Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние условий культивирования на лигнинолитическуюактивность грибов Phanerochaеte chrysosporiumи Panus tigrinus

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние условий культивирования на лигнинолитическуюактивность грибов Phanerochaеte chrysosporiumи Panus tigrinus"

российская академия наук

Институт биохимии и физиологии ' •> микроорганизмов

mjj:

на правах рукописи

Мясоедова Нина Михайловна

УДК 547. 992. 3. 577.15

Влияние условий культивирования на лигнинолитическую активность грибов Phanerochaete chrysosporium и Panus tigrinus

Автореферат• диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук (специальность 03.00.23 - биотехнология)

Пущино - 1993 г.

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научный руководитель: доктор биол. наук, профессор Л. А. Головлева

Официальные оппоненты: доктор биол. наук К К. Ерошин доктор хим. наук А. П. Синицин

Ведущее учреждение: Институт микробиологии АН Белоруссии, г. Минск

Защита состоится мин.

на заседании Специализированного совета (Д. 00.2. 69. 01) при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущино Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии • и физиологии микроорганизмов РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биол. наук

В. Ы. Вагабов

ВВЕДЕНИЕ

Проблема разложения промышленных лигнинов (лигносульфонатов, хдорлигнинов, сульфатного лигнина, гидролизного лигнина), остающихся в качестве побочных продуктов при производстве пульпы, бумаги, спирта и т. д. стоит очень остро. Кроме того, что не используется значительная часть древесины, возникла еще и экологическая проблема, т. к. многотоннажные отходы ежегодно скапливаются в отвалах. Делигнификация растительного сырья, идущего на корм скоту, также представляет большую проблему.

Все это привело к тому, что в последние годы во многих лабораториях мира проводились исследования по поиску микроорганизмов, разлагающих лигнин, и разработки по их использованию в биотехнологических процессах разложения лигнина. Обнаружение ключевого фермента разложения лигнина - лигнинпероксидазы еще больше подогрело интерес исследователей к проблеме энзиматического разложения лигнина. К моменту начала данной работы был известен один гриб белой гнили Phanervchaete chrysosporium, способный разлагать лигнин. Основные исследования по энзимологии разложения лигнина были выполнены с этим грибом. Однако выходы лигнинолитических ферментов, синтезируемых этим грибом, не высоки, активность их нестабильна, условия культивирования гриба достаточно сложные и требуются отдельные дорогостоящие компоненты среды. Все это побудило исследователей искать другие штаммы грибов, обладающих лигниноли-тической активностью. Появились сообщения о выделении грибов Phlebia radiata, Conolus versicolor, Lentims edodes, эти грибы детально изучаются с целью их дальнейшего использования в биотехнологических процессах.

Цель работы: сравнение лигнинолитических сеойств грибов-деструкторов лигнина из коллекции лаборатории, выбор наиболее перспективного штамма, разработка условий культивирования, позволяющих стабильно получать высокие выходы ферментов как всего лигнинолитического комплекса, так и отдельных ключевых ферментов комплекса.

Задали исследования:

1) провести сравнительный анализ лигнинолитической активности грибов Phanerochaete chrysosporium 1764, Panus tigrinus 8/18 и 144;

2) провести подбор индукторов для биосинтеза доминирующих оксида-зы и Мп-пероксидаэы, а также отдельных иэоформ;

3) разработать условия погруженного культивирования гриба Panus

tiв"iлин 8/18, оптимальные для биосинтеза лигнинолитического комл—

лекса;

4) разработать условия твердофазной ферментации гриба Panus tigrinus на различных отходах сельского хозяйства с целью повышения выхода ферментов и удешевления процесса;

5) провести предварительные испытания по использованию гриба Panus tigrinus и его внеклеточного лигнинолитического комплекса для утилизации гидролизного лигнина с целью его превращения в кормовой препарат.

Научная новизна. Отобран активный штамм P. tigrinus 8/18, характеризующийся более высокой лигнинолитической активностью по сравнению с известными грибами-деструкторами лигнина.

Изучена динамика биосинтеза лигнинолитических ферментов и состава лигнинолитического ферментного комплекса данного гриба.

