбции этих ионов кислыми липидами и связанное с этим увеличение проницаемости липидного бислоя.

3. Показаны различные стратегии регуляции термотропного поведения липидов Yersinia pseudotuberculosis и Pseudomonas putida в зависимости от температуры культивирования бактерий, что может быть причиной более выраженных психрофильных свойств у Yersinia pseudotuberculosis по сравнению с Pseudomonas putida.

4. Найдено, что низкая температура культивирования и введение глюкозы в питательный бульон в условиях аэрации аддитивно снижают температуру фазовых переходов липидов Yersinia pseudotuberculosis. Причиной снижения температуры фазовых переходов являются повышение уровня моноеновых и снижение содержания циклопропановых жирных кислот.

5. Показано, что повышение температуры в условиях аэрации или добавление глюкозы в питательный бульон при пониженной аэрации приводит к увеличению процентного содержания кислых липидов в Yersinia pseudotuberculosis.

6. Выявлена зависимость повышения температуры фазовых переходов липидов Yersinia pseudotuberculosis от повышения содержания лизофосфатидилэтаноламина при выращивании бактерий при низкой температуре, в условиях пониженной аэрации культуралыюй среды, что коррелирует с понижением выживаемости бактерии в этих условиях.

7. Показано, что полученные в результате культивирования при 37°С и 8°С липиды Yersinia pseudotuberculosis с разным содержанием лизофосфатидилэтаноламина, в разной степени влияют на конформацию мономерной и олигомерной форм иерсинина и эта зависимость прямо противоположна при низкой и высокой температурах инкубирования липндных везикул с белком.

Список работ, опубликованных но теме диссертации

Статьи в реферируемых журналах

1. Bakhokiina S.I., Sanina N.M., Krasikova I.N., Popova O.B., Solov'eva T.F The impact of abiotic factors (temperature and glucose) on physicochemical properties of Yersinia pseudotuberculosis // Biochimie. 2004. Vol 86. №12. P. 875-881.

2. Бахолдина С.И., Санина П.М., Попова О.Б., Шубин Ф.Н., Соловьева Е.Ф. Термотропиое поведение липидов и морфология клеток Yersinia pseudotuberculosis с высоким содержанием лизофосфатидилэтаноламина // Микробиология. 2007. № 3. С. 321-328.

3. Попова О.Б., Санина Н.М., Лихацкая Г.Н., Безвербная И.П. Влияние ионов меди и кадмия на физико-химические свойства липидов морской бактерии Pseudomonas putida 1В28 при различной температуре культивирования // Биология моря. 2008. Т. 34, № 3. С. 210-216.

Материалы конференций п симпозиумов

4. Bakholdina S.I., Sanina N.M., Popova О.В., Krasikova I.N., Solov'eva T.F. Optimization of thermal behavior of lipids from Yersinia pseudotuberculosis as a result of glucose additives to nutritious broth // Abstract for BioScience2004. Glasgow, Scotland. P. 62a.

5. Сашша H.M., Бахолдина С.И., Попова О.Б., Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф. Влияние абиотических факторов на термотропиое поведение липидов из Yersinia pseudotuberculosis //Тезисы III съезда биофизиков России, Воронеж, 2004. Т. 1. С. 17.

6. Bakholdina S.I., Sanina N.M., Popova О.В., Krasikova I.N., Solov'eva T.F. The impact of abiotic factors on thermotropic behavior of lipids from Yersinia pseudotuberculosis // Abstract for 3rd EuroFedLipid Congress. Edinburgh, Scotland. 2004. P. 261.

7. Popova O.B., Sanina N.M., Bezverbnaya 1.Р., Maltsev A.I. Effect of heavy metals and temperature on physicochemical properties of lipids from Pseudomonas jluorescens II Abstract for 7th International Marine Biotechnology Conference. St. John's, Newfoundland and Labrador, Canada, 2005. P. 127.

8. Popova O.B., Sanina N.M., Bezverbnaya I.P., Mal'tsev A.I. Heavy metals and temperature impact on physicochemical properties of lipids from Pseudomonas fluorescens (strain 296) // Abstract for 13'h International Biodeterioration and Biodégradation Symposium. Madrid, Spain. 2005. P. 186.

9. Bakholdina S.I., Sanina N.M., Popova O.B., Shubin F.N., Somova L.M., Solov'eva T.F. Thermopropic Behavior of Lipids and Biological Properties of Yersinia Pseudotuberculosis with a High Content of Lysophosphatidylethanolamine // Abstract for 9th International Symposium on Yersinia, October 10-14, 2006, Lexington, USA. P. 47.

10. Бахолдина С.И., Шубин Ф.Н., Санина H.M., Попова О.Б., Соловьева Е.Ф. Высокий уровень лизофосфатидилэтаноламина в бактериях псевдотуберкулеза коррелирует с их повышенной инвазивностыо // Тезисы Второй Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями», Санкт-Петербург, 2006. С. 41.

11. Бахолдина С.И., Шубин Ф.Н., Санина Н.М., Попова О.Б., Сомова Л.М., Соловьева Т.Ф. Бактерии псевдотуберкулеза с высоким содержанием фосфатидилэтаноламина обладают повышенной инвазивностыо н устойчивостью к температурному стрессу // Тезисы II Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», 19-21 декабря 2006, Владивосток. С. 77.

