Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние условий культивирования на размножение растений рода Astragalus L. и синтез вторичных соединений в культуре in vitro

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние условий культивирования на размножение растений рода Astragalus L. и синтез вторичных соединений в культуре in vitro"

На правах рукописи , h /У-

ЭНХТАЙВАН АЛТАНЦЭЦЭГ

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА РАЗМНОЖЕНИЕ РАСТЕНИЙ РОДА ASTRAGALUS L. И СИНТЕЗ ВТОРИЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Специальности: 03.01.05 - Физиология и биохимия растений

03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 MAP 2015

005559592

Москва — 2015

005559592

Работа выполнена на кафедре генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства ФГБОУ ПО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

кафедры генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства ФГБОУ ПО РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева Калашникова Елена Анатольевна

Официальные оппоненты: Долгих Юлия Ивановна

доктор биологических наук, профессор, заведующая лаборатории генетики культивируемых клеток ФГБУН «Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН»

Овчинникова Вера Николаевна

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клеточной инженерии растений ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии»

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт селекции и семеноводства овощных культур

Защита диссертации состоится «16» апреля 2015 г. в 14:30 час. на заседании диссертационного совета Д 220.043.08 на базе Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г.Москва, ул. Прянишникова, д. 19, тел/факс 8(499)976-21-84, e-mail: dissovet@;timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова ФГБОУ ПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева на сайте университета ЬНр:/Л¥1У\\'Л1тасгк).ги/

Автореферат разослан «18» февраля 2015 г. Ученый секретарь

диссертационного совета ' - - _ ' С.Л. Белопухов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальпость работы. Одно из направлений современного сельского хозяйства - расширение видового состава культурных растений. Это связано с недостаточной обеспеченностью высокобелковыми кормами, невысокой эффективностью возделывания традиционных культур, а также неустойчивостью монокультурных посевов. Кроме того, наблюдается деградация почвенного покрова, снижение урожайности культур из-за прекращения работ по сохранению и повышению плодородия земель. Одним из приемов борьбы с деградацией почвы является использование фиторесурсов, в частности применение многолетних трав и кормовых культур (люцерна, эспарцет, кострец безостый и др.). В настоящее время широкового распространения приобретают и новые кормовые культуры, такие как лядвенец рогатый, щавель кормовой, козлятник восточный и другие. Перспективными объектами поиска новых видов и форм для интродукции и селекции являются многолетние бобовые растения. К таким представителям относятся растения обширного рода астрагал.

Род Astragalus L. насчитывает более 2480 видов, многие из которых являются многолетниками, не содержат токсических веществ и широко распространены по земному шару. Большинство видов (около 900) встречается на территории России и сопредельных государств, главным образом в Средней Азии. Помимо фитомелиоративных свойств для растений рода астрагал характерно синтез вторичных соединений, которые могут широко применяться в кормопроизводстве, ветеринарии, защите растений, и особенно в медицине при производстве лекарственных препаратов.

Лекарственные препараты, полученные из растительного материала, в настоящее время на мировом рынке составляют более 60% и тенденция к увеличению объема производства таких препаратов постоянно возрастает. По прогнозам Всемирной Организации Здравоохранения доля таких фитопрепаратов в ближайшие 10 лет составит более 80% [http://wvw.marketcenter.ru]

Производство фитопрепаратов предусматривает использование растений, которые, например, находятся на грани исчезновения вследствие интенсивной, нерациональной, недостаточно контролируемой заготовки сырья.

Астрагал монгольский (Astragalus mongholicus Bge.) и астрагал приподнимающийся (Astragalus adsurgens Pall.), произрастающие на территории Монголии, являются редкими лекарственными растениями и находятся на грани исчезновения. Кроме того, данные виды представляют интерес для исследований, так как в растениях синтезируются вещества, обладающие противораковым действием. Поэтому поиск путей сохранения биоразнообразия данных видов является актуальной проблемой для Монголии.

3

Цели и задачи исследования. Цель работы - изучить влияние условий культивирования на микроразмножение астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) и астрагала приподнимающегося {Astragalus adsurgens Pall.) и синтез вторичных соединений в условиях in vitro.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- Изучить особенности размножения астрагала монгольского (.Astragalus mongholicus Bge.) и астрагала приподнимающегося {Astragalus adsurgens Pall.) in vitro.

Установить зависимость эффективности микроразмножения изучаемых видов астрагала от гормонального состава питательной среды, типа первичного экспланта и условий культивирования.

- Изучить влияние светодиодных ламп разного света на морфогенетический потенциал культивируемых тканей.

Получить и оценить действие растительных эсктрактов Астрагала, полученных при разных условиях культивирования растений в условиях in vitro, на раковые клетки линии HeLa (рак шейки матки человека).

Научная новизна работы. Впервые проведены комплексные исследования по оптимизации условий культивирования in vitro астрагала монгольского {Astragalus mongholicus Bge.) и астрагала приподнимающегося {Astragalus adsurgens Pall.) и установлены особенности их размножения в условиях in vitro. Показано, что для изучаемых видов размножение осуществляется за счет активации развития существующих в растении меристем и образования почек de novo. Причем для астрагала монгольского был характерен высокий коэффициент размножения, но низкая способность к ризогенезу, в то время как для астрагала приподнимающегося низкий коэффициент размножения сопровождался хорошей укореняемостью микропобегов.

Впервые для астрагала монгольского и астрагала приподнимающегося было изучено влияние различных цитокининов на эффективность размножения и установлено, что присутствие в составе питательной среды препарата Дропп в концентрации 0,1 мг/л стимулировало процесс образования почек de novo, формирование микропобегов, и увеличивало коэффициент размножения.

Впервые для изучаемых видов астрагала было установлено влияние светодиодных ламп разного света (белого спектра, красного спектра, красного и синего спектров) на морфогенетический потенциал культивируемых тканей. Установлено, что исследуемые светодиодные лампы не оказали существенного влияния на формирование побегов. Однако светодиодные лампы красного и синего света оказали благоприятное действие на процесс формирования мощной корневой системы для изучаемых видов астрагала.

