Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ УДОБРЕНИЙ НА ПРОТЕОЛЙТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ УДОБРЕНИЙ НА ПРОТЕОЛЙТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛ ЬСКОХОЗЯ ЯСТВ ЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

ПЛЕШКОВ Александр Сергеевич

ВЛИЯНИЕ УДОБРЕНИИ НА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ОЗИМОИ ПШЕНИЦЫ!

06.01.04 — Агрохимия 03.00.04 — Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

МОСКВА — 1982

¿Г/ссе^'С*-'^ 9 .-Г-*.- гс ' Г ~ с.Х.^.у^

и

Работа выполнена на кафедре агрономической и биологической химии Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Плешков Б. П.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук Павлов А. Н., кандидат биологических наук Кожемячко В. А.

Ведущее учреждение — Центральный институт агрохимического обслуживания сельского хозяйства СССР.

Защита состоится « 1982 г.

в « № » час. на заседании Специализированного совета Д 120.35.02. в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, Тимирязевская ул., 49, корп. 8, Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан « 1982 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

Дорожкнна Л. А.

Актуальность темы. В Отчетном докладе на XXVI съезде КПСС Генеральный секретарь ЦК КПСС Л. И. Брежнев, касаясь вопросов сельского хозяйства, отмечал, что «...перед ним стоит та же главная проблема, что и в других отраслях народного хозяйства, — повышение эффективности и качества». Решениями XXVI съезда предусмотрено дальнейшее увеличе* ние сельскохозяйственной продукции и улучшение ее качества в целях более полного удовлетворения потребностей населе-^ ння в продуктах питания и народного хозяйства в сырье. Получение высоких урожаев заданного качества требует знания внутренних процессов, происходящих в растениях, с целью целенаправленного совершенствования технологии возделывания сельскохозяйственных культур, в том числе и применения удобрений.

Важными критериями, определяющими качество зерна, яв* ляется содержание и качественный состав, входящих в них белковых веществ. В настоящее время достигнуты значительные успехи в изучении влияния условий минерального питания на качественный состав белков ряда сельскохозяйственных культур, однако очень мало известно об изменениях в содержании основных групп гидролитических ферментов, оказывающих большое влияние на технологические и посевные качества зерна. Одной из наиболее важных групп гидролитических ферментов являются протеазы, которые совместно с запасными белками образуют специфический белково-протеазный комплекс, играющий исключительно большую роль в жизнедеятельности семян. До настоящего времени все еще слабо изучен вопрос о влиянии удобрений на активность и свойства протеолитических ферментов как при созревании зерна, так п при его прорастании. Поэтому в нашей работе мы. изучали влияние удобрений на состав и свойства протеолитических ферментов озимой пшеницы Мироновская 808 при созревании, в зрелом зерне н при прорастанин.

Цель и задачи исследования. Целью нашнх исследований являлось изучение влияния удобрений на активность и свойства протеолитических ферментов чепнр дтирнииы при его со-Цбятр. вз?чг.:1 oicra 1

U:cl tr,j¡, J!css:.a «ш:з.

зреваннн и прорастании. В задачу исследовании входило также совершенствование методов анализа сложных белковых смесей с помощью ионообменной хроматографии н гельфнль-трацни на сефадексах, препаративного и аналитического диск-электрофореза. Кроме этого, изучали скорость включения "С-глнщпга в различные органы проростков и влияние хло-рамфеникола на включение ИС-глшшна, активность ферментов, их состав и свойства.

Объект исследования. В работе использовали образны озимой мягкой пшеницы сорта Мироновская 808, отобранные с многолетнего полевого опыта, заложенного на дерново-подзолисто и почве Московской области в четырехпольном севообороте с двух вариантов — без удобрений (первый вариант) и NiooP&oKm (второй варнант). Чередование культур в севообороте: вика с овсом, озимая пшеница, картофель, овес. Почва имела следующую характеристику: содержание гумуса 2,3% в первом и 2,6% во втором варианте, гидролитическая кислотность — 2,2 и 1,3 мг-экв/100 г, подвижная Р3О5 соответственно 1,6 и 4,5 мг/100 г,- обменный KsO 12,5 и 20,9 мг/100 г. Образцы растений фиксировали жидким азотом, затем лио-фильно высушивали. Повторность опыта. четырехкратная, площадь делянки 128 м2, учетная площадь 100 ма, урожай на контроле 26 ц/га и с применением удобрений 38 ц/га, HCPcs-Зц. . ... . . .

Методы исследований. При определении атнвностн'протез за основу был взят-метод-Ансопа (Anson, 1938). В качестве субстрата использовали казеин (по Гаммерстену). Для изу: чения свойств ферментов использовали следующие эффекторы: 1,65х10-3М цнегеин, 2,86Х10-3М парахлормеркурнбен-зоат (п—ХМБ), 2,7X Ю-3M этнленднамннтетраацетат (ЭДТА), 3%-ная перекись водорода. За единицу протеолити-ческой активности принимали количество фермента, вызывающего'изменение оптической илотности на 0,001 за 1 час лро: тив контроля при EÎM. Полученные результаты выражали в единицахудельной активности, рассчитанной как число про-теолитнческнх единиц на 1 мг белка. Все результаты определений ферментативной активности представлены в единицах удельной- активности. Активность аминопептидаз определяли с L-лейцнл — р-нафтиламидом, активность, эндопептндаз с N — а-бензоил — L-аргннина мндом.

, Научная новизна результатов. В работе впервые проведено изучение влияния удобрений на активность и состав про-теолнтическнх ферментов при созревании зерна пшеницы. Показано, что удобрения изменяют состав и свойства протеаз в зрелом зерне и при прорастании семян. Изучена, скорость включения мС-глишша в различные органы проростков, разработано устройство для препаративного электрофореза (Ав-

topCKoe свидетельство № 544898, 1977 г.) и усовершенствовав метод разделения белков на сефадексах. -

Практическая ценность. Полученные результаты о влиянии условий минерального питания на активность н свойства про-теолитнческнх ферментов можно использовать в дальнейшем для получения зерна с заданными свойствами, а также в селекционной работе для получения новых сортов, имеющих меньшую активность протеаз в зрелом зерне, которое лучше хранится,-!! большую активность протеолитическнх ферментов при прорастании семян, что обеспечивает лучшую мобилизацию запасных белков.

Устройство, разработанное для препаративного электрофореза, позволяет проводить разделение практически любого количества смеси белков на колонках различных габаритов. Усовершенствованный метод разделения протеолитическнх ферментов на сефадексе G-100 с использованием средства части белков к фазе геля позволяет получать в результате одного этапа разделения очистку ферментов в 500—2500 раз и изучать свойства ферментных фракций без повторной рехрома-* тог ра фин.

Апробация работы. Работа докладывалась на конференции молодых ученых ТСХЛ в 1979 году.*По теме диссертации опубликовано 4 статьи н получено Авторское' свидетельство. Работа выполнена иа кафедре агрономической п биологической химии Московской ордена Ленина н ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной* * * академии им. 1С Л. Тимирязева. ..........

Структура н объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части (4 главы), заключения, выводов и списка литературы (190 источников). Работа изложена на 100 страницах машинописи н иллюстрирована 20 таблицами, 7 рисунками.

. Содержание работы • * ■

В 1-й главе обзора литературы изложены краткие сведения о биохимических изменениях белкового комплекса зерна пшеницы лрн созревашш н прорастании. Во 2-й главе представлены основные сведения о протеолитическнх ферментах растений и протеолитическнх ферментах пшеницы. ;

Экспериментальная часть состоит из 4 глав. В первой главе описаны методы изучения ферментов н белков; результаты, изложенные в 4—б-fi главах, приведены в тексте автореферата.

Влияние удобрений иа аминокислотный состав белков при созревашш пшеницы . .

Пищевая*и кормовая ценность зерна определяется не только содержанием белков, но и их сбалансированностью по амк*

йокнйлотйому составу. В наших исследованиях Для изучения* аминокислотного состава белков из зерна выделяли суммарные белки в фазы молочно-восковой и полной спелости. Было показано, что содержание общего и белкового азота при применении удобрений было выше во все фазы созревания зерна (табл. !)'•

В фазу молочно-восковой спелости в суммарных белках растений неудобренного варианта содержалось больше треонина, серина, метнонина и меньше глутаминовой кислоты

Таблица I Содержание азота в зерне пшеницы при созревании (в % иа сухую массу)

Варианты

Общий

Белковый

Небелковый

Формирование зерна

> удобрен

оРаоКсл .

Без

N100 г воІЧм

ПЙ

1,61 2,23

Молочная спелость

Без удобрений

ЫюоРбоКво , .

1.С6 1,94

Молочио-восковая спелость

Без удобрений М|соР«оК$о . .

1,76 1,98

Восковая спелость

Без удобрений

1,62 2,15

Полная спелость

Без удобрений

1 МіооР$оК$о , .

1,87 2,31

1.41 1,76

1,34 1,61

1,45 1,76

1,47 1,91

1,72 * 2,06

0,20 0.17

0,22 0,33

0,31 0,22

0,15 ' 0,24

0,15 0,25

(табл. 2у. При созревании в белках зерна увеличивалось содержание глутаминовой кислоты и пролнна и уменьшалось содержание лизина, причем более значительно в растениях, выращенных с применением удобрений. В суммарных белках зрелого зерна растений неудобренного варианта содержалось больше лизина, аргинина, треонина, .зланина, метионина и меньше аспарагиновой и глутаминовой кислот, лейцина и тирозина. Сумма незаменимых амннокнелот уменьшалась от молочно-восковой до полной спелости в суммарных белках зерна растений неудобренного варианта от 32,7% до 29,6%, а в белках зерна растений удобренного варианта от 31,6% до 28.6%. . , ,

Таблица 2

Содержание аминокислот в суммарных бедках пшеницы

(в % от сумми)

Аминокислоты Без удобрений N100 РіаКм

молочио-восковая спелость полная спелость молочно-восковая спелость полная спелость

Лизин 4,1 3,6 4,1 2,7

Гнетидни 2.4 2,6 2,4 2.4

Аргинин 5,1 5,2 4,9 4,8

Асиарагшювая кис-

лота 6.2 5,6 6,3 6.4

Треонин 4.5 4,2 4,2 3,5

Сернн 5,4 5,5 5,0 5,4

Глутаминовая кисло- 20,9

та 19,5 22,4 23,3

Пролни 12,5 13,0 12,6 13,0

Г ли ш ш 7,0 7,2 6,9 7,2

Алании 5,9 5,8 6.1 5,1

Вал ни 5.7 5,5 5,6 5.5

.Метионнн 1.1 1,1 0,6 0.5

Изолейшш 3,9 3,6 4,0 3,8

ЛеЛцнн 8,9 7,3 8,6 8.2

Тирозин 3,3 3.1 3,3 3,8

Фенилаланнн 4,5 4.3 4,5 4,4

Сумма незаменимых

аминокислот 32,7 29,6 31,6 28,6

■Таким образом, применение удобрении в дозе МшРеоКбо вызывало повышение урожая зерна озимой пшеницы от 26 до 38 ц/га и увеличение содержания в зерне общего и белкового азота, что сопровождалось увеличением в суммарных белках количества глутаминовой и аспарагиновой кислот, лейцина и тирозина и уменьшением содержания лизина, аргинина, треонина, аланина и метионина. .

Активность и свойства протеолитических ферментов пшеницы в процессе созревания

• Изучение формирования протеазного комплекса созревающего зерна имеет особое значение, поскольку протеазы, вы: полняюшие разнообразные функции, могут участвовать не только в распаде белков, приводящем к обновлению ферментных систем, но и в реакциях транспептидации, а также при формировании четвертичной структуры глобулярных белков. Кроме того, нормальное функционирование протеазного комплекса является важной предпосылкой получения муки и теста с хорошими хлебопекарными свойствами, а также образова-

ІШя полноценного жизнеспособного проростка (Мосолов, 1971; Степанов, 1973).

Несмотря на то, что протеолитнческие ферменты выполняют очень важные функции прн формировании полноценного зерна, исследования по влиянию удобрений на активность н свойства нротеолитическнх ферментов до сих пор не проводились.

Изучение суммарной активности и свойств протеолитиче-скнх ферментов (табл. 3) показало, что уже на ранних эта*

Таблица 3

Активность протеолнткческих ферментов пшеницы по фазам созревания

Без уді>брений N івдРбоКбо

рН 1 2 3 4 5 1 2 3 4 | 5

3,5 6,0 8,0і

3,5 6,0 8,0

3,2

. 3,5

Колошение

3.5 80 100 КО 0 0 0 0 0 .0 0

6,0 63 0 0 48 64 47 92 88 0 20

8,0 115 135 05 137 0 24 70 38 0 0

Формирование зерна

10

370 230

30 (2 40 85 50 60 55 30 80

320 310 320 245 315 320 270 314 260

235 210 260 85 245 240 215 220 60

Молочная спелость

88 41 И7 67 220 75 89 74 40 205

67 62 54 60 0 85 80 55 70 0

54 59 58 сз 0 65 90 СО. 37 0

Молочно-воскова я спелость

3,5 13 15 16 20 11 15

6,0 0 0 0 0 0 10

10

16

19

21

20

33

Восковая спелость

20

Зрелое зерно

32

32

31

6 10

15

37

7 9

19

42

0 -9

, 47

11

5

14

53

Эффекторы: 1 — вода, 2 — шістени, 3 — П-ХМБ; 4 — ЭДТЛ, 5 — Н20,

пах созревания в функциональных частях колоса и в. верхнем листе при различных условиях питания обнаружены не только различия в уровне активности, но и имеются различия в качественном составе ферментов. Максимальной активностью обладали протеолитнческие ферменты в фазу формирования зерна. Наибольшую активность в эту фазу имели нейтральные н щелочные протеазы. В дальнейшем возрастала роль кислых иротеолнтическнх ферментов.

В фазы восковой и полной спелости в зерне отсутствовали щелочные протеазы. Нейтральные протеазы в фазу восковой и полной спелости зерна у растений, выращенных без удобрении, активировались цистеином, у удобренных растений эти ферменты в фазу восковой спелости ннгнбировалнсь цистеином, а в зрелом зерне отсутствовали.

В результате разделения белков на сефадексе в-МО было установлено, что в фазу формирования зерна в водорастворимых белках зерна растений неудобренного варианта содержалось больше высокомолекулярных белков, , элюпруемых в объеме 20—40 мл, и меньше иизкомолекулярных белков, а также белков, имеющих сродство к фазе геля. В фазу молочно-восковой спелости количество высокомолекулярных белков в зерне снижалось, однако в зерне растеннй удобренного варианта содержание этих белков было ниже,, чем в зерне растеннй, выращенных без удобрений.

В фазе формирования зерна у растеннй первого варианта были обнаружены 4 протеазы, обладавшие активностью без применения эффекторов, 5 ферментов, активируемых цистеином, 5 протеаз, активируемых парахлормеркурнбензоатом (п—ХМБ) и 3 — перекисью водорода, У растеннй второго (удобренного) варианта были выявлены 3 протеазы, обладав-' шне' активностью при отсутствии ыффекторов, 6 — активируемых цистеином, 4 — п—ХМБ и 2 фермента, активируемых 1 перекисью водорода. В фазу молочно-восковой спелости в зерне растений первого варианта обнаружено 5 ферментов, обладавших активностью без эффекторов и по 4 фермента, активируемых соответственно цистеином, п—ХМБ и перекисью водорода. В зерне растений второго варианта были обнаружены 3 протеазы, обладавшие активностью без применения эффекторов, но 3 фермента, активируемых цистеином и п—ХМБ, а-одна ферментная фракция активировалась Ні02.

У растеннй первого варианта в фазе формирования зерна были идентифицированы 5 кислых аминопеитидаз, а у растений второго варианта только две. В зерне растеннй первого (без удобрений) варианта были обнаружены 5 нейтральных амниопептидаэ, а у растений второго варианта — 4, причем выделенные ферментные фракции различались по молекулярным массам.

Следует отметить, что некоторые ферментные фракции, обладая амино- или эндопентндазной активностью, не обнаруживали прогеазной активности с казенном. С другой стороны, отдельные выделенные ферментные фракции обладали как нентидазной, так н общей протеазной активностью.

В фазу молочио-восковой спелости в зерне растеннй первого варианта преобладали кислые амннопептидазы и практически не обнаруживались нейтральные, а в зерне растений второго варианта, наоборот, преобладали нейтральные амино-иептндазы.

Для изучения свойств протеолнтическнх ферментов нами проводилось также разделение водорастворимых белков эндосперма на ДЭЛЭ-целлюлозе

При разделении на ДЭЛЭ-целлюлозе в условиях опыта ступенчато изменялась не только ионная сила элюирующего раствора, но и его кислотность, поэтому все пробы, элюнруе-мые каждым отделышм элюентом, для изучения свойств ферментов были сгруппированы в две фракции — пик выхода белков и окончание пика.

Таблица 4

Белки фракций в процентах от их суммы

Э.иоирующнй раствор

Варианты 0,00!>М буфер 0.05М N301 1 0,1М ХаС1 | 0,2М МаС1 0,4 М ИаО 1% МаОН

Без удобрений 23,0 21,0 13.7 30,1 9,3 6.2 8,0 •1,7 4,1 3,1 39.9 31,9

Результаты показали, что в зрелом зерне обоих вариантов содержалось примерно одинаковое количество белков, не сорбируемых на ДЭЛЭ-целлюлозе. Наибольшие различия отмечались во фракции, элюнруемой 0,05 М МаС1 (рН 7,20). В эндосперме зерна растеннй первого варианта активность протеза без эффекторов обнаружена в о—6 н 9—10 фракциях, в то время как в эндосперме растеннй удобренного варианта только в 1 фракции.

При использовании в качестве эффектора цистеииа обнаружена активность ферментов в 1—1 фракциях. Кромеэтого.в зерне 1 варианта цистенном активировались ферменты 6-й и 9-й фракций (табл. Г>). При использовании в качестве эффектора п-ХМБ активностью в зерне растений первого варианта обладали белки 1 н 9 фракций, в зерне растеннй второго варианта фракций 1, 4, 5 и 11. ЭДТЛ активировались ферменты 2-й фракции растений первого и 1-й фракции второго варлан-8

0911 Без удобрений 0,01

и Р к "100 60 60

0,5

1,0-

I 2

рОСГК!