12. Попова О.Б., Сашша Н.М., Лихацкая Г.П., Безвербная И.П. Изменение физико-химических свойств липидов Pseudomonas putida IB28 под влиянием ионов тяжелых металлов при различных температурах культивирования // Тезисы XI Международной молодежной школы-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС, 2007 г. С. 32.

13. Попова О.Б., Сашша Н.М., Безвербная И.П. Влияние тяжелых металлов на состав и термотролное поведение липидов морской бактерии Pseudomonas putida 1В13 // Материалы Международной научно-практической конференции «Морская экология-2007", Владивосток. Т. 1. С. 64-69.

Соискатель

Попова О.Б.

ПОПОВА ОЛЬГА БОРИСОВНА

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ТЕРМОТРОПНОЕ ПОВЕДЕНИЕ ЛИПИДОВ PSEUDOMONAS PUTIDA И YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 23.03.09 Формат 60x84/16 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1.0 Заказ № 090096

Отпечатано в Типографии ((Краски» 690048, г. Владивосток, пр-т 100-летия, 43, тел.: 36-26-16,55-95-31, www.kpacku.com

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Попова, Ольга Борисовна

Содержание.

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Строение мембран грамотрицательных бактерий.

1.2 Характеристика липидов мембран грамотрицательных бактерий.

1.2.1. Особенности липидного состава.

1.2.1.1. Функции цвиттерионных липидов.

1.2.1.2 Функции анионных фосфолипидов.

1.2.2. Шаперонное действие бактериальных липидов.

1.2.3. Особенности состава жирных кислот.

1.3. Полиморфизм мембранообразующих липидов бактерий.

1.4. Влияние внешних факторов на физико-химические свойства фосфолипидного матрикса мембран бактерий.

1.4.1. Влияние температуры.

1.4.2. Влияние тяжелых металлов.

1.4.3. Влияние глюкозы и аэрации.

2. Материалы и методы.

2.1. Биологические объекты.

2.1.1. Условия культивирования.

2.2. Экстракция липидов.

2.3. Микротонкослойная хроматография липидов.

2.3.1. Системы растворителей для разделения липидов.

2.3.2. Обнаружение липидов.

2.4. Количественное определение липидов.

2.4.1. Определение общих липидов.

2.4.2. Определение фосфолипидов.

2.4.3. Анализ состава жирных радикалов липидов.

2.5. Калориметрический анализ липидов.

2.6. Анализ бислойных липидных мембран.

2.7. Атомно-адсорбционный анализ.

2.8. ДСН-электрофорез и иммуноблоттинг.

2.9. Количественный анализ результатов. 38!

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Влияние ионов тяжелых металлов и температуры культивирования на термотропное поведение липидов металлрезистентных штаммов Pseudomonas putida.

3.1.1. Сравнительная характеристика роста и липидного состава Pseudomonas putida IB28 и Pseudomonas putida IB 13.

3.1.2. Сравнительная характеристика жирнокислотного состава Pseudomonas putida IB28 и Pseudomonas putida IB 13.

3.1.3. Фазовые переходы общих липидов мембран Pseudomonas putida1,IB28 и Pseudomonas putida IB 13.

3.1.4. Анализ сорбционной способности липидов Pseudomonas putida^\KL% и Pseudomonas putida IB 13.

3.1.5. Анализ проницаемости бислойных липидных мембран на основе липидов Pseudomonas putida IB28.

3.2. Влияние условий культивирования на термотропное поведение липидов-Yersinia pseudotuberculosis.

3.2.1. Влияние температуры, условий аэрации и глюкозы на липидный состав Yersinia Pseudotuberculosis.

3.2.2. Влияние температуры, условий аэрации и глюкозы на жирнокислотный-состав липидов Yersinia pseudotuberculosis. 69 *

3.2.3. Влияние температуры, условий аэрации- и глюкозы на фазовые переходы липидов Yersinia pseudotuberculosis.

3.3. Влияние адаптационных изменений в содержании лизофосфатидилэтаноламина Yersinia pseudotuberculosis на конформацию

OmpF-белка (порина).

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние условий культивирования на термотропное поведение липидов Pseudomonas putida и Yersinia pseudotuberculosis"

Выяснение роли липидов в молекулярных механизмах адаптации бактерий к различным условиям существования является важной задачей современной физико-химической биологии, а также микробиологии и иммунологии.

Мембраны бактерий обеспечивают первичный контакт клеток с окружающей средой и являются универсальной системой передачи информации. Под действием внешних факторов в мембране может изменяться степень жидкостности липидного матрикса, возникать нарушение баланса между содержанием бислойных и небислойных липидов, и, в свою очередь, липид-белковых взаимодействий (Beney, Gervais, 2001; Epand, 2007), что приводит к запуску адаптационного механизма клетки. Именно на бактериях впервые было показано, что компенсаторные приспособления к различным условиям осуществляются за счет композиционных и внутримолекулярных перестроек мембранных липидов и направлены, на« поддержание жидкокристаллического состояния липидного матрикса, оптимального для функционирования мембран (Beney, Gervais, 2001; Cronan, 2006).

