Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние света красной и зеленой областей спектра на морфогенез изолированных апикальных меристем LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние света красной и зеленой областей спектра на морфогенез изолированных апикальных меристем LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи УДК 577. 342:581.143

КОШЕЛЬ Лариса Алексеевна

ВЛИЯНИЕ СВЕТА КРАСНОЙ И ЗЕЛЕНОЙ ОБЛАСТЕЙ СПЕКТРА НА МОРФОГЕНЕЗ ИЗОЛИРОВАННЫХ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL.

(специальность 03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -

! 99Я

Работа выполнена в отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАК

Научный руководитель

член-корреспондент РАН, академик РААН, доктор биологических наук, профессор Р. Г. Бутенко

Официальные оппоненты

доктор биологических наук И. А. Шульгин

кандидат биологических наук К П. Аксенова

Ведущая организация

Ж

- Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

рига диссертации состоится " ¿¿¿¿Ы^3 г. часов на заседании Специализированного совета

по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (К 002. 45.01) при Институте физиологии растений РАН по адресу: 127276, Москва И-276, ул. Ботаническая, .35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институ-. та физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан "

1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

JL И. Сергеева

Актуальность проблемы. ' Культивируемые органы, ткани и клетки растений: служат модельными системами при изучении процессов роста и морфогенеза высших растений. Культура апикальных меристем имеет значительное преимущество перед культурами тканей других типов, так как изолированная меристема способна формировать полноценное растение без влияния уже сформированных органов, что позволяет изучать регуляцию процессов морфогенеза с помощью внешних факторов. Как показано было в работах последних десятилетий, одним из самых существенных экологических факторов, определяющих рост и развитие растений, является свет. Применение методов культуры тканей, обеспечивающих присутствие в питательной .среде углеводов дает возможность выделить морфогенетическую функцию света, действующего на ткани апикальной меристемы.

Возможность получать растения-регенеранты томатов, генетически идентичные исходным сортам и линиям, ценным в селекционном отношении, а так же возможность в строго контролируемых условиях регулировать морфогенез растений, являются . важной предпосылкой для применения метода культуры изолированных апикальных меристем в селекции этой важной овощной культуры.

Цель и задачи исследования. Перед нами стояло две разноплановые цели. 1) первая - изучить возможность клонального микроразмножения в культуре изолированных меристем мутантной и гибридной линий томата для получения в больших количествах посадочного материала. 2) провести исследование влияния спектрального состава света на рост и морфогенез in vitro изолированных апикальных меристем томата. Для их достижения необходимо было решить ряд задач: _ '

- разработать метод клонального размножения мутантной и гибридной линий томата;

- изучить эффекты импульсного красного света (КС) на процессы морфогенеза в культуре меристем;

- определить влияние продолжительного зеленого света (ЗС) на рост и развитие побегов в культуре изолированных меристем;

- выяснить ход процессов 'морфогенеза при совместной

действии КС и ЗС;

- выявить различия в реакции ткани апикальной меристемы томата на действующий свет на разных этапах развития.

. Научная новизна и практическая значимость работы. Изучено влияние красного и зеленого света, в разной степени оказывающих морфогенетическое действие на процессы роста и морфогенеза в культуре изолированных апикальных меристем томата. Получены принципиально новые факты о влиянии КС и ЗС, действующих по отдельности, и при их взаимодействии, на развитие различных структур растительного организма.

Модифицированный способ клонального микроразмножения ценных селекционных (мутантных и гибридных) линий томатов позволяет сократить время получения посадочного материала за счет более быстрого формирования растений-регенерантов. Возможность получения селекционного материала в течение всего года на ограниченных производственных площадях представляет определенную практическую ценность. Изучение морфогенетичес-ких потенций культивируемых апикальных меристем томата при разных условиях освещения предоставляет возможность регулирования светом процессов их роста и развития в ходе клонального микроразмножзния.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзной конференции "Молодые ученые - для интенсификации сельского хозяйства" (Омск, ■ 1989), на 2 Всесоюзном съезде ВОФР (Минск, 1990), на V Международном молодежном симпозиуме "Регуляция метаболизма растений" (Варна, 1990), на II, IV, и VI зимних школах МГУ "Биология растительной клетки" (Пувдно, 1985, 1990, 1992), на ежегодных семинарах отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР АН СССР. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа страниц, ЗК рисунков, (Ч таблиц) состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов работы, изложение результатов экспериментов и их обсуздение, заключения, выводов, списка литературы (23Ь наименования, из лих зарубежных авторов).

