Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние условий культивирования на рост и состав жирных кислот жгутиконосца ASTASIA LONGA

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние условий культивирования на рост и состав жирных кислот жгутиконосца ASTASIA LONGA"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ

М.В. ЛОМОНОСОВА

РГ6 од

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

'Р iqoft На правах рукописи

УДК 577.1

АЛЬ ХАШАДИ ХАСАН АХМЕД

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА РОСТ И СОСТАВ ЯИРНЫХ КИСЛОТ ЖГУТИКОНОСЦА ASTASIA LONGA

Специальность 03.00.07- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафэдре микробиологии биологического факультета Московского Государственного университета имени 11.В. Ломоносова.

Научные руководители : доктор биологических наук, H.H. Сухарева кандидат биологических наук И.В. Еотвинко

Официальные оппоненты : доктор биологических наук Е.П. Феофилова кандидат биологических наук И.Н. Сквдрцова

Ведущее учреждение - Институт медицинской паразитологии и тропической медицины ш. Е.И. Марциновскпго, Москва.

Защита состоится " г. в часов

на заседании специализированного совета Д 053 . 05 . 66 . при Московском государственном университете по адресу : 119899, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией модно ознакомится в библиотек биологического факультета МГУ.•

Автореферат разослан " " bM&fötä 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук Н.Ф. Пискункова

Актуальность проблемы. В последнее десятилетие

значительно расширились представления о липидах разных организмов, традиционно, считавшихся запасными веществами. Показана их барьерная функция, участие в мембранном транспорте, в реакциях, катализируемых рядом ферментов, процессах возбуждения и раздражения, терыосенсорных

реакциях,- в координировании контрольных механизмов ( Крепе, 1981; Chopra, Khuller, 1985; Феофилова и др., 1987 ).

Эти соединения представляют интерес и как препараты медицинского назначения, так как, в отличие от антибиотиков и хиниопрепаратов, обладает такими ценными свойствами, как низкая токсичность и способность к стимуляции иммунной системы макроорганизма ( Сухарева, 1975; Хорохорина, 1988 ). Одно из направлений широкого использования микробных, лигадов - замена растительных масел, идущих на пищевые нуяды ( Феофилова, 1990, 1391 ). Проведены исследования по использованию лшпидных препаратов в качестве добавок в корм сельскохозяйственных ииеотных и птиц ( Шмидт, .1979; Феофилова, 1991 ).

В научном и практическом аспектах перспективны простейшие, являющиеся валнш звеном в эволюции аивого мира и стояпцге у истоков развития метазоз ( Райков, 1967; Полянский, 1971, 197В; Шульман, 1971; Засухин, 1972; Taylor, 1976 ). В этой группе микроорганизмов интересны, в частности, агутиконосцы, так как различные их представители характеризуются анатомическими особенностями и метаболизмом, свойственным либо нивотныы, либо растительным клеткам, а некоторые обладают двойственной способностью ( Clark, Stone, I960; Manners et al.',

- £ -

1966; Dewey, 1967; Ryley, 1967; Хольц, 1969; Hols, 1974; Palmer, 1974 ). В составе липидов зоо- и фитофлагеллят обнаружены весьма ценные в биологическом отношении соединения, такие как убихиноны, токоферолы, фосфолипиды, а также свойственная клеткам животных арахидоновая кислота - предшественник простатландинов ( Okumura et al., 1985 ).

Экспериментально обосновано применение непатогенных для человека свободноживущих флагеллят как источника биологически активных веществ, в частности, липидов и полисахаридов ( Сухарева, 1989 ). Это открывает возможности для существенного расширения круга продуцентов биологически активных веществ га счет представителей Protozoa. Среди изученных флагеллят большого внимания заслуживает Astasia longa. Данный организм удовлетворяет основным критериям, предъявляемым к продуцентам таких соединений. Простота состава среды для роста, достаточно высокий выход биомассы, особенности состава липидов и способность к сверхсинтезу ß-1,3-глюкана в виде цитоплазматических гранул. определяет целесообразность использования этого жгутиконосца как продуцента липидов и полисахаридов ( Сухарева, 1975 ).

Цель и задачи исследования. Целы) настоящей работы была

оптимизация условий роста Astasia longa в связи с синтезом жирных кислот широкого спектра.

