Влияние салициловой кислоты на протеомы листьев и корней гороха

Егорова, Алевтина Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние салициловой кислоты на протеомы листьев и корней гороха
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние салициловой кислоты на протеомы листьев и корней гороха"

На правах рукописи

Егорова Алевтина Михайловна

ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА ПРОТЕОМЫ ЛИСТЬЕВ И КОРНЕЙ ГОРОХА

03.00Л2.- фитология и биохимии растении

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на сонсканнс ученой степени кандидата биологических наук

^ МОП

Казань - 2009

003482464

Работа выполнена в группе белкового метаболизма Учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Научный руководитель:

академик РАН

Игорь Анатольевич Тарчевский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ольга Николаевна Кулаева (г. Москва)

доктор биологических наук Фарида Вилевна Минибаева (г. Казань)

Ведущая орг анизация:

Учреждение Российской академии наук институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Зашита состоится 2009 года в // часов на заседании

диссертационного совета Д 002.005.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Казанском институте биохимии и биофизики КазПЦ РАН по адресу: 420111. г. Казань, ул. Лобачевского, д. 2/31. а/я № 30, тел/факс (843)2927347

С диссертацией можно ознакомиться в 1 [ентрадыюй научной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан

« Л? _» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Б. Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Одним из магистральных направлений исследований биологических систем в последнем десятилетии может считаться протеомика, в том числе протеомика растений. Ее задачей является получение информации о протеомах - совокупности белков организма, изменениях в наборе и содержании белков в ходе развития растения и при изменении условий существования, в том числе при действии различных биотических и абиотических стрессоров. В повышении устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессорам ключевую роль играют стрессовые фитогормоны. На сегодняшний день имеются данные о влиянии стрессовых фитогормонов на протеомы целых растений и их органов. Данные о влиянии салициловой кислоты (СК) - ключевого фактора индукции системного иммунитета растений - на протеомы корней практически отсутствуют, поэтому можно сделать вывод, что исследование влияния на протеомы корней СК является актуальным. Работа в этом направлении может внести вклад в познание особенностей функционирования сигнальных систем клеток растений, поскольку изменение протеомов под влиянием СК осуществляется при участии сигнальных систем.

Различные сигнальные системы в нашей стране интенсивно изучаются в институте физиологии растений РАН (О.Н. Кулаева, Вл.В. Кузнецов, В.В. Кузнецов и др.). институте биохимии РАН (О.П. Кораблева, О.Л. Озерецковская. Н.И.Васюкова и др.). в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СОРАН (В. К Войников. Л.А. Ломоватская и др.), институте биохимии и генетики УНЦ РАН (И.В. Максимов, Ф.М. Шакирова и др.), Казанском институте биохимии и биофизики (А.Н. Гречкин. Ф.Г. Каримова. Л.Х. Гордон, Ф.В. Минибаева, И.А.Тарчевский и др.), Санкт-Петербургском госуниверситете (С.С. Медведев, М.Ф.Шишова и др.). Результатом функционирования сигнальных систем является репрограммирование экспрессии генов и синтеза белков, что приводит к изменению протеомов. В то же время, протеомному анализу действия стрессовых фитогормонов, в частности, салициловой кислоты, практически не уделяется внимание.

Цель и задачи исследования. Целью исследований было выяснение особенностей влияния одного из ключевых факторов системного фитоиммунитета -салициловой кислоты на протеомы листьев и корней гороха.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выявление салицилат-индуцируемых белков листьев и корней гороха с

помощью двумерного электрофореза.

2. Идентификация выявленных салицилат-индуцируемых белков с помощью

масс-спектрометрии (МА1ЛЭ1-ТОР МЭ (МЭ/МЭ)).

3. Анализ роли СК-индуцируемых белков.

Научная новизна работы. Впервые идентифицированы в качестве СК-индуцируемых 15 белков: бета-субъединица В трансляционного фактора I элонгации.

10.11-редуктаза 12-оксофитодиеновой кислоты, нуклеотидсвязывающий белок обогащенный лейциновыми повторами (NBS - LRR type RGA), 5-метилтетрагидро-птероилтриглутаматгомоцистеин-8-метилтрансфераза, малатдегидрогеназа цитоплаз-матическая, предшественник шаперонина альфа-српбО, полиубиквитин и полиубиквитинподобный белок, белок 14-3-3, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA). альфа-амилаза (каталитическая область), гликозидгидролаза семейства 18, глутаминамидотрансфераза. липиддесатуразоподобньш белок, белок 33 кДа фотосистемы II. Все эти белки принимают участие в защитных реакциях, в энергетических процессах у растений, в дупликации и репарации ДНК, синтезе, рефолдинге и деградации белков, в сигнальных процессах клеток.