Впервые из растительной биомассы in vitro астрагала монгольского и астрагала приподнимающегося получены растительные экстракты и установлена их цитотоксичность на раковые клетки линии HeLa (рак шейки матки человека) при разных условиях культивирования.

Практическая значимость работы. Разработанные технологии размножения астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) и астрагала приподнимающегося (Astragalus adsurgens Pall.) могут быть применены для сохранения и создания коллекции in vitro данных видов. Полученные результаты могут быть применены в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических работ по дисциплинам «Физиология растений», «Сельскохозяйственная биотехнология», «Прикладная биотехнология», «Культура тканей и клеток растений» для студентов, обучающихся по направлениям «Агрономия» и «Биотехнология».

Положения, выносимые на защиту:

1. Особенности размножения астрагала монгольского {Astragalus mongholicus Bge.) и астрагала приподнимающегося (Astragalus adsurgens Pall.) in vitro;

2. Эффективность применения светодиодных ламп при клональном микроразмножении астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) и астрагала приподнимающегося (Astragalus adsurgens Pall.);

3. Действие растительных эсктрактов, полученных при разных способах культивирования астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) и астрагала приподнимающегося {Astragalus adsurgens Pall.) в условиях in vitro, на раковые клетки линии HeLa (рак шейки матки человека).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Международной научной конференции молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (Москва, 2012); Юбилейной конференции «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры», посвященной 80-летию ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси» (Минск, 2012); 17-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века". Российско-Германский Форум (Пущино, 2013); Всероссийской (с международным участием) научной конференции «Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов» (Четвертые чтения памяти профессора O.A. Зауралова), Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева (Саранск, 2013); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 170-летию со дня рождения К.А. Тимирязева (Москва, 2013); Международной научно-практической конференции «Практико-ориентированные биотехнологические исследования в растениеводстве, животноводстве и медицине» Брестский государственный

5

университет имени А.С.Пушкина (Брест, 2013); 2nd International Symposium Secondary Metabolites. Chemistry, Biology and Biotechnology (Москва, 2014).

Личный вклад автора. Работа является результатом исследований, проведенных лично автором на всех этапах работы: выбор направления исследований, разработка программы и методов исследований, проведение исследований, обработка и анализ полученных данных, подготовка публикаций. Исследования по определению цитотоксичности растительных экстрактов были проведены совместно с кандидатом биологических наук, с сотрудником лаборатории молекулярной биологии Института проблем химической физики РАН А.А. Балакиной.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, общим объемом 2,3 п.л., в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, материал и методы исследований, экспериментальной части (3 главы), выводов, а так же списка цитируемой литературы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 1 таблицу, 59 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 154 источника, из которых 39 на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работу проводили на кафедре генетики, биотехнологии, селекции и семеноводства РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева с 2012 по 2014 г.

Объектом исследования служили семена астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) и астрагала приподнимающегося {Astragalus adsurgens Pall.), собранные в Монголии, а также сегменты гипокотиля, семядольные листья, апикальные почки, изолированные со стерильных 20-ти суточных проростков.

Семена поверхностно стерилизовали раствором сулемы (0,1%) в течение 10 мин., после чего их трижды промывали стерильной дистиллированной водой и помещали для проращивания на безгормональную питательную среду Мурсиге-Скуга (МС).

Для индукции образования адвентивных почек и побегов в состав питательной среды добавляли в качестве цитокининов БАП, 2ip, кинетин в концентрациях 1-2 мг/л, а также препарат Дропп — 0,01-0,1 мг/л. В качестве ауксинов - НУК или ИУК в концентрации 1 мг/л.

Экспланты культивировали при температуре 24°С, 16-часовом фотопериоде, освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 3 тыс.лк.

Укоренение микропобегов проводили на питательной среде, содержащей '/2 минеральных солей по прописи МС, сахарозу 15 г/л, а также регуляторы

6

роста (ИМК в концентрации 1-2 мг/л и препарат Циркон - 1 мг/л). Укоренившиеся растений переносили в почвенный субстрат (торфогрунт) «Универсаль».

Культивирование микропобегов астрагала в условиях разного света проводили в лаборатории искусственного климата РГАУ-МСХА. Было изучено влияние светодиодных ламп белого света, красного света, красного и синего света. В качестве контроля были выбраны люминесцентные лампы (условия световой комнаты).

Оценку действия растительных экстрактов на раковые клетки M-HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки человека, сублиния HeLa, клон М HeLa, коллекция Института цитологии РАН, Санкт-Петербург) проводили в лаборатории молекулярной биологии Института проблем химической физики РАН, при непосредственном участии кандидата биологических наук Балакиной А. А.. Растительный экстракт получали из микропобегов астрагала монгольского и приподнимающегося, полученных на питательных средах разного гормонального состава, культивируемых в условиях разного света. Культивирование опухолевых клеток проводили согласно общепринятой методике [Фрешни Р.Я., 2011].

Для определения количества выживших клеток использовали метод МТТ-теста. Измерение поглощения проводили при длине волны 570 нм на планшетном фотометре «Эфос». Расчет интенсивности МТТ-окрашивания проводили в % относительно контроля (контроль — 100%). Чем выше процент окрашивания, тем выше жизнеспособность клеток и ниже цитотоксичность экстрактов.

Статическая обработка данных. Математическая обработка экспериментальных данных выполнена на основе методов математической статистики [Доспехов Б.А., 1985; Смиряев А.В, Кильчевский А.В., 2007].

Эксперименты проводил в трех биологических и 2-3 аналитических повторностях. На графиках представлены средние арифметические значения определений и их стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Технология клоналыюго микроразмножения растений рода Astragalus L.

В работе были использованы различные первичные экспланты (сегменты семядольных листьев и гипокотиля, верхушечные почки, изолированные со стерильных проростков), а также разные методы клонирования (микрочеренкование и регенерация растений из каллусной ткани).

Астрагал монгольский {Astragalus mongholicus Bge.). На первом этапе клонального микроразмножения необходимо оптимизировать условия стерилизации семян и подобрать оптимальные питательные среды,

7

повышающие посевные качества семян и обеспечивающие формирование проростков правильной морфологии и обладающих ускоренным ростом. Для этого применяют биологически активные вещества или регуляторы роста из класса цитокининов, которыми обрабатывают семена перед посевом или их добавляют в состав питательной среды. В нашей работе мы применили второй прием. На первом этапе клонального микроразмножения семена после поверхностной стерилизации культивировали на питательных средах, в состав которых входили различные регуляторы роста: БАЛ, кинетин, 2ip, Дропп. В качестве контроля была выбрана безгормональная среда.

Экспериментально установлено, что присутствие в составе питательной среды регуляторов роста оказывает отрицательное влияние на формирование проростков астрагала в условиях in vitro. В этих вариантах наблюдали образование утолщенных семядольных листьев и гипокотиля, а в зоне корневой системы - формирование каллусной ткани. Исключение составила безгормональная среда, на которой в течение 21 суток формировались проростки правильной морфологии.

Полученные проростки в дальнейшем черенковали с целью изучения регенерационной способности различных первичных эксплантов: сегмент гипокотиля, семядольные листья и верхушечная почка.

Установлено, что наибольшей регенерационной способностью обладали верхушечные почки, в базалыюй части которых формировались почки с!е novo, которые в дальнейшем развивались в побеги. На изолированных семядольных листьях и гипокотиле было отмечено в 50% случаев лишь образование каллусной ткани и только в каллусной ткани, полученной из сегментов гипокотиля наблюдали единичное образование меристематических очагов. Поэтому в дальнейших экспериментах в качестве первичного экспланта использовали только верхушечные почки.

На этапе собственно микроразмножения необходимо добиться получения максимального количества микропобегов. С этой целью в следующей серии экспериментов нами были изучены такие цитокинины как 2ip, БАП, препарат Дропп, а также безгормональная среда.

Исследования показали, что в процессе культивирования микрочеренков астрагала монгольского на разных питательных средах, формировались побеги, отличающиеся по морфометрическим показателям. На II пассаже было отмечено, что в вариантах с присутствием гормонов в питательной среде высота микропобегов за один и то же учитываемый интервал времени была в 1,6 раза меньше, по сравнению с контрольным вариантом (безгормональная среда) (Рис. 1). Однако в вариантах с присутствием гормонов отмечалась высокая способность эксплантов к образованию адвентивных побегов (Рис. 2). Число их составило в среднем 5,4 шт. на среде с 2ip, 7,2 шт - на среде с Дропп

8

и 5,8 шт - на среде с БАП, что в 1,7 - 2,3 раза выше по сравнению с контрольным вариантом (3,2 шт).

Рис. 1 Длина микропобегов

астрагала монгольского (Astragalus monghoticus Bge.)

При дальнейшем культивировании микропобегов в течение трех последующих пассажей на тех же вариантах питательных сред наблюдали увеличение морфогенетической активности эксплантов. Число образовавшихся адвентивных побегов на У-ом пассаже составило в среднем на среде с 21р 10,0 шт, на среде с препаратом Дропп - 11,1 шт, среде с БАП - 8,0 шт, что в 1,3-1,8 раз выше по сравнению с результатами второго пассажа (Рис. 2, 3).

Рис. 2 Количество мнкропобсгов на одном

экспланте астрагала монгольского (Astragalus mongUolicus Bge.)

Размноженные микропобеги в дальнейшем были перенесены на этап укоренения. Для этого в состав питательной среды были добавлены вещества, обладающие ауксиновой активностью - ИМК (1-2 мг/л) или препарат Циркон (1 мг/л).

Экспериментально установлено, что ни в одном из исследуемых вариантов нами не было обнаружено образование адвентивных корней. Поэтому этан укоренения был в дальнейшем оптимизирован в экспериментах по влиянию светодиодных ламп разного света на морфогенетические процессы.

я Контроль яБап/кук ; Дрошт'нук »2ip/HVK

г д е

Рис. 3 Растення-регеперанты, выращенные на разных вариантах питательных сред: а - безгормональная питательная среда, б - среда с добавлением 2ip (II пассаж), в - среда с добавлением препарата Дропп (Ш пассаж); г - среда с добавлением 2ip (IV пассаж), д - среда с добавлением препарата Дропп (IV пассаж), е - среда с добавлением препарата Дропп (V пассаж)

Астрагал приподнимающийся {Astragalus adsurgens Pall.).

Исследования показали, что исследуемые семена астрагала приподнимающегося обладают 100% всхожестью. Уже на 3-й сутки наблюдали прорастание семян и развитие корешка, а через 2 недели — формирование хорошо развитого проростка. В качестве первичного экспланта использовали верхушечную почку проростка, которую культивировали на питательной среде, содержащей БАЛ в концентрации 1-3 мг/л в сочетании с НУК 0,5 мг/л.

Экспериментально установлено, что присутствие в составе питательной среды БАП в концентрации 2 и 3 мг/л приводило к образованию множества мелких микропобегов, которые при пересадке на свежую среду в 48% случаев погибали. В варианте применения БАП в концентрации 1 мг/л формировались побеги, которые при пересадке и микрочеренковании вновь образовывали хорошо сформированные побеги. Кроме того, в этом варианте в базальной

части микропобегов наблюдали формирование 3-5 шт. адвентивных почек, которые в дальнейшем развивались в растения.

Несмотря на то, что БАП проявил стимулирующий эффект, все же коэффициент размножения был не достаточно высок (в среднем 1:4). Поэтому в последующей серии эксперимента необходимо было подобрать состав питательной среды, обеспечивающий повышение коэффициента размножения. Для этой цели нами было изучено влияние таких цитокининов, как 2ip и препарата Дропп, а также безгормональной среды (контрольный вариант).