В соответствии о этой целью поставлены следующие задачи:

- определение влияния условий культивирования - А. longa, а также фазы роста культур на состав и соотношение жирных кислот атого микроорганизма;

- изучение морфологических и биохимических особенностей

- -а -

клонов А. longa в связи с биосинтезом жирных кислот.

Научная новизна и значимость результатов. В результате комплексного подхода к регуляции липогенеза Astasia longa установлена прямая корреляция относительного содержания ненасыщенных жирных кислот с повышением температуры и усилением аэрации. Показано, что максимальное количество непредельных, в том числе полиеновых, жирных кислот накапливается после завершения роста, причем атому процессу благоприятствует естественное подкисление среды. Показано, что плотность и условия подготовки инокулята существенно влияют на содержание ненасыщенных кислот А. longa.

Практическая ценность. Оптимизация условий культивирования А. longa позволила повысить выход практически ценных полиеновых кислот, особенно арахидоновой, докозапентаеновой и докозагексаеновой. Определены условия максимального накопления биомассы зтого простейшего. Предварительные эксперименты, проведенные в НИИ пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева, показали, что биомасса А. longa может конкурировать о белково-витаминным концентратом в качестве добавки в корм животным.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на семинарах лаборатории антибиотиков (1991г.) и кафедры микробиологии (1992 и 1993г.).

Публикации. По теме диссертации опубликована 1 статья.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов исследований и выводов. Работа изложена на 10В странитцах машинописи, иллюстрирована 13 таблицами и 6 рисунками. Список цитируемой литературы включает 192 работ, из них 73 на русском языке.

Экспериментальная часть.

Объект и методы исследования.

В качестве объекта исследования была выбрана свободноживущая фитофлагеллята Astasia longa штамм А-60, культура которого поддерживается в лаборатории антибиотиков биологического факультета МГУ.

А. longa поддерживали на модифицированной синтетической среде Крамера-Майерса ( Cramer, Mayers, 1952 ). Среда для культивирования содержала этиловый спирт /ректификат/ -10 ил, а также соли ( г/л): NH4CL-1,0; KHg Р 04-1,0; Kg Н Р04. .ЗН2 0 .-1,0; MgSO^. . 7 Hg О -0,2; цитрат натрия Na^CgHgO^ 5Н^Э - 0,8; микроэлементы ( иг/л): Fe> (SO^.)^- 3,0; CuSO^ .БН^ О- 1,8; CoCl2

.6Н2 0-1,3; ZnSO^. 7Н 0,4; N^MoO^.21^ О- 0,2; CSClg - 0,02; витамины. С мг/л): Е^- 0,02; В^- 0,01; вода дистиллированная;1 начальное значение pH - 6,8-7,2. Эксперименты проводили в колбах емкостью 750 мл с 250 мл среды в стационарных условиях и на качалке ( 200 об/мин ).

Клоны А. longa выращивали в чашках Петри на среде Кранера-Майерса, содержащей 1,5Х агара, в течение 10 дней при 25°С.

Для получения- кормовой биомассы А.longa выращивали., на опытной установке лаборатории антибиотиков. биологического факультета МГУ в аппаратах емкостью 10 и 40 л при 24-25 С в течение 6 суток. Количество поступающего стерильного воздуха контролировали с помощью ротаметра PC-2 (1 объема воздуха на 1 л среды в мин).

Количество клеток в культуре простейшего определяли о помощью камеры Горяева:

Изменение морфологии и содержания гранул парамилона у простейших контролировали с помощью светового. микроскопа в препаратах "раздавленная капля", а также фиксированных ( смесью абсолютного этилового спирта и эфира, 2:1 ) и окрашенных по Романовскому препаратах.

Общую липидную фракцию из культуры А. longa выделяли по методу Фолча ( Folch et al., 1951, 1957 ) Клетки осаждали центрифугированием. Биомассу переносили в колбу с притертой пробкой смесью хлороформ-метанол (2:1 по объему ). Смесь растворителей добавляли из расчета 20 мл на 1 г сухой биомассы. Через 24 ч лизированные клетки отфильтровывали через бумажный фильтр. Для очистки экстракта от нелипидных примесей его промывали. 10-кратным объемом дистиллированной воды методом "стакан в стакан" иди в делительной воронке ( Folch et al., 1951 ). После расслоения экстракта верхний воднометанольный слой удаляли с помощью сифона.

