Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние стрессорных факторов на содержание нейроспецифических белков в мозге крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние стрессорных факторов на содержание нейроспецифических белков в мозге крыс"

V//' 1 О МАР 1397

КИЇВСЬКИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

На правах рукопису

ГУБКІНА Олена Анатоліївна

Вплив стресорішх факторів на вміст нейроспецнфічішх білків у мозку щурів

03.00.13. - фізіологія людини та тварин, 03.00.04. - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації «а здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1997

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі біофізики та біохімії Дніпропетровського державного університету

Наукові керівники:

доктор біологічних наук, професор В. О. Березін

кандидат біологічних наук, доцент Є. О. Лепьохін

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор

Неруш П. О.

Офіційні опоненти.

Провідна установа:

1. Доктор біологічних наук Масюк А. І.

2. Доктор біологічних наук Федоров О. М.

Інститут фізіології

ім. О. О. Богомольця НАН України

Захист дисертації відбудеться “ р. о 14.°°

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.01.10 при Київському університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 252022, м. Київ, пр. Глушкова, 2, НДІ фізіології Київського університету імені Тараса Шевченка, кімн. 503.

Відгуки на автореферат дисертації надсилати за адресою: 252022, м. Київ, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського університету імені Тараса Шевченка за адресою: 252033, Київ-33, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 73уСЖ?0%Ч997року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Гушинець Г. П.

кандидат біологічних наук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В межах сучасної теорії стресу будь які фактори, які загрожують гомеостазу організму, розглядаються як стресори, а сукупність процесів, які ініціюються стресорами в організмі, визначають як стрес (Johnson Е. О., 1992). В комплексі факторів стресорного впливу на організм людини особливе місце займають хронічні низькодозові радіаційні дії, які стали невід’ємним компонентом довкілля в багатьох регіонах внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, а також емоційно напружені ситуації, які набувають хронічного характеру внаслідок глобальних соціально-економічних перетворень в СНД.

Ситуація, що склалася, значною мірою вимагає дослідження механізмів дії малих доз іонізуючого випромінювання та емоційного стресу на організм, а також пошуку засобів ефективного захисту від вищезгаданих факторів (Кекелидзе 3. И., 1996; Коган Б. М., 1996; Горбань Є. М., 1996; Кудяшева А. Г., 1996; Гончаренко Е. Н., 1996).

На наш погляд, особливий інтерес становить дослідження' дії стресорів на організм, який розвивається, оскільки погроза гомеостазу на певних, так званих, “критичних” етапах онтогенезу, значною мірою змінює компенсаторні можливості дорослої особини (Науменко Е. В., 1990). Одним з прикладів такого роду ефектів є дія підвищеної концентрації фенілаланіну на мозок, що розвивається.

Центральною ланкою регуляції гомеостазу є центральна нервова система (ЦНС). Її реакція на згадані вище стресорні дії супроводжується зміною збудливості окремих утворень мозку (Неруш П. А., 1991; Liang С. L., 1992), обміну медіаторів в різних ділянках мозку (Gorman A. L., 1993; Hommes F. А., 1991; Masuda М., 1993), модифікацією спорідненості або зміною кількості рецепторів до неиротрансмітерів (Hommes F. А., 1991; Лнпшиц P. X., 1989; Тайц М. 10., 1992), змінами на рівні поведінки (Неруш П. А., 1991; Lou Н. С., 1985). Будь який з визначених вище феноменів може супроводжуватись кількісними змінами нейроспецнфічних білків, зокрема молекули адгезії пер-иоиих клітин (МАНК), оскільки для неї вказана участь в регуляції активності ферментів медіаторного обміну (Acheson А., 1988), виникненні тимчасової лотепціації (Luthl А., 1994), фор-

муванні умовних рефлексів (Cremer Н., 1994; Doyle Е., 1992). Важливо відзначити, що функціональні зрушення в ЦНС відбуваються не лише внаслідок міжнейронадьних взаємодій. Функціональна активність нейронів в більшості випадків визначається їхньою взаємодією з гліальними клітинами, зокрема з астроцитами (Ройтбак А. И., 1993). Участь останніх у різного роду фізіологічних та патологічних процесах в ЦНС пов’язана з реорганізацією проміжних філаментів цих клітин, що супроводжується кількісними змінами нейрослецнфічного білка, який утворює ці філаменти - гліального фібрилярного кислого білка (ГФКБ) (Eddleston М., 1994; Liu W., 1994). Стан МАНК-залежної міжклітинної адгезії та проміжні філаменти астроглії при стресах різного генезу практично не досліджені.