- 5 - .

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика объектов исследования.

В работе использовали томаты Lycopersicon esculentum Mill, сорта Московский осенний, гибрида линии 29/85, селекционной линии Мутант-3 (все получены в лаборатории селекции пасленовых культур ВНИИССОК).

В экспериментах сорт "Московский осенний" использовали в качестве стандарта. Линия Мутант-3 характеризуется стерильностью типа Stamenless. Данная линия включена нами в эксперимент для оценки эффективности клонального микроразмножения ценного в селекционной практике генотипа томата. Для гетерозисной линии Гибрид 29/85 нам так же представлялось важным определить потенциальные возможности генотипа для размножения методом микроклонирования.

Применение техники in vitro для клонального микрораэм-нозкения томата.

Семена томата стерилизовали 1 мин 70Z этиловым спиртом и 7 мин 10£-ным раствором перекиси водорода, проращивали в-чашках Петри при различных условиях освещения: в темноте и на белом свету (БС) в факторостатной камере (температура ' 25-1 С, влажность воздуха 70%, освещенность 4000 люкс люминесцентными лампами БС-80, фотопериод 16 часов). Из 14-15 дневных проростков в ламинар-боксе с помощью стерильных инъ-* екционных игл и микроскальпелей под бинокулярной лупой MECIO вычленяли меристемы размером 300-400 мкм с 2 примордиями.

Экспланты помешали в чашки•Петри на искусственные питательные среды; модифицированные на основе среды Мурасиге и Скута (макро- и микро соли по Ш (Murashige, Skoog, 1962), витамины по Гамборгу (Gamborg,1968), миоинозитол 100 мг/л, сахароза 30 г/л, бакто-агар "Feгак" 6 г/л). В качестве регуляторов роста в среду добавляли кинетин (Кин) (0,5 мг/л -0,75 мг/л) и гибберелловую кислоту (ГК) (0 - 1,0 мг/л) фирмы "Serva". Изолированные стеблевые меристемы томата выращивали в камере фитотрона ИФР на БС при указанных условиях, но при освещенности 7000 люкс.

Полученные из меристем побеги в возрасте 17-21 дня пересаживали на среды для ризогенеза: а)безгормональные, б)со-

держащие Кин, в)Кин в сочетании с б-бензиламинопурином (ВАЛ). Через 2-3 недели культивирования меристем на средах для стеблевого морфогенеза и ризогенеза учитывали изменения в куль-. туре, оценивая высоту основного побега, число листьев на побеге и их форму, начало и интенсивность корнеобразования, каллусообразование, окраску листьев и стеблей (визуально).

Клональнсе микроразмножение томата достигалось двумя путями: черенкованием побегов, сформировавшихся на среде для морфогенеза, и индукцией образования адвентивных почек в ткани апикальной меристемы на цитокининсодержащих средах.

Шлученные растения-регенеранты высаживали в легкую почвенную смесь на 3-4 дня, после чего адаптированные растения переносили в открытый грунт.

Эксперименты по импульсному и продолжительному освещению культур апикальных меристем.

Чашки с семенами для контрольных вариантов находились в факторостатной камере при освещении БС. Чашки с опытными вариантами помещали в камеру с ЗС или инкубировали в темноте. Освещение семян при прорастании ЗС 'достигалось, помещением чашек с семенами в фотостат, находящийся в стандартных фак-торостатных условиях (зеленый фильтр с максимумом пропускания 520 нм, освещенность 75 люкс).

Из 1-3-15 дневных проростков вычленяли меристемы: при освещении БС - контрольные варианты и ЗС низкой интенсивности - опытные варианты. Экспланты помещали на агаризованную питательную среду, дополненную регуляторами роста в концентрациях, определенных нами как оптимальные для морфогенеза побегов из меристем при освещении БС в нормальных условиях.

Контрольные чашки помещали в факторостатную камеру на БС в стандартные условия, где они находились в течение всего времени опыта. Изолированные меристемы опытных вариантов делили на две части и инкубировали либо в темноте, либо в камере с ЗС в течение 30 дней. Для импульсного освещения КС меристем, инкубируемых в темноте или па ЗС, были' выбраны следующие режимы: 1) 5 мин в течение (х) 18 дней; 2) 30 мин х 3 дня; 3) 5 мин ДКС х 10 дней; 4) (5 мин КС + 5 мин ДКС) х 10 дней.

Монохроматический свет для импульсной обработки эксп-лантов получали с помощью интерференционных светофильтров (КС - мах 662 нь*, ДКС - мах 727 нм, ширина полос пропускания 12 нм). Источником света служил проектор типа ДМ-4M. Уровень освещенности КС и ДКС составлял 50 и 5 люкс соответственно.

Для определения времени приобретения изолированными апексами компетентности к действию морфогенетически активного красного света, освещение культур начинали сразу после вычленения меристем из проростков, а также после 1, 2, 3 недель прединкубации в камере с ЗС или в темноте, при этом эк-спланты каждого из возрастов подвергали воздействию света при всех указанных режимах. Кроме того, часть культур находилась в течение всего времени опыта в темноте, часть - на ЗС без дополнительного освещения. В каждом варианте обрабатывали по 2-3 чашки в среднем по 10 эксплантов в каждой.

Образовавшиеся на среде для стеблевого морфогенеза побеги пересаживали на среду для ризогенеза. Побеги контрольного варианта после пересадки продолжали расти на БС. Побеги каж-. дого из опытных вариантов делили на 2 части и переносили на БС в те же условия, что и контрольные растения, или в камеру с ЗС. Время культивирования на ризогенной среде составляло во всех случаях .30 дней, после чего учитывали изменения в морфологии побегов ( те же, что и при оценке роста эксплан-- тов на средах для побегообразования).

Приготовление образцов и проведение сканирующей электронной микроскопии С СЭМ)'.

Образцы (апикальные меристемы, развивающиеся на морфо-генных средах, апексы побегов, кусочки каллусной ткани и пр.) промывали в стерильной воде,,фиксировали в'25-% глута-ровом альдегиде на фосфатном буфере Миллонинга 4-6 дней (в зависимости от объема ткани). После фиксации ткань обезвоживали растворами этанола в возрастающей концентрации до абсолютного, затем - ацетоном ( Уилки, 1968) . Обезвоженную ткань замещали СО в закуумной установке. Напыленные золотом образцы фотографировали на приставке к электронному микроскопу с увеличением 200-1000.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.Клональное микроразмкожекие томатов в культуре апикальных меристем.

• вотирование побегов из изолированных апикальных меристем томата на средах для стеблевого моногенеза.

■ Семена томатов трех генотипов проращивали в течение 14 дней при различных режимах освещения (темнота (Т), БС, ЗС, разное сочетание темноты и БС). Для всех линий отмечено, что состояние проростков, асизнеспособность изолированных меристем и признаки морфогенеза в культуре in vitro заметно изменялись в зависимости от светового режима инкубации прорастающих семян. Влияние режима освещения семян 'проявлялось заметнее на средах для морфогенеза с неблагоприятным соотношением регуляторов роста На средах с концентрациями кинетина и гиббереллина, близкими к оптимальным, эффект режима предварительного освещения семян на рост изолированных меристем был сглаженным.

Изолированные из проростков апикальные меристемы после помещения на питательную среду быстро развивались в побеги. Культивирование in vitro стеблевых меристем сорта Московский осенний и линии Мутант-3 возможно на модифицированной ■ среде МС с добавлением одного кинетина или в сочетании с гибберел-лином. В первом случае наблюдали разнообразие форм органогенеза (побегообразование, корнеобразование, каллусогенез).

Добавление экзогенного ГК в среду приводило к ограничениям в реализации морфогенетических программ, способствуя образованию нормальных побегов. Удовлетворительные результаты были получены на среде с концентрациями кинетина 0,75 мг/л и ГК 0,2 мг/л (Табл. 1). Концентрация ГК, равная концентрации Кин или превышающая ее, являлась репрессирующей для развития очередных примордиев, вытягивания стебля, кор-необразования.

В наших экспериментах все попытки включить ауксин (ИУК) в среды культивирования не оказывали положительного' эффекта. Очевидно, содержание эндогенного ауксина у томатов, используемых в работе, достаточно высоко, применяемый стимулятор

роста создает гиперконцентрацию ауксина в ткани.

Табл.1. Рост апикальных меристем томата линии Мутант-3 на средах для стеблевого морфогенеза (освещение прорастающих семян б дней Т + 8 дней БС).

Концентрации Жизнеспо- Образова- Длина Число Число Кор-

регуляторов собность нормаль- стеб- листьев дней необ-

роста в сре- меристем ных побе- ля,см /длина на разо-

де, мг/л % гов,% меддоуз- сре- вание

лий, см де X •

0.75 Кин + 0,2 ГК 89,7 74 0,9 5,8/0,15 14 0

76,2 83,8 1.2 7,0/0,17 22 12,5

0,6 Кин + 0,4 ГК 88 71 0,4 2,2/ 0.18 20 0

79 53 0.4 2,2/0,18 20 0

0.75 Кин + 0,4 ГК 89 57 0,5 2,5/0,20 17 0

97 80 0.7 3,2/0,22 19 0

100 100 •0,5 . 2,5/0,20 19 0

84 69 0,5 3,4/0,15 20 0

0,75 Кин + 0,5 ГК 100 93 0,8 2,3/0,35 19 0

83 77 0,5 2,0/0,35 19 0

93 83 0,5 2,5/0,20 19 0

Меристемы гибридной линии,хорошо вводились в культуру in vitro, приживались на средах с одним кинетином (0,6 мг/л) или Кин (0,75 мг/л) + ГК (0,4 мг/л) к развивались в нормальные побеги без отклонений от нормы.

При образовании побегов из изолированных меристем томата в культуре in vitro можно было наблюдать большое разнообразие форм листовых пластинок, которое определялось влиянием экзогенных фитогормонов, при этом побеги, развивающиеся из изолированных меристем разных генотипов, характеризовались

разной реакцией развивающихся примордиев на содержание в питательной среде Кин и ГК.

Размножение растений в культуре in vitro.

• При ткрочеренювании полученные из стеблей растений-регенерантов черенки помещали на питательные среды, содержащие половинную норму минеральных солей по МО, витамины по Гамборгу, миоинозитол 50 мг/л, агар 5 г/л, Кин в низких концентрациях (0,1 мг/л, 0,3 мг/л ). Наблюдалась зависимость роста черенков от яруса, с которого они были взяты,' от содержания цитокининов в среде. Кроме того, рост пазушных почек у черенков (преимущественно, взятых с нижних ярусов) подавлялся со временем культивирования основных побегов на ци-токининсодержащих средах для корнеобразования. Расчеты ( с учетом выпадения части черенков, плохого роста пазушных почек у черенков с нижних ярусов растений и т. п.) показывают, что при использовании изолированных меристем мутантной линии в качестве исходного материала для клонального микроразмножения от одного зкспланта за 2 месяца можно получить от 100 до 130 растений, но возможности субкультивирования этим не ограничиваются.

Б наших опытах полностью сформированные растения-реге-неранты, полученные на средах со всеми сочетаниями фитогор-монов, демонстрировали сильное апикальное доминирование, что подтверждает предположение о высоком уровне эндогенного ауксина у изолированных апикальных меристем. Разница в окраске листьев, длине стебля у побегов, развивающихся на черенках, взятых с разных ярусов растения-регенеранта, свидетельствует о значительном градиенте в ткани последнего концентрации ци-токинина и ауксина

При культивировании изолированных апикальных меристем томата на питательных средах южно было наблюдать образование дополнительных побегов в ткани меристематического эксп-данта без пролиферации каллуса.

Гипертрофированный рост и еаложение нескольких адвентивных почек (от 3 до 15) в латеральной и инициальной зонах меристемы наблюдалось на средах для стеблевого морфогенеза, содержащих 0,5 мг/л Кин или 0,75 мг/л Кин + 0.4 мг/л ГК (до

- и -

6,5%). Чаще подобные образования появлялись после пересадки сформировавшихся из изолированных меристем побегов на среды, обогащенные цитокининами (0,75 мг/л Кин + 0,2 иг/л БАП, 0,6 мг/л Кин +0,2 мг/л БАП) (до 28 %). Побеги с гипертрофированными меристемами не развивали корней на ризогенной среде, даже после пересадки на среду с индолйлмасляной кислотой корни не инициировались к развитию.