Жирнокислотный состав липидов А. longa исследовали методом гаважидкостной хроматографии ( Берчфилд, Сторрс, 1964 ). 5-10 мг экстракта помещали в колбу, растворитель упаривали досуха на испарителе. В колбу, содержащую 5-10 мг липидов, приливали 1 мл 2% метанодьного раствора NaOH. Реакционную смесь нагревали на водяной бане при 70°С в течение 5 мин. до полного растворения липидов. К полученному раствору добавляли 0,5 мл 5Х BF в СИ ОН. Реакционную смесь нагревали при 70"с в течение 2 мин., охлаждали, разбавляли водой ( 2-3 мл ) и экстрагировали гексаном ( 1:1 ). Верхний слой, содержащий метиловые эфиры жирных кислот, упаривали досуха и анализировали с помощью газожидкостного хроматографа <•" Varían model 3700 " на стеклянной колонке ( 1м х 0,4см ). В

- в -

качестве стационарной фазы применяли 107. цианпропильный метилсшшкон средней полярности ( Р-2330 ) на хромсорбенте WAW с размером частиц 100-200 меш . Температуру колонки программировали от 150 до 220"с, газ-носитель гелий пропускали со скоростью 20 мл/мин.

Идентификацию жирных кислот на хроматограммах проводили, сравнивая относительные удерживаемые объемы метиловых эфиров исследуемого образца с относительными объемами растворов метиловых эфиров стандартных жирных кислот. Содержание жирных кислот рассчитывали по площади соответствующих пиков на хроматограммах и выражали в процентах от суммы жирных кислот исследуемого образца.

Ранее была проведена идентификация жирных кислот A. longa методом хромато-масс-спектрометрии и определено соответствие их сигналам, полученным с помощью газожидкостной хроматографии ( Медведев и др., 1983 ).

Результаты и их обсуждение.

В настоящей работе осуществлен комплексный подход к проблеме липогенеза флагеллят на примере биосинтеза жирных кислот Astasia lonea. В результате обнаружено, что при одновременном

о

повышении температуры от 25 до 29 С и аэрации среды

(пассивная-_активная) достигается значительное увеличение

удельной скорости роста культуры и выхода биомассы ( рио.1 ). Сокращается длительность лаг-фазы и увеличивается продолжительность экспоненциальной фазы роста, увеличивается скорость деления клеток.На сутки раньше достигается стационарное состояние. Наблюдаемый в условиях активной аэрации вторичный рост- достаточно типичное явление в „ развитии

Число клеток, 106 кл/мл

Рис.-f. Влияние аэрации на рост А. longa при разных температурах, 1,2-пассивная аэрация, 3,4-активная аэрация; 2,4-при 25 С 1,3-при 2Э°С.

»¿икроорганизюв. Очевидна, завершение. опыта, к седьмым .оуткам при' пассивной, аэрации, не спсюобатвупщей. интенсивному развитию, не позволило наблюдать его и в этом ремме.

Аналогичные данные получены для других простейших по влиянип аэрации при постояяой температуре'. ( Зильберблат» 1958, Сухарева.а др,. 1369),. Повышение температуры без усиления, азрацкк оказывает меньший эффект, и практически не дает ускорения роста

A. longa. Итак, режим активной аэрации предпочтительнее

пассивной для роста А. longa, что согласуется и с результатами цитологических исследовании. В конце экспоненциальной фазы роста культур при активной аэрации большинство клеток имеет правильную ланцетовидную форму. При культивировании А. longa в

условиях пассивной аэрации клетки более крупные, часто неправильной формы, немного округлых. При культивировании А. longa на качалке количество гранул парамилона остается постоянным во всех фазах роста простейшего, в то время как при пассивной аэрации, начиная со стационарной фазы роста, количество гранул парамилона сокрап^ается и к концу культивирования ( 168 ч ) значительное число клеток ( 60-70% ) уже не содержит их.

В литературе имеются сведения о влиянии на морфологию простейших такого фактора среды, как pH. Наблюдаемая в процессе развития Trypanazoma cruzi "самонейтрализация" культуральной среды после ее закисления сопровождается исчезновением обычных широких эпимастигот и появлением тонких форм в результате вторичного роста. Аналогично, у Crlthldla oncopelti промастиготы бочонковидной или ланцетовидной формы, характерные для первого максимума, сменяются веретенообразными клетками ( Сухарева, 1989 ).

Из полученных нами данных ( рио.2 ) следует, что А. longa не столь чувствительна к изменению pH, как Т. cruzi и С. oncopelti ( Сухарева, 1989 ). В отличие от этих простейших, рост А. longa и накопление жирных кислот не требуют постоянного регулирования pH. Напротив, естественное изменение pH в процессе культивирования, по-видимому, даже благоприятствует биосинтезу ненасыщенных и полине'насыщенных жирных кислот, повышая их

Число клеток," 1Ю6 кл/мл

Тб-

12

РН

4 -

Т-1-1-—1-1

Возраст

24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 к^уры,ч

Рис.2 • Влияние pH среды на клеток f. longa.

1,2,3- накопление клеток; 4,5,6-изменение pH; 3,4- без подтитровки; 1,6- с подтитровкой на 3 сутки; ■ 2,5- с подтитровкой на 5 сутки.

(родерхание к: стационарной, фазе до. 71,0Z и 37,0%, соответственно ( табл.1 ).

Известно, что условия среды оказывают сильное влияние на физиолого^биохимические особенности микроорганизмов. Наблюдается неоднородность, гетерогешгооть популяции, отражающая, адаптивные тенденции развития. Установлены клоновые различии в культурах А.longa' и E.gracllis в степени, устойчивости к высоким концентрациям этилового • спирта, а у А. longa- и ионов кальция

— ш -

Таблица ? Т:

Влияние рн среды на состав жирных кислот а. юпда

(относительное содержание, х>-

Код жирной кислоты 3 су Т. 6 су Т. 10 сут.

контроль ОПЫТ контроль ОШТ контроль опыт

с'12«0 2,2 2,5 0 1,7 0,9 0

с13:0 5,3 6,2 1,6 4,2 3,7 6,2

с14ю 23,3 25,2 6,5 .24,6 10,6 11,2

с14»1 о, ь о,4 о о,9 0,4 о

°15ю 2,9 2,3 1,2 2,1 2,7 2,3

с16:0 12,1 11,5 11,9 11,6 10,9 15,2

°16«1 1,3 1,7 1,4 1,5 1,6 1,1

2,9 2,8 2,1 1,9 1,3 в,5

с18:х 5,6 4,3 5,4 , 1,6 3,7 6,2

с1н12 2,6 3,1 4,0 4,1 2,2 1,1

0 0 0 0 0 0

п 0 о 0 0 0 0

2011

®20 «2 13,7 14,2 15,4 0,7 12,6 8,4

с20«3 4,1 4,5 7,0 5,5 16,5 8,4

^20 «4 14,4 15,2 20,0 23,3 20,7 24,7

^20 «5 0 0 0 0 0 о

С _ _ 0 о 0 0 0 0

22 «2

^22 «4 0,9 1,5 1,1 0,9 1,1 о

о о 0 0 0 0

22 »5

с22 с 6 0,5 о,в 0,9 0,6 1,2 1,6

^24 «0 3,6 2,7 4,9 3,7 4,1 2,3

с24:1 3,8 1,1 7,? 3,8 5,7 3,4

Сумма насыщенных 52,3 53,2 28,7 49,3 34,1 45,5

жирных кислот

Сумма ненасыщен- 47,0 46, в 71,3 50,0 63,7 54,5

ных жирных кислот

В том числе 19,9 22,0 37,3 29,9 39,7 35, 4

поливновых

Примечание» контроль - без подтитровки,

опыт - с подтитровкой на третьи и пя'И.е сутки

( Сухарева, 1989 ). Нами была использована идея клонирования простейшего с целью получения гомогенной высокопродуктивной по ненасыщенным жирным кислотам культура. Однако, полученные клоны А. longa не различались по морфологии колоний и клеток. Практически был идентичен и состав лирных кислот клонов ( табл. 2 ). По-видимому, условия выращивания колоний А. longa, использованные в работе, не позволили' проявиться попудяционной изменчивости, столь типичной для микроорганизмов (Милько, Егоров, 1992), либо она не характерна для А. longa.

Известно, что доза и возраст посевного материала определяют продолжительность лаг-фазы и скорость деления флагеллят. Так, интенсивное развитие Т. cruzi наблюдается из инокулята, взятого в конце экспоненциальной- начале стационарной фазы роста (Зильберблат, 1968). Для интенсификации развития культуры А. longa, по налим данным, следует брать инокулят в стационарной фазе или фазе вторичного роста и в концентрации не более

<s о

1,5-1,8. 10 кл/мл, выращенный при 29 С и активной аэрации ( рис. 3,4 ) ( табл.3 ). Указанный режим способствует получению биомассы с высоким содержанием непредельных жирных кислот, особенно полиеновых.

Известно, что не всегда условия, оптимальные, для роста и развития микроорганизма, являются оптимальными для биосинтеза им того или иного вещества. У А. longa максимальное количество ненасыщенных лирных кислот синтезируется при достаточно высоком накоплении клеток.

Для жгутиконосцев независимо от фазы роста культур характерно стабильное соотношение насыщенных и ненасыщенных

Таблица^ 2

Состав ЖИрПШС КИСЛОТ ОТДеЛЫШХ КЛОНОВ й. .longa,' (а)и (б) , в разных фазах ' роста «относительное содержание, х>.

Экспоненциальная фаза ( з сут.>

( а > Г t о >

Стационарная фаза

t 5 сут.) а )| с о >

Фаза отмирания t 7 сут. )

< а > I <7*

°12 0 2,1 2,1 0 0,7 1,0 0,5

°13 0 6,2 6,3 3,9 4,4 3) 5 2,3

с14 0 31,в 31,7 11,5 22,5 6,9 8,7

с14 1 0,8 0,8 0 0,7 0 о,з

с15 0 4,1 3,8 1,1 2,1 1,5 1,2

с16 0 13,2 12,5 9,9 11,7 14,8 12,0

с16 1 1.2 1,3 2,в 1,в 1.0 2,0

c1q 0 2,5 2,9 в,в 2,3 1,0 1,3

°1в 1 5,0 4,6 9,9 2,9 5,9 4,4

с18 2 3,3 3,8 2,в 4,7 2,5 4,2

с1в 3 о О 0 0 0 0

с20 1 о О О 0 0 1 0

с20 2 12,3 12,9 11,0 12,3 14,в 15,5

с20 3 4.1 4,2 5,5 4,4 в,4 13,4

°20 4 13,2 13,3 22,0 21,3 26,6 18,1

с20 5 О 0 0 0 0 0

°22 2 0 0 0 О . 0 0

°22 4 - — 1,1 1,2 0 1.7

°22 5 0 О 0 0 0 0

с22 6 — — 1.7 0,6 2,5 1.2

с24 о - - 2,в 3,5 3,9 4,4

с24 1 - - 5,5 2,9 4,9 8,7

Сумма насыщенных жирных кислот

Сумма ненасыщенных жирных кислот

В том числе пошваових

59,9 57,2 37,9 43,9 32,5 30,4 40,1 40,в 62,1 56,1 67,5 69,6 17,4 17,5 30,2 27,5 зв,4 34,4

- тз -

Таблица 3

Влияние температур выращивания посевного материала и

культур а. longa при пассивной и активной аэрации на состав жирных кислот «относительное содержание, %>-