Известно, что поддержание жидкокристаллического состояния мембран является необходимым условием для активной жизни бактерий, их устойчивости к воздействию различных факторов окружающей среды. Этот феномен называется гомеовязкостной адаптацией, и впервые был изучен на липидах Escherichia coli (Sinensky, 1974). Изменения в составе мембранных липидов, особенно в жирнокислотном составе липидного бислоя, играют главную* роль в этом процессе. В настоящее время вместо термина «гомеовязкостная адаптация» предлагается использовать более точное понятие «гомеофазная адаптация» (поддержание ламеллярной жидкокристаллической фазы липидов мембран) (Hartig et al., 2005). Несмотря на широкую известность этого феномена, работы по гомеовязкостной/гомеофазной адаптации бактерий малочисленны и ограничены изучением немногих видов бактерий (Morein et al., 1996; Hartig et al., 2005; Baysse, CTGara, 2007).

Функциональная, роль бактериальных липидов определяется их локализацией во внешних слоях клетки и зависимостью активности различных белков- мембраны от жидкостности липидного матрикса. Предполагается, что степень вовлечения липидов в,адаптационные процессы зависит от биологических особенностей различных видов бактерий, особенно у видов-с высокой экологической пластичностью (Hartig et al., 2005; Medeot et al., 2007). Распространенные бактерии, такие как Pseudomonas, способны модулировать экспрессию генов в ответ на широкий- круг стрессоров окружающей» среды, обеспечивая, физиолого-биохимическую адаптацию. Последние данные свидедельствуют о том, что бактериальные мембраны являются не только мишенями для внешних сигналов, но также первичными сенсорами и предшественниками вторичных мессенджеров при запуске адаптационного ответа мембран. Изменения в окружающей среде вызывают тонкие изменения мембранной жидкостности липидов-мембран;.в результате сигнал из окружающей среды трансформируется в активацию транскрипции стрессовых генов, вовлеченных в клеточный ответ, властности в изменение состава и физического состояния,липидов*мембран (Vigh et al., 2007).

Большое внимание уделяется роли липидов- и их .жирных кислот как таксономических маркёров, а также индикаторов, патогенности и биопродукции микроорганизмов.

Поскольку- разнообразие: липидного состава; бактерий может обеспечивать различные механизмы гомеовязкостной/гомеофазной адаптации, то целью, нашей работы было изучение: изменения состава и термотропного поведения1 липидов двух различных видов грамотрицательных бактерий: Yersinia pseudotuberculosis и штаммов Pseudomonas putida IB28 и IB 13изолированных из? морской среды, под действием; температуры, а также: таких внешних факторов* как изменение режима, аэрации,, наличие в питательной среде глюкозы: (для Y. pseudotuberculosis) и ионов меди или кадмия (для P. putida), эффект которых: , на термотропное поведение липидов мембран практически не изучен.

Оба вида характеризуются большим разнообразием условий обитания и, следовательно; обладают хорошими адаптационными' . возможностями, быстро: приспосабливаясь к изменениям в. окружающей" среде (Бузолева; 2000; Regeard et al., 2000; Spiers et: al., 2000), поэтому представляют собой удобные модели для изучения влияния: абиогенных факторов - на, физико-химические свойства липидного матрикса бактериальных мембран.

Работа выполнена при финансовой поддержке US. CRDF и МОН РФ (гранты RUX0-003-VL-06/BP2M03 и ВР4М03 и РЫП.2.1.1.2641), NATO Collaboration Linkage Grants (CLG № 978844; NR CLG 980842), РФФИ (грант № 06-04-9605 6-рвостока) и проекта МОН РФ № 603 в рамках АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы на 2009/2010 гг».

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Попова, Ольга Борисовна

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что повышение температуры культивирования и присутствие и присутствие в среде ионов тяжелых металлов (Си" и Cd" ) аддитивно действуют на состав липидов исследованных штаммов Pseudomonas putida, вызывая увеличение содержания кислых липидов, насыщенных и циклопропановых жирных кислот.

3. Показаны различные стратегии регуляции термотропного поведения липидов Yersinia^pseudotuberculosis и Pseudomonas putida в зависимости от температуры культивирования бактерий, что может быть причиной более выраженных психрофильных свойств у Yersinia pseudotuberculosis по сравнению с Pseudomonas putida.

4. Найдено, что низкая температура^ культивирования и введение глюкозы в питательный бульон в условиях аэрации аддитивно снижают температуру фазовых переходов липидов Yersinia pseudotuberculosis. Причиной снижения температуры фазовых переходов являются повышение уровня моноеновых и снижение содержания циклопропановых жирных кислот.

6. Выявлена зависимость повышения температуры фазовых переходов липидов Yersinia pseudotuberculosis от повышения содержания лизофосфатидилэтаноламина при выращивании бактерий при низкой температуре, в условиях пониженной аэрации культуральной среды, что коррелирует с понижением выживаемости бактерии в этих условиях.