Пересаживая сегменты гипертрофированной меристематичес-кой ткани с адвентивными почками на среду, обогащенную цито-. кининами, можно было поддерживать формирование множественных инициалей в течение нескольких пассажей, хотя после 4-5 пересадок активность инициации почек снижалась. На среде со сбалансированными концентрациями цитокининов адвентивные почки развивались в одиночные нормальные побеги. .

Мы предполагаем, что гипертрофированные меристемы появляются на высокоцитокининовых средах в том случае, если побеги на эти среды пересаживаются достаточно рано (в возрасте 12-14 дней, когда уровни эндогенных фитогормонов еще претерпевают изменения в ходе перестройки программ морфогенеза), и явление это связано с недостаточным синтезом определенных форм ауксинов на первых этапах культивирования.' Изменение в тканях экспланта соотношения цитокинин/ауксин в пользу первого вызывает видимые нарушения развития: интенсивное деле-« ние клеток в инициальной и образование адвентивных почек в латеральной зонах меристемы, остановку роста стебля, отсутствие способности к укйренению.

Развитие побегов на средах для укоренения.

Образовавшиеся на средах для стеблевого морфогенеза или полученные в культуре меристем адвентивные побеГи пересаживали на среду для укоренения (среды мМБ, сахароза 20 г/л, агар 5 г/л) без регуляторов роста либо с добавлением кинети-на одного или в сочетании с БАП

Побеги, развившиеся из меристем всех трех изучаемых генотипов, не укоренялись на всех вариантах сред с преобладанием концентрации БАП над Кин, медленно образовывали корни на средах с соотношением Кин/БАП - 3. Лучшей для получения полностью сформированных регенерантов томата мутантного и

гибридного генотипов была среда с содержанием 0,5 мг/л Кин + 0,2 мг/л БАБ, а для сорта Московский осенний - 0,4 мг/л Кин +0,2 мг/л БАЕ Укоренение начиналось на 6-9 день, полное и дружное укоренение зависело от исходной среды для органогенеза, на которой выращивали меристематические экспланты (лучшее корнеобразование наблюдалось у побегов, выращенных на средах для стеблевого морфогенеза с оптимальным сочетанием регуляторов роста, в противном случае рост побегов на ри-зогенных средах был замедленным, укоренение не было полным). При инкубировании побегов на среде без регуляторов роста и на среде с добавлением 0,5 мг/л Кин происходило раннее укоренение (начало ризогенеза на 6 день при высоте побегов 0,5 см), но полного укоренения всех побегов не наблюдалось (до 90%).

Табл.2. Процессы корнеобразования на цитокининсодержащих средах в культуре побегов линии Мутант-3, выращенных на среде (0,75 мг/л Кин + 0,4 мг/л ГК).

Состав среды, Корнеобра- Высота уко- - Начало кор-

мг/л зование, реняющихся необразова-

% побегов, см ния, дни

без фитогормонов 85,7 2,2 6

83,3 1,0 11 .

0,4 Кин + 0,5 БАП 0 - -

0,75 Кин + 0,8 БАП 40 0,5 21

0,5 Кин + 0,2 БАП 91,0 2,0 6

100 2,0 11

• 0,6 Кин + 0,2 БАП 28,6 1,0 12

0.3 Кин + 0,1 БАП 41,2 1,1 18

0,5 Кин 87,5 1,5 6 '

66,6 ■ 1,8 11

Полученные в культуре in vitro растения-регенеранты томатов были переданы в лабораторию селекции пасленовых культур ВНИКССОК и высажены в опытные теплицы. Растения развива-

лись с теми же темпами (Московский осенний) или быстрее, чем контрольные растения, высаженные в грунт рассадой (Гибрид 29/85, Мутант-3). Все генетические формы томатов зацветали и давали плоды (у Мутанта-3 - по 2-3 мелких плода на кисть).

II. Влияние спектрального состава света на рост и развитие апикальных меристем томата в культуре in vitro.

Опираясь на полученные в ходе разработки способа кло-нального микроразмножения результаты, мы перешли к изучению культуры апикальных меристем in vitro как системы, отвечающей разнообразными ростовыми реакциями на воздействие светом разного спектрального состава (а именно, красного, который считается морфогенетически активным, и зеленого, которому исследователи не приписывают выраженного морфогенетического эффекта). Мы сравнивали влияние импульсного КС как действующего освещения и ЗС в качестве фонового продолжительного освещения (параллельно с темнотой), так как морфогенетический эффект кратковременного ЗС несравнимо меньше действия КС. о

Инкубация изолированных чернотеи в темноте и аффекты импульсного освеедгние КС и ¿КС.