Код жирной кислоты Пассивная аэрация Активная аэрация

а. 25 25 в. 25 27 с. 27 25 d. 27 27 е. 25 29 F. 29 29

°12«0 1,7 0,2 1,5 1,3 2,3 2,7

с13:0 6,5 5,4 7,4 11,7 12,8 12,3

с14«0 24,в 27,2 30,7 13,6 24,6 15,3

с14«1 8,7 7,4 7,6 6,0 4,5 5,4

°15:0 6,1 9,0 6,3 10,7 п -f ) ' 2,7

с16:0 19,3 13,? 20,0 4,4 7,6 12,6

с16! 1 4,8 7,2 5,3 14,7 9,2 5,8

в,0 0,7 1,1 3,6 1,1 0

°1ви 2,4 3,2 2,3 2,3 1,2 6,5

1,1 0,7 1,0 1,4 1,1 0,7

с1в53 с20:1 ®20!2 0,8 0,7 1,5 0 0 4,5 0,7 0 1,3 1,1 0,2 2,0 1,6 0 3,1 о 0 2,5

с20!3 1,3 з,о 1,1 2,7 6, 5 4,1

®20«4 2,7 6,6 3,2 6,6 13,7 7,7

^20 i 5 0,5 0,7 0,7 1,1 1,1 1,1

^22 а 2 1,5 0,7 1,5 2,8 1,1 5,1

®22:4 С22«5 2,1 2,7 3,4 1,1 2,6 1,1 5,1 4,1 4,2 1,0 в,7 4,3

с22 «6 с24 10 °24!1 1,1 0 0 1,0 0 0 0,7 0 0 2,0 0 0 0,8 0 0 2,5 0 о

Сумма насыщенных жирных кислот 66,3 53,7 67,0 46,3 50,в 45,6

Суша ненасыщенных жирных кислот 33,7 41,3 31,0 53,7 49,2 54,4

В том числе полиеновых 11,3 15,5 10,0 22,7 27, 1 28, 3

Число меток, 106 кл/мл

20

15 -

10

24 48 72

96

—i— 120

—г-144

Возраст

168 КУЛЬТУР"» 4

v

Рис.3. Влияние объема инокулята на рост А. longa при 29 С; и активной аэрации; 1-10; 2-20} 3-30% .

жирных кислот в фосфолипидной фракции. Более лабильна. ' фракция нейтральных липидов, га счет которой и пожег быть осуществлено увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот, представляющих особый интерес, как в научной, так и. прикладном аспекте.. В клетках, А. longa в наибольших количествах.. обнаруживаются, на насыщенных.. . кислота мириотиновая:. C^.q, пентадекановая. С^д.д,'

из

^ 8.2.. эйкозатриевовая арахидоновая с20:4' докозапентаенавая

докозагекоаеновая Cgg.g-

Результаты.экспериментов показывают, что оптимизация, условий, культивирования. А. longa позволяет повысить содержание в клетках

пальмитиновая.

C|g.Q, стеариновая: C^q.q;. из ненасыщенных:

олеиновая С.

18:1'

линолевая. Со

20:3' °22:5'

- Т5 -

Число клеток, 106 кл/мл

- 10

15

5

3

1 г

Возраст

' 1 1 1 ' 1 1 г культуры,ч 24 48 72 96 120 144 168

Рис.4. Влияние возраста инокулята на рост а. longa.

1-Зсут. : 2-2сут. : 3-5сут. , 4-7сут.

ненасыщенных жирных кислот ( до 91,0% >, в том числе полиеновых ( до 53,07. ), при. резком уменьшении доли насыщенных кислот ( до 9.0Z. ). Повышение • температуры, так яе как и усиление аэрации, приводит- к снижению содержания 'предельных. жирных кислот при одновременном. повышении. уровня ненасыщенных нирных кислот. Изменение баланса кислот.происходит в основном за счет увеличения доли, арахидоновой, докозадентаеновой и докозагексаеновой кислот. .Наблюдается заметное снижение уровня миристиновой кислоты, в то время как для остальных предельных кислот зависимость от степени повышения температуры не столь очевидна ( табл. 4 ).

Итак, результаты экспериментов выявляют два эффекта,

Таблица:' 4

Влияниэ аэрации и температуры культивирования на жирнс&йс-лотный состав ft- longa (отиоситвлыюэ содержание, X).