7. Показано, что липиды Yersinia pseudotuberculosis с разным содержанием лизофосфатидилэтаноламина, полученные в результате культивирования при 37°С и 8°С, в разной степени влияют на конформацию мономерной и олигомерной форм иерсинина и эта зависимость прямо противоположна при низкой и высокой температурах инкубирования липидных везикул с белком.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Попова, Ольга Борисовна, Владивосток

1. Антонов В.Ф. Эволюция липидных пор в бислое при фазовом переходе мембранных липидов. В кн.: Проблемы регуляции в биологических системах. Под общей ред. А.Б. Рубина. М.-Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», 2006. 480 с. С. 82-103.

2. Бахолдина С.И., Красикова И.Н., Шубин Ф.Н., Бузолева Л.С., Соловьева Т.Ф. Влияние способа культивирования и фазы роста на липидный состав Yersinia pseudotuberculosis II Биохимия. 2001. Т. 66. вып. 4. С. 511-519.

3. Бахолдина С.И., Санина Н.М., Попова О.Б., Шубин Ф.Н., Соловьева Е.Ф. Термотропное поведение липидов и морфология клеток Yersinia pseudotuberculosis с высоким содержанием лизофосфатидилэтаноламина //Микробиология. 2007. № 3. С. 321-328.

4. Безвербная И.П., Димитриева Г.Ю., Тазаки К., Ватанабе X. Опыт оценки качества прибрежных морских вод Приморья на основе микробной индикации // Водные ресурсы. 2003: № 2. С. 222-231.

5. Бузолева Л.С. Динамика размножения патогенных бактерий в зависимости от трофических и температурных условий культивирования // Журн. Микробиол. 2000. № 2. С. 15-18.

6. Валитова Ю.Н., Гордон Л.Х., Огородникова Т.И., Лыгин А.В. Роль фосфолипазы А2 в изменении потребления кислорода корневыми клетками пшеницы при механическом повреждении // Доклады академии наук. 2001. Т. 376. С. 823-825.

7. Геннис Р. Биомембраны: молекулярная структура и функции.- М.: Изд-во «Мир», 1997. 622 с.

8. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение.- М.: Изд-во «Мир», 2002. 589 с.

9. Дзадзиева М.Ф., Бузолева Л.С., Попков, А.А. Эффект условий питания и температуры культивации на синтез липидов Yersinia pseudotuberculosis II Ж. Микроб. Эпидем. Иммунобиол. 1999. № 6. С. 17-20.

10. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. -М.: Наука, 1981.-294 с.

11. Иванов А.Ю., Гаврюшкин А.В., Сиунова Т.В., Хасанова Л.А., Хасанова З.М. Устойчивость некоторых штаммов • бактерий рода Pseudomonas к повреждающему действию ионов тяжелых металлов // Микробиология. 1999. Т. 68. №3. С. 366-374.

12. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Глюкоза как фактор среды роста, регулирующий липидный состав Yersinia pseudotuberculosis Н Биохимия. 2001. Т. 66. Вып. 8. С. 1122-1127.

13. Кржечковская В.В., Кубатиев А.А., Наумов Ю.И. Мембраны. Серия "Критические технологии". ВИНИТИ. 2004. Т. 2 (22). С. 9-21.

14. Лось Д.А. Структура, регуляция экспрессии и функционирование десатураз жирных кислот // Успехи биологической химии. 2001. Т. 41. С. 163—198.

15. Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. Наука, Москва, 1986. 240 с.

16. Николаев Ю.А., Проссер Дж. А., Паников Н.С. Внеклеточные факторы адаптации к неблагоприятным условиям среды в периодической культуре Pseudomonas fluorescens II Микробиология. 2000. Т.69. № 5. С. 629-635.

17. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф. Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний // Вестник ДВО РАН. 2004. № з. с. 35-44.

18. Сазыкин Ю.О., Швец А.В., Иванов В.П. Антибиотикорезистентность и системы активного выброса ксенобиотиков у бактерий // Антибиотики и химиотерапия. 1999. № 9. С. 3-6.

19. Сомов Г.П., Покровский М.И., Беседнова Н.Н. Псевдотуберкулез. М.: Медицина, 1990, 240 с.

20. Bukholm G., Tannass Т., Nedenskov P., Esbensen Y., Grav H.J., Hovig Т., Guldvog I. С olony v ariation о f Helicobacter pylori: pathogenic p otential i s correlated to cell wall lipid composition // Scand. J. Gastroenterol. 1997. V. 32. P. 445-454.

21. Carman G.M., Deems R.A., Dennis E.A. Lipid signaling enzymes and surface dilution kinetics // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 18711-18714.

22. Carreau J.P., Dubacq J.P. Adaptation of macro-scale method to the micro-scale for fatty acid methyl ^raws-esterification of biological extracts // J. Chromatogr. 1978. V. 151. P. 384-390.

23. Carrol K.K. Quantitative estimation of peak areas in gas-liquid chromatography // Nature. 1961. V.191. P. 377-378.

24. Cervantes C., Gutierez-Corona F. Copper resistance mechanisms in bacteria and fungi //FEMS Microbiol. Rev. 1994. V. 14. №. 2. P. 23-30.