Разработаны условия погруженного культивирования гриба Р. tigrinus, позволяющие получать активные лигнинолитические препараты.

Впервые подобраны условия твердофазной ферментации растительных отходов, обеспечивающие высокий выход лигнинолитических ферментов.

Обнаружены индукторы, избирательно повышающие выходы Мп-пе-роксидазы и оксидазы.

Практическая значимость. Полученные лигнинолитические препараты и отдельные ферменты комплекса могут быть применены для де-лигнификации растительных золокон с целью получения волокон высокого качества, для получения ценных реагентов, трудно доступных химическим путем. Показана принципиальная возможность использования данного гриба для получения кормовых препаратов на основе гидролизного лигнина

Апробация. Основные положения диссертационной работы доложены на 2-ом семинаре "Превращения древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействии" (Рига, СССР, 1985); на конференции "Biotechnology in the pulp and paper industry" (Stockholm, Sweden, 1986); на советско-финских . семинарах "Microbial

degradation of lignocellulose raw materials"(Tbilisi, USSR, 1985), "Bioconversion of plant raw materials by

microorgamsm3"(Riga, USSR, 1988); на финско-советских семинарах "Monitoring and control of plant raw material bioconversion" (Espoo, Finland, 1984), "Bioconversion of plant raw materials -

Публикации. Ш теме диссертации опубликовано 16 печатных работ.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части (5 глав), включающей описание материалов и методов, изложения экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (167 ссылок). Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 26 рисунков.

Принятые сокращения.

КТММК -«¿-кето-/-тиометилмасляная кислота

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

Т«Ф - твердофазная ферментация

ВЛФК - внеклеточный лигнинолитический ферментный комплекс

АЕТС - 2,2-азино-ди-З-этилбензотиазолин-б-серная кислота

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Мжрооргашвмы

В работе использовали штамм Phanerochaete chrysosporium Burds BKMF-1764, полученный из Российской коллекции микроорганизмов РАН и штаммы Parois tigrinus 144 и Parus tignnus 8/18 (Скрябин с со-авт., 1984; Головлева с соавт. , 1986), выделенные с гнищей древесины Ленкоранского района Азербайджана и Ботанического сада г. Душанбе.

Культивирование ютроорганизиов

Для приготовления инокулята грибы P. tignnus 144 и 8/18 культивировали в течение 8 суток на жидкой среде следующего состава (г/л): NH4N03 - 0.2; КН2ГО4 - 0.2; К^РОу - 0.02; MgSO^HgO -0.1; пептон - 0.5; соевая мука -0.5; глицерин - 6.0. Грибы выращивали в колбах объемом 700 мл со 100 мл среды на качалке при 200 об/мин при 29 "С.

Погруженное культивирование проводили на модифицированной среде Кирка следующего состава (г/л): KHgPO^ - 0.2; MgS^^HgO -0.05; СаС12" 0.01; раствор микроэлементов - 1 мл; тиамин - 2.5 мг /л (Kirk et al., 1978). В качестве источников азота использовали аспарагин (0. 52 мМ) и NH4N0j(0. 49 mM). pH среды поддерживали 4.5, используя 10 мМ диметилсукцинатный буфер. В качестве субстрата вносили березовый лигнин (0.5 г/л). Грибы культивировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 20 мл среды при 37'с без перемешивания. Каждые 2-3 дня колбы продували кислородом ил воздухом.

Выращивание культуры гриба в экспериментах по оптимизации ус-лоеий культивирования- проводили на модифицированной среде Кирка, с использованием следующих моно- и дисахаров: ксилоза, арабиноза, галактоза, рамноза, манноза, лактоза, целлобиоза, сахароза, фруктоза, глицерин в концентрации (2 г/л). pH среды - 4. 5 - поддерживали с использованием 10 мМ буферных растворов: формиатный, цит-ратный, тиобарбитуратный, метафталатный, ацетатный,