Изолированные меристемы томатов при инкубации на всех гормонсодержаших питательных средах в темноте не были способны к продолжительному росту и формировали только вытянутые стеблеподобные образования, примордии апекса не развивались. Продолжительность роста зависела от качества света, действующего на развивающиеся из семян проростки.

Освещение культур изолированных меристем в темноте импульсным КС вызывало вытягивание стеблевой части, черешков листьев (без развития листовой пластинки), образование кор^ !ней у части побегов. Побеги были полностью этиолированными. 'Степень развития структур зависела от вспраста культур, при котором начинали освещение (сразу после вычленения, через 1 или 2 недели культивировании в_ темноте) и от числа импульсов действующего света (освещение по 5 мин 18 дней или:по 30 мин 3 дня). Последнее определяло также скорость роста побегов после перенесения на ВС (Табл. 3).

Освещение меристем, находящихся в темноте по режимам 3

- Г-Г-

или 4 (см. стр. 5) не приводило к морфогенетическим изменениям в культуре, меристемные экспланты темнели и погибали.

Эффекты импульсного осветит ме рис темных эксплантов КС и ДКС на фоне ЗС.

Культивирование меристемных эксплантов на ЗС без дополнительного освещения приводило к формированию из примордиев листообразных сидячих пластинок, черешок листа и стеблевая часть побега не развивались. Рост культур был ограничен образованием таких микропобегов. Морфогенетическое действие ЗС в культурах растительных тканей отмечалось и другими авторами (Кас1кас1е, ^рэоп,- 1978).

Дальнейшее развитие апексов могло быть инициировано при освещении их импульсным КС. При этом характер и скорость роста меристем зависели от числа получаемых точками роста импульсов и от возраста апексов, при котором начинали освещение. Во всех случаях освещение КС вызывало развитие пластинки листа (простой формы - при освещении сразу после вычленения и зрелой формы - при освещении КС после прединкуба-ции на ЗС). Два изменяющиеся фактора влияли также на соотношение формы листьев и скорость развития побегов после перенесения на БС (Табл. 3).

При освещении апексов по режимам 3 или 4 (см. стр. 5) в камере с зеленым освещением рост их полностью не ингибиро-вался, как это наблюдалось для темноты. В этих случаях при-мордии развивались в вытянутые листовидные пластинки (с ровными краями - при освещении сразу после вычленения, зазубренные - при освещении после предварительной инкубации на ЗС): Развитие стеблевых меристем в условиях освещения ДКС на фоне ЗС было ограничено образованием листовидных структур с апикальным ростом, так как в дальнейшем экспланты отмирали. Различий- между освещением одним ДКС и КС + ДКС обнаружено не было.

Незначительный рост и развитие меристем при действии ЗС позволяет предположить участие пигмента, поглощающего в области 500-540 нм. Неполное подавление дальним красным светом эффекта КС на фоне ЗС свидетельствует о включении в процессы морфогенеза высокоэнергетических реакций.

- 15 -

Табл.3. Морфогенез в культуре апикальных меристем томата при освещении светом разного спектрального состава на среде для стеблевого морфогенеза.

А. Обработка в темноте.

Вариант Инкубация меристемы на среде к началу освещения

освещения 0 дней 7 дней 14 дней

5 мин КС х 18 дней

30 мин КС х 3 дня

ДКС

(КС + ДКС) ■ ■

и'

Б. Обработка на фоне ЗС.

Вариант освещения

Инкубация меристемы на среде к началу освещения О дней 7 дней 14 дней

14 дней

5 мин КС х 18 дней

30 мин КС х 3 дня

ДКС (КС + ДКС) •

В. Контроля (продолжительное освещение)

Темнота

ЗС

БС

- 16 -

Рост побегов на среде для укоренение при продолжительном оо веще mm ЗС.

Для определения влияния ЗС на сформировавшиеся из меристем побеги, их после обработки импульсным КС при выращивании на 8С или в темноте пересаживали на среду для укоренения и помещали в камеру с ЗС. В этом случае ростовые процессы сравнивали с ростом побегов, прошедших аналогичную обработку КС, но укореняемых на БС.