25. Cha J.S., Cooksey D.A. Copper resistance in Pseudomonas syringae mediated by periplasmic and outer membrane proteins // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 8915-8919.

26. Chen X.C., Shi J.Y., Chen Y.X., Xu X.H., Chen L.T., Wang H., Hu T.D. Determination of copper binding in Pseudomonas putida CZ1 by chemical modifications and X-ray absorption spectroscopy // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 74. P. 881-889.

27. Christie W.W. Equivalent chain length of methyl ester derivatives of fatty acids on gas chromatography//J. Chromatogr. 1988. V. 447. P. 305-314.

28. Cooksey D.A. Molecular mechanisms of copper resistance and accumulation in bacteria//FEMS Microbiol. Rev. 1994. V. 14. P. 381-386.'

29. Correa O., Rivas E., Barneix A. Cellular envelops and tolerance to acid pH in Mesorhizobium lotill Curr. Microbiol. 1999. V. 38. P. 329-334.

30. Crist R.H., Oberholser К., Shank N., Nguyen N. Nature of binding between metallic ions and algal cell walls// Environ. Sci. Technol. 1981. V. 15. P. 1212-1217.

31. CpxRA two component system// J. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 2432-2440. Di Russo C.C., Black P.N., Weimar J.D. Molecular inroads into the regulation and metabolism of fatty acids, lessons from bacteria // Prog. Lipid Res. 1999. V. 38. P: 129-197.

32. Domenech O., A. Morros, Cabanas MiE., Montero M.T., Hernandez-Borrell J. Supported planar bilayers from hexagonal phases // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1768. P. 100-106.

33. Dowhan W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are so many lipids? // Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 199-232.

34. Dowhan W., Mileykowskaya E., Bogdanov M. Diversity and versatility of lipid-protein interactions revealed by molecular genetic approaches // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1666. P. 19-39.

35. Epand R.M. Lipid polymorphism and' lipid-protein interactions // Biochim. Biophys. Acta. 1998. V. 1376. P. 353-368.

36. Epand R.M. Membrane lipid polymorphism: relationship to bilayer properties and protein function. In: Methods in Molecular Biology. V. 400: Methods in Membrane Lipids. Ed. by A.M. Dopico, Humana Press, 2007. P. 15-26.

37. Epand R.M., Epand R.F. Lipid domains in bacterial membranes and the action of antimicrobial agents // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1788. P. 289-294.

38. Fang J., Barcelona M.J., Alvarez P.J.J. A direct comparison between fatty acid analysis and intact phospholipid profiling for microbial identification // Organ. Geochem. 2000. V. 31. P. 881-887.

39. Folch J., Lees M., Sloane-Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. V.14. №. 226. P. 497-509.

40. Fukushima N., Ishii I., Contos J., Weiner J.A., Chun J. Lysophospholipid receptors // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001. V. 41. P. 507-534.

41. Gadd G.M: Microbial control of heavy metal pollution. In: Microbial' Control of Pollution // Eds. Fry J.C., Gadd G.M., Herbert R.A., Jones CW., Watson-Craik I.A. 48th Symp. Soc. Gen. Microbiol. Cambridge Univ. Press, London. 1992. P. 59-88.

42. Garab G., Lohner K., Laggner P., Farkas T. Self-regulation of the lipid content of membranes by non-bilayer lipids: a hypothesis // Trends in Plant Sci. 2000. V. 5. P. 489-494.

43. Garner J., Crooke E. Membrane regulation of the chromosomal replication activity of E. coli DnaA requires a discrete site on the protein // EMBO J. 1996. V.15. P. 3477-3485.

44. Goldfme H. Bacterial membranes and lipid packing theory // J. Lipid Res. 1984. V. 25. P. 1501-1507.

45. Hartig С., Loffhagen N., Harms H. Formation of trans fatty acids is not involved in growth-linked membrane adaptation of Pseudomonas putida // Appl. Env. Microbiol. 2005. V. 71. P. 1915-1922.

46. Harvey H.R., Dyda R., Kirchman D. Impact of DOM composition on bacterial lipids and community structure in estuaries // Aquat. Microb. Ecol. 2006. V. 42. P. 105-117.

47. Hazel J.R. Thermal adaptation-in biological membranes: is homeoviscous adaptation the explanation//Annu. Rev. Physiol. 1995. V. 57. P. 19-42.

48. Hazel J.R., Williams E.E. The role of alterations in membrane lipid composition in enabling physiological adaptation of organisms to their physical environment //Prog. Lipid Res. 1990. V. 29. P. 167-227.

49. Hazel J.R., McKinley S.J., Gerrtis. F. Thermal acclimation of phase behavior in plasma membrane lipids of rainbow trout hepatocytes // Am. J. Physiol. 1998. V. 275. №. 3. P. 861-869.

50. Heacock P.N., Dowhan W. Construction of a lethal mutation in the synthesis of the major acidic phospholipids of Escherichia coli И J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 13044-13049.

51. Heacock P.N., Dowhan W. Alteration of the phospholipid composition of Escherichia coli through genetic manipulation // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 14972-14977.