барбитуратный, полиакрилатный, сукцинатный, орто-фталатный, пиро-мелитовый, триметилангидридный. Индукторы вносили в 100 мкл диме-тилформамида при засеве культуры, конечная концентрация 2Ш. Марганец вносили в виде MnSO^HgO, концентрацию, выраженную в мг/ л Mn(II), рассчитывали по результатам анализа на атомно-абсорбцион-ном спектрофотометре Perkin - Elmer 5100 (США). Для иммобилизации мицелия использовали пенополиуретан в кубиках 1x1 см (4 г на 200 мл среды) и поликапроамидное волокно - 2,5 г на 200 мг ("Вия"). Культивирование проводили в колбах объемом 700 мл с 200 мл среды на качалке при 200 об/мин при 29°С. При твердофазной ферментации навески соломы (5 г) или опилок (7 г) помешдли в колбы объемом 700 мл, увлажняли водопроводной водой в соотношении 1: 3 (по весу) , стерилизовали 1 ч при 1 атм и засевали инокулятом. Методы определения лигнинолигоческой активности грибов Лигнинолитическую активность грибов определяли:

- по выделению этилена иа КТЬШК (Glenn et al. , 1983);

- по обесцвечиванию полимерного красителя Poly В-411 (Glenn, Gold, 1983);

- по расщеплению характерных связей в модельных соединениях лигнина^}-1 mß-Q-i. -типов;

- по разложению лигнина (Zadrazil, Brunnert, 1980; Janhekar et al. , 1981).

Методы определения активности ферментов

Дня приготовления препаратов ферментов культуру центрифугировали при 9000 g в течение 10 минут. Супернатант фильтровали на мембранных фильтрах (Millipore, тип НА, диаметр пор 45 мкм) для полного отделения мицелия и споровых загрязнений. В полученной культуральной жидкости проводили определение активностей внеклеточных ферментов.

Активность оксидазы определяли по скорости окисления сирин-галдазина (Leonowicz, Crzywnowicz, 1981) и АБТС (Chan, Coffer

л погл

Активность лигниназы - по скорости окисления вератрового спирта до вератрового альдегида (Tien, Kirk, 1984; Gold et al., 1984).

Активность Mn-пероксидазы определяли по окислению НАДН (Asada et al., 1987).

Активность каталазы - по убыли перекиси водорода (АеЬ, 1983).

Определение образования перекиси водорода

Определение удельной активности образования перекиси водорода проводили по методу, описанному Грином и Голдом (Green and Gold, 1984).

Спектрофотометрические измерения проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-160 (Япония).

Аналитические методы

Целлюлозу определяли по Апдеграфу (Updegraff, 1969). Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Биомассу определяли весовым методом.

Напевный электрофорез

Вертикальный диск-электрофорез в неденатурирующих условиях по Laemmly (1970)проводили в 10% ПААГ, из состава растворов исключали додицилсульфат-Ыа и,5-меркаптоэтанол. Специфическое окрашивание гелей на присутствие оксидазы и пероксидазы проводили с АБТС или о-дианизидином (Гааль с соавт., 1982) и 4-хлор-1-нафтолом (Fairbanks et al., 1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЕСУНДЕНИЕ Сравнительное изучение лхггааголитической активности rprfjOB Ph. chrysospariua, P. tigrinu3 8/18 и 144

Динамика лигнинолитической активности грибов Ph. chrysosporium, P. tigrinus 8/18 и 144, снятая по выделению этилена из КТММК, показала, что все 3 штамма имеют лигнинолитическую активность (рис.1). Выделение этилена данными грибами начиналось на 3 сутки и достигало максимальных значений на 6 сутки культивирования, причем P. tigrinus более интенсивно осушэствляли данный процесс. Снижение концентрации лигнина происходило у данных штаммов также на 3 сутки культивирования, к концу 3 недели лигнин разлагался грибом Ph. chrysosporium на 20%, а P. tigrinus 144 на 25%, P. tigrinus 8/18 на 30% (рис.1).

cd BJ

с >

l 10 12 14 10 18 :

сутки

Рис. 1. Убыль лигнина (1) и выделение этилена из КТЫМК (2) культурами Ph. chrysosporium 1764 (■—■) и Р. tigrinus 8/18 (*—«), Р. tigrinus 144 (+—*■).

Сравнительное изучение лигнинолитической активности грибов показало, что наиболее перспективным является гриб Р. tigrinus 8/18 и дальнейшие исследования проводили с ним.

Ферменты лкгнкналхгнческаго комплекса гриба P. tigrinus 8/18 при погруженном культивкровалкм

Определение состава ферментного комплекса гриба P. tigrinus показало отсутствие активности лигнин-пероксидазы - фермента считающегося ключевым для большинства грибов белой гнили (Tien, Kirk, 1983; Gold et al. , 1984) и отсутствие активности оксидазы. Активность Mn-аависимой пероксидазы, определенная по окислению НАДН коррелировала с общей лигнинолитической активностью культуры. В этой ситуации роль ключевого фермента выполняет Мп-зависимая пероксидаза, что является Ътличительной особенностью ВЛФК гриба P. tigrinus.

Учитывая, что при энзиматическом разложении лигнина участвует перекись водорода и она необходима для фукционирования Мп-перок-сидазы, мы провели изучение способности гриба P. tigrinus продуцировать HgOg. Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что как фракция мицелия так и культуральная жидкость гриба Р. tigrinus были способны к образованию перекиси водорода, причем

удельная активность образования Н^р^Зыла в 5 раз выше в культу-ральной жидкости, чем в мицелиальной фракции. Таблица 1. Образование перекиси водорода грибом Р. ЫеПпиз

(нмоль/мин/мг белка)

Варианты

Препарат мицелия Культуральная жидкость

Субстрат Полная Контроль Контроль Полная Контроль Контроль реакц. без суб- с кипяче- реакц. без суб- с кипяче смесь страта нием смесь страта нием

Глюкоза 2,66 1,15 0 16,1 15,2 0

Целлюлоза 0,99 0,45 0 8,2 7,4 0

Солома 0,96 0,43 0 8,0 7,2 0

В образовании перекиси водорода грибом P. tigrinus принимает участие глюкозооксидаза. Динамика активности данного фермента имела такой же характер, как и динамика удельной активности образования HgC^ культуральной жидкостью гриба.

Глюкозооксидаза у гриба P. tigrinus является внеклеточным ферментом; в результате чего возможно создать зысокий локальный уровень перекиси водорода в непосредственной близости к полимерному лигнину и ускорить таким образом его деполимеризацию. В то время как у Ph. chrysosporium этот процесс осуществляется в перип-лазматическом пространстве мицелия и для прямого участия перекиси в лигнинолизисе необходима ее экскреция (Forney et al. , 1982).

Твердофазное культивирование гриба P. tigrinus 8/18

Общая лигнинолитическая активность гриба P. tigrinus при ТОФ соломы, определенная по выделению этилена из КТЫМК, развивалась в виде двух пиков с максимумами на 5-6 и 10-11 сутки культивирования (рис. 2А). Динамика лигнинолитической активности гриба при твердофазном культивировании на опилках виноградной лозы отличалась от таковой при ферментации на соломе: общая лигнинолитическая активность была в 3 раза выше и имела три пика: на 4,7 и 10 сутки (рис. 2А).

сутки

Рис. 2. Динамика общей лигнинолитической активности гриба Р. tigrinus (А)>—■ (1) ТФФ пшеничной соломы ;

* — + (2) ТФФ виноградной лоаы. Динамика активности ферментов (Б) Мп-пероксидааы *—»(1), оксидазы

*-* (2), при ТФФ пшеничной соломы.

Снижение содержания лигнина при ТФФ P. tigrinus начиналось на 3 сутки культивирования, через 14 дней лигнин разлагался грибом при твердофазном культивировании на соломе на 20%, а на лозе на 30%.

Изучение активности ферментов комплекса у гриба P. tigrinus при твердофазной ферментации показало, что активность лигнин-пе-роксидазы, как и при погруженном культивировании, отсутствовала. Активность Mn-пероксидазы появлялась на 3 сутки культивирования и достигала максимальных аначений на 5-6 и 10-11 сутки (рис.. 2Б). Динамика активности фермента хорошо коррелировала с обшей лигнинолитической активностью культуры.

В отличие от погруженного культивирования при ТйФ гриба была обнаружена активность оксидазы, которая на 3 сутки, имела 2 максимума на 5-6 и 10-11 сутки (рис. 2Б).

Состав субстрата, на котором проводят твердофазное культивирование грибов, оказывает влияние не только на обшую лигнинолити-

ческую активность, но и на соотношение ферментов внеклеточного лигнинолитического комплекса. Препарат, полученный при ТФХ> соломы грибом P. tigrinus при соотношении Mn-зависимой пероксидазы и ок-сидазы 4:1, осуществлял расщепление С^-ОДсвязи в модельных сое-диненийх лигнинг\/-1 i^-Q-4-типов с образованием вератрового альдегида (рис. 3). Лигнинолитический комплекс гриба, синтезирующийся в процессе твердофазной ферментации виноградной лозы (при соотношении Mn-пероксидазы и оксидазы 2:1 был способен к осуществлению более широкого спектра реакций. Кроме расщепления С/-С^он осуществлял разрыв Q^-O-связей; окисление альдегидной группы и реакции деметилирования (рис. 3).

Таким образом, применение твердофазной ферментации позволило увеличить общую лигнинолитическуга активность гриба P. tigrinus в 3-9 раз по сравнению с погруженным культивированием, увеличить выход Мп-пероксидазы в 4 раза и проиндуцировать биосинтез оксидазы. Кроме того применение Т<ХФ гриба на лигноцеллюлоаных отходах позволяет значительно удешевить процесс биосинтеза ферментов по сравнению с погруженным культивированием.

Оптимизация условий культивирования гриба P. tigrinus с целью повьвенхя продукции ферментов

Несмотря на то, что Т2Ф позволила значительно увеличить выход лигнинолитических ферментов-, этот способ имеет определенные недостатки. Так, ферментные препараты содержат большое количество водорастворимого лигнина, который затрудняет очистку лигнинолитических ферментов. Поэтому следующий этап нашей работы заключался в оптимизации условий погруженного культивирования с целью повышения выхода ферментов.

Индукция лигнинолитических ферментов гриба белой гнили P. tigrinu3 ароматическими соединениями

Поиск возможных индукторов Мп-пероксидазы и оксидазы Р. tigrinus среди мономерных ароматических соединений, вносимых в грибную культуру при инокулировании, позволил выявить вещества, повышающие выход Мп-пероксидазы (3-, 4-метилбензиловые (спирты) и оксидазы (2,6-диметилфенол, сиреневый альдегид и 3, 4-диметокси-З -фенилпропеновая кислота) .

ио-dH

Ч^ОСНз осн3

сно

соон

соон

осн.

осн3

Вератровый альдегид

чосн3 осн3

Вератровая кислота

0СН3

Метоксибензойная кислота

сн3

HC-0-Q

бен.

ОСНг

iH2-CH3

с=о

ОСНс

осн„

осн3

Пропиовератрон

СНО сно соон соон

0СН3 0СН3 осн3

Метоксибензойный Вератровый Вератровая Бензойная альдегид альдегид кислота кислота

Рис. 3. Разложение модельных соединений лигнинаJZ-1 (А) и ^-0-4 (Б) типов грибом P. tigrinus при ТФФ на виноградной лозе

3,4-Диметоксикоричная кислота индуцировала оба фермента. Обращает на себя внимание избирательность действия соединений: индукторы, специфичные для Mn-пероксидазы, или не оказывали существенного влияния на биосинтез оксидазы, или подавляли его. Специфичность ответа на структуру индуктора довольно высокая. Так

3.4-диметоксикоричная кислота индуцировала Mn-пероксидазу, но 4-диметоксикоричная подавляла. Аналогично действие индукторов оксидазы. Индукторы, найденные для Kfri-пероксидазы P. tigrinus, существенно отличаются от индукторов, известных для лигнин-пероксидазы Ph. chrysosporium. Этот факт интересен в связи с тем, что в составе ВЛФК P. tigrinus Mn-пероксидаза выполняет функцию ключевого фермента аналогично лигнин-пероксидазе Ph. chrysosporium (Tien, 1986), причем, основные физико-химические свойства этих ферментов совпадают.