За нашим припущенням зміни в системі МАНК-залежної міжклітинної адгезії та реорганізація проміжних філаментів астроглії є ланками в низці реакцій центральної нервової системи на різні за природою та механізмом дії на організм стрссори. Ми припускаємо також, їмо у мозку тварин, в різному ступені стійких до стресу, закономірності зміни вмісту МАНК та ГФКБ повинні різнитися, якщо не якісно, то, до певної міри, кількісно.

В плані модифікації ефектів іонізуючої радіації певний інтерес становить електромагнітне випромінювання надзвичайно високочастотного діапазону (ЕМВ НВЧ). У деяких випадках ЕМВ НВЧ сприяє дотриманню або відновленню гомеостазу організму, зокрема знижує пошкоджуючу дію іонізуючого випромінювання (Беляев И. Я., 1989; Девятков Н. Д., 1983). В тон же час вплив довготривалого опромінення в цьому діапазоні на нервову систему, як центральну ланку регуляції гомеостазу, практично не досліджений. Тому оцінка дії ЕМВ НВЧ на нервову систему є надзвичайно актуальною.

Емоційний стан організму може бути значною мірою модифікований різними фармакологічними засобами. До останніх належить нейролептик рисперидон, який успішно застосовується для усунення різних исихотичних станів (Keck P. Е., 1995; Lom-broso P. J., 1995).

Мста роботи - оцінити впливи низькодозового рентгенівського випромінювання, емоційно напруженої ситуації та підвищеної концентрації фенілаланіну у крові на кількісні зміни ней-

роспецифічних білків, а саме ГФКБ і МАНК, а також оцінити можливості корекції викликаних стресором змін за допомогою нейролептичного засобу рисперидону та ЕМВ НВЧ.

Для досягнення цісї мети необхідно було вирішити такі завдання:

1) виділити та очистити неироспецифічні білки ГФКБ та МАНК з можу людини та тура;

2) отримати моиоспешіфічну антисироватку до ГФКБ для імунохімічного визначення нього білка в екстрактах тканини мозку;

3) вивчити вплив рентгенівського випромінювання у малих дозах та ЕМВ НВЧ на вміст ГФКБ у мозочку, середньому і довгастому мозку щурів;

4) дослідити особливості зміни вмісту ГФКБ та МАНК у смугастому тілі, гіпокампі і середньому мозку щурів з високою та низькою руховою активністю у “відкритому полі” при емоційному стресі та дії рисперидону;

5) вивчити динаміку' вмісту ГФКБ та МАНК під час пост-натаїьного розвитку мозку щурів за умов експериментальної гі-перфенілаланінемії.

Основні положення, які виносяться на захист.

1. Доведена придатність поліклональної антисироватки до ГФКБ, отриманої в результаті імунізації кролів препаратом очищеного білка, для використання в імунохімічннх методах аналізу.

2. Встановлена схожість ефектів ЕМВ НВЧ та рентгенівського випромінювання у малих дозах на обмін проміжніх філа-ментів астроглії при роздільному опроміненні та антагонізм дії цих видів випромінювання при їх послідовній дії ЕМВ НВЧ -рентген.

3. Показана залежність ефектів емоційного стресу і нейролептика рисперидона на вміст ГФКБ і МАНК у смугастому тілі, гіпокампі і середньому мозку щурів від рухової активності цих тварин у “відкритому полі”.

4. Встановлено порушення експресії ГФКБ та МАНК під час постнататьного розвитку мозочка щурів в умовах експериментальної гіперфенілаланінемії.

З

Наукова новизна та практичне значення роботи.

1. Вперше показано, шо зміни в системі МАНК-залежної міжклітинної адгезії та реорганізація проміжних філаментів аст-роглії є компонентами реакції організму на дію стресорів різної природи.

2. Вперше продемонстрована подібність ефектів низькоін-тенсивного ЕМВ НВЧ та низькоінтенсивного рентгенівського випромінювання на метаболізм білка проміжних філаментів аст-роглії ГФКБ.

3. Встановлено модифікуючий вплив ЕМВ НВЧ на ефекти низькодозового рентгенівського випромінювання.

4. Вперше показано, шо ефект емоційного стресу і рисле-

ридону на вміст нейроспецифічних білків ГФКБ та МАНК у смугастому тілі, середньому мозку і гіпокампі щурів залежить від їх рухової активності у “відкритому полі”. .

5. Вперше встановлено, шо підвищення концентрації фенілаланіну на ранніх етапах постнатального розвитку приводить до зміни постнатальної динаміки ГФКБ та МАНК в мозочку щурів.

Практичне значення роботи.

1. Одержана антисироватка до ГФКБ може бути використана у кліниці для імунохімічної діагностики захворювань ЦНС;

2. Дані відносно впливу ЕМВ НВЧ та рентгенівського випромінювання на проміжні філаменти астроцитів та глюкозу сироватки крові можуть бути використані при розробці комплексних заходів щодо захисту населення від хронічних радіаційних, впливів, а також мають буї и враховані при плануванні роботи з джерелами ЕМВ НВЧ на радіаційно забруднених територіях.