52. Heipieper H.J., de Bont J.A.M. Adaptation of Pseudomonas putida S12 to ethanol and toluene at the level of fatty acid composition of membranes // Appl. Env. Microbiol. 1994. V. 60. P. 4440-4444.

53. Henderson R.J., Millar R.M., Sargent J.R., J0stensen J.-P. 7гаш'-топоешс and polyunsaturated fatty acids in phospholipids of a Vibrio species of bacterium in relation to growth conditions // Lipids. 1993. V. 28. P. 389-396.

54. Hendrick J.P., Wickner W. SecA protein needs both acidic phospholipids and SecY/E protein for functional high-affinity binding to the Escherichia coli plasma membrane // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 24596-24600.

55. Huijbregts R. P. H., de Kroon A. I. P. M., de Kruijff B. Topology and transport of membrane lipids in bacteria // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V.1469. №. 1. P. 43-61.

56. Kanaho Y., Suzuki T. Phosphoinositide kinases as enzymes that produce versatile signaling lipids, phosphoinositides //J. Biochem. 2002. V. 131. P. 503-509.

57. Keller S.L., Gruner S.M., Gawrisch K. Small concentrations of alamethicin induce a cubic phase in bulk phosphatidylethanolamine mixtures // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1278. P. 241-246.

58. Kern R., Joseleau-Petit D., Chattopadhyay M.K., Richarme G. Chaperone-like properties of lysophospholipids // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 289. P. 1268-1274.

59. Keweloh H., Diefenbach R., Rehm H .J. Increase of phenol tolerance of Escherichia coli by alterations of fatty acid composition of the membrane lipids // Arch. Microbiol. 1991. V. 151. P. 49-53.

60. Klein W., Weber M.H.W., Marahiel M.A. Cold shock response of Bacillus subtilis: isoleucine-dependent switch in the fatty acid branching pattern for membrane adaptation to low temperatures // J. Bacteriol. 1999. V.181. P. 5341-5349.

61. Koch1 A.L. The Bacteria: Their Origin, Structure, Function and Antibiosis.-Springer, 2007. 226 p.

62. Komatsu H., Okada S. Increased permeability of phase-separated liposomal membranes with mixtures of ethanol-induced interdigitated and non-interdigitated structures // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1237. P. 169175.

63. Kozloff L.M., Turner M.A., Arellano F. Formation of bacterial membrane ice-nucleating lipoglicoprotein complexes // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 65286536.

64. Krasikova I.N., Khotimchenko S.V., Soloveva T.F., Ovodov Y.S. Mutual influence of plasmid profile and growth temperature on the lipid compositionof Yersinia pseudotuberculosis bacteria // Biochim. Biophys. Acta. 1995. V. 1257. P.118-124.

65. MartinLM.F., Disalvo E.A. Effect of polar head groups on the activity of aspartyl protease adsorbed to lipid membranes // Chem. Phys. Lipids. 2003. V. 122. P. 177-183.

66. Matsumoto K., Kusaka J., Nishibori А., Нага H. Lipid domains in bacterial membranes // Mol. Microbiol. 2006. Vol. 61. P. 1110-1117.

67. Mannisto M.K., Puhakka J.A. Temperature- and growth-phase-regulated changes in lipid fatty acid structures of psychrotolerant groundwater Proteobacteria // Arch. Microbiol. 2001. №. 177. P. 41-46.

68. McGarrity J.T., Armstrong J.B. Phase transition behaviour of artificial liposomes composed of phosphatidylcholines acylated with cyclopropane fatty acids // Biochim. Biophys. Acta. 1981. V. 640. P. 544-548.

69. Medeot D., Bueno M., Dardanelli M., Garcia de Lema M. Adaptational changes in lipids of Bradyrhizobium* SEMIA 6144 nodulating peanut as a response to growth temperature and salinity //Curr. Microbiol. 2007. V. 54. P. 31-35.

70. Melchior DL. Lipid phase transition and regulation of membrane fluidity of procaryotes // Curr. Top. Membr. Transp. 1982. V. 17. P. 263-316.

71. Meyer J-M. Pyoverdines: pigments, siderophores and potential taxonomic markers of fluorescent Pseudomonas species // Arch Microbiol. 2000. V. 174. №. 3. P. 135-152.

72. Mileykovskaya E., Dowhan W. The Cpx two-component signal transduction pathway is activated in Escherichia coli mutant strains lacking phosphatidylethanolamine // J. Bacterid. 1997. V. 179. P. 1029-1034.

73. Mileykovskaya E., Dowhan W. Role of membrane lipids in bacterial division-site selection // Curr. Opin. Microbiol. 2005. Vol. 8. P. 135-142.

74. Mirams R.E., Smith S.J., Hadler K.S., Ollis D.L., Schenk G., Gahan L.R. Cadmium (II) complexes of the glycerophosphodiester-degrading enzyme GpdQ and a biomimetic N,0 ligand // J. Biol. Inorgan. Chem. 2008. V. 13. P. 71065-1072.

75. Morein S., Andersson A., Rilfors L., Lindblom G. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures // J. Biol. Chem. 1996.V. 22. P. 6801-6809.