Научно-практическая значимость работы. Результаты проведенных нами исследований вносят вклад в познание молекулярных механизмов действия стрессового фитогормона салициловой кислоты, являющейся одним из ключевых факторов системного иммунитета растений. Был обнаружен целый ряд белков, неизвестных ранее в качестве салицилат-индуцируемых, что позволило расширить представления о механизмах регуляции салициловой кислотой реакций формирования фитоиммунитета. Материалы диссертации могут быть использованы при чтении курсов лекций и учитываться при подборе компонентов для создания новых эффективных антипатогенных препаратов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пушино, 2007): школе-конференции молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007); Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008); Международном симпозиуме «Липиды и оксилипины растений» (Казань, 2008); IV Всероссийском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), а также на итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2008 и 2009 гг.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 статей, две из которых - в реферируемом журнале «Доклады РАН».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 5 таблиц и 34 рисунка. Список литературы включает 225 источников.

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Объекты исследования. В работе использовали листья и корни проростков гороха Pisum sativum L. сорта Труженик. Проростки выращивали на 74 водной среды Хогленда-Арнона! при 25°С, освещенности 10 кЛюкс при 16-часовом световом

периоде. Влияние CK в разных концентрациях на рост корней оценивали, измеряя длин>' главного корпя через 2, 4, б сут действия CK. Для проведения протеомных исследований объектом служили 8-ми дневные проростки гороха, которые помещали на растворы CK. Корни фиксировали через 2 и 5 сут воздействия салицилата, листья проростков фиксировали через 5 сут обработки CK.

1.2. Выделение белков. Экстракцию растворимых белков листьев проводили 0,025 М Трис-HCl буфером (pH 8.0), содержащим 2 мМ ЭДТА, 100 мМ ДТТ и 1% коктейль ингибиторов протеаз, и 0,025 М натрий ацетатным буфером (pH 5.2) (100 мМ ДТТ, 1% коктейль ингибиторов протеаз) при температуре 4°С. Растворимые белки корней экстрагировали 0,025 М Трис-HCl буфером (pH 8.3) с теми же добавками. Образцы центрифугировали 15 мин (14000 g) при 4°С. затем к надосадочной жидкости, содержащей растворимые белки, приливали равный объем холодного раствора 20%-ной ТХУ в ацетоне с 25 мМ ДТТ. Пробы выдерживали 1 ч при -20°С, после чего образцы центрифугировали 15 мин (14000 g) при 4°С. Осадок промывали охлажденным ацетоном с добавлением 50 мМ ДТТ, этиловым спиртом, эфиром (этоксиэтан), высушивали и растворяли в буфере для изоэлектрического фокусирования (6 М мочевина, 2 М тиомочевина, 2% CHAPS. 2% тритон Х-100, 50 мМ ДТТ и 0.5% Bio-Lyte (pH 3-Ю)). Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry at al., 1951), используя в качестве стандарта БСА.

1.3. Разделение растворимых белков методом двумерного электрофореза. 20-электрофорез проводили на приборах Protean IEF Cell, Protean 11 xi 2-D Cell (BioRad. США) с использованием стрипов 17 см с иммобилизованным линейным градиентом pH 4-7, pH 3-1 и pH 3.9-5.1. Настрипы наносили равное количество белка контрольного и опытного вариантов. Регидратацию стрипов осуществляли при 50 В в течение 12 ч, изофокусирование - 10-12 ч при 20°. Общее количество вольт-часов составляло 60000. Перед началом разделения белков по молекулярным массам стрипм уравновешивали 15 мин в 1-ом буфере (0,125 М Трис-HCl, 2% Ds-Na, 30% глицерин, 6 М мочевина, 2% ДТТ и следы бромфенолового синего), затем выдерживали 15 мин во 2-ом уравновешивающем буфере, который вместо ДТТ включал 2,5% йодацетамид. Разделение белков по молекулярным массам проводили с помощью 12,5% Ds-Na-ПААГ - электрофореза в Трис-глициновом буфере (40 мА на 1 гель). Пластины геля окрашивали красителем Кумасси G-250 (0,05% Coomassie G-250, 2% ТХУ, 20% этанол). Сканирование гелей проводили на сканере EPSON 4990 Photo (Индонезия).

1.4. Обработка гелей. Анализ белковых пятен на 2Д- электрофореграммах проводили с помощью программы Phoretix 2D v 2004 (Nonlinear Dynamics). В дальнейшем идентифицировали белковые пятна, отношение содержания которых в контроле и опыте было больше 1,5.

1.5. Идентификация белков. Идентификацию белков проводили методом MALDI-TOF масс-спектро.метрии с помощью программы Mascot

(www.matrixsciencc.com). Поиск по «пептидному фингерпринту» проводился в базе данных NCBI (подбаза - растения). С использованием программного обеспечения Biotools 3.0 (Broker Daltonics, Германия) был также проведен поиск по результатам MS+MS/MS.

1.6. Определение признаков программируемой клеточной смерти (ПКС).

1.6.1. Окраска корней красителем Эванс голубой. Для оценки гибели клеток апексов корней использовали краситель Эванс голубой (0,1% раствор). Для этого корни проростков гороха отрезали от стеблей и помещали в краситель на 20 мин при комнатной температуре; затем корни отмывали в дистиллированной воде в течение 20 мин. Корни сканировали на сканере EPSON 4990 Photo.