Влияние ионов №(11) на активность липсоншегических фэрмэнтов

Внесение Mn(II) в диапазоне концентраций от 0-120 мг/л показало, что максимальная активность Мп-пероксидазы достигалась при внесении Mn( 11) в среду в концентрации 71 мг/л. На активность оксидазы Mn(II) не оказывал заметного влияния..

Подбор нсточшяа углерода

При подборе оптимального источника углерода были проверены моносахариды, дисахариды и глицерин. Из И проверенных соединений лишь манноза и мальтоза обеспечивали увеличение активности Мп-пе-роксидазы, соответственно, в 2 и 3,8 раза.

При выращивании P. tigrinus с различными моно- и дисахаридами в качестве источника углерода наибольший прирост биомассы отмечали при использовании мальтозы (Бухало, 1988). Аналогичный эффект мальтозы на продукцию лигнинолитических ферментов, полученный в наших условиях, свидетельствует, вероятно, о большей "метаболической доступности" мальтозы для P. tigrinus.

Подбор буферных систем

Из 11 проверенных буферных систем сукцинатная, тартратная, пиромелитовая и о-фталатная повышали выход Мп-пероксидазы по сравнению с используемым в контроле диметилсукцинатным буфером в

1.5-2,0 раза

- 12 -

Влияние детергентов на выход лигнинолитических ферментов

Использование оптимальной концентрации Твина-20' или Твина-80 (0.025%) позволило не только повысить активность Мп-пероксидазы в 1,5 раза, но и вести культивирование с перемешиванием. Последнее дает возможность отказаться от кислородной атмосферы и увеличить в 10 раз объем культуральной среды.

(^мобилизация мицелия гриба Р. Ь1ег1пиз

В качестве носителей для иммобилизации мицелия гриба использовали пенополиуретановые кубики и поликапроамидное волокно.

Применение иммобилизации мицелия в стандартных условиях не увеличивало активность Мп-пероксидазы по сравнению с контролем. Однако, применение иммобилизации мицелия привело к тому, что перемешивание не подавляло лигнинолитической активности, так что стало возможным отказаться от.кислородной атмосферы и увеличить в 10 раз объем культуральной среды.

Применение температурного сдвига и сдвига скорости перемешивания

Была проверена эффективность сдвига скорости перемешивания и температурного сдвига. Изменение режима скорости перемешивания не дало позитивных результатов. А сдвиг температурного режима с 37°С в первые трое суток культивирования до 29^0, начиная с 4-х суток культивирования приводил к увеличению выхода лигнинолитических ферментов Р. Игг^пиБ в 1,5-2,0 раза

Комбинирование приемов культивировании

Комбинирование данных приемов позволило подобрать их оптимальное соотношение. В лучшем варианте( минеральная среда Кирка с добавлением МпБО^в концентрации 71 мг/л ;.-абуферена 20 мМ тартрат-ным буфером рН - 4,5; источник углерода - 1% мальтоза; индуктор -2 мМ 3-метилбензиловый спирт или 2.6-диметилфенол; 0.025% Твин-80; мицелий гриба иммобилизован на поликапроамидном волокне; температурный сдвиг) удается повысить активность Мп-пероксидазы в 400 раз по сравнению со стандартными условиями культивирования и в 13 раз по сравнению с твердофазной ферментацией на соломе. Объединение приемов дало возможность получить высокую активность ок-сидазы, в то время как в стандартных условиях активность данного фермента не была обнаружена и увеличить биосинтез оксидазы в 3 раза по сравнению с ТФФ на соломе.

Разработка способов утилизации гидролизного липпоп с не-

разработанные нами условия твердофазной ферментации были успешно применены для утилизации гидролизного лигнина - распространенного отхода производства спирта, фурфурола и кормовых дрожжей в России.