76. Mouritsen O.G., Kinnunen P.K.J. Role of lipid organization and dynamics for membrane fluidity. In: Biological membranes (Eds. Merz К. M., Roux B.) // Birkhauser, Boston. 1996. P. 463-502.

77. Murray S.R., Ernst R.K., Bermudes D., Miller S.I., Low K.B. PmrA(Con) confers pmrHFIJKL-dependent EGTA and polymyxin resistance on msbB Salmonella by decorating lipid A with phosphoethanolamine // J. Bacterid. 2007. V. 189. P. 5161-5169.

78. Nies D.H. Microbial heavy metal resistance // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51. P. 730-750.

79. Paulick M.G., Bertozzi C.R. The glycosylphosphatidylinositol anchor: A complex membrane-anchoring structure for proteins // Biochemistry. 2008. V. 47. P. 6991-7000.

80. Pinkart H.C., White D.C. Phospholipid biosynthesis and solvent tolerance in

81. Rowinski P., Korytkowska A., Bilewicz R. Diffusion of hydrophilic probes in bicontinuous lipidic cubic phase // Chem. Phys. Lipids. 2003. V. 124. P. 147156.

82. Russel N.J. Cold adaptation of microorganisms I I Philos. Trans. R. Soc. London B. Biol. Sci. 1990. V. 326. P. 595-611.

83. Russel N.J. Mechanisms of thermal adaptation in bacteria: blueprints for survival // Trends Biochem. Sci. 1984. V. 9. P 108-112.

84. Salamah A.A, АН M.A. Effect of temperature on the lipid and fatty acid composition of Yersinia pseudotuberculosis II New Microbiol. 1995. V. 18, №.1.P. 27-33.

85. Saydam N., SteinerF., Georgiev O., Schaffner W. Heat and heavy metal stress synergize to mediate transcriptional hyperactivation by metal-responsive transcription factor MTF-1 // J. Biol. Chem. 2003.V. 278. №. 34. P. 3187931883.

86. Sanina N.M., Kostetsky E.Y. Thermotropic behavior of major phospholipids from marine • invertebrates: changes with warm-acclimation and seasonal acclimatization // Сотр. Biochem. Physiol. Part B. 2002. V. 132. №. 2. P. 143-153.

87. Sanina N.M., Goncharova S.N., Kostetsky E.Y. Seasonal changes in fatty acid composition and thermotropic behavior of polar lipids from marine macrophytes // Phytochemistry. 2008. V. 69. P. 1517-1527.

88. Seddon J.M., Templer R.H. Polymorphism of lipid-water systems. In: Structure and Dynamics of Membranes. R. Lipowslcy and E. Sackmann (eds.), -Amsterdam: Elsevier, 1995. P. 97-160

89. Seelig J. Phospholipid headgroups as sensors of electric charge. In: New Developments in Lipid-Protein Interactions and Receptor Functions. (Eds.: K.W.A. Wirtz, L. Parker, J.A. Evangelopoulos, J.P. Changeues), London: Plenum, 1993. P. 441-448.

90. Seto-Young D., Chen C.C., Wilson Т.Н. Effect of different phospholipids on the reconstitution of two functions of the lactose carrier of Escherichia coli II J. Membr. Biol. 1985. V. 84. P. 256-67.

91. Shalaev E.Y., Steponkus P.L. Phase diagram of 1,2-dioleoyl-phosphatidyl ethanolamine (DOPE): water system at subzero temperatures and low water contents//Biochem. Biophys. Acta. 1999. V. 1419. P. 229-247.

92. Snijder H.J., Dijkstra B.W. Bacterial phospholipase A: structure and function of an integral membrane phospholipase // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1488. P. 91-101.

93. Shuai J.W., Jung P. Optimal ion channel clustering for intracellular calcium signaling //PNAS. 2003. V. 100. P. 506-510.

94. Simons K., Toomre D. Lipid rafts and signal transduction // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2000. V. 1. P. 31-39.

95. Sinensky M. Homeoviscous adaptation a homeostatic process that regulates the viscosity of membrane lipids in Escherichia coli II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. V. 71.№.2. P. 522-525.

96. Spiers A.J., Buckling A., Rainey P.B. The causes of Pseudomonas diversity // Microbiol. 2000. V. 146. P. 2345-2350.

97. Suutari M., Laakso S. Microbial fatty acids and thermal adaptation // Crit. Rev. Microbiol. 1994. V. 20. P. 285-328.

98. Svetashev V.I., Vaskovsky V.E. A simplified technique for thin-layer microchro-matography of lipids // J. Cromatogr. 1972. V. 67. №. 2. P. 376-378.

99. Swan T.M., Watson K. Stress tolerance in a yeast lipid mutant: membrane lipids influence tolerance to heat and ethanol independently of heat shock proteins and trehalose // Can. J. Microbiol. 1999. V. 45. P. 472-479.

100. Tang Y., Hollingsworth R. Regulation of lipid synthesis in Bradyrhizobium japonicum: low oxigen concentration trigger phosphatidylinositol biosintesis //Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 1963-1966.

101. Tannaes Т., Bukholm I.K., Bukholm G. High relative content of lysophospholipids of Helicobacter pylori mediates increased risk for ulcer disease // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005. V. 44. P. 17-23.