3. Вивчення впливу емоційного стресу та психотропного засобу рисперидону на ГФКБ та МАНК у мозкові було проведено у відповідності з угодою на дослідження з підрозділом Janssen research Foundation фірми Janssen Farmaceutica NV (Бельгія).

Апробація роботи. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на: підсумкових наукових конференціях ДДУ (1993-1995), 1-му Міжнародному з’їзді “Гормони, мозок і нейропсихофармакологія” (Родос, 1993), спеціальній конференції ФЕБС з біологічних мембран (Хельсінки, 1994), 15-

ft конференції Міжнародного нейрохімічного товариства (Кіото, 1995), 2-му з’їзді радіобіологів України (Дніпропетровськ, 1995).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 наукових праць.

Об’єм та структура роботи. Дисертація викладена на 124 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, трьох розділів (огляд літератури, методики, результати дослідження та їх обговорення), узагальнення та висновків. Список літератури вмішує 249 назв російською, українською та іноземною мовами. Дисертація ілюстрована 12 таблицями і 19 малюнками.

Всі результати, які представлено і обговорено, отримані автором безпосередньо.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Досліди проводили на турах лінії Вістар масою 170-200 г, а також статево незрілих щурах тієї ж лінії віком 5, 14, 22, 28 і 35 днів після народження.

Рентгенівське опромінення здійснювали на установці РУМ -17 за умов: напруга 150кВ, сила струму 6мА, фільтр А1 3.0 мм, опромінюване поле 20*20 (см2). Тварин опромінювали протягом 8 діб по 0.774 мКл/кг при потужності дози 0.64 *!(И мА/кг. Сумарна доза складала 6.192 мКл/кг (24Р).

Джерелом ЕМВ НВЧ був стандартний генератор сигналів Г-141, який працював у режимі частоти, що коливається, (діапазон 38-53 ГГц), середня щільність потоку потужності - 70 Вт/м2 . Опромінення ЕМВ НВЧ проводили локально і починали за 15 діб до рентгенівського опромінення. У наступні 8 діб здійснювали комбіноване опромінення у послідовності ЕМВ НВЧ-рентген.

Емоційно-стресовий стан (ЕСС) формували згідно з моделлю Ведяєва (Ведяев Ф. П., 1983). Для оцінки інтегративної діяльності ЦНС використовували тест “відкритого поля” (Воронина Т. А., 1982) та методику вироблення умовної реакції пасивного уникнення (УРПУ) (Bures J., 1963) •

Моделювання гіперфенілаланінемії проводилося згідно Matsuo К. (Matsuo К., 1988).

Нейролептик рисперидон був наданий фірмою Janssen Research Foundation (Бельгія). Ін’єкції рисперидону починали на фоні емоційно-стресового стану, що сформувався, і здійснювали

протягом 14 діб у дозі 0.4мг/кг маси тіла. Дозу було обрано таким чином, щоб блокувати серотонінергічні рецептори другого типу (5НТ2) та практично не зачіпати дофамінергічні рецептори (D2) (Schotte Н., 1989)

Антисироватку до ГФКБ одержували шляхом імунізації кролів препаратом очищеного згідно з методикою (Недзвецкиіі В. С, 1986) ГФКБ з мозку людини (аутопсіймии матеріал жертв нещасних випадків через 8-12 годин після загибелі). Використовували схему імунізації, яка є модифікацією методу Харбоу та Інгільд (Аксельсен Н., 1977).Специфічність одержаної сироватки тестували методами перехресного імунослектрофорезу (Березин В. А., 1987) та імуноблотингу (Stott D. J., 1989).

Для кількісного визначення ГФКБ і МАНК спочатку проводили послідовну екстракцію тканини мозку буферами такого складу: розчинна форма ГФКБ - буфер А (25 мМ трис-НСІ, pH 7.4, 1 мМ етілендіамінтетраацетат (ЕДТА), 2 мМ 2-меркаптоетанол, 0.2 мМ фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ); МАНК - буфер А, який вміщує 2% Тритон Х-100; фі-ламентна форма ГФКБ - буфер А, який вмішує 4М сечовину. ГФКБ та МАНК у одержаних екстрактах визначали методами ракетно-лінейного імуноелектрофорезу (Березин В. А., 1987) та імуноферментного аналізу (Ibsen S., 1983)

Для кількісного визначення ГФКБ використовували антисироватку, одержану як було вказано вище. МАНК визначали за допомогою моноспецифічної антисироватки, охарактеризованої раніше (Krivko 1. М., 1993).