12 12 корешм эндосперм

I 2

ромкя

I 2 коретш

I 2

эндосперм

Ряс.1* Относительная электрофоретическая подьихлосг* кислых «мшопептждаз 3-сугоаншс проростков.

Вржмечаме: I - контроль (инфильтрация воды)« 2 - ифильтрадяя ингибиторе.

та. Перекисью водорода активировались ферменты 4 фракции растений неудобренного варианта, а в зерне растений второго варианта — 1 и 2 фракций.

Т а б л н ц а 5

Активность протеолктическкх ферментов в зрелом зерне пшеницы после разделения ферментных белков на ДЭАЭ-целлюлозе

Фракции

с. о 5 1 2 1 3 | 4 6 7 8 9 10 И

-е- 0.006 м. буфер 0,05 М | МаС( 0.1 М !ЧаС1 0.2 № МаС1 0.4 М МаС1 1% ЫаОН

Бе з удо< 5рениЙ

Вода 0 о 0 0 95 270 0 0 191 3220 0

Цисте ин 44 514 32 282 0 1580 0 0 303 0 21

п-ХМВ 29 0 0 0 0 0 0 0 109 0 0

здтл О 281 О 0 0 0 0 0 0 0 0

Н^О» 0 0 О 302 0 0 * 0 0 0 0 0

• ^юоРб сКм

Вода 73 0 0 0 0 О 0 0 0 0 0

Ц» степи 106 66 43 70 0 0 0 0 0 0 о

п-ХМБ 318 О 0 800 5Й6 0 0 0 0 0 1Г>5

ЭДТЛ 63 0 0 0 0 о 0 0 0 0 зг>

ПгОг 05 38 0 0 0 0 0 О 0 0 47

Примечание: 1—11 номера сгруппированных фракций.

При прорашлвашш зерна, полученного без внесения удобрений (вариант 1) на воде и растворе хлорамфеиикола, установлено, что ингибитор белкового синтеза практически не снижал массу ростков и корешков. У варианта, иы ращенного с внесением удобрений, наблюдзлось достоверное снижение массы корешков при проращивании на хлорамфеннколс. Содержание белкового азота в расчете на 1000 проростков при проращивании на растворе с хлорамфениколом снижалось в ростках и корешках первого варианта (без удобрении) и в ростках второго варианта на 11—12%, а в корешках проростков второго варианта на 41.% {табл. 6). При проращивании на растворе хлорамфеиикола снижалось содержание небелкового азота в ростках и корешках. Это снижение было более значительное в ростках проростков первого варианта н корешках второго варианта.

Ростки, корешки и эндосперм проростков второго варианта, выращенного с применением удобрений, имели Солее низкую

активность амино- и эндопептидаз,- чем проростки пз семян, выращенных в варианте без удобрений. '

* ' Активность кислых амннопеитндаз (рН 3,5) в ростках и корешках была значительно ниже, чем активность нейтральных амннопеитндаз (рН 6,0). В зерне' активность кислых амино-пептндаз более чем в 3 раза превышала активность нейтральных ферментов (табл.-б)т Корешки -характеризовались более высокой эндопентндазной активностью, чем ростки и эндосперм. . . , .

При переносе растений на 1 час 'на фильтры,"смоченные ■ хлорамфениколом; активность амино:и эндопептндаз не изменялась или несколько возрастала. После прорашнванпя па ингибиторе в течение 20 час. активность ферментоа по сравнению с действием ингибитора в течение 1 часа заметно снижалась.

В эндосперме 3-суточных проростков п 2—2,3 раза возра-

, ' ' Т а б л л ц а 6

Активность лротеолитнческкх ферментов в проростках

. озимой пшеницы 1 ■ , „*

Ростки Корешки* Эндосперм

Условия ЛИЛ БЛА ЛНЛ БЛЛ ЛНЛ БЛЛ

проращивай ия РН 3.5 . / рн I 6,0 рн 6,0 . р II 3.5,, ри 6,0 . 6,0 рН 3,5 РІІ 6,0 Рн 6,0

Без удобреніїІІ ' *

"л В С 25,5 28,3 19,9 35,2 26,8 19,0 18,9 17,9 32,0 39,5 34.9 41,8 65,1 29,0 53,3 '68,6 18,3 45,4 56,8 40,6 13,6 17,6 12,1 34,3' 54.0 27.1

' МіроРМКСІ

л в с 16,5 29,3 24,7 27,7 66.0 37,5 11,2 35,3 12,8 26,9 43,5 30,9 29.0 60,7 35.1 26,9 53.6 13,3 34,3 39,3 35,3 10,6 12,5 10,0 14.3 11.4 5,3