102. Theuvenet A.P.R., Kesseles B.G:F., Blankensteijn W.M., Borst-Pawels G.W.H.F. А С omparative s tudy о f K+loss from a cadmium-sensitive and,a с admium-resistant strain of Saccharomyces cerevisiae II FEMS Microbiol. Lett. 1987. V. 43. P. 147-153.

103. Thurmond R.L., Dodd S.W., Brown M.F. Molecular areas of phospholipids as determined by 2H-NMR spectroscopy// Biophys. J. 1991. V. 59. P. 108-113.

104. Vanounou S., Parola A.H., Fishov I. Phosphatidylethanolamine and phosphatidylglycerol are segregated into different domains in bacterial membrane: a study with pyrene-labelled phospholipids // Mol. Microbiol. 2003. V. 49. P. 1067-1079.

105. Van Rensburg C.E.J., Joone G.K., СГSullivan J.F., Anderson R. Antimicrobial activities of clofazimine and B669 are mediated by lysophospholipids // Antimicrob. Agents and Chemotherapy. 1992. Vol. 36, № 12. P. 2729-2735.

106. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasendin I.M. An universal reagent for phospholipid analysis//Chromatog. 1975. V. 114. P. 129-141.

107. Vaskovsky V.E., Terekhova T.A. HPTLC of phospholipid mixtures containing phosphatidylglycerol //J. High. Resol. Chrom. 1979. V. 2. P. 671-672.

108. Verkleij A.J. Lipidic intramembranous particles // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 779. № l.p. 43-63.

109. Vigh L., Nakamoto H., Landry J., Gomez-Munoz A., Harwood J .L., Horvath I. Membrane regulation of the stress response from prokaryotic models to mammalian cells // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007. V. 1113. P. 40-51.

110. Wada H., Gombos Z., Murata N. Enhancement of chilling tolerance of a cyanobacterium by genetic manipulation of fatty acid desaturation // Nature. 1990: V. 347. P. 200-203.

111. Wagner H., .Pohl P., Munging A. Sphingolipids and glycolipids of fungy and higher plants. Isolation of an inositol free phytosphingolipids from Scenedesmus obliquus H Z. Naturforsch.J 969. V. 24. №. 3". P. 360-365.

112. Wang L., Zhou Q., Chua H. Contribution of cell outer membrane and" inner membrane to Cu~ adsorption by cell envelope of Pseudomonas putida 5-x // J. Environ. Sci. Health A Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng. 2004. V.- 39. № 8. P. 2071-2080.

113. Wang L., Li F., Zhou Q. Contribution of cell-surface components to Cu2+ adsorption by Pseudomonas putida 5-x // Appl. Biochem. Biotechnol. 2006. V. 128. P. 33-46.

114. Wang X., Bogdanov M., Dowhan W. Topology of polytopic membrane protein subdomains is dictated by membrane phospholipid composition // EMBO J. 2002. V. 21. P. 5673-81.

115. Weast R.C. CRC handbook of chemistry and physics. CRC Press, (70 edn.), Boca Raton, FL, 1989. 266 p.

116. Weber M.H.W., Marahiel M.A. Coping with the cold: the cold shock response in the gram-positive soil bacterium Bacillus subtilis II Philos. Transac.: Biol. Sci. 2002. V*. 357. P: 895-907.

117. Welti R., Glaser M. Lipid domains in model and biological membranes // Chem. Phys. Lipids. 1994. V. 73. P. 121-137.

118. Wilkinson S.G. Gram-negative bacteria. In: Microbial lipids. Ratledge C., Wilkinson S.G. (eds.). V. 1, Academic Press, 1988. P. 355-356.

119. Williams W. P. Cold-induced lipid phase transitions // Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 1990. V. 326. №. 1237. P. 555-570.

120. Williams W.P. In: Lipids in Photosynthesis: structure, functions and genetics. Eds. Siegenthaler P.A. & Murata N., Kluwer, Nederlands, 2002. P. 1-20.

121. Wolf C., Koumanov K., Tenchov В., Quinn P.J. Cholesterol favors phase separation of sphingomyelin // Biophys. Chem. 2001. V. 89. P. 163-172.

122. Wolf C., Quinn P.J. Lipidomics: Practical aspects and applications // Prog. Lipid Res. 2008. V. 47. P. 15-36.

123. Xu Y., Feng L, Jeffrey P.D., Shi Y., Morel F.M. Structure and metal exchange in the cadmium carbonic anhydrase of marine diatoms // Nature. 2008. V. 452. P. 56-61.

124. Zajchowski L.D., Robbins S.M. Lipid rafts and little caves. Compartmentalized signaling in membrane microdomains // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 737-752.

125. Zhang W., Bogdanov M., Pi J., Pittard A.J., Dowhan W. Reversible topological organization within a polytopic membrane protein is governed by a change in membrane phospholipid composition // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 50128-50135.

Информация о работе

Попова, Ольга Борисовна
кандидата биологических наук
Владивосток, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние условий культивирования на термотропное поведение липидов Pseudomonas putida и Yersinia pseudotuberculosis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы