Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ СОЛЕВОГО СТРЕССА И РЕГУЛЯТОРОВ НА РОСТ И МОРФОГЕНЕЗ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ ВИНОГРАДА

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ СОЛЕВОГО СТРЕССА И РЕГУЛЯТОРОВ НА РОСТ И МОРФОГЕНЕЗ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ ВИНОГРАДА"

Л-Жъ%

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи АБЕД АЛЬ АЗ ИЗ АЛЬ АЛИ

- »а* -

удк 581.143.5:634,84

ВЛИЯНИЕ СОЛЕВОГО СТРЕССА И РЕГУЛЯТОРОВ НА РОСТ И МОРФОГЕНЕЗ

' * * * изолЙ^ВА¥нных;'Т^АНЕГ- -г ? ^

И ОРГАНОВ В И Н ОГЙЙК " (03. 00- 12 — физиология растений)'1

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологйч'еских *наук <

'Г, ».У,*".-4 -

МОСКВА 1993

Работа вигг лнена на кафедре ф ииоіогип растении и дарвинизма Даі сстанского гос.уда >ственного университета им. В И Ленина (1990 — 1993 гг )

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор А. Г. Юсуфов

Официальные оппоненты- доктор бпоіоиічесгч.их на\к, профессор Л- Д. Прусакова;

доктор сельскохозяйственных нал к, трофессор К. В Смирнов.

Ведущая организация: Всероссийский на\чно-исслшова-тельский институт виноградарства и виноделия, Новочеркасск

Защита состоитср «4» октября 19^3 года в «16» часов не заседании специализированного совета Д 120 35 07 п Чос-ковскои сельскохозяйственной академии имени К А. Тими-ря^ва по защите диссертации на соискание ученои степени доктора биоюшческих нау ч

Адрес 127350, Москва И 550, .л Тимирязевская, 49, сок-тор защиты диссертаций ТСХА

С диссертацией можно о шакомгться и ЦИБ ТСХЛ

/ --/

Автореферат диссертации разослан О ^і/ссе/^- ідоз г

Ученый секретарь специализированного совета —

канд! дат биологических нау^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рост и морфогенез растений-интегральный ревультат реализации генетической програмш в определенных условиях. В них проявляются адаптивность и, в конечном итоге, предпосылки жизнедеятельности и продуктивности индивидуума. Этим объясняется неослабевающий интерес к исследование явлений роста и морфогенеза в физиологии растений.

От успеха реализации процессов роста и морфогенеза во многом зависит продуктивность растений. Указанные процессы отличаются исключительной лабильностью, они меняются даже при кратковременных стрессовых ситуациях. В естественной же обстановке практически не удается обеспечить оптимальные условия для роста и морфогенеза растений в течении всего онтогенеза. В связи с этим важнейшей задачей остается изучение механизма действия и последствий стрессов на растения и поиск возможностей ослабления их отрицательного аффекта.

К стрессам исключительно чувствительны изолированные органы и ткани. В практике часто приходится сталкиваться с резким снижением приживаемости черенков и ухудшением состояния саженцев у растений из-за нарушения режима полива и поднятия грунтовых вод. Задача состоит в уточнении не только последствий солевого стресса для жизнеспособности черенков (в том числе и такой культуры, как виноград), но поиска возможностей ослабления его результатов.

В познании закономерностей онтогенеза растений, специфики действия разных условий велика роль метода культуры изолированных клеток, тканей и органов (Турецкая, 1961; Бутенко, 1864, 1877; Уоринг и Филлипс, 1883; Qrahan, Warein?, 1876). Тем не менее перспективы использования данного метода в ряде разделов ботаники и растевеводства недостаточно осознаны. В конкретизации сказанного и поставлена задача изучения процессов роста и морфогенеза черенков и изолированных структур ткани и органов винограда In vitro при сочетании солевого стресса и действия регуляторов роста.

^ ЦЕНТРАЛЬНАЯ

Научная с.-чзяиотека » •оск. ¿'»..ь'-.гохол ачадемии :

А _ о ли ft

- А -

Д#д> и задачи исследования. Цель работы - изучение действия регуляторов роста на процессы роста и морфогенеза черенков и полированных тканей In vitro в условиях аасоления среды. Для ее решения поставлены следующие задачи:

- оценка чувствительности процессов роста и морфогенеза при регенерации черенков и эксплантов разных структур винограда In vitro к режимам засоления среды;

- мучение возможностей блокировки эффекта засоления среды введением в ткани регуляторов роста;

- выявление связи между процессами роста побегов и ризогенеза у черенков при изменении режима засоления среды;

- изучение последействия стрессовых условий на жизнеспособность черенков и саженцев;

- сравнение физиологического состояния саженцев из черенков, культивировавшихся в различных условиях солевого стресса.

Основные положения выносимые на защиту;

1. Степень отрицательного аффекта солевого стресса различна для черенков и эксплантов In vitro, она не всегда коррелирова-лась с солеустойчивостью сортов.

2. Дія оценки солеустойчивости растении изучение процессов регенерации у черенков дает большую информацию, чем эксплантов in vitro.

3. Специфика объектов и моделей в солеустойчивости проявляется только при умеренных режимах стресса.

4. Различные этапы морфогенеза у черенков и эксплантов отличается по чувствительности к солевому стрессу.

В. Регуляторы роста (ШК и БАЛ) оказывают неодинаковое влияние при введении их в ткани до и после контакта с солевым стрессом.

В. Эффект солевого стресса проявляется в морфологии и физиологии, он необратим в случае превышения пороговых доз.

Научная новизна, в работе воедино связаны задачи изучения процессов роста и регенерации черенков и изолированных структур при действии регуляторов роста и солей.