Вміст загального білка в екстрактах мозку щурів проводили за методом Bredford М. (Bredford М., 1976). Концентрацію глюкози в сироватці крові визначали глюкозооксидазним методом (Trinder P., 1969) з використанням діагностичних наборів фірми “Kohe" (Фінляндія).

Оцінку статистичної вірогідності даних проводили на основі U-критерію (Вілкоксона-Манна-Уітні) (Гублер Е. В., 1973), а також t-критерію (Колодяжний В. 1., 1980).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Характеристика антисироватка до гліального фібрилярпого кислого білка Антисиропатку до ГФКБ тестували методом перехресного імуноелектрофорезу та імуноблотінгу. При застосуванні перехресного імуноелектрофорезу антисироватка, яка тестується, дає один преципітат при використанні в якості антигену як екстракту мозку людини, так і екстракту мозку щура, одержаних внаслідок екстракції тканини мозку буфером, що містить 4М сечовину. На блотограмі ця антисироватка інтенсивно фарбує поліпептид, який за молекулярною масою відповідає недеградо-ваному ГФКБ.

Таким чином, одержана антисироватка високо специфічна до ГФКБ і може бути застосована в імунохімічних методах аналізу.

Вплив стресорчих факторів па ГФКБ та МАНК у мозку.

Перш ніж перейти до викладення результатів дослідження впливу різних стресорів на ГФКБ та МАНК у мозку, ми вважаємо за необхідне зупинитися на нашому підході до оцінки отриманих даних. Відомо, шо стресори значно впливають на обмін білків у мозку (Палладин А. В., 1973) та модифікують властивості біомембран (Барабой В. А., 1982). Останнє позначається на екстрагуванні мембранних білків (МАНК) та асоційованих з мембранами цитоскелетних сруктур (ГФКБ). А тому в тих випадках, коли в екстрактах тканини мозку тварин, які підлягали дії стресогенних чинників, змінювалась концентрація загального білка, оцінка змінн вмісту індивідуального білка проводилась у мкг/мл відповідного екстракту. Якщо кількість загального білка була на рівні контрольних величин, оцінювали зміну питомої концентрації досліджуваного білка (мкг індивідуального білка/мг загального білка). Останнє дозволяє згладити флуктуації концентрації індивідуального білка, які виникають через складність відтворення процедури еМе^зкціі від зразка до зразка. .

б міст шаііШвМ іїНІкії § ткаїпгггі мозку значно зростає впродовж постна-№іЬН(Ш (йЯйИїку. Щоб ліквідувати артефакти, пов’язані із змінам НШсіу нШІЇМШх Ш ГФКБ та МАНК білків у

процесі онтогенезу, ми аналізували паралельно зміни питомої концентрації (мкг/мг загального білка) них білків із змінами їх концентрації (мкг/мл).

Положення рівноваги біосинтез ГФКБ ^ деградація ГФКБ оцінювали на основі визначення змін вмісту розчинної та філа-ментної форм цього білка у відповідних екстрактах.

ГФКБ у мозку щурів при опроміненні ЕМВ НВЧ та рентгенівському опроміненні

Вміст ГФКБ досліджували у відділах мозку, які відповідальні за рівень збудливості ЦНС, а також беруть участь у регуляції вегетативних функцій організму: середньому і довгастому мозку та мозочку.

Для оцінки стресогенності ЕМВ НВЧ та рентгенівського випромінювання ми визначали концентрацію глюкози у сироватці крові. Збільшення концентрації глюкози було відзначено тільки при рентгенівському опроміненні. .

Фракціоноване опромінення ЕМВ НВЧ впродовж 23 діб (38-53 ГГц) знижує питому концентрацію розчинної форми а ГФКБ у всіх досліджених відділах мозху і не впливає на вміст філаментної форми. В умовах фракціонованого рентгенівського опромінення (сумарна доза 27Р) у мозочку знижується вміст філаментної форми ГФКБ, а в довгастому мозку - обох форм цього білка (рис. 1).

Таким чином, обидва фактори зсувають рівновагу біосинтез ГФКБ £ деградація ГФКБ в бік останньої. Але рентгенівське випромінювання в порівнянні з ЕМВ НВЧ викликає більш значні зміни метаболізму ГФКБ у мозочку і особливо в довга-, стому мозку, який бере участь у регуляції вмісту глюкози в крові. При цьому за умов рентгенівського опромінення кількісні зміни ГФКБ супроводжуються зростанням концентрації глюкози в сироватці крові, в той час як за умов дії ЕМВ НВЧ такий зв’язок відсутній.

При комбінованому опроміненні ЕМЧ НВЧ+рентген має місце збільшення вмісту філаментної форми ГФКБ не тільки по відношенню до його вмісту при рентгенівському опроміненні, але й по відношенню до контролю.