Исследования показали, что в процессе культивирования микрочеренков астрагала приподнимающегося на питательных средах, содержащих различные гормоны, формировались побеги, отличающиеся по скорости роста. Была выявлена одинаковая ответная реакция микрочеренков на состав питательной среды. На всех этапах культивирования (в течение 4 пассажей) активный рост побегов был отмечен лишь на безгормональной среде, в то время как в вариантах с гормонами учитываемый показатель (высота микропобегов) был в 1,5-2 раза ниже контрольного варианта (Рис. 4).

ю Контроль й Бап/кух * Дродп/вук » 2ip/Hy.v'

Э 4,5 -ё 4 ' i :....................

Й 3.5 -g 3 - И я 2 g V-| 0 ............ К1 8 1 I ill 1111 шШ I Siiffl •

II ппссаж III пзссаа: IV пасс«* V пассзж

Рис. 4 Длина микропобегов астрагала приподнимающегося (Astragalus adsurgens Pall.)

Среди всех исследуемых вариантов выделялся вариант с препаратом Дропп. В этих условиях было отмечено не только быстрое формирование микропобегов, но и отмечался самый высокий коэффициент размножения (Рис. 5), который сохранялся на протяжении пяти пассажей. Добавление в состав питательной среды 2ip оказалось не эффективным.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами были подобраны условия культивирования семян и изолированных верхушечных почек на первом этапе клонального микроразмножения астрагала приподнимающегося {Astragalus adsurgens Pall.) и подобраны условия для его дальнейшего размножения в условиях in vitro.

Рис. 5 Количество микронобегов на одном эксиланте астрагала приподнимающегося

(Astragalus adsurgens Pall.)

Полученные микрочеренки в дальнейшем были перенесены на этап укоренения. Экспериментально установлено, что присутствие в составе питательной среды ИМК 1 мг/л приводило в 34,7% случаев к формированию слабой корневой системы. Несмотря на это, полученные растения-регенеранты в дальнейшем были перенесены в условия стерильного грунта для адаптации, а затем в полевые условия.

Таким образом, поведенные исследования позволили нам заключить, что изучаемые виды астрагала обладают разным морфогенетическим потенциалом, который проявляется как в размножении, так и в укоренении. Если для астрагала монгольского характерен высокий коэффициент размножения в условиях in vitro -1:11, то для астрагала приподнимающегося этот показатель составляет всего 1:4. Несмотря на низкий коэффициент размножения, все же для астрагала приподнимающегося были получены укоренившиеся микроиобеги, в то время как для астрагала монгольского этот процесс нами не был отмечен. Это еще раз свидетельствует о том, что морфогенетический потенциал главным образом зависит от исследуемого генотипа, а, следовательно, и от метаболических процессов, протекающих в специализированных клетках.

2. Влияние светодиодных ламп разного света на морфогенетическую активность клеток Astragalus mongholicus Bge. и Astragalus adsurgens Pall, в

условиях in vitro

Процессы морфогенеза зависят от ряда взаимосвязанных факторов, таких как гормональный и минеральный состав питательной среды, а также факторов физической природы, среди которых выделяется свет — регулирующий не только процесс морфогенеза, но и синтез вторичных метаболитов.

Астрагал монгольский (Astragalus monsholicus Bge.).

В экспериментах микропобеги астрагала монгольского культивировали в течение пяти пассажей в условиях освещения светодиодными лампами разного света (красного, белого, красного и синего) на фоне разного гормонального

III пассаж IV пассаж

состава питательной среды (безгормональная среда, БАП/НУК, Дропп/НУК, 21р/НУК). В качестве контроля были выбраны люминесцентные лампы (условия световой комнаты). Основные показатели эффективности применения светодиодных ламп - количество образовавшихся микропобегов на одном экспланте (шт) и средняя высота этих микропобегов (см). Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1 — Влиипис гормонального состава питательной среды и условий освещения на морфометрнческне показатели мпкропобегов Astragalus mongholicus Bge

Количество мпкропобегов, шт Длина мпкропобегов, см

белый красный красный и синий люминесцентные лампы белый красный красный 11 синий люминесцентные лампы

БАШНУК 4,0±0,2 3,3±0,2 2,3±0,2 6,9±0,3 2,7±0,1 2,3±0,1 2,5±0,1 3,3±0,2

Дропп/НУК 3,6±0,2 4,5±0,2 7,0±0,3 9,3±0,5 2,6±0,1 3,5±0,2 2,7±0,1 3,4±0,2

21р/НУК 1,8±0,1 2,2±0,1 2,5±0,1 8,0±0,4 2,6±0,1 2,8±0,1 2,3±0,1 3,6±0,2

Безгормонов 2,0±0,1 1,2±0,1 2.5±0,1 6,6±0,3 2,9±0,1 6,3±0,3 3,2±0,2 5,4±0,3

Безгормональная среда. Исследования показали, что в условиях безгормональной среды светодиодные лампы не оказывали влияние на индукцию образования адвентивных почек/побегов (коэффициент размножения). В контрольном варианте (люминесцентные лампы) среднее количество микропобегов составило на ранних пассажах 3,2 шт, а к концу пятого пассажа учитываемый показатель возрос до 6,6 шт. Установлено, что белый свет, а также красный и синий свет оказали одинаковое влияние на образование адвентивных почек (2 - 2,5 шт), в то время как применение красного света существенно ингибировало этот процесс (1—1,2 шт). Причем при длительном культивировании микропобегов в условиях разного источника света интенсивность морфогенеза уменьшалась.

Несмотря на то, что при использовании разных светодиодных ламп коэффициент размножения был ниже контрольного варианта (люминесцентные лампы) все же было отмечено, что применение красных светодиодных ламп оказало положительное влияние на рост побегов. В этом варианте была отмечена максимальная высота микропобегов.

Содержание в питательной среде БАП/НУК. В результате культивирования микропобегов на питательных средах, содержащих в составе питательной среды БАП/НУК и в условиях разного источника света установлено, что в этих условиях максимальный коэффициент размножения (6 - 8 шт) был получен в контрольном варианта (люминесцентные лампы). Среди

всех источников света лишь вариант с применением белых светодиодов оказался наилучшим. В этом варианте на ранних этапах культивирования наблюдали формирование от 4 до 5,3 шт на один эксплант. Причем эта способность к регенерации уменьшалась на последующих пассажах (3 - 3,1 шт). В остальных вариантах учитываемый показатель был ниже и составил в среднем 2,0 шт в течение четырех пассажей.