25 °С 29 °С

Код

жирной пассивная качалка пассивная качалка

кислот аэрация аэрация

С12 о 1,7 1,7 3,8 1,8

С13 О 13,5 20,2 14,8 5,3

С14 О 31,3 23,6 6,1 9,5

С14 1 8,8 11,4 7,3 4,7

С15 О 10,0 7,7 13,8 2,0

С16 О 12,9 10,3 7,6 6,1

С16 1 5,3 5,1 2,5 11,3

С1в О 1,3 О,9 5,4 1,0

С18 1 1,8 2,1 1,6 4,8

С1В 2 0,3 О, 6 0,7 1,3

°18 3 0,2 о,о 0,0 1,1

°20 1 0,5 1,0 1,0 0,8

С20 2 1.2 2,2 4,0 5,3

С20 3 1,3 2,1 8,9 4,8

°20 4 4,2 5,8 13,3 18,9

С20 5 0,2 0,5 1,1 0,9

С22 2 0,4 0,6 1,1 1.7

°22 4 2,0 2,4 0,3 9,1

С22 S 0,8 1,3 3,3 3,4

°22 6 1,5 1,1 3,8 3,6

С24 О 0 О О 0

°24 1 0 0 0 0

Сумма насыщенных жирных кислот 72,9 64,0 51,5 25,8

Сумма ненасыщенных жирных кислот 27,1 36,0 48,5 74,2

-В том числе полиеношх 10,2 13,0 33,7 41,9

регулирующих относительное содержание ненасыщенных жирных кислот в клетках А. longa : температурный и аэрации, причем первый выражен сильнее. Он показан для различных групп микроорганизмов и в целом отражает изменение степени "текучести" мембраны (прямо связанной со степенью ненасьщености жирных кислот) как ответную реакцию организма, когда с повышением температуры содержание непредельных кислот уменьшается (Ефременко,1991; Surrmer et al., 1965; Aeberhard et al.,1981). Полученные наш данные противоречат этому мнению. Возможно, они объясняются особенностями метаболизма и экологии А. longa. Увеличение концентрации

ненасыщенных жирных кислот мснсет происходить не в мембранных, а в резервных дипидах, например, триацилглицеридах. В литературе по этому вопросу содержатся противоречивые данные для А. longa. Ранее был установлен факт уменьшения у этого простейшего при 26-28 суммы непредельных жирных кислот до 51,0% по сравнению с 64,0% при 22-24. °С ( Сухарева, 1989 ). В то же время Удалова с соавторами ( 1989 ) обнаружили повышение содержания ненасыщенных, в ■ том числе полиеновых кислот при увеличении температуры культивирования А. longa с 20 до 29 ° С. Это согласуется о нашими данными. Возможно, А. . longa обладает десатуразами с различными температурными оптамумами, активность которых регулируется степенью аэрации среды. На этом втором эффекте, т. е. аэрации, остановимся подробнее.'

Нами было показано, что увеличение аэрации стимулирует развитие А. longa. Возрастает скорость размножения клеток в экспоненциальной фазе роста культур, в результате чего на сутки раньше достигается стационарная фаза. Содержание ненасыщенных жирных кислот, нарастая к стационарной фазе (первый максимум).

Та0лиц£5

о

Содоржааш жирных кислот а. longa при температуре 29 О в условиях пассивной аэрации «относительное содержание. "/.).

Код жирной кислоты Время, су Т.

3 4 5 6 7

°12«0 °13!0 1.2 11,9 1.2 6,9 2,4 5,3 0,3 2,9 1,9 5,3

С14Ю 13, в 9,5 17,2 6,3 14,9

С14»1 6,6 8,3 9,7 В,7 6,6

°15Ю 6,6 5,0 5,3 2,2 6,5

10,5 13,0 18, 1 1В,9 13,О

С1б:1 2,9 2,3 3,2 0,9 3,5

0,6 0,3 0,5 О о,9

°18«1 1,6 1,В 2,9 2,6 2,4

С10Г2 С1ВсЗ 0,2 0,4 0,1 0,3 0 - 0 О 0,6 0 0,2

С20« 1 ®20»2 0 1,3 0 о,7 0 0,7 О 0,4 0 1,1

°20 13 1,5 О, 6 0,7 0,4 0,9

°20«4 4,2 2,0 2,3 1,1 3,1

С20«5 0,5 0,1 0 0 0,3

С22!2 °22»4 1.3 4.4 1,0 5,0 0,7 3,0 1.3 4.4 1,3 4,1

°22«5 С22«6 2,4 12,1 В,5 12,3 5,В 9,5 10, В 16,2 5,6 В, 3

С24 «О 8,7 10,7 6,7 11,2 10,0

°24«1 7,3 9,9 5,7 10,7 7, в

Сумма насыщенных жирных кислот 44,6 35,9 40,9 30,6 42,5

Сумма нонасшдоц-аых шриих кислот 55,4 64,1 51,1 69,4 57,5

В том числе полиэновых 37,4 49,5 33, 7 55,4 42,3

Таблица. S

Содержание жирных кислот а. longa при температуре 29 С в условиях активной аэрации «относительное содежание, %).