Рис. 1 Питома концентрація ГФКБ (М±ш; Ч“4) у різних відділах

мозку іцурів при опроміненні ЕМВ НВЧ та рентгенівському опроміненні: а) розчинна форма ГФКБ, б) філдметка форма ГФКБ;

М - мозочок, Д - довгастий мозок. С - середній мозок;

1-коіпроль. 2-ЕМВ НВЧ, 3-ЕМВ НВЧ+рентгенівське випромінеїшя, 4-рснтгснівське вшіромінєння; * - вірогідно відрізняється від 1 (р<0.05)

+ - вірогідно відрізняється від 4 (р<0.05)

Визнано, що збільшення вмісту ГФКБ у мозку свідчить про активацію астроцитів у відповідь на різного роду пошкодження (Chiu F. С„ 1985; Hatten М., 1991; Chiang С. S., 1993; Eddleston М., 1994). Остання, в багатьох випадках, сприяє компенсації дії пошкоджуючих факторів (Eddleston М., 1994). Оскільки при комбінованому опроміненні вміст глюкози у сироватці крові не змінюється, ми вважаємо, що зростання концентрації ГФКБ є наслідком деяких функціональних зрушень, які були ініційовані в ЦНС опроміненням ЕМВ НВЧ.

Таким чином, опромінення ЕМВ НВЧ, яке передує рентгенівському опроміненню, модифікує ефекти останньго на проміжні філаменти астроглії та вміст глюкози у сироватці крові; спостерігається антагонізм дії цих сидів випромінювання.

Взагалі наведені нами дані свідчать, що реорганізація проміжних філамєнтів астроглії є часткою відповіді мозку на ЕМВ НВЧ, рентгенівське випромінювання та комбінацію цих видів випромінювання.

Кількісні зміни ГФКБ та МАНК у різних відділах можу щурів при емоційному стресі та дії рисперидопу

Основну увагу в цій частині роботи було прнділено аналізу вітливу емоційного стресу та нейрсшептика рисперидопу на вміст ГФКБ та МАНК в мозку щурів, які відрізняються руховою активністю у “відкритому полі”. Вміст МАНК і ГФКБ досліджували в відділах мозку, які беруть участь у регуляції цілеспрямованих рухів (смугасте тіло і середній мозок) та емоційного стану тварин (гіпокамп).

Тестування орієнтовно-дослідницької діяльності щурів у “відкритому полі” дозволило виділити два протилежних типи тварин. Щури з високою рухливою активністю були названі тваринами активної поведінки (АП), протилежний тип - тваринами пасивної поведінки (ПП). Критерієм формування невротичного стану служили прискорене згасання умовної реакції пасивного уникнення та пригнічення орієнтовно-дослідницької діяльності.

Необхідно підкреслити, що згідно одержаних даних порушення орієнтовно-дослідницької діяльності сильніше проявляється у щурів АП у порівнянні з тваринами ПП, що свідчить про різну реактивність в умовах ЕСС.

Вміст ГФКБ і МАНК у середньому мозку, смугастому тілі і гіпокампі шурів з АП не відрізняється значно від такого в відповідних відділах мозку тварин з ПП . J

Концентрація філаментного ГФКБ в умовах ЕСС змінюється у середньому мозку щурів ПП. (знижена) та гіпокампі тварин АП (підвищена) (рис. 2). Перше, очевидно, є наслідком зміщення рівноваги біосинтез ГФКБ Ф деградація ГФКБ в бік деградації. Крім аналізу філаментних властивостей ГФКБ (Mallock D. А., 1987; Paetau А., 1986), це припущення зроблене на одержаних раніше іншими дослідниками даних про збільшення кількості низькомолекулярних дериватів ГФКБ за умов емоційного стресу (Недзвецкий В. С., 1991; Ушакова Г. А., ОМІ).

Збільшення вмісту ГФКБ в гіпокампі шурій АІ1 Hftii fcCC свідчить про наявність пошкоджень в ULb’ilj НЩЬІІ мозку (Hatten М., 1991; Eddleston М., 1994). ЖШ ШШі Дані узгоджуються з опублікованими ранійіе ia'/IWvfW tifto наявність дегенеративних змії* у нейронах шюкашіу іїри емоційному стресі

^арокку Я. М., 1987; Ііпо Н., 1989) Важливо відзначити, що зміни вмісту ГФКБ у гіпокампі, котрий бере участь в регуляції емоційного стану тварини, спостерігалися лише у більш чутливих ло емоційного стресу щурів АП і не спостерігалися у тварин ПП.

При дії рисперидону концентрація ГФКБ підвищувалась в гіпокампі щурів як АП, так і ПП (рис. 2). Однак, у тварин ПП цей ефект проявляється сильніше.