Так как Р. и£Г1пиз не может использовать гидролизный лигнин в качестве единственного источника углерода, мы попытались использовать его в смеси с различными добавками, такими как пшеничная или ржаная солома, а также молочная сыворотка. Использовали смеси гидролизного лигнина и пшеничной или ржаной соломы в соотношении 3:1; 1:1; 1:3, а молочной сыворотки в соотношении 1,5:1; 3:1; 7:1. Во всех вариантах мицелий гриба колонизировал ростовой субстрат и обнаруживалась активность внеклеточных лигнинолитичес-ких ферментов. С увеличением содержания гидролизного лигнина в ростовом субстрате активность Мп-пероксидазы снижалась, а оксидазы - увеличивалась (рис. 4).

Рис. 4. Динамика активности лигнинолитических ферментов

Мп-пероксидазы (»---*,*------■ ) и оксидазы

(«-*,*■-+, ■-■) при культивировании гриба

Р. 1идг1пиз на смеси гидролизный лигнин и пшеничная солома в соотношении 3:1(1), 1:1(2), 1:3 (3).

За 15 суток культивирования гриб разлагал 33% лигнина, а прирост "истинного белка" составил - 1,6%.

моа?>в граба Р. МеНпиз

О г * в 8 10 12

сутки

Таким образом, показана принципиальная возможность утилизации гидролизного лигнина с помощью гриба P. tigrinus методом твердофазной ферментации растительных отходов. В результате проведенной работы получены опытные образцы кормовых препаратов на основе смеси гидролизный лигнин: ржаная (или пшеничная) солома или молочная сыворотка, которые переданы в Институт микробиологии Министерства обороны РФ для проведения токсикологической экспертизы.

ВЫВОДЫ

1. В результате сравнительного анализа лигнинолитической активности грибов Ph. chrysosponum 1764, P. tigrinus 8/18 и 144 в качестве наиболее перспективной культуры выбран гриб P. tigrinus 8/18. Показано, что лигнинолитическая активность данного штамма в 1,5-2,0 раза выше, чем у гриба Ph. chrysosponum.

2. Разработаны условия твердофазной ферментации гриба Р. tigrinus 8/18 на различных отходах сельского хозяйства и промышленности (таких как солома, гидролизный лигнин, молочная сыворотка), увеличивающие общую лигнинолитическую активность в 9 раз, а активность Мп-пероксидазы в 4 раза по сравнению с погруженным культивированием в стандартных условиях.

3. Разработаны новые условия погруженного куьтивирования, включающие применение индукторов, детергентов, иммобилизацию мицелия, использование другого источника углерода; применение сдвига температурного режима.

В результате выход Mn-зависимой пероксидазы был повышен в 400 (100 нкат/мл), а оксидазы в 200 раз (20 нкат/мл) по сравнению со стандартными условиями.

Получено решение НИИГГЕЭ на выдачу патента от 05. 07.93 г. на заявку No 5055933 "Способ получения лигнинолитических ферментов грибов белой гнили" .

4. Показана принципиальная возможность утилизации гидролизного лигнина с помощью гриба Р. tigrinus 8/18 с целью получения кормовых препаратов.

- 15 -

ГЬ материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Головлева Л. А., Мальцева О. Е , Леонтьевский А. А. , Мясоедова Е М. , Скрябин Г. К. Биосинтез лигниназы при твердофазной ферментации соломы грибами Panus tigrinus. - Докл. АН СССР, 1987, т. 294, С. 992-995.

2. Головлева Л. А., Мальцева О. К , Мясоедова Е М. , Полманис А. Г., StyKOB Н А. Оценка влияния различных способов предобработки растительных субстратов на лигнинолитическую активность гриба Panus tigrinus 144. - Химия древесины. 1988, No. 2, с. 66- 71.

3. Леонтьевский А. А. , Мясоедова Я М. , Головлева Л. А. Способ получения лигнинолитических ферментов. - Решение НИИГПЭ о выдаче патента от 05. 07.1993 на заявку No. 5055933.

4. Леонтьевский А. А. , Мясоедова Е М. , Коломиец Э. И. , Головлева Л. А. Индукция лигнинолитических ферментов гриба белой гнили Panus tigrinus 8/18. - Биохимия, 1991, т. 56, No. 9, с. 1665-1675.