Примечание: ЛНЛ — активность аминопептндаз с субстратов I, — лей-ццл — р — нафтндамидоч; БАЛ — активность эндопептндаз с субстратом N — и — Сензоил — Ь — аргининами дом; Л — 72 часа проращивания на воде; В — 71 час прорашивання на воде + I час на 0,05% хлорзмфени-коле; С — 52 часа проращивания на воде + 20 часов на 0,03% хлорамфе» ннколе. ,

стало количество белков, не сорбируемых на ДЭЛЭ-целлюло-зе. После разделения' водорастворимых . белков эндосперма проростков на ДЭАЭ-целлюлозе были изучены активность и свойства протеолнтнческнх ферментов в присутствии различных эффекторов {цистенн п-ХМБ, ЫгОг,. ЭДТА). Было установлено, что. различия,, обусловленные, условиями минера ль-

ного питания, возрастали при проращивании семян на 0,05% хлорамфениколе.

Для изучения скорости включения пС-глицнна в белки проводили инфильтрацию меченой аминокислоты (20 мкг/мл с удельной активностью 50000 расп./мин. мкг) в целые проростки. При проращивании на воде скорость включения "С-глн-

цнна в белки была примерно одинаковой (табл. 8).

*

Таблица 7

' Разделение водорастворимых белков зерна на ДЭАЭ-целлюлозе ' , (белки фракций в процентах от их суммы)

Условия проращивания 1 в» Щ V 8-г Й„ юи О <3 — « еч « Ь-4 М -■-и V* я

еГщ е=2 о2 о2

Без удобрений

72 .часа проращивания на воде . 52 часа на. воде + 20 часов на хлорамфениколе...... 56,4' 56,6 10,0 11,3 5,9 6,5 6,3 6.6 5,1 3,7 15.4 15,3

ЫиоРмКби

72 часа проращивания на воде . 52 часа на воде + 20 часов на хлорамфениколе...... 47,6 51,6 12.1 10,0 7,8 7.3 7,6 8.2 6,3 4,9 18.6 18,0

Таблица 8

Включение н С-глицина в белки проростков озимой пшеницы (удельная радиоактивность расп./мин.)

.Условия опыта Семена выращены без удобрений Семена выращены с впесенпеч М|ИРбвКи>

ростки корешки эндосперм росткн корешки эндосперм

72 часа лрорашивания на воде , ...... Инфильтрация хлорамфеникола ..... 52 часа на воде 4- 20 часов на хлорамфениколе 97 ±9 225— 11 22±14 655—31 78+±34 399 ±26 100+9 56±10 49 ±13 90±10 220±21 77=17 74] ±33 460±22 12о± 18 87 ±9 101±21 91 ± 17

При коротких экспозициях с ингибитором (после его инфильтрации) наблюдалось увеличение скорости включения мС-глицина в белки ростков и корешков проростков семян, выращенных в варианте без удобрений и в белки ростков удобренного варианта. После 20-часового проращивания семян на растворе хлорамфеникола скорость включения меченого глицина в белки ростков, корешков и эндосперма проро-

стков неудобренного варианта!)! в белки корешков второго варианта снижалась, а.скорость поступления глицина в ростки и эндосперм проростков второго варианта не изменялась.

Наши данные об увеличении включения нС-глицина в белки проростков при инфильтрации хлорамфеиикола совпадают с данными Илюшенко и Тимашева (1978), наблюдавшими уве. личеиие скорости включения 3Н-лейцина в белки цитоплазмы корней гороха, при коротких Экспозициях на хлорамфениколе, а также с данными Авериной,с соавторами (1977) об увеличении активности ферментов,' при- коротких экспозициях на

хлорамфениколе. ......

.. С,целью более детального изучения белкового комплекса проростков мы проводили разделение водорастворимых белков на сефадексе С—100, а также методом электрофореза в полиакрнламидном геле.

В результате определения амииопептидазпой активности при рН 3,5 было установлено, что эти ферменты разделяются

Та блица 9

Пептида зная активность водорастворимых * белков " 3-ёу точных проростков пшеницы после разделения на сефадексе 6-100

.Активность аминонептидаз Активность мдонептидаз

(рН 3,5): ' (рН 6,0)

Уе (мл)

инфильтрация ии фильтрация

контроль ' хлорам фенн- контроль хлор а м фен и-

холэ 1 кола

■ 8 0 О ■ - 0 ' ' 2300

10 О 0 . 0 . 0

12 10000 170 0 830

14 1000 • • 2100 . 730 2100

16 1400 500 2600 1000

18 1000 , 0 1300 0

20 О 0 .. 1700 0

22 0 0 5900 0

24 0 0 550 3200

26 0 0 1000 1000

28 0 0 ' 0 О

30 0 О 4000- • • ■ 8100

32 0 0 750 0

34 0 0 0 0

36 417 1000 420 1о0№

38 590 • 120 590 380

40 2900 5000 5700 25ТО0

42 0 2300 .0 10000

44 0 0 , ЮООО' . 3000

46 0 0 о 2500

48 0 0 0 0

50 0 0. ... • 0 0

Примечание. Проростки выращены из семян,, полученных в варианте без удобрений.