Экспериментально установлено, что лампы разного спектра не оказывали существенного влияния на рост побегов. Во всех вариантах, за исключением контроля, наблюдали формирование небольших побегов, но имеющих правильную морфологию. Причем, белый свет на третьем и четвертом пассажах, проявил стимулирующий эффект.

Содержание в питательной среде Дропп/НУК. Исследования показали, что применение разных светодиодных ламп не оказывало существенного влияния на индукцию образования почек и микропобегов de novo, по сравнению с контрольным вариантом. Среди всех исследуемых ламп, выделялся вариант с применением красного и синего света. В этих условиях наблюдалось стабильное формирование адвентивных почек в среднем 7 шт на протяжении четырех субкультивирований.

Несмотря на то, что свет разного спектра не оказал стимулирующего влияния на интенсивность морфогенеза, все же эффект применения разных источников света был отмечен при учете высоты сформировавшихся микропобегов. Хорошо выраженный эффект был получен в варианте с применением ламп красного света на ранних пассажах.

Содержание в питательной среде 2ip/l 1УК. Полученные результаты свидетельствуют о том, что культивирование микропобегов на среде, содержащей 21р/НУК, и в условиях разных светодиодных ламп не оказывает существенного влияния на индукцию образования адвентивных почек. Во всех вариантах наблюдалась одинаковая способность эксплантов формировать адвентивные почки. Причем на протяжении четырех пассажей этот показатель во всех вариантах света составил не более 2,5 шт. Исключение составил контрольный вариант (люминесцентные лампы), в котором частота побегообразования была в 2 раза на втором пассаже и в 5 раз на пятом пассаже выше по сравнению со всеми другими вариантами.

Что касается длины микропобегов, то на ранних этапах культивирования во всех исследуемых вариантах наблюдалось формирование одинаковых по высоте побегов. Причем, при последующих субкультивировании микропобегов в аналогичных условиях наблюдали не значительный стимулирующий эффект рост побегов при использовании светодиодных ламп красного света. В контрольном варианте рост побегов усиливался лишь на четверном пассаже

Таким образом, проведенные исследования позволили заключить, что для астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) применение в технологии клоналыюго микроразмножения разных светодиодных ламп (белый, красный, красный и синий свет) не является эффективным. Это связано с тем, что данные лампы не оказывали существенного влияния на такой важный показатель как коэффициент размножение (количество побегов, образовавшихся на одном экспланте в течение одного пассажа). Наилучшие результаты для данного вида были получены при использовании стандартных условий культивирования -применение люминесцентных ламп.

Однако полное отрицание применения светодиодных ламп при клональном микроразмножении астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) не совсем корректно, так как в условиях применения светодиодных ламп красного и синего света наблюдали формирование корневой системы у микропобегов, что не было характерно для стандартных условий культивирования.

Астрагал приподнимающийся (Astragalus adsursens Pall.). Для астрагала приподнимающегося были проведены исследования аналогичные, как и для астрагала монгольского. Микропобеги выращивали при разном освещении и на разных питательных средах, отличающихся только гормональным составом. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Влияние гормонального состава ннтатсльпой среды и условий освещения на морфометрнческпе показатели микропобегов Astragalus adsurgetis Pall

Количество мнкропобегов, шт Длина микропобегов, см

белый красный красный II синий люминесцентные лампы белый красный красный н синий люминесцентные лампы

КЛП/НУК 3,0±0,2 3,2±0,2 4,0±0,2 3,3±0,2 2,6±0,1 2,1±0,1 2,4±0,1 1,9±0,1

Дропп/т"к 4,1±0,2 3,6±0,2 2,9±0,1 4,1±0,2 2,8±0,1 3,2±0,2 2,8±0,1 2,7±0Д

2¡p/lIVTv 1,8±0,1 1,5±0,1 2,9±0,1 1,8±0,1 2,6±0,1 2,5±0,1 2,1±0,1 1,8±0,1

Безгормонов 1,7±0,1 1,2±0,1 3,4±0,2 3,3±0,2 2,7±0,1 3,5±0,2 1,8±0,1 3,7±0,2

Безгормональная среда. Исследования показали, что в условиях безгормоналыюй среды разный источник света оказывает влияние на индукцию образования адвентивных почек/побегов (коэффициент размножения).

В контрольном варианте (люминесцентные лампы) не зависимо от числа субкультивирований среднее количество микропобегов на один эксплант составило 3-3,5 шт. Причем при применении ламп синего и красного света был получен схожий результат, который существенно превосходил варианты,

15

где были применены лампы белого и красного света. Причем следует отметить, что в условиях белого света среднее число микропобегов было постоянным на протяжении четырех пассажей и составило 1,5 — 1,8 шт, в то время как в условиях красного света этот показатель снижался в процессе культивирования. На втором пассаже он составил 2,5 шт и к концу пятого пассажа этот показатель снизился до 0,5 шт. Полученные данные свидетельствуют о том что применение светодиодных ламп красного света оказывает негативное влияние на коэффициент размножения при условии их постоянного применения.

Светодиодные лампы оказали влияние не только на коэффициент размножения, но и на высоту сформировавшихся побегов. Например, при использовании красного света на ранних пассажах наблюдали формирование удлиненных побегов (до 7 см в высоту), в то время как в остальных вариантах этот показатель не превышал 4 см. Однако следует отметить, что последующее культивирование микропобегов в условиях красного света приводило к формированию укороченных побегов, которые к концу пятого пассажа были в 1.5 — 3 раза меньше (ниже) по сравнению с побегами, полученными во всех других условиях освещения.