5. Леонтьевский А. А., Мясоедова Н М. , Мальцева О. R , Термхи-тарова Е Г. , Крупянко В. И. , Головлева Л. А. Мп-зависимая перокси-даза и оксидаза Panus tigrinus 8/18: очистка и свойства. - Биохимия, 1990, т. 55, No. 10, с. 1841-1846.

6. Леонтьевский А. А. , Мясоедова Е М., Овчаренко Е И. , Головлева Л. А. Влияние ионов Mn(II) на экспрессию лигнинолитических ферментов гриба белой гнили Panus tigrinus 8/18. - Биохимия, 1992, Т. 57, N0.4, с. 582-587.

7. Мальцева О. Е , Леонтьевский А. А. , Мясоедова Е М. , Головлева Л. А. Разложение лигнина грибами белой гнили Phanerochaete chrysosporium F-1764 и Panus tigrinus 144 и роль пероксида водорода в этом процессе. - Химия древесины, 1987, No. 2, с. 28-30.

8. Мальцева О. Е , Мясоедова Е М., Головлева Л. А. , Скрябин Г. К. Изучение механизма разложения лигнина грибом Phanerochaete chrysosporium 1764. - Известия АН СССР. сер. биол. , 1985, No. 3, с. 330-338.

9. Мясоедова Е М., Баскунов Б. П. , Шевченко В. И. , Головлева Л. А. Разложение модельных соединений лигнина^9-1 nß-0-4- типа грибами Panus tigrinus и Coriolus versicolor. - Микробиология, 1983, Т. 58, No.2, с. 256-261.

10. Golovleva L. А., Leontievsky A.A., Maltseva 0. V. , Myasoedova N.M. Ligninolytic enzymes of the fungus Panus tigrinus 8/18: biosynthesis, purification, characteristies. - Proc. of

Finnish-Soviet, seminar "Bioconversion of plant raw materials -biotechnology advancement", VTT, Espoo, 1991, p. 93 -109.

11. Golovleva L. A. , Leontievsky A. A. , Maltseva 0. V. , Myasoedova N. M. Ligninolytic enzymes of the fungus Panus tigrinus 8/18: biosynthesis, purification and properties. - J. Biotechnol. , 1993, v. 30, p. 71-77.

12. Golovleva L. A. , Maltseva 0. V. , Myasoedova, N. M. .Leontievsky A.A. Panus tigrinus 144 - degrading lignin. Proc. of the Third. Int. Conf. "Biotechnology in the pulp and paper industry", Stockholm, 1986, p. 28-29.

13. Kfaltseva 0. V. , Niku-Paavola M.-L. , Leontievsky A. A., Myasoedova fj. M., Golovleva L. A. Ligninolytical enzymes of the white rot fungus Panus tigrinus. - Biotechnol. Appl. Biochem., 1991, v. 13, p. 291-302.

14. Maltseva 0. V., Niku-Paavola M.-L., Myasoedova N. M., Baskunov B. P. , Golovleva L. A. Comparative studies of degradation of lignin model compounds by pure ligninolytic enzymes of Panus tigrinus and Phlebea radiata. - Proc. of Finnish-Soviet seminar "Bioconversion of plant raw materials - biotechnology advancement", VTT, Espoo, 1991, p.60-69.

15. Maltseva 0. V. , Myasoedova N. M., Golovleva L. A. Degradation of lignin by the fungus Phanerochaete chrysosporium 1764. - Proc. of Finnish-Soviet seminar "Monitoring and control of plant raw material bioconversion. Technological aspects", VTT, Espoo, 1985, p. 8-24.

16. Maltseva 0. V., Myasoedova N. M., Leontievsky A. A., Golovleva L. A. Characteristics of the ligninolytic system of Panus tigrinus 144. - Proc. of Soviet-Finnish seminar "Degradation of lignocellulose raw materials", Tbilisi, 1986, p. 74-82.

£4.12.93 r. 3an. 59I0P Tup. 130 3K3. yn.-n3fl.j. 1.0

OinenaTaHO Ha poranpHHTe b OHTH HHH PAH