Побеги, полученные из меристем при разных режимах освещения, на ризогенной среде на ЗС не развивались: можно было наблюдать лишь слабое позеленение и утолщение стеблей и черешков лиетьев. У побегов, полученных из меристем, культивируемых на ЗС (в отличие от темнорастущих), влияние ЗС сказывалось в том, что уже имеющиеся на побеге листья приобретали зрелую форму.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные экспериментальным путем результаты позволили высказать ряд суждений о морфогенетических потенциях изолированных апикальных меристем томата в культуре in vitro, в частности, при освещении светом разного спектрального состава.

Показано, что разработанная модифицированная методика клонального микроразмножения томатов позволяет • получать в больших количествах растения гибридных и мутантных линий, использующихся при селекционных работах: за 1,5-2 месяца от одного исходного проростка можно получать до 100-130 растений с помощью черенкования и до 500-700 растений путем инициации образования адвентивных почек в ткани меристематичее-кого экспланта.

В ходе работы были выявлены некоторые особенности роста и развития апикальных меристем томатов в культуре in vitro:

- для развития изолированной меристемы в нормальный побег необходимо присутствие в среде культивирования гибберел-лина на первом этапе культивирования. -Увеличение концентрации экзогенного гиббереллина ингибирует развитие листовых примордиев в апексе, препятствует формированию корней у побегов, '

- цитокинины, в норме выводящие из-под апикального доминирования ' пазушные почки томата, в культуре меристем оказывают противоположное действие - при длительном культивировании на цитокининовых средах развивается глубокий покой боковых почек,

-для культур изолированных меристем характерно продленное действие компонентов сред культивирования на экспланты -концентрации регуляторов роста в среде определяют реакцию формирующегося растения на последующие среды культивирования.

Можно предположить, что изолированные из проростков апикальные меристемы томата обладают' высоким уровнем эндогенных ауксинов. Возможно, что в первые дни культивирования синтез этого стимулятора роста снижен вследствие переключения генетической программы в условиях посттравматического морфогенеза без обмена метаболитами со сформировавшимися органами растения. Нормальный гормональный баланс, характерный для интактной меристемы, по-видимому, восстанавливается чео реэ 13-15 дней инкубации на питательной среде. В этот период повышенные концентрации экзогенных цитокининов воспринимаются как стрессовый фактор,-развивающиеся на питательных средах апикальные меристемы реагируют на него интенсивным делением клеток в центральной и латеральной зонах меристемы и заложением множественных почек.

Качество света, действующего на прорастающие семена и развивающиеся иэ них побеги - источники эксплантов, так же как и продолжительность освещения, определяют характер роста изолированных меристем в культуре in vitro. * У эксплантов, полученных из ЗС-освещаемых проростков, снижена активность меристем, ограничено развитие листовых примордиев, репрессировано растяжение клеток стебля. Развити" семян в темноте или при освещении ВС без предварительной инкубации в темноте также снижает жизнеспособность изолированных из проростков меристем. '' . • .

Процессы формирования отдельных органов в культуре изолированных меристем относительно независимы и определяются действием света как красной, так и зеленой области спектра.

Характер развития апикальных меристем зависит от 3 основных факторов, изменяющихся в нашем эксперименте: 1) число импульсов физиологически активного света, получаемых апексами на первых стадиях развития; 2) фоновое освещение при импульсном воздействии активным светом; 3) возраст меристем, развивающихся после эксплантации в фоновых условиях.

В культуре изолированных меристем томата освещение КС главным образом вызывает рост стебля, черешков листьев, индукцию образования адвентивных корней de novo. Развитие систем, задействованных в фотосинтезе, инициирует ЗС, который непосредственно не вызывает морфогенетических реакций и не участвует в фотосинтетических процессах (развитие фотосинте-зирующих поверхностей, пропластид). Можно отметить отсутствие морфогенетической активности фонового освещения ЗС на более поздних этапах формирования растения по сравнению с начальным периодом развития меристем.