Код Время , сути

жирной ' з 4 5 6 7

кислоты

с12«0 1.4 2,5 0,1 3,0 0,9

с13ю . 2,5 3,2 0,4 1,8 1.9

°14:0 14,4 27, в 4,1 33,2 9,3

с14!1 4,1 3,9 0,7 3,0 5,9

с15!0 1,2 1,7 3,0 1.0 0,9

°16ю 14,4 14,0 2,4 20,0 12,в

с16ч 7,9 9.7 24,0 10,0 10,4

в > о 0,0 о,7 1.1 1,4 . 0

с1в»1 3,7 3,1 з,в 2,7 2. В

с18«2 1.6 1,5 3,2 1,3 о

°1в!3 0 0 0,4 0,3 1,4

С 0 0 0 0 0

20 81

®20 « 2 6,5 4,0 3,2 3 р 5 3,3

®20 »3 6,0 3,5 4,7 3,4 3, 3

с20 14 10,3 7,3 1с,0 7,3 14,1

®20 8 3 0,4 0,3 0 0,1 0

с22 8 2 1.7 1.0 3,2 о,7 1,9

^22« 4 3,0 1.7 6,4 0 7,0

с22«5 3,1 4,7 7,в •4,0 8,5

®22«6 6,8 7,4 в,0 1,4 7,0

с24 г 0 2,4 1,3 1.2 0,1 2,4

°24»1 4,9 3,1 6,2 1.1 5,7

Сумма насыщенных 34,7 49,9 в, 6 бо, 4 26,2

жирных кислот

Сумма ненасыщен- 73,в

ных жирных кислот 65,3 50, 1 91,4 37,6

В том числе 3?, 1 26,0 53, 3 17,7 49,4

полиеновых

уменьшается в пост-стационарной фазе, вновь увеличиваясь в фазе отмирания (второй максимум, по величине больше первого), вновь падая при вторичном росте с последующим нарастанием ( таб>. 5,6 ). Эти закономерности хорошо объясняются антиоксидантной функцией ненасыщенных кислот. Показано, что изменение количества перекисей лидидов тесно связано с процессами клеточного деления. Продукты липопереокисления известны как репрессоры размножения клеток. Увеличение скорости размножения клеток прямо коррелирует с уменьшением содержания липоперекисей и, соответственно, ненасыщенных жирных кислот, являющихся основным субстратом переокисления (Сухарева, 1989). Следует подчеркнуть, что специфичность состава жирных кислот обусловливает степень переокисления и влияет на структурную организацию и свойства бишембраны.

А. 1опеа особенно интересна наличием арахидоновой кислоты. Следует отметить, что ее содержание возрастает при активной аэрации и 29 0 С и максимально в фазе отмирания ( 5 сутки ). По-видимому, обогащение фосфолипидных компонентов ивибрав арахидоновой кислотой привадит к разрыхлению их структуры, усиливается гидратация мембран и возрастает их контакт с водной средой, а следовательно, создается условия повышенного доступа кислорода к полиненаоыщвнным ацилам мембранных фосфашпщаа (Сухарева, 1989).

ВЬВОДЫ.

1. Установлено, что наиболее быстрый рост А. происходит при 29°С о активной аэрацией.

2. Оптимальная плотнооть инокулята составляет не

1оп?а более

-21 -

6 о

1,5-1,8.10 кл./мл, условия его выращивания: при 25 или 29 С с принудительной аэрацией до начала стационарной фазы роста.

3. Показано, что естественное снижение pH в процессе культивирования А. longa предпочтительнее искусственного доведения pH до начального уровня, как для развития этого микроорганизма , так и для образования им ненасыщенных жирных кислот.

4. Установлена прямая корреляция относительного содержания ненасыщенных иирных кислот в клетках А. longa с повышением температуры и усилением аэрации.

5. Выход непредельных кислот а подобранном режима культивирования А. longa в пост-стацяонарпоА фазе достигает 91,0%, в том числе подиеновых- 53,0%. доля особо ценной, арахидояовой кислоты доходит до 18,01.

6. Отдельные клоны А. longa практически не различаются по скорости роста и содержания ненасыщенных кирных кгтагот, что свидетельствует об относительной гомогенности популяции простейшего.

Публикации по теме диссертации.

Адь-Хаммади X., КотоваИ.Б., Сухарева H.H.. Влияние условий культивирования на рост-и состав жирных кислот простейшего Astasia longa. Известия РАН, серия биологическая, 1992, N 5, С. 675-683.

Подписано в печать J А 03 У У Усл. печ. л. ifJ?

Формат 60x84/16

' Заказ М Тираж НО

Типография Россельхозакадемии 115598, Москва, ул. Ягодная, 12.