на сефадексе в виде двух пиков, ¿люггруюшнхся в объемах (Уе) 12—18 мл и 36—42 мл. Эндоиентидазы (рН 6,0) разделялись гель-фильтрацией на четыре фракции, которые элюи-ровалнсь в объемах 14—26 мл, 30—32 мл, 36—40 и 44 мл.

. После инфильтрации хлорамфеннкола в составе пептидаэ-ного комплекса ростков произошли определенные количественные и качественные изменения. Значительно снизилась активность аминопептидаз 1 фракции (Уе= 12—18 мл), в то же время амннопептидазная активность 2 фракции (Уе=36—' 40 мл) заметно возросла.

После проращивания семян на воде электрофорезом в ПАГ в ростках было идентифицировано 2—3 электрофоретическнх компонента кислых аминопептидаз, в корнях — 3 компонента и в эндосперме от 3 до 6. Хлорамфеникол заметно изменял, изоферментный состав кислых аминопептидаз, что, вероятно, было вызвано ингибпрованнем синтеза как отдельных ферментов, так и некоторых белковых ингибиторов данных протеаз (Нилов и др., 1971; Фурсов, І975),

Для определения интенсивности включения "С-глнцина в отдельные электрофоретнческне белковые зоны была выполнена разрезка гелей и их озолеГтние в Окснмате (Интертехник). Результаты этой работы представлены в табл. 10. '

Было установлено, что под действием хлорамфеннкола нн-гнбировался синтез белков 9 и 13 электрофоретическнх зон, однако инициировалось включение меченого углерода в белковые компоненты 2 и 3 зон (табл. 10).

Таблица 10

Включение мС-глнцика в водорастворимые белки З-суточиых ростков пшеницы (семена выращены в варианте без удобрений)

„Ча зон

Относительная эле ктроф еретическая подвижность

Удельная радиоактивность, рзсп/мнн.

инфильтрация воды

ішфндьтрашія хлорамфеннкола

1

2

3

4—7 8 9 10

11

12 13

0,00-0,03 0,03-0.06 0,06-0,09 0,09-0.52 0,52-0,58 0.58-0,61 0,61-0,65 0,65—0,76 0,76-0,87 0,87—1,00

0 О 0 0

72*13 , 128 ±11 272:9 0

31 ±9 17±13

0

31*10 57*10 0

78*12 10±9 30±9 0

27* 12 0

По сравнению с контролем при инфильтрации хлорамфеннкола были обнаружены две дополнительные белковые зоны, обладавшие аминопептидазной активностью (с ОЭП 0,05 и 0,63). Судя по скорости включения метки, снитез амннонептн-

дазиогб компонента с ОЭП-0,05, по-внднмомуг инициировался под-действием хлорамфеникола* • ' * ■. . "Таким образом показано/что хлорамфеникол по-разному-изменял скорость включения нС-гли1Шна в проростки, выра* щениые из зерна удобренного и неудобренного вариантов, Протеолнтические ферменты- проростков различны у изученных вариантов как по составу,- так-и по свойствам. Электрофорезом в ПАГ показано,- что хлорамфеникол не влиял на включение "С-глицина в белки с ОЭП 0,52—0,58; 0,61—0,65 и 0,76—0,87, уменьшал- включение глниина в белки с ОЭП' 0,58—0,61 н способствовал включению меченой аминокислоты в белки ростков с ОЭП 0,03—0,09.

. - Выводы.

1. Применение удобрений в дозе ЫюоРеоКбо вызывало повышение урожая зерна озимой пшеницы, от 26 до 38 ц/га и увеличение содержания в зерне общего н белкового азота. Повышение содержания белков и зерне сопровождалось увеличением в суммарных белках количества глутаминовой и аспараги? новой кислот, лейцина н тирозина и уменьшением содержания лизина, аргинина, треонина, аланина и метионина.