Рисперидон, уведений на фоні ЕСС, модифікує ефекти + о *

1 500 -(

8. с 400 -

0 * 300 -

0

№ 200 -

І 100 -

е

0

а)

.Оті

123 4 С

12 3 4 Г

р 500 -і

& Є- 400 -

X

2 300 -

§

200 -

їв 100 -

Є

І— 0 —

б)

+

**

ІЛ

12 3 4 С

12 3 4 Г

Рис. 2.Вміст ГФКБ у середньому мозку (С) і гіпокампі (Г)

щурів за умов емоційного стресу (ЕСС) та дії рисперидону а) шури активної поведінки, б) щури пасивної поведінки,

1-контроль, 2-ЕСС, 3-ЕСС+рисперндон, 4-рисперндон ■ ‘-вірогідно відрізняється від 1 (р<0.05)

' . +-вірогідно відрізняється від 2 (р<0.05)

а-вірогідно відрізняється від 4 (р<0.05)

останнього на метаболізм ГФКБ у середньому мозку щурів ПП: концентрація філаментного ГФКБ збільшується і досягає контрольних величин (рис. 2). Таким чином, у середньому мозку тварин з ПП препарат сприяє відновленню порушеного стресом балансу між біосинтезом та деградацією ГФКБ.

У гіпокампі щурів АП спостерігається синергічна дія стресу та рисперидону. У щурів ПП цей ефект не відмічено (рис. 2).

Вміст МАНК в умовах емоційного стресу зростає в смугастому тілі щурів АП (рис. 3). У тварин цього типу ЕСС викликає також значне зниження рухової активності у “відкритому полі”. У щурів ПП не відзначено пригнічення рухової активності за

МАНК, % до ко

умов стресу, не виявлено також змін вмісту МАНК у смугастому тілі.

Таким чином, збільшення вмісту МАНК у смугастому тілі є нейрохімічним відображенням зниження рухової активності за умов емоційного стресу.

Введення рисперидону щурам, які не підлягали дії емоційного стресу, приводить до підвищення вмісту МАНК у смугастому тілі тільки щурів ПП.'У тварин АП зміни вмісту МАНК у цьому відділі мозку відсутні. Враховуючи відомі дані (Асіієбоп А. М аі., 1988), що одним із механізмів регуляції біосинтезу медіаторів є концентрація МАНК на контактуючих поверхнях, ми припускаємо, що збільшення концентрації МАНК у смугастому тілі щурів ПП є компенсаторною реакцією, яка спрямована на відновлення порушеної рмспервдоном-базової активності серо-тонінергічних терміналей. Не виключено, що збільшення концентрації МАНК у смугастому тілі щурів з АП при емоційному

Рис. З Вміст МАНК у смугастому

тілі (СТ) та средньому мозку (С) щурів активної поведінки при емоційному стресі (ЕСС) та дії рисперидону:

1-контроль, 2-ЕСС, 3-ЕСС+рисперидон 4-рисперидон;

•-вірогідно відрізняється від 1 (р<0.05) +-віроіідно відрізняється від 2 (р<0.05) о -вірогідно відрізняється від 4 (р<0.05)

стресі також є наслідком зміни активності певних провідних шляхів мозку. .

В той час, як вміст МАНК у середньому мозку щурів з АП залишається на рівні контрольних величин і при ЕСС, і при введенні рисперидону нестресованим тваринам, дія препарату на фоні емоційного стресу викликає підвищення вмісту МАНК у цьому відділі мозку (рис. 3). Оскільки відомо, що кількість ссро-тонінових 5НТ2-рецепторів у середньому мозку відносно незначна (Абрамяиц И. И., 1991), ми припускаємо, що зміна вмісту МАНК у цьому відділі мозку при введенні препарату на фоні

сформованого неврозу може бути пов’язана із зміною чутливості нейронів середнього мозку до серотоніну за умов емоційного стресу (Судаков К. В., 1992).

Таким чином, одержані результати свідчать, що емоційний стрес та рисперилон впливають на вміст МАНК і ГФКБ у різних відділах мозку щурів, а вплив емоційного стресу та рисперидону на ці білки є диференційованим в залежності від рухової активності тварини у “відкритому полі”. .

Постнатальиі зміни концентрації ГФКБ та МАНК у мозку щурів за умов гіперфепілаланшемії

Вплив підвищенної концентрації фенілаланіну на постна-тальну динаміку ГФКБ і МАНК було досліджено у півкулях мозку га мозочку, у котрих за умов гіперфенілаланіиемії спостерігалися значні морфо-функціональні зміни (Huether G., 1981; Wen G. Y„ 1980; Nigam M. P., 1979; Hommes F. A., 1988).