Содержание в питательной среде БАП/НУК. В результате культивирования микропобегов на питательных средах, содержащих в составе питательной среды БАП/НУК и в условиях разного источника света установлено, что в этих условиях наблюдается увеличение коэффициента размножения по сравнению с условиями культивирования микропобегов на безгормоналыюй среде. Причем максимальный коэффициент размножения (до 4,5 шт) был получен при использовании светодиодных ламп красного и синего света на втором и третьем пассажах. Однако последующее культивирование микропобегов в этих условиях привело к снижению учитываемого показателя. В остальных вариантах на протяжении четырех субкультивирований существенных изменений по коэффициенту размножения не было отмечено, и учитываемый показатель в среднем составил от 2,7 до 3,7 шт.

Что касается влияния светодиодных ламп на высоту микропобегов, то нами был отмечен стабильный эффект лишь при применении белого света. В этих условиях культивирования наблюдали на протяжении четырех пассажей формирование побегов высотой в среднем 2,5 см, в то время как в остальных вариантах этот показатель был не стабильным и изменялся на каждом пассаже.

Содержание в питательной среде Дропп/НУК. При культивировании микропобегов на средах с Дропп/НУК нельзя однозначно сказать о положительном или отрицательном влиянии тех или иных светодиодных ламп на процесс морфогенеза. Например, на ранних пассажах наибольший коэффициент размножения был отмечен в варианте с применение светодиодных ламп белого света. Однако при дальнейшем культивировании в

16

этих условиях наблюдалось снижение учитываемого показателя с 5,7 до 3,5. В то время как в остальных вариантах этот показатель незначительно увеличивался, и максимальные результаты были получены на третьем пассаже, которые при дальнейшем культивировании в аналогичных условиях постепенно снижались. Например, в процессе культивирования на красном свете коэффициент размножения изменялся 3,4 (II пассаж) - 4,7 (III пассаж) -3,9 (IV пассаж) - 2,3 (V пассаж). Аналогичные закономерности были характерны и для контрольного варианта, а также для света красного и синего.

Что касается высоты микропобегов, то следует отметить, что лампы разного света оказывают не существенное влияние на этот показатель. Во всех вариантах наблюдали формирование побегов, превышающих контрольный вариант (люминесцентные лампы) в среднем на 0,8-1,0 см. Наилучший рост был отмечен в условиях-освещения красным светом. Исключение составили лишь более поздние пассажи, когда в контрольном варианте сформировавшиеся побеги опережали в росте микропобеги, образующиеся в других вариантах освещения.

Содержание в питательной среде 2ф/ПУК. Совершенно иная картина наблюдалась при культивировании микропобегов на среде с 2ip/IIYK. Наивысший коэффициент размножения был получен при использовании светодиодных ламп красного и синего света. В этих условиях количество микропобегов, образовавшихся de novo было в 1,5 раза выше по сравнению с другими вариантами. Особенно это явно проявлялось на третьем и четвертом пассажах

По длине микропобегов так же были отмечены закономерности. Светодиодные лампы по своей значимости на рост побегов распределились следующим образом:1- белые лампы, 2 - красные лампы, 3 - красные и синие лампы, 4 — люминесцентные лампы (контрольный вариант).

Таким образом, исследования показали, что для астрагала приподнимающегося светодиодные лампы оказывают влияние на морфогенетический потенциал культивируемых тканей. Причем это коррелирует с гормональным составом питательной среды. Наилучшие показатели по индукции образованию адвентивных почек и росту микропобегов были получены при использовании светодиодных ламп красного и синего света. Причем эти учитываемые показатели не зависели от изучаемого состава питательной среды. Кроме того, в этом варианте освещения наблюдалось формирование мощной, разветвленной корневой системы, что не было отмечено в других вариантах (Рис. 6).

Рис. 6 Корневая система, сформированная на среде, содержащей ИМК 1 мг/л + Циркон 1мг/л и при освещении светодиодными лампами красного и синего света

3. Изучение цитотоксичиости растительных экстрактов, полученных из микропобегов Astragalus mongholicus Bge. и Astragalus adsurgens Pall.

Как известно, большинство из изученных видов растений астрагала содержат в своем составе вещества вторичного синтеза, такие как: флавоноиды, алкалоиды, сапонины, кумарины и др. Однако среди всех веществ, главенствующее место занимают флавоноиды. Они в больших количествах содержатся в наземной части растении по сравнению с корнями. Например, в надземной части A.propinquns Schh. содержится кверцетина, изорамнегина, рамноцетрина, прониниозида, кемферола, куматакенина 1,95% - 7.45%; в надземной части A.adsurgens Pall, кверцетина, изорамнетина, кемферола содержится 2,95%, а в A.adsurgens Pall обнаружено этих соединений 3,97% [Дунгэрдорж Д., 1978, 1970].

В настоящее время является актуальным поиск новых биологически активных соединений обладающих противоопухолевыми свойствами, получаемые из растительного сырья. На территории Российской Федерации ряд препаратов, полученных на основе вторичных метаболитов растений, широко применяются в клинической практике при лечении различных типов рака (этопозид, винбластин, таксол и др.). Известно, что корень астрагала монгольского используется как в традиционной, так и в народной медицине, в том числе и как средство для лечения опухолей различного типа. В нашей работе была изучена цитотоксичность экстрактов, полученных из микропобегов астрагала монгольского и приподнимающегося, культивируемых на средах разного гормонального состава, в течение 5-7 пассажей и при освещении светодиодными лампами разного света (белый, красный, красный и синий).

Поскольку в литературе не существует данных по цитотоксичиости экстрактов из листьев астрагала монгольского и ранее такие эксперименты не

проводились, то было необходимо на первом этапе экспериментально установить то количество растительного материала, при котором можно наблюдать эффект. При этом особое внимание нами было уделено на условия и сроки выращивания растительного материала in vitro.

Образцы были взяты на I, IV и VII пассажах. Для получения рабочего раствора использовали 100 мкл экстракта и 900 мкл среды. Результаты эксперимента представлены на рисунке 7.

70 ;

60

9 as 50 ■

3 да ■

30 ;

Е 20

10 -

0

..............г............................... 7

т................Ш<ш

I .7 .......»»¡я^Ык

* Кончроль 8!дрсдп»нук

* 2ip-Hyf: is бап-vHVK

Рис.7 Влияние регуляторов роста растении и продолжительности культивирования на цитотоксичность растительных экстрактов

Было показано, что наибольшей цитотоксичностью независимо от времени культивирования in vitro обладают экстракты, полученные из микропобегов, культивируемые на среде, содержащей в качестве регуляторов роста Дропп, а так же на безгормональной среде.