2. На ранних фазах созревания зерна в функциональных частях колоса и верхнем листе при различных условиях питания растений обнаружены не только-различия в уровне про-теазной активности, но и. состава протеолитическнх ферментов. Наибольшую активность протеолнтические ферменты имели в фазу формирования зерна, затем от фазы формирования зерна до молочной спелости наблюдалось снижение активности нейтральных и щелочных протеаз и повышение активности кислых иротеолитнческих ферментов, после "наступления фазы- молочной спелости отмечалось снижение активности всех протеаз. * * ' ■ ■

' 3.'Разделение'протеолитнческих' ферментов на сефадексе в-ЮО с использованием сродства части'белков к фазе геля позволило изучить качественный состав протеаз и их свойства без повторной рехроматографии. В результате такого разделения белков были получены ферментные фракции высокой степени очистки (500—2500 раз). ' '

4, С помощью разработанного нами устройства для препаративного электрофореза с непосредственным элюированием разделяемых компонентов проводилось разделение до 800 мг белка на колонках диаметром до 9 см. Были выделены фракции, обладавшие ферментативной активностью и изучены их свойства. , ' ' ".**'.

5. При исследовании протеолитнческих ферментов проростков пшеницы * установлено, что активность аминопептидаз в

ростка'х И; корешках была наиболее высокой при рН 6,0,-а й эндосперме — при рН 3,5. Активность всех-протеаз была выше в проростках семян, выращенных на неудобренном фоне. С использованием ингибитора белкового синтеза хлорамфе-иикола были выявлены заметные различия в амнно- и эндопен-тидазной активности как между отдельными органами проростков, так и между проростками семян, выращенных при различных условиях питания растений.

6. При проращивании семян на0,05%-ном растворехлорам-феникола было обнаружено, что ингибитор белкового синтеза оказывал заметное влияние на скорость снижения массы эндосперма и абсолютное содержание белкового и небелкового азота в ростках и корешках. Содержание белкового азота наиболее значительно снижалось в корешках из проростков семян, полученных в варианте с внесением удобрений, а содержание небелкового азота — в ростках из проростков семян, выращенных на неудобренном фоне.

7. Инфильтрация нС-глицина в проростки пшеницы позволила установить скорость включения этой аминокислоты в белки различных органов. Отмечена высокая интенсивность включения меченой аминокислоты в белки эндосперма, где идут интенсивные, процессы распада запасных веществ. Инфильтрация хлорамфеникола снижала скорость включения иС-глнцина в белки эндосперма проростков неудобренного и в корешки проростков удобренного вариантов. 20-часовое проращивание на 0,05% хлорамфениколе не изменило скорости включения нС-глицнна в белки ростков и эндосперма проростков удобренного варианта и снижало наиболее интенсивно включение меченой аминокислоты в белки ростков первого (без удобрений) и корешки проростков второго вариантов.

8. Изучение белково-протеазпого комплекса проростков пшеницы с использованием изотопной методики, ионообменной хроматографии и гельфнльтрацни показало, что семена, выращенные при различных условиях питания растений, различаются по активности протеолитических ферментов и их качественному составу,

9. В зрелом зерне удобренного варианта' отмечена более высокая активность протеолитических ферментов, что несколько снижает его посевные качества. Проростки, выращенные из семян удобренного варианта, имели более низкую активность протеолитических ферментов и меньшую скорость мобилизации запасных белков эндосперма при прорастании.

10. При внесении удобрений обнаружены заметные различия в составе и активности протеолитических ферментов уже на ранних фазах созревания зерна. Эти различия в значительной степени сохраняются в зрелом зерне. Проращивание семян, выращенных без удобрений и на удобренном фоне, пока-

зало,' что" удобрения оказывают влияние не только на формирование протеазного комплекса созревающего зерна, но и обладают последействием, определяя уровень протеазнок активности в процессе прорастания семян.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Волжин В. Л., Плешков А. С., Аистова Л. В. Устройство для препаративного электрофореза. «Известия ТСХА», вып. 4, 1974, стр. 102—107.

2. Плешков А. С., Плешков Б. П., Варнцев Ю. А. Кузнецова Н. Е. Разделение протеолитических ферментов зерна озимой пшеницы на сефадексе G-100. «Известия ТСХА», вып. 1, 1976, стр. 184—188.

3. Плешков А. С., Новиков Н. Н., Давидова Е. Г., Полосина Т. В., Шкарин Б. И, Состав протеолитических ферментов и скорость синтеза белка в проростках пшеницы. «Известия ТСХА», вып. I. 1980, стр. 97—105.

4. Плешков А. С. Активность и свойства протеолитических ферментов озимой пшеницы при разных условиях питания. «Известия ТСХА», вып. 3, 1980, стр. 103—111.

. 5. Волжин В. Л., Плешков Б. П., Плешков Д. С. Устройство для препаративного электрофореза. Авторское свидетельство № 544898, 1977. .

Л 73-128 13/У—82 г. Объем 1 п. л. Заказ 108*. Тираж 100

1ипография Московской с.-х. академии км. К. Л. Тимирязева 127^50, Москва Ц-И50, Тимирязевская ул., 44