Встановлені нами закономірності зміни вмісту ГФКБ та МАНК в ході постнатального розвитку півкуль мозку га мозочку щурів аналогічні описаним раніше іншими авторами (Jorgensen

О. S., 1981; Landry С. F., 1990; Mallock D. А., 1987). Підвищення концентрації фенілаланіну в крові щурів, починаючи з 5-го дня постнатального розвитку, впливає на вміст ГФКБ та МАНК тільки у мозочку. У цьому відділі мозку спостерігається зміна псстнатальної динаміки МАНК (рис. 4) та збільшення вмісту ГФКБ на 35-й день постнатального розвитку.

Оскільки дозрівання великих півкуль гто відношенню до мозочка відбувається в онтогенезі у більш ранньому віці, ми вважаємо, що критична фаза онтогенезу, в якій фенілаланін впливає на метаболізм ГФКБ і МАНК у півкулях мозку, завершилася або майже завершилася до початку гіперфенілаланін-емічного режиму.

Значне збільшення вмісту МАНК, яке припада? на 5-й день постнатального розвитку мозочку контрольних тварин, співпадає у часі з періодом найбільш інтенсивної міграції гранулярних клітин (Jorgensen О. S., 1981; Werz W., 1985). У мутантів reeler, які характеризуються значніш порушенням міграції клітин, МАНК в онтогенезі з’являється дещо пізніше, ніж у нормальних особин

(СскІГгаіпсІ С., 1988). Тому ми припускаємо, що зростання вмісту МАНК у мозочку при гіперфенілаланінемії проходить у більш

5 10 15 20 25 ЗО 35 40

• дні після народження

пізній час у зв’язку з порушенням міграції гранулярних клітин.

Оскільки відомо, що участь МАНК у иорфогенезі ЦНС не обмежена тільки регуляцією міграції клітин (Linneman D., 1989; Rutishauser U., 1988), не виключено, що зміна динаміки концентрації МАНК у мозочку, що розвивається за умов гіперфе-нілаланінемії, може бути пов’язана також з порушенням інших МАНК-залежних процесів. Подібні зміни в системі міжклітинної адгезії цілком можуть приводити до характерного для гіперфенілаланінемії зниження числа синапсів у дорослому мозкові (Bauman М. L., 1982; Nigam М. P., 1979).

Збільшення концентрації ГФКБ на 35-й день постнатально-го розвитку мозочку в умовах гіперфенілаланінемії, на нашу думку, відображає активацію певних популяцій астроцитів у відповідь на пошкодження хімічним агентом (O'Callagan J. P., 1988). Ми припускаємо, що активація астроглії пов’язана з деструкцією мієліну, оскільки, по-перше, демієлінізація нервових волокон е одним з типових пошкоджень мозку при гіперфенілаланінемії (Alvord Е. С., 1950; Bechar М., 1965; Crome L., 1962) і, по-друге, у мутантів jimpy, практично позбавлених мієліну, характер постнатальних змін концентрації ГФКБ подібний встановленому нами при гіперфенілаланінемії (Jacue С., 1980).

Таким чином, одержані дані свідчать, що кількіснії зміни ГФКБ і МАНК є компонентами реакції мозку, що розМШМіся, на підвищенії)! концентрації фенілаланіну. -

100 -і

Рис. 4 Постнзтальні зміни

вмісту МАНК {Мі-іп. п“4-у мозочку щурів:

1-контроль,

2-гіперфенілалаііінемія.

* - вірогідно відрізняється від коїгтроля (р<0.05)

20

висновки

1. Поліклональна антисироватка до ГФКБ, одержана п результаті імунізації кролів препаратом очищеного білка, є моно-спепифічною і придатна для використання в імунохімічннх методах аналізу.

2. Як рентгенівське випромінювана в малих дозах, так і ЕМВ НВЧ викликають зміщення рівноваги біосинтез

ГФКБ # деградація ГФКБ в бік деградації, внаслідок чого знижується концентрація розчинної і/або філаментної форми цього білка у середньому, довгастому мозку і мозочку іцурів. При цьому у довгастому мозку і мозочку рентгенівське випромінювання, у порівнянні з ЕМВ НВЧ, викликає більш значні зміни метаболізму ГФКБ.

3. Зміни метаболізму ГФКБ при комбінованому опроміненні у послідовності ЕМВ НВЧ+рентгеи мають протилежну спрямованість у порівнянні із змінами, які викликаються кожним з видів опромінення окремо, а саме відбувається посилення біосинтезу ГФКБ.

4. Емоційний стрес і нейролептик рнсперидон диференційовано в залежності під активного чи пасивного типу рухової ак-тивкісті щурів у “відкритому полі” впливають на обмін ГФКБ та МАНК у мозку.

5. Збільшення вмісту МАНКу смугастому тілі є нейрохімі-чни.м відображенням порушення рухливої активності щурів при емоційному стресі.