Нормальное развитие изолированных апексов томата в культуре in vitro возможно при одновременном влиянии света красной и зеленой области спектра на точки роста. Для КС-индуцированных процессов органогенеза необходимо действие мор-фогенетически активного света в течение определенного критического времени (15-16 дней), кроме того, свет должен действовать на меристемы, находящиеся в состоянии восприимчивости к действующему свету. Возможно, что существует связь между временем восстановления нормального гормонального баланса в тканях меристемы на первых этапах культивирования и приобретением компетенции к действующему свету в течение первых 2 недель культивирования на питательных средах.

~ Обращение эффекта КС светом дальней красной области в реакциях морфогенеза в культурах изолированных меристем, растущих в темноте, свидетельствует об участии в них фитох-ромной системы регуляции. Зависимость степени проявления морфогенетического ответа от числа импульсов КС, • а также различие действия ДКС в темноте и на фоне ЗС дает возможность говорить о том, что мы наблюдаем высокоэнергетические реакции. Модификация КС-индуцированных реакций морфогенеза сзетом средних длин волн и незначительный морфогенетический

эффект ЗС подразумевают поглощение 30 пигментом-рецептором, но природа его остается неясной.

ВЫВОДЫ

1. Растения-регенеранты гибридных и мутантных линий томата, сохраняющие признаки исходных растений, можно успешно получать в культуре изолированных апикальных меристем на питательных средах, дополненных стимуляторами роста.

2. Клональное размножение томатов в культуре in vitro помимо черенкования может достигаться путем инициации образования адвентивных почек в ткани апикальной меристемы на цитокининсодержащих средах.

3. Гормональный статус изолированных меристем томата может значительно изменяться в ходе.их развития, круциальные изменения гормонального баланса происходят, по-видимому, в первые дни культивирования на питательных средах.

4. На жизнеспособность изолированных апикальных меристем томата и характер их развития в культуре in vitro влияют следующие факторы: качество света, действующего на прорастающие семена и развивающиеся из них проростки, число импульсов физиологически активного КС, получаемых эксплантом на первых стадиях развития, возраст изолированной меристемы, обрабатываемой КС, фоновое освещение во время действия КС.

5. .Процессы формирования отдельных органов в культуре изолированных меристем относительно независимы. КС обеспечивает развитие механических структур, ЗС принимает участие в формировании листовой пластинки, зеленых пигментов. Нормальное развитие растения возможно при одновремённом действии света красной и зеленой области спектра на апексй.

6. Морфогенетический эффект ЗС сильнее проявляется на первых стадиях развития изолированных метстем (начало формирования побега)'по сравнению с остальными этапами онтогенеза растения.

?'. Компетентность к физиологически активному КС в культуре апикальных меристем томата развиьается в течение первой недоли культивирования in vitro и сохраняется не более 3 недель.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Коппель Л А. , Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение томата (Lycopersicon esculentum Mill.) в культуре in vitro. Тез. докл. Всесоюз. конф. "Молодые ученые для интенсификации сельского хозяйства", Омск, 1989, стр. 25.

2. Коппель JL А. Влияние света разного качества на морфогенез в культуре апикальных меристем томата. Тез. докл. IV Всесоюзной конф. мол. ученых по физиологии раст. клетки. Минск, 1990, стр. 89.

3. Корре 11 L. The effect of light quality on morphogenesis in culture of tomato apical meristems. Proceeding of the Vllth International Congress on Plant Tissue and Cell Culture, Amsterdam, 1990, p. 235.

4. Koppell LA. The effect of light quality on morphogenesis in culture of tomato apical meristems. Proceeding of the Vth International Youth Symposium on Plant Metabolism Regulation, Varna, Bulgaria, 1990, p. 306-309.

5. Koppell L. A., Butenko R. Q. Different quality light affects the morphogenesis of tomato shoot apical meristems in tissue culture. Abstracts of World Congrees on Cell and Tissue Culture. Anaheim, California, 1991.

6. Коппель JL A. , Бугенко P. Г.. Клональное микроразмножение мутантной линии томата с низким выходом семян. Доклады ВАСХНИЛ, 1991, 10, стр. 9-12.

7. Коппель Л. А. , Бутенко Р. Г. Развитие • апикальных меристем томата в условиях воздействия светом разного спектрального состава. Физиология растений, 1992, т. 39, в. 2, стр. .

Подписано в печать 26.U3.S2. Заказ 557 "Тираж 100 Формат 60x84/16

Москва. Типография РАС1Н