В этих вариантах цитотоксичность составила в среднем 3%. В то время как в вариантах с БАП и 2ip растительный экстракт не проявил цитотоксичность. Этот показатель на ранних этапах культивирования составил 48,3 и 60,2%, соответственно. Однако при длительном культивировании микропобегов на разных питательных средах (в течение семи пассажей) цитотоксичность полученных растительных экстрактов во всех вариантах существенно увеличилась. Показано, что менее 10 % исследуемых раковых клеток выжило.

Таким образом, был сделан вывод, что все изученные экстракты не зависимо от условий выращивания растительного материала (микропобегов) обладают цитотоксичностью для изученной линии опухолевых клеток.

В следующей серии эксперимента необходимо было выявить концентрацию, вызывающую гибель 50%-клеток, то есть IC50 для каждого варианта культуральной среды. Для этого определяли массу полученного после лиофилизации экстракта и растворяли его до концентрации 50 мг/мл. На клетки наносили экстракты в концентрации от 50 до 5000 мкг/мл. Результаты представлены на рисунке 8.

1 40

F—

Я 20

fa. i

I

; ДРОПП.НУК

«2|р,'ВУК

50 ми"

250 MKi 500 МЫ" 1000 MET 2500 .MKT j500 MM 5000 lixr

Put. 8 Влияние

различных копией граций экстрактов астрагала монгольского на жизнеспособность опухолевых клеток (люминесцентные лампы)

В результате проведенных исследований было установлено, что наибольшей токсичность для изученной линии клеток обладает экстракт, полученный на безгормональной среде и на среде, содержащей препарат Дропп. 50 и более процентов клеток гибнет при концентрации более 500 мкг/мл и 1000 мкг/мл, соответственно. Наименьший цитотоксический эффект был отмечен в варианте с 21р - 50% клеток гибнет только при высоких концентрациях - 5000 мкг/мл. Полученные данные можно объяснить тем, что именно на среде с 2'гр формирование побегов происходило менее интенсивно и морфогенетический потенциал был слабо выражен. Это проявлялось по таким показателям как медленная скорость роста побегов и низкий коэффициент размножения. Вероятно, в клетках таких побегов отмечается нарушение метаболических процессов.

В связи с тем, что при концентрации экстрактов начиная с 5000 мкг/мл наблюдали гибель опухолевых клеток во всех вариантах, то в дальнейших экспериментах данная концентрация была взята для изучения влияния физических факторов на цитотоксичность растительных экстрактов.

Известно, что спектральный состав света оказывает влияние на изменение метаболических процессов, происходящих внутри клетки, ткани и органа. Поэтому в следующей серии эксперимента нами было изучено влияние красного, белого, красного и синего света на активность растительных экстрактов, полученных из микропобегов астрагала монгольского и астрагала приподнимающегося (Рис. 9-12).

Рис. 9 Влияние различного света и гормонального состава питательной

среды на цитотоксичность растительных экстрактов Astragalus mongliolicus Bge.

Как следует из результатов, представленных на рисунке 9, растительный экстракт, полученный из растений астрагала монгольского проявляет различную цитотоксичность по отношению к клеткам М-НеЬа. Во всех вариантах выращивания микропобегов (красный и синий свет, белый свет) учитываемый показатель составляет от 9 до 22%, что свидетельствует о высокой цитотоксичности экстрактов. Следует отметить, что даже для варианта выращивания микропобегов на среде с 21р МТТ-окрашивание составило 15%, в то время как в контрольном варианте (люминесцентные лампы, смотри рисунок 8) этот показатель находился на уровне 45%. Все это свидетельствует о том, что спектр белого и красно-синего света оказал стимулирующий эффект на синтез вторичных метаболитов, который проявился в высокой цитотоксичности экстрактов по отношению к клеткам М-НеЬа.

Для астрагала приподнимающегося был получен неоднозначный эффект действия растительных экстрактов на клетки М-НеЬа. Эта ответная реакция зависела, прежде всего, от гормонального состава питательной среды, а также от условий освещения. Кроме того, растительный экстракт разной концентрации (500, 1000, 2500 мкг/мл) проявил не одинаковую цитотоксичность. Установлено, что чем меньше концентрация растительного экстракта, тем меньшей цитотоксичностью он обладает. С повышением концентрации, увеличивается его эффект (Рис. 10-12).

ОЕЕЛЫ0<1Н;Т и'.ТЛС'НМ £ 1« 1 » : в............ i WOwt-ка 100 СВЕТ к КРАСНЫЙ И ШНИЙ СВЕ Г ¡11 .....: iSlja feiaSig II l|f Омж'хэ ^ООмкгчи

j анклыйевкт « красныП свкг «красный я ennui) ткг Hi а. ЗДОихгла ЮООжт'ЫЛ 2500 исг-'мл

Рис. 10 Влияние различных концентраций экстрактов, полученных из микропобегов

Astragalus adsurgens Pall, (безгормональная среда), на жизнеспособность опухолевых клеток

Рис. И Влияние различных концентраций экстрактов, полученных из микропобегов Astragalus adsurgens Pall, (среда, содержащая БАП и НУК), на жизнеспособность опухолевых клеток

Рис. 12 Влияние различных концентраций экстрактов, полученных из микропобегов Astragalus adsurgens Pall, (среда, содержащая Дропп и НУК), на жизнеспособность опухолевых клеток

Как следует из данных, приведенных на рисунках, наибольшей цитотоксичностью обладали растительные экстракты, полученные из надземной части растений астрагала приподнимающегося, выращенных в условиях светодиодных ламп красного и синего света. Причем при концентрации экстракта 2500 мкг/мл цитотоксичность растительных экстрактов была максимальной и составляла 5 - 37%, в то время как в других вариантах при данной концентрации, учитываемый показатель был более 50%. Исключение составил экстракт, полученный из растений выращенных на среде с БАП и НУК при освещении светодиодными лампами красного света, для которого цитотоксичность была отмечена на уровне 9% (Рис. 12).