- Б -

Каждый ив изученных вопросов мог бы , несмотря на ухе достигнутые успехи в исследовании процессов регенерации у черенков (Дубровицкая, 1961; Турецкая, 1961; Гартман и Кастер, 1063; Та-расенко, 1967 и др.)» изолированных структур (Бутенко, 1077; Уо-ринг и Филлипс, 1983) и физиологии действия регуляторов роста (Кулаева, 1973; Кефели, 1974; Дорфлинг, 1983; Кефели и Прусако-ва,198б;Кефели и др., 1988), а также в использовании метода культуры иаолированных структур для научения солеустойчивисти (Смирнов, 1970; Pandey, Divate, 1976; Walker, Dumbroff, 1081), служить предметом специального изучения даже применительно к объекту с учетом его значимости для производства. В работе объ-еденены равные проблемы под углом ревения обвей задачи и в таком комплексном плане процессы регенерации ецв мало исследованы.

Результаты изучения процессов регенерации и солеустойчивости черенков и эксплантов использованы для обсуждения вопроса о путях реализации адаптивной стратегии растений в стрессовых условиях.

Практическая ценность. Результаты работы могут быть использованы в практике размножения растений черенками для увеличения выхода посадочного материала и при оценке солеустойчивости растений. ..............—-

Апробация работы. Материалы доложены на ежегодных научных конференциях ДГУ (1991 - 1993 гг.) региональных конференциях по Флоре Северного Кавказа и Дона (Ростов, 1001) и регенерации растений (Махачкала, 1001). По теме опубликовано 6 сообщений.

Объем и структура. Диссертация излажена на 145 стр. машвопи-си, включает 60 табл. и 14 рис. Она состоит из введения и Б глав текста, заключения и выводов. В библиографии 152 названий, из них 66 иностранные.

- в -

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Опыты проведены на районированных в Дагестане сортах винограда (Yltls vlnlfera L.), известных по своей хорошей (Агадаи), средней (Гиляби) и слабой (Жемчуг Сава) солеустойчивости. В некоторых же экспериментах дополнительно использованы также ива (Salix alba 1.). тополь (Populus deltolles Marsh) и традесканция (Tradesoantla virldes Hort).

Дія опытов нарезали 2-3 глазковыв черенки винограда с вызревшей лоаы прошлого года. Черенки культивировали в кристаллизаторах ори температуре 22 - 24 С на искусственном освещении (лампы накаливания - 600 вт/м2 ). Черенки были разделены по вариантам обработки и режимам культивирования (см. ниже). В неделю 1 раз меняли среду культивирования черенков.Для обработки черенков использованы индолин-3-масляная кислота(ИМК-производство "Serva" -БО мг/л), б-бенвиламинопурин (ВАЛ - производство "Chemapol", Прага - 26 мг/л) и вода.

В опытах In vitro материал (экспланты черешка, побега, пластинки листа и апексы) брали с побегов проращиваемых черенков. После соответствующей подготовки (стерилизация раствором 0,012 сулеш в течение 7-15 мин.) акспланты культивировали на среде Цурас иге-Скута (MC) с добавлением регуляторов роста и некоторых солей, (см. ниже).

Для создания режимов засоления использованы водные растворы NaCl, NflftSO*, CaSÜ4 (IQ-3 - Ю-1 М) с осмотическим давлением (4 - 0,40 атм). Основная схема опытов по сочетании условий засоленім и регуляторов роста сводилась к изменению их концентраций и последовательности воздействия, а также продолжительности действия стресса. У черенков учитывали сроки, типографию и мощность раавития корней, интенсивность пробуждения почек, рост побегов, тип и степень повреждения. Состояние черенков (и саженцев) оценивали танке по содержанию хлорофилла (Баженова и др., 1064), белка (Loury et al, 1951) и свободных аминокислот (Benson, Cordon, Patterson, 1967; Козаренко и др., 1981), кальция, натрия,

калия (атомно-аОсорбционнш методом; Мо1оЬ, 1055), анионов (метод высокоэффективной хромотографии на приборе Цвет Э006), по активности эндогенных регуляторов роста (Кефели и др, 1973). Учитывалось и изменение концентрации исходных растворов солей в ходе последующего культивирования черенков.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПРОЦЕССОВ РОСТА И РЕГЕНЕРАЦИИ У ЧЕРЕНКОВ К ЗАСОЛЕНИЮ СУБСТРАТА

Исследованные сорта винограда обнаруживали раалкчия в ризоге-неве и прорастании почек в водной культуре. Так, у черенков Жемчуг Саба развитие корней и пробуждение почек происходило на 28-36, Агадаи - на 32-44 и Гюляби - 30-36 день посадки. Растянутость процесса пробуждения почек составила соответственно 16, 8 и 12 дней. Кроме того, у черенков Жемчуг Саба и Гпляби пробуждение почек опережало развитие корней на несколько дней. По этой причине соотнопение величины биомасса побегов + листьев / биомасса корней (коэффициент полярности -КП) снижается в направлении: Жемчуг Саба - Агадаи - Гпляби. Высокая величина КП - результат угнетения ривогенеза при активном пробуждении почек и росте побегов. По атой причине для черенков всех сортов высокая величина КП была характерна в варианте с обработкой БАП по сравнению варианта ИМК.

Постоянное культивирование черенков в растворах Ю-1 II (нева-висимо от сорта винограда и состава солей) приводило к летальному исходу - происходило обезвоживание и загнивание их тканей. В растворах солей умеренных концентраций (Ю-2 - 10~3 К) черенки проявляли жизнеспособность, хотя и при этом черенки Жемчуг Саба оставались угнетенными (табл. 1).

Ингибирование риаогенеза у черенков Агадаи в солевых растворах меньше выражено. Процессы риаогенеза более чувствительны к солевому стрессу, тогда как пробуждение почек происходит и при воздействии стрессора. Культивирование в растворе СаБО« оказывает более отрицательное влияние, чем в растворе N££1.

Таблица 1

Ривогенеа и пробуждение почек у черенков при культивировании я солевых (Ю-2 и) растворах (опыт 7. 12. 1989г)

11 I-■

| | Среда культивирования I

| Сорта |-1-1-1

1 | Вода | N801 | СаЭД I

Агадаи | | | I

1 I 43 1 41 | 42 |

2 | 70.8 | 70.8 | 55.8 |

3 I 41.3 | 41.3 | 37.8 | Гшяби II ||

1 | 37 | 37 | 36 |

2 | 40.0 | 45.6 | 10.0 I

3 | 90.0 | 70.0 | 80.0 | Жемчуг Саба | | | I

1 | 41 | 41 1-1

2 | 20 I 10.3 | О |

3 | 100 | 00.3 | 100 | -1-1_I_I

Примечание: день начала риаогенева (1), на 42-45 день посадки укореняемостъ (2) и пробуждение почек в г. (3).

При смене сред культивирования реакция черенков разных сортов сохраняет свою специфику- Так, при культивировании черенков в растворе N801 (10~2 Ы в течении 12 суток) и последующем их перенос« а воду черенки Жемчуг Саба вновь выделяются наибольшим угнетением. У черенков солеустойчивого Агадаи в этих условиях ин-гябжромвие ривогенева менее выражено. Перевод черенков ив воды а солевой раствор (после 12 суток) имеет менее отрицательные последствия ввиду наибольшей чувствительности к стрессу начальных этапов ривогенева.

Предварительная обработка ИЫК и БАЛ принципиально не меняет реакцно черенков на солевой стресс. В табл. 2 представлены данные опыта (7. 12. 1989г) по культивированию в растворах солей (10~2 М) черенков, обработанных ИМК (50 мг/л) и ВАЛ (25 мг/л).

Таблица 2

Риэогенеа черенков винограда при сочетании обработки регуляторами роста и солевого стресса.

' .'А .

I I

Варианты обработки и культивирования

Гюляби

-г

Агадаи

т-г~

Жемчуг Саба |

tе

2 | 3 |

-1-1

Г I

20 (100 |

20 |100 |

О 1100 |

1 I

40 |100 |

20»1100 |

О . |100 |

I ч

О J100J

о l-80'l. ,, Ó |100 |

Вода Вода (а) NaCl (б) CaS04(B)

имк

(а)

(б) (в)

ЕАП

(а)

(б) (в)

38 38

36 35 за

38 38 40

40 40

О

50 80 20

30 20 10

100 .90

90

90 60 90

80 60 60

45 42

45

38 38 35

45 42 45

62 62 43

100 100 87

Ф

50 37

50 50 57

37 37 12

87 37 50

42 42

4040

Примечание: 1 и 2 см. в табл. ренков в X на 38-42 день.

1; 3 - пробуждение почек у че-

Из табл. 2 видно, что наибольшее угнетений ризогенеаа характерно для черенков Жемчуг Саба при активном пробуждении 'доч^к. Культивирование в растворе СаБ04 приводит к большим отрицательным последствиям, чем в растворе ЫаС1. Предварительная обработка БАП еще более угнетает риаогенез у черенков Жемчуг Саба в{С*,условиях солевого стресса. Обработка в растворе Ю1К. вызывает ускорение темпов развития'корней и повышает укореняемость черенков. Черенки разных вариантов заметно отличались по величине бвоцассы корней, листовой пластинки и побега. Наибольшие'различия тхр атому показателю присуши сортам, меньше вариантам обработки и культивирования (табл. 3). ' • ¡* I -

Таблица 3

Сырая биомасса (в иг) корней (К) и побегов(П) в зависимости от обработки рутуляторами роста и условий культивирования черенков (Данные на 74-й день опыта)

1- | Варианты | см. табл. 2 т-- | Гюляби - | Агадаи -1 Жемчуг Саба|

1 к 1 П 1 1 к 1 1 п 1 К 1 ■ 1 П | 1 ■

1 Вода а | БО 1 | 780 I 50 1 11020 20 1 1 | 700 |

б | 110 | 720 I 70 Ц100 10 |1890 |

в | 70 |1090 I 50 I 680 10 1 530 |

I имк а | 100 I 860 I 80 11180 10 11730 |

б | 150 11200 | 160 11530 10 I 600 |

в | 90 | 960 I 90 11380 10 1 350 |

| БАП а I 110 11240 I 30 I 530 5 I 590 |

б I 100 | 920 | 110 11340 10 I1290 I

в | 30 | 660 | 50 Ц150 10 1 810 |

I. | | | .1______________ 1____л

Различиями в исходной биомассе корней и побегов обусловлены и отклонения в величине КП по сортам и вариантам. По всем вариантам у черенков сорта Жемчуг Саба величина КП оказалась вире ив-ва явного дисбаланса развития корней и роста побегов. Ввиду большей уравновешенности черенков в вариантах обработки ИМК и (^льготирования в растворе ЫаС1 эта величина соответственно снижается.

В одном из опытов проводилось постоянное культивирование черенков в смеси растворов (10~2 >1) ЫаС1 + МагИОд (Б) или в воде (А). Растворы отдельных солей оказываются менее отрицательными для черенков, чем их смеси (табл. 4). Тем не менее, и в этом опте сорта сохраняли четкие различия в ризогенеээ и росте побегов. Во всех случаях предварительная обработка ИЫК приводила к увеличению числа и длины корней. Положительный аффект ИМК больше проявляется при культивировании черенков в воде, тогда как солевой стресс ослаблял его.

Таблица 4

Влияние обработки регуляторами роста и условий культивирования на черенки винограда.

-г

1--' I

•Распускание почек,

Сорта и условия культивирования

РизогенезД

-Ч

I

• О |

о I

■67 |

Б8 |

100 ' I'

50 |

I

Агадаи

Гюляби

А Б А Б

Жемчуг Саба А Б

75 62 92 . 75 30 13

75 84 91 58 33 О

58 25 67 67 20 О

8 О 75 92 100 87

25 .0 91 67 100 67

а.

л-

Примечание: Черенки до посадки выдержаны в течении 12 часов в воде, в растворах ИЫК и БАЛ (1-3), А и Б см. в тексте. Данные на 45-й день черенкования. '*»'«. <

У слабосолеустойчивого сорта Жемчуг Саба распускание почек опережало развитие корней, особенно в варианте Б. У Агадаи,-' наоборот, при этом формирование корней предшествовало распусканию почек. У Гюляби разрыв между распусканием почек и развитием корней был минимален. Регуляторы роста не снимали отрицательный эффект солевого стресса у неустойчивого к засолению Жемчуг Саба. > Одним из показателей для оценки состояния черенков служит характер связи между пробуждением почек и ризогенезом. Для трудно черенкуемых форм быстрое пробуждение почек имеет особенно'отр»--цателыте последствия (Правдин, 1938; Лобинский, 1957; Гартман и Кестер, 1963; Комиссаров, 1964). ■ ■■"*''. *

Вычисление коэффициента корреляции показало; что у черенков.' сорта Жемчуг Саба отсутствует связь между указанными процессам^ ввиду резкого угнетения корне образ ования. Точно также у всех* сортов при обработке БАЛ подобная связь нарушена... Она наиболее.

шражена у черенков Гпляби, особенно в варианте БАП. В варианте ПК связь между ризогеиеаом и пробуждением почек нередко имеет отрицательный знак, как реаультат стимуляции процесса корнеобра-аования.

Солевой стресс заметно сказывается на состоянии саженцев из черенков. В этих же целях была определена жизнеспособность черенков после отторжения всех новообразований и перевода в водную (фльтуру. Оказалось, что у черенков Жемчуг Саба, культивировавшихся в условиях солевого стресса, вообщэ не происходит развитие корней и побегов после их отторжения. Отрастание лучше шло у че ренков Агадаи, несколько слабее - у Гпляби.

Саженцы из черенков, испытавших длительный солевой стресс, имели равные некротические пятна на пластинке, слабый рост корней и побегов, часто у них наблюдалось отмирание точек роста побегов и высыхание листьев. По степени повреждения сорта занимали следующий возрастающий ряд: Агадаи - Гпляби - Жемчуг Саба. Сильные повреждения отмечены у саженцев из черенков, культивированых в растворе N32304 и СаБО^. Предварительная обработка черенков регуляторами роста не способствовала полному устранению повреждаемости саженцев, хотя, несомненно, в варианте с БАП наблюдалась тенденция ее ослабления. Варианты и сорта заметно отличались между собой по частоте встречаемости разных типов повреждения у черенков, что отражалось и на состоянии саженцев.

' Повторение опытов на черенках ивы, тополя и традесканции подтвердило положение, что специфика реакции объектов на солевой стресс проявляется только при определенных концентрациях, обработка регуляторами роста принципиально не меняет ее. Чувствительность черенков к солевому стрессу возрастала в ряду : тополь - традесканция - ива. и для них более летальными оказались соли серной кислоты.

На примере исследованьпс растений обнаружено, что разные этапы регенерации у черенков отличаптся по чувствительности к солевому стрессу. Так, процессы риаогенеза более чувствительны, чем пробуждение почек. В ризогенезе наиболее чувствителен этап заложе ния корней, в побегообразовании рост поОегов

- 13 -

ОСОБЕННОСТИ РОСТА И МОРФОГЕНЕЗА . -

ИЗОЛИРОВАННЫХ CTPYKTST ВИНОГРАДА IN VITRO

Экспланты листовой пластинки, черешка, побега и изолированные почки одного и того же сорта обнаруживали неодинаковые потенции к пролиферации и росту. Наименее они проявлялись у эксплантов листовой пластинки, несмотря на способность изолированных листьев с черешком у винограда к укоренение (Юсуфов, 1988). Как правило, на мелких жилках у эксплантов листовой пластинки формировался только слабый каллус даже после долгого куль тивирования. У сравниваемых эксплантов развитие каллуса находилось в обратной зависимости от их роста. Так, изолирование почки, проявляя высокую активность к росту, в формировании каллуса и корней уступали эксплаятам побега и даже отчасти черешка. В то же время на каллусах у эксплантов побега (особенно черешков) почки развивались реже, чем на каллусах у изолированных апексов. На эксплантах у Хемчут Саба каллус формировался быстрее, чем на эксплантах' Ага-даи и Гвляби. У эксплантов всех сортов развитие каллуса опережало корнеобразование и ризогенеэ часто не сопровождался дифференциацией почек на каллусах.

Опыты in vitro по солеустойчивости эксплантов проводились : по более развернутой схеме. :'/..'

Некоторые ее варианты приведены ниже (табл.' 5) ' . •

1. Контроль - минимальная среда МС '

2. Среда + ИМИ, 1 мг/л.

3. Среда + БАЛ, 1 мг/л.

4. Среда + NaCl, БО мг/л.. •>.•/"' В. Среда + JOK + БАЛ (1:1). / ' : в. Среда + ИМК + БАЛ (1:1) + NaCl, БО мг/л. ' /

7. Среда + ИМК + БАЛ (1:1) + NaCl, 100 мг/л. •

Реакции эксплантов на солевой стресс по результатам риэогене-за нечетко выражена (табл. 5). С учетом выживаемости, каллусоге-неза и темпов развития корней можно говорить о наличии тенденции ухудшения показателей жизнеспособности при дополнительном введении в среду NagSo4 и использовании растворов ' NaCl и NagSO« Ь концентрации 100 мг/л. Ухудшение жизнеспособности особенно резко

Таблица 5

Ривогенев (в 7. на БО-й день) у изолированных почек (П), апеллянтов побега (ПО) и пластинки листа (Л) у сортов винограда

і- і 1 1 1

| Варианты 1 ь - 1 II Агадаи 1 Гюляби | Жемчуг Саба |

1 г 1 по | Л 1 п т г 1 по | Л Г 1 п по 1 л |

\ — Ь - t - > - \ - 1 1 - Ч— 1

| 1 1 10 1 0 1 0 1 14 I 0 | 0 1 0 0 1 о о

1 г | 40 1 50 | 0 | 29 1 ІЗ | 0 1 1 і

1 з 1 о 1 30 1 0 1 14 1 14 | 0 | - - 1 - I

1 4 | 20 1 30 | 0 1 о 1 0 | 0 1 0 - 1 - 1

1 5 1 ю 1 40 | 0 1 14 1 14 | 0 1 о 20 1 0 I

1 8 1 0 1 20 | 0 | 29 1 14 I 0 1 о 20 1 о і

1 7 1 01 30 | 0 | 40 1 29 | 0 1 о 2D 1 0 1

• і і ' 1 1 1 ...1 , II

проявлялось у эксплантов Жемчуга СаОа, а у других сортов, в основном, на листовой пластинке. Экспланти побега и черешка проявляли большую толерантность к солевому стрессу, чем даже изолирование ПОЧКИ.

В принципе, трудно выделить общие особенности реакции сортов на солевой стресс по всем зкеплантам In vitro Если рассматривать устойчивость разных зкеплантов, то сорта занимают следующий возрастающий ряд:

1) по выживаемости и активности роста листовой пластинки (Агадаи - Гюляби - Жемчуг Саба);

2) по активности каллус ооОразовашш (Агадаи Гюляби Жем чуг Саба);

3) по активности ризогенеза (Жрмчуг Пба ГвлпОи Ага дай).

Независимо от сорта преимущества в выживаемости и ризогенезе в условиях солевого стресса имеют экспланты побега, а затем изолирование почки. У изолированных почек развитие корней происхо дило медленно из аа активного роста поОега.

Активность роста побега заметно задерживает корнеобразование на изолированных почках In vitro, как и при росте побега у че ренков.

Между солеустоичивостыо стеблевых черенков у изученных сортов и реакцией эксплантов разных структур на засоление среды нет параллелизма Можно говорить лишь о тенденции большей активности в реализации отдел1 них реакций у эксплантов побега, черешка и изолированных почек у солеустоичивых сортов в условиях засоления среды. В связи с этим вопрос о возможности использования реакции эксплантов In vitro на заселение среды, как экспресс-метод для оценки голеустоичивогти шшограда нуждается в дальнейшем изучении

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЧЕРЕНКОВ, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ

Состояние черенков (точнее, саженцев из них) после воздействия разнообразными факторами является одним из важных показателей, характеризующих направленность изменения физиологических процессов, морфогенеза и роста.

В ряде исследований показано, что на разных этапах регенерации в тканях изолированных органов и структур происходят сложные метаболические изменения (Турецкая, 1961; Гартман и Кестер, 1963; Бутенко, 1964; Кефели, 1974 и др.). В то же время все еще актуальны исследования в этом направлении, особенно для оценки состояния полученного потомства регенератов

Как показали наши исследования , солевой стресс оказывает последействие на физиологическое состояние саженцев из черенков. Так, после культивирования черенков в растворе NaCl (5*10-2 Ю резко возрастает в листьях содержание Na+ и С1- По уровню их содержания саженцы сорта Жемчуг Саба заметно превосходят'Агадаи. Обработка черенков регуляторами роста не окааывада существенного влияния на уровень содержания катионов и анионов в листьях (табл. 6). При культивировании в условиях солевого стресса меняется не только содержание ионов, содержащихся в растворе, но и соотношение других катионов и анионов друг к другу (AI - Saldi et al., 1984, 19PS). Степень повреждения корневой системы и выпада черенков (показатели слабой солеустоичивости) хорошо кпррелируется с уровнем накопления в листьях катионов и анионов у сортов, вариантов обработки и культивирования

По вариантам культивирования и обработки меняется пул свободна аминокислот и содержание белка в листьях. Листья у саженцев ■В черенков Жемчуг Саба исходно характеризовались большим содержанием белка, чем Агадаи. Культивирование в условиях солевого стресса сопровождается снижением содержания белка в листьях у сортов.

Таблица в

Содержание некоторых катионов и анионов в листьях у саженцев винграда, полученных из черенков после различных воздействий.

Дата анализа 6.02.1992 г.

1 | Сорта, вариант | культивирована | и обработки і •ы | В мг/г сухой биомассы -1

1 Ыа+ і 1 к+ і I Са2+ | і і С1- 504г" 1

| Агадаи 1 1 1 1

| Вода контроль(1) | .1.6 | 44 1 0,1 | 0,1 21,5 |

| ИМК, 50 иг/л (2) I 1,3 1 13 1 0,9 | 1.2 20.0 |

| ВАЛ, 26 мг/л (3) | 2,0 1 13 1 0,5 | 1,0 3,5 |

| N301. 6*10-1 М | 1 1 1

| контроль (4) I 29,0 | 54 1 1,8 | 3,1 9,3 |

І ИИК (6) I 29,0 1 50 1 1.5 | 30,0 7,8 |

| ВАЛ (6) | 10,0 1 21 1 2,0 | 27,0 3,1 |

| Жемчуг Саба (1) 1 0,5 1 51 1 0,09 | 1.3 23,0 |

(2) I 1.3 | 69 1 0,12 | 1.8 21.0 I

(3) 1 1.7 1 34 1 0,04 | 3,0 15,0 |

(4) | 37,8 | 88 1 0,03 | 50,0 16,0 |

(6) | 41,0 | 89 1 0,48 | 53,0 17.0 I

(6) | 63,0 | 118 1 0,61 | 80,0 20,0 I

і_ * і ' < . «

В то же время оно более заметно падает у сорта Жемчуг Саба в отличия от Агадаи. Предварительная обработка черенков регуляторами роста не предотвращает падения уровня содержания белка в листьях (табл. 7).

Между уровнем содержания белка и пулом свободных аминокислот имеется корреляция. Так, сорта и варианты, у которых обнаружено низкое содержание белка, отличались, как правило, повышенным пулом свободных аминокислот в листьях. Даже у черенков сорта Ага-даи в вариантах, где наступает резкая депрессия ризогенеза и роста побегов (ЫаС1 + МаеЗОд), удалось отметить скачок в величине свободных аминокислот, не говоря уже о том, что такое явление было общим для Жемчуг Саба(табл в)

Таблица 7

Содержание белка (мг/г сырой биомассы) в листьях у саженцев винограда,полученных из черенков винограда разных условий культивирования (8 февраля 1992г)

1-г | Сорта и варианты | ■ 1 -г М + п | 1 СУ, 7. т-1 в7. к контролю |

1 1 | Агадаи 1 | 1 2,68*0,2 | 15,6 100 I

1 2 1 2,50*0,1 I 10,0 93 I

1 3 | 2,66*0,3 I 14,2 99 1

1 4 1 1,96*0,1 | 16,8 73 1

1 5 1 2,46*0,6 | 44,7 91 I

1 8 | 1,75*0,4 | 38,8 65 |

| Жемчуг саба 1 | 3,43+0.4 | 27,4 100 ]

1 2 | 2,81*0,3 I 22,0 81 I

1 3 | 3,38*0,2 | 16,8 98 |

1 4 [ 2,42*0,4 | 36,3 70 , |

1 5 | 2,42*0,2 I 23,1 70 I

1 б | 2,68+0,1 | 11,5 78 |

1 ____1. 1 1 «

Примечание: Обозначения 1 - 6 в табл. б.

При культивировании в условиях солевого стресса у черенков Жемчуг Саба отмечено значительное повышение содержания лизина, гистидина, аспарагиновой кислоты, серина, глицина и цистеина, менее значительно - треонина, пролина, метионина, изолейцина, лейцина и тирозина У сорта Агадаи в этих же условиях уровень содержания свободных аминокислот мало изменился по сравнению с контролем. В варианте с депрессией у черенков Агадаи (N801 + МагЗОд) возрастало содержание таких аминокислот, как лизин, ас-

парагиновая кислота, треонин, аланин, метионин, лейцин и фенила-ланин; особенно серии, пролин и глутаминовая кислота. Как известно глутаминовая кислота участвует в ааотном обмене растений (Андреева, 1988), занимая ключевые позиции в метаболизме большинства аминокислот (Брей, 1986). Возможно, нарушением азотного обмена и обусловлено резкое повышение содержания глута-миновой кислоты в листьях у черенков, культивируемых в условиях солевого стресса. Как результат его наблюдается изменение содержания других аминокислот. Суммарные же данные показывают, что нарушения в азотном обмене у сорта Жемчуг Саба более значительны. Так, при культивировании в одинаковых условиях у Жемчуга Саба содержание свободных аминокислот оказывается намного выше, чем у Агадаи. Черенки же Агадаи приближаются к Жемчугу Саба только в варианте МаС1 + ИагЗОа.

I

Таблица 8

I

Суммарное содержание аминокислот(шМ/г свежей ткани) а листьях саженцев винограда Агадаи (А) и Жемчуг Саба (Б) из черенков, культивированных в разных режимах

1 -Т | Варианты | шМ/г --г— 1 1 В 7. —■

■ 1 ■ А I 1 1 Б I ■ 1 А I 1 Б I

1 1 | Контроль (вода) | 1 5,74 | 1 6,80 | 1 100 | 100 1

I МаС1, Б*10"2 М | 3,96 | 12,99 | 69 | 180 |

| ИаС1 -1- Ыа2504(1:1) 1 13,62 | отмирание| 232 | I

■ 1 1 1.

Содержание хлорофилла в листьях - важный показатель уравновешенности растений в стрессовых условиях (Шлык, 1966; Леопольд, 1068; Ыокроносов, 1981; Клейтон, 1984), в том числе и при солевом стрессе (Строганов, 1963). Сорта отличаются по содержанию хлорофилла даже в нормальных условиях. В условиях стресса, когда наблпдается ингибирование риэогенеза без летального исхода, у черенков Агадаи содержание хлорофилла оказывается почти на уров-

не контроля. Предварительная обработка черенков регуляторами роста не способствовала сдвигу в содержании хлорофилла в листьях, хотя варианты отличались по величине биомассы побегов (табл. 3).

В другом опыте (9.03 1991 г.) была поставлена задача выяснить влияние 5, 10, 15, и 20 суточного пребывания в растворе ЫедЗОд (10_1М) после предварительной их обработки в растворе ИМК и ВАЛ.

Любая продолжительность культивирования черенков в растворе ЫагЭТд снижает жизнеспособность, что было заметно по ингибирова-нию процесса ризогенеза и роста побегов. Наибольшее ингибирова-ние было характерно для черенков сорта Жемчуг Саба. У черенков Жемчуг Саба, выдержавших в растворе 10 суток, полностью отмирали начавшие рост почки. Тогда как у 501 черенков Агадаи побеги оставались зелеными даже после пребывания в растворе в течении 20 суток. У черенков Гюляби такой же результат был обнаружен после пребывания в растворе в течении 15 суток, тогда как ризогенез полностью подавлялся уже на 10 сутки экспонирования в растворе. Предобработка регуляторами роста не способствовала повышению толерантности черенков.

Из табл. 9 видно, что листья у черенков 15 и 20 суточного пребывания в растворе соли по содержанию хлорофилла не уступают другим вариантам после перевода их в водную культуру. Объясняется это тем, что варианты 5 и 10 дневной экспозиции отличались более активным ростом, чем варианты 15 и 20 суточного экспонирования. Здесь вновь сталкиваемся с фактом обратной корреляции между интенсивностью роста растений и содержанием хлорофилла в листьях, что показано во многих опытах. В. целом, у черенков Агадаи после переноса в водную культуру 'стабилизация дойтигается быстрее, чем у Жемчуг Саба.

Сравнение черенков разных сортов и вариантов культивирования и обработки по содержанию эндогенных регуляторов роста, показало наличие различий между ними. В листьях у черенков Жемчуг Саба в среднем (по всем вариантам) преобладающими оказались ингибиторы роста, а у Агадаи - все зоны хроматограммы содержали вещества более или менее стимулирующие рост колеоптилей. У черенков Агадаи после предобработки ИМК и ВАЛ при культивировании в воде

<

Таблица 9

Средние показатели содержания хлорофилла(мг/г сырой биомассы) й листьях у саженцев из черенков, культивированных в растворе) Ыа2Б04 (1СГ1 М)

1-;- | Продолжитльность | культивирования в | растворе, суток Жемчуг Саб а Лгадаи 1 1 к

а 1 1 в 1 а/в а 1 1 1 в | а/в в 1 ■

| 0 - вода 1,96 1 1 0,69 2,7 0,93 1 0.32 | 3.0 ■ 1

1 6 0,69 1 0,23 3.0 1.11 1 0,36 | 3,0 1

1 ю 0,93 | 0,36 2,6 1,07 1 0,42 | 2,4 I

1 16 1,16 1 0,42 2.7 1,09 1 0.37 | 2,9 1

| 20 1,05 1 0,38 2.7 0,68 1 0.23 | 3,0 1

■ .1 . , . .. __________ . 1 1 л

происходило снижение уровня активности эндогенных стимуляторов в виду интенсивной их метаболизаций на рост. В варианте с культивированием в растворе N301 заметна тенденция увеличения числа стицулиругацих зон на хромотограммах, тогда как в растворе №2Б04 - их уменьшение. В тканях у черенков Жемчуг Саба в вариантах с культивированнием в растворе МагЗОд преобладают зоны ингибиторов с ЯГ 0,6-1,0, Агадаи - с ЯГ 0,1-0,6.

В системе использованных растворителей (Н-бутанол: этанол: вода - 4:1:1) ЯГ АЕК лежит в ингибирующей зоне 0,80-0,92. ЛЕК обычно накапливается в стрессовых условиях. Подавление роста и опадение листьев у черенков в растворе N32504, возможно, есть результат усиления биосинтеза этилена под влиянием накопления АБК (Кефели и др., 1989). Несмотря на тенденцию преобладания эндогенных ингибиторов в листьях и почках у черенков при депрессии роста (вариант Ыае504). особенно у слабо солеустойчивого Жемчуга Саба, все же трудно сделать широкие обобщения о влиянии засоления среды на уровень их активности по результатам проведенных опытов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Замечена тенденция угнетения процессов роста и регенерации у черенков в условиях засоления, особенно у не солеустойчивого Жемчуг СаОа. С другой стороны, очевидно, что разные этапы регенерации и морфогенеза, а также различные структуры одного и того же растения.отличаются по чувствительности к засолению.

По степени угнетения процессов роста и регенерации у черенков в условиях засоления сорта занимают следующий возрастающий ряд: Агадаи - Гюляби - Жемчуг Саба, что соответствует их полевой со-леустойчивости. При культивировании же черенков в воде (контроль) по активности процессов роста и регенерации сорта обычно располагаются в обратном порядке. В контроле и в условиях солевого стресса у черенков Жемчуг Саба распускание почек обычно опережает ризогене8, тогда как у Агадаи - эти процессы значительно синхронизированы. По этой причине у черенков Агадаи поддерживается благоприятное соотношение между биомассой корней и побегов.

Культивирование в условиях солевого стресса сопровождается развитием некротических пятен на листовой пластинке, уменьшением размеров листьев, задержкой роста побегов, отмиранием точек роста побегов и корней. Все это ведет к снижению выживаемости и последующего отрастания черенков, даже после перевода их в водную культуру. Подобные отрицательные эффекты наиболее выражены у черенков Жемчуг Саба, менее - у Агадаи. Специфика реагирования сортов на засоление проявляется только при определенных концентрациях. С нарастанием концентрации растворов (т.е. с усилением общей их токсичности) сортовые различия у черенков не проявляются из-за усиления летального эффекта (Berstein et al, 1956; Ehlli, 1960; Alexander and Woolham, 1968; Dowton, 1977).

Депрессия роста и ризогенеза у черенков в условиях засоления среды коррелируется с изменением концентрации и соотношения катионов и анионов, пула свободных аминокислот в тканях листа, содержания белка, хлорофилла и активности эндогенных регуляторов.

Обнаружены различия как па сортам, так и вариантам культивирования, что особенно заметно било в накоплении анионов и катионов (Alexander at al, 1971; Klshore et al, 1986; Ruhl, 1989). Черенки Жемчуг Саба в физиологическом отношении оказались менее солеустойчивыми. Такое же состояние у черенков Агадаи проявлялось только в вариантах с резкой депрессией роста и нарушением равновесия между биомассой корней и листьев (NaCl + NagS04). Физиологическая уравновешенность черенков долгое время не восстанавливается даже после снятия солевого стресса при - переводе в водную культуру. Наиболее продолжительно последствия засоления сохранялись у черенков Жемчуг Саба. Предобработка черенков в растворах КМК и БАП не способствовала заметному смещению реакции сортов на засоление, т.е. но блокировала его отрицательный эффект.

Реакция эксплантов черешка, пластинки листа и побега, а также изолированных почек на засоление не всегда отличалось наличием четких сортовых градаций. На примере результатов культивирования равных структур In vitro выявлена обратная связь между степенью их специализации и активностью к регенерации (Кренкв, 1950; Moueeth, Halperln, 1975; Юсуфов, 1982). Во всех случаях наиболее чувствительными к засолению среды оказались экспланты листовой пластинки, более толерантными - побега и черешка. В среднем по солеустойчивости всех эксплантов сорта располагаются в убывающем порядке: Агадаи - Гюляби - Жемчуг Саба. В то же время отмечена большая чувствительность к засолению среды у эксплантов In vitro по сравнению с черенками соответствующих сортов. В целом нет строгой корреляции между солеустойчивостыо черенков и эксплантов соответствующих сортов.

Поскольку устойчивость к стрессам представляет собой феномен организменного уровня, связанный с наличием комплекса структурных и функциональных приобретений, постольку и не следует ожидать строгого соответствия реакции черенков и эксплантов разных структур на засоление. С ослаблением способности к самостоятельной жизни у структур их чувствительность к засолению возрастает.

В результате отбора у растений вырабатывается специфическая адаптивная стратегия реагирования на стрессы - механизмы обеспечения репродуктивного успеха. В ее основе лежит комплекс приобретений на разных уровнях (от клетки до организма). Этому критерию менее отвечают сорта, у которых нарушена связь между процессами ризогенеза и роста побегов, а также активно накапливаются в тканях катионы и анионы в условиях засоления среды. Все это ведет к энергетическому истощению черенков и последующему их отмиранию или снижению способности к отрастанию после снятия стресса. Обработкой ИМК и БАЛ не удается существенно изменить адаптивную стратегию реогирования сортов на стрессы.

ВЫВОДЫ

1. Стеблевые черенки и экспланты разных структур у винограда проявляют различную активность к регенерации и росту в условиях солевого стресса. Толерантность к солевому стрессу более выражена у исследованых структур Агадаи по сравнению с Жемчуг Саба.

2. Ингибирующий эффект солевого стресса проявляется в комплексе морфологических и физиологических изменений, что сопровождается снижением жизнеспособности черенков и эксплантов. Депрессивное состояние в морфологии коррелируется с изменением в содержании катионов и анионов, белка и хлорофилла, пула свободных аминокислот в стрессовых условиях. Изменения в активности эндогенных регуляторов роста в листьях у черенков оказались менее специфичными.

3. Степень ухудшения физиологического состояния у изолированных структур в условиях солевого стресса зависит от солеустойчи-вости сортов.Она сильнее проявляется у структур слабо солеус-тойчивого сорта Жемчуг Саба, чем солеустойчивого Агадаи.

4. Сортовые различия черенков и эксплантов проявляются только при низких концентрациях растворов (10-3 и 10-2 И). Высокая концентрация раствора (10-1 11) оказывается токсичной независимо от сорта и продолжительности культивирования. Сдли, содержащие ионы серы и кальция, оказались более токсичными, чем содержащие ионы натрия и хлора

- ¿.ід -

В. Лобая продолжительность жесткого стресса (10-1 Ы) снижает жизнеспособность черенков. Черенки несолеустойчивых сортов даже при экспозиции 5-10 дней в растворе испытывают сильное угнетение и теряют способность к отрастанию после возйращвния в водную ^льтуру.

6. Предобработка регуляторами роста ускоряет (ИМК) или подавляет (БАЛ) ризогенез у черенков. На пробуждение почек влияние И1ІК и БАП противоположно. Специфика действия регуляторов роста более заметна при введении их в ткань до начала солевого стресса, чем после воздействия стресса (12 суток). Отрицательный эффект солевого стресса не удается блокировать предобработкой черенков регуляторами роста.

7. Экспланты разных структур более чувствительны к солевому стрессу, чем черенки соответствующих сортов. Реакция эксплан-тов на солевой стресс к тому же не всегда специфична и корре-лируется с солеустойчивостыо черенков. Тем не менее просматривается тенденция снижения солеустойчивости эксплантой в ряду: Агадаи - Гюляби - Жемчуг Саба.

8. Различия изолированных структур в реагировании . на солевой стресс зависят от адаптивной стратегии сортов - способности поддерживать равновесие между разными этапами морфогенеза. Обработка регуляторами существенно пе монпот адаптивную стра тегию винограда.

- 25 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Абед адъ Азиа, Юсуфов А. Г. Влияние солевого стресса на черенки винограда, обработанных ИМК и БАП // Процессы регенерации в онтогенезе растений Махачкала. Дагестанский университет, 1991. С 67-64.

2. Юсуфов А. Г.. Абед алъ Азиз. О возможности оценки солеус-тойчивости винограда по процессам регенерации у черенков // Регенерация растений. Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции. Махачкала: Дагестанский университет, 1991. С 57-58.

3. Абед алъ Азиз, Полецкая Т. Л. Пролиферация и ризогенез винограда при засолении среды // Регенерация растений. Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции. Махачкала: Дагестанский университет, 1991. С 59-60.

4. Юсуфов А. Г., Абед алъ Азиз. Процессы регенерации сортов винограда при засолении субстрата как проявление их адаптивной стратегии // Флора нижнего Дона и Северного Кавказа: структура, динамика, охрана, проблемы использования. Тезисы докладов научно-практической конференции. Ростов н/Д: РГУ, 1991. С 116-117.

5. Абед алъ Азиз. Связь процессов укоренения и роста виноградной лозы при различных воздействиях // Сборник статей студентов, аспирантов и преподователей университета (естественно -технические науки) Махачкала: Датестане гай университет. 1992. С 7-10.

6. Магомедова М. А., Абед алъ Азиз. О возможности повышения стрессоустойчивости растений регуляторами роста //Тезисы докладов 3-го Всероссийского съезда физиологов растений, 6, С-Пб,1993. С 665.

г

2000001006092

2000001006092