6. Нейролептик рисперидон при уведенні.інтактним щурам змінює вміст ГФКБ у гіпокампі тварин активної та пасивної поведінки, а також вміст МАНК у смугастому тілі останніх. Одна% цей препарат на фоні емоційного стресу регулює обмін ГФКБ у середньому мозку турів пасивної поведінки, сприяючи відновленню вихідного рівня цього білка.

7. Розвиток мозочка щурів за умоа гіперфенілаланінемії супроводжується зміною постнатальної динаміки МАНК.

Останнє може бути причиною порушення морфогенезу цього відділу мозку при гіперфенілаланінемії. На відносно пізніх етапах постнатального розвитку у цьому відділі мозку збільшується концентрація ГФКБ, можливо, внаслідок порушення процесу мієлінізації. ■

8. Зміна метаболізму ГФКБ і МАНК є однією з ланок низки регуляторних процесів, які відбуваються в ЦНС при компенсації зрушень, викликаних стресом у дорослому організмі. Однією з причин незворотніх морфо-функціональїшх змін у мозку дорослої тварини, які виникли внаслідок стресу на ранніх етапах постнатального розвитку, може бути порушення в системі МАНК -залежної міжклітинної адгезії.

СПИСОК НАУКОВИХ РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ»

1. Е. А. Губкина, А. Е. Кушнир, С. К. Березюк, В. А. По-

тапов, Е. А. Лепехин. Воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения в диапазоне крайне высоких частот на животный организм на фоне общего рентгеновского излучения в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. - 1996. -Т. 36, № 5. - С. 722 - 726. . .

2. G. A. Ushakova, Н. A. Gubkina, V. A. Kachur, Е. A. Lepekhin. Effect of Experimental Hyperphenylalaninemia on the Postnatal Rat Brain// Intern. J. Devel. Neurosci. - 1997 - V 15, № 1. -

P. 23-36.

3. G. A. Ushakova, H. A. Gubkina, V. A. Kachur, E. A. Lepekhin. Quantification of NCAM, GFAP and hyaluronate-binding activity in postnatal rat brain during experimental hyperplie-

. nylalaninemia // J. Neurochem. - 1995. - V. 65, Suppl. - S. 182.

4. Ushakova G., Gubkina H., Nerush P. NCAM levels in brain of rats subjected to stress and some drugs // 1st International Congress on Hormones, Brain and Neuropsycohpannacology: Abstr. -Rodos, 1993. - 0352.

5. Gubkina H. A., Lepekhin E. A. NCAM and GFAP quantifi-- cation in experimental rat hyperphenylalaninemia // FEBS Special

Meeting Biological Membranes : Abstr. - Helsinki, 1994. - 391.

Губкина Е. Л. Влияние стрессорных факторов на содержание псйроспецифических белков в мозге крыс.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальностям OJ.OO.I3. - физиология человека и животных, 03.00.04. - биохимия, Кнепский университет имени Тараса Шевченко, Киев, 1997.

Защищаются результаты экспериментальных исследований, изложенные и обобщенные в диссертации и 5 опубликованных научных работах. Установлено, что количественные изменения глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ) и молекулы адгезии нервных клеток (МАНК) являются звеньями в цепи реакций центральной нервной системы на различные по природе и механизму действия на организм стрессоры. Показано, что влияние эмоционального стресса на ГФКБ и МАНК в мозге крыс зависит от двигательной активности этих животных в “открытом поле”. Выдвинуто предположение, что одной из причин необратимых морфофункциональных изменений в мозге взрослых животных, возникших вследствие стресса на ранних этапах постнатального развития, может быть нарушение в системе МАНК-зависимой межклеточной адгезии.

Gubkina Н. Л.- Influence of stressors on the content of some neurospecific proteins in rat brain

Thesis to obtain the candidate of biological sciences on the specialities 03.00.1-3. -physiology of man and animals, 03.00.04. - biochemistry, Taras Shevchcnkd Kiev University, Kiev, 1997. '

■ 5 Scientific papers and the thesis are defended. Glial fibrillary acidic

protein (GFAP) and neural cell adhesion molecule (NCAM) quantitative'alterations are proved to be the links in the succession of central nervous system reactions on the stressors, differentiated by their nature and mechanism effect on the living organism. Effect of emotional stress on GFAP and NCAM in rat brain is shown to depend on the behavioural activity of the animal in the “open field”. The data also suggest that the alterations in NCAM-dependent intercellular adhesion, produced by early postnatal stress, may result in permanent brain dysfunction in adults.

Ключові слова: молекула адгеізї нервових клітин (МАНК), гліальний фі-брилярний кислий білок (ГФКБ), рентгенівське випромінювання, електромагнітне випромінювання надзвичайно високої частоти (ЕМВ НВЧ), емоційний стрес, гіперфенілаланінемія, нейролептик рисперидон.

тип.сЬГУ лак.. 3ZO'JZO.