Таким образом, экспериментально установлено, что условия культивирования оказывают существенное влияние на синтез вторичных соединений в надземных частях растений астрагала монгольского и астрагала приподнимающегося. Дальнейшая оптимизация условий культивирования может привести к получению высокоцитотоксичных экстрактов, которые найдут свое применение в медицине для борьбы с онкологическими болезнями.

1. Впервые для астрагала монгольского и астрагала приподнимающегося разработана технология клонального микроразмножения. Показано, что для данных видов размножение осуществляется за счет активации развития существующих меристем. Использование гипокотильных сегментов и семядольных листьев не эффективно.

2. Установлена зависимость морфогенетического потенциала изолированных эксплантов от видовой принадлежности растений. Для астрагала монгольского способность культивируемых эксплантов к образованию адвентивных почек и формированию микропобегов было в 2 раза выше по

ВЫВОДЫ

сравнению с астрагалом приподнимающимся. Однако по способности к укоренению астрагал приподнимающийся занимал лидирующее положение.

3. Выявлено, что присутствие в составе питательной среды препарата Дропп в концентрации 0,1 мг/л стимулировало процесс индукции образования адвентивных почек, формирование микропобегов и увеличивало коэффициент размножения. Этот процесс не зависел от исследуемого вида и условий культивирования растительных эксплантов.

4. Установлено, что светодиодные лампы разного света оказывают неоднозначное влияние на размножение и укоренение микропобегов двух изучаемых видов астрагала. Применение светодиодных ламп разного света для астрагала монгольского на этапе размножения было не эффективно, а на этапе укоренения - существенно повышало способность мнкропобегов к укоренению, что не было характерно для контрольного варианта (люминесцентные лампы). Для астрагала приподнимающегося установлено положительное влияние света красного и синего спектра на всех этапах клоналыюго микроразмножения.

5. Впервые для астрагала монгольского и астрагала приподнимающегося получены и изучены растительные экстракты и установлена их цитотоксичность на рост раковых клеток M-HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки человека, сублиния HeLa, клон М HeLa). Культивирование микропобегов в условиях светодиодных ламп существенно повышало цитотоксичность экстрактов, полученных из растительной биомассы двух изучаемых видов астрагала.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алтаицэцэг, Э. Биотехнологический подход к сохранению редких и лекарственных видов рода Astragalus (Fabaceae) / Э. Алтанцэцэг, Е.А. Калашникова // Международная научная конференция молодых ученых и специалистов РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, посвященная 125-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова, г. Москва, 5-6 июня. - 2012. - С. 21-23.

2. Алтанцэцэг, Э. Клональное микроразмножение Astragalus mongholicus Bge / Э. Алтанцэцэг, Е.А. Калашникова // Юбилейная конференция «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия мировой флоры», посвященной 80-летию ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси», г. Минск, 19 - 22 июня. - 2012. - С. 483 - 485.

3. Алтанцэцэг, Э. Подбор условий культивирования семян и изолированных эксплантов стерильных проростков на первом этапе клонального микроразмножения астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge) / Э.

23

Алтанцэцэг, Е.А. Калашникова // 17-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Российско-Германский Форум, г.Пущино, 22 - 26 апреля. - 2013.

4. Алтанцэцэг, Э. Введение в культуру in vitro редких видов рода Astragalus L./ Э. Алтанцэцэг, Е.А. Калашникова /У Всероссийская (с международным участием) научная конференция «Актуальные проблемы экологии и физиологии живых организмов» (Четвертые чтения памяти профессора О.А. Зауралова), Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева, г. Саранск, 15 - 17 мая. - 2013. - С. 225 - 228.

5. Алтанцэцэг, Э. Ввлияние гормонального состава питательной среды на размножение Astragalus mongholicus Bge. in vitro / Э. Алтанцэцэг, Е.А. Калашникова // Научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов, посвященной 170-летию со дня рождения К.А. Тимирязева, г. Москва, 5-6 июня. - 2013.

6. Алтанцэцэг, Э. Использование препаратов дропп и цитодеф в культуре ткани Astragalus mongholicus Bge. / Э. Алтанцэцэг, Е.А. Калашникова // Международная научно-практическая конференция «Практико-ориентированные биотехнологические исследования в растениеводстве, животноводстве и медицине» Брестский государственный университет имени А.С.Пушкина, г. Брест, 27 - 28 июня. - 2013. - С. 32 - 35.

7. Алтанцэцэг, Э. Размножение Астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) в условиях in vitro / Э. Алтанцэцэг, Е.А. Калашникова // Известия ТСХА, - 2013. выпуск 6, - С. 40-48.

8. Алтанцэцэг, Э. Размножение Астрагала приподнимающегося (Astragalus adsurgens Pall.) в условиях in vitro / Э. Алтанцэцэг, Е.А. Калашникова // Кормопроизводство:Москва. - 2014. №2. - С. 26 - 30.

9. Enkhtaivan, A. Astragalus mongholicus Bge. exctracts cytotoxic effect on HeLa Cells / A. Balakina, A. Enkhtaivan, E. Kuzmina, E. Kalashnikova, A.Terentiev // 2nd International Symposium Secondary Metabolites. Chemistry, Biology and Biotechnology. 19-23 May. - 2014. - p. 110.

10. Enkhtaivan, A. Propagation in vitro rare species and medical plants Astragalus L./ A. Enkhtaivan, E.A. Kalashnikova // 2nd International Symposium Secondary Metabolites. Chemistry, Biology and Biotechnology. 19-23 May. - 2014. - p. 90.

Отпечатано с готового оринал-макета

Подписано в печать 13.02.2015 г. Формат 60x84 1/16. Усл.печ.л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 91.

Издательство РГАУ-МСХА 127550, Москва, Тимирязевская ул.,44 Тел.: (499) 977-00-12,977-40-64