1.6.2. Выделение и электрофоретическое разделение ДНК. Выделение тотальной ДНК из клеток растений проводили методом фенольной экстракции (Гловер, 1988). Для выделения ДНК использовали кончики корней длиной 1-1,5 см. Дальнейшую очистку проводили с обработкой препаратами РНК-азы и протеиназы К. Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле.

1.6.3. Детекция NO. Для детекции оксида азота (NO) использовали специфический флуоресцентный краситель диаминофлуоресцин диацетат (DAF-FM DA). Кончики корней длиной 2 см помещали на 15 мин в раствор 10 мкМ красителя DAF-FM DA в 5 мМ MES буфере с добавлением 0,25 мМ КС1 (рН 6.15). Затем корни отмывались в том же буфере от красителя 20 мин. Флуоресценцию возбуждали светом 500 нм, эмиссию наблюдали при 515 нм с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа LSM 510 МЕТА (Carl Zeiss, Германия).

1.7. Статистика. Эксперименты проводили в двух-трех биологических и трех аналитических повторностях. Для электрофореза приведены результаты одного характерного опыта. Статистическая обработка данных проводилась с использованием t - критерия Стьюдента (при уровне достоверности Р<0,05).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ 11 ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При исследовании влияния СК на протеомы растений гороха мы учитывали, что картина изменений набора и содержания белков зависит от продолжительности действия и концентрации СК. Эти изменения могут сопровождаться изменением других физиолого-биохимичееких и анатомо-морфологических показателей.

2.1. Влияние СК на рост корней проростков гороха и общее содержание растворимых белков. При изучении влияния СК на рост главного корня 3-х дневных проростков гороха использовали концентрации от 10 до 100 мкМ.

СК в концентрациях 10 и 25 мкМ существенно не влияла на рост корней (рис. 1); при концентрации СК 50 мкМ происходило небольшое ингибирование роста корней; отрицательное влияние на рост корней усиливалось при увеличении концентрации и продолжительности действия СК. На 6 сут ингибирование роста корней при СК 100 мкМ составляло 31%. происходила гибель апекса корня, образовывалась перетяжка,

2 сут 4 суг 6 суг

□ контроль О 10 мкМ СК □ 25 мкМ СК ■ 50 мкМ СК В 100 мкМ СК

Рис. 1. Влияние СК на рост главного корня проростков гороха.

отделяющая живую часть корня от мертвой (см. главу 2.4.).

Для оценки содержания растворимых белков в проростках гороха использовали 8-ми дневные растения, которые затем помещали на растворы СК (50 мкМ и 100 мкМ) на 1, 3 и 5 сут. Как и ожидалось, общее содержание белков было выше в листьях, по сравнению с корнями. СК в обеих концентрациях не оказывала существенного влияния на общее содержание растворимых белков в корнях и листьях (рис. 2). Однако известно, что СК вызывает изменение содержания отдельных белков, что делает целесообразным изучение ее влияния на протеомы листьев и корней.

корни

1 сут 3 сут 5 сут

□ контроль В 50 мкМ СК И 100 мкМ СК

1 сут 3 суг 5 сут

□ контроль В 50 мкМСК Щ МОмкМСК

Рис. 2. Влияние СК на общее содержание растворимых белков в листьях и корнях гороха.

2.2. Влияние СК на протеом листьев гороха. Для сопоставления СК-индуцируемых изменений протеомов листьев и корней использовали только СК в концентрации 50 мкМ, поскольку в более высокой концентрации СК вызывала морфологические изменения корней, но не листьев, и сопоставление их протеомов было бы некорректным.

В наших опытах при извлечении белков из листьев с помощью 0,025 М Трис-НС1

буфера (рН 8.0) с последующим их разделением на 2-Д электрофореграммах наиболее высоким содержанием отличались белки фотосинтетического аппарата растений. По данным литературы, на долю белков цикла Кальвина приходится от 30% до 50% от общего содержания растворимых белков листьев (Ellis, 1979; Schitzet et al., 2004). Мы обнаружили, что наиболее высоким содержанием отличаются большие и малые субъединицы (СЕ) рибулезо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О)

кДа

7 4

к-Да

66' 1 - • . <

^ * I .«

А,----В—? . .

36"

2924- 11*'*■

I 19 А 8 4

20.1-

14.;

кДа

2iv

21 20

-Г *

66-

45-

.15

36-

\ \

Рв.а. .

29—

24- 20

20,

14,3" г

„В...........!:.*

•Г1 .;

10 кДа

6ft-

4536-

2924-

ту. Я

20.1-

66-

45- *

36-

29-

24-

20,Ь

14,3-

Рис. 3. Электрофореграммы растворимых белков листьев гороха, а - контроль (рН 47); б - СК 50 мкМ (рН 4-7); в- контроль (рН 3-10); г - СК 50 мкМ (рН 3-10). Время действия СК 5 сут.

Б В - Г

V»4!, >> Н 24, "41 29 ,30 3*

? 17 23

, V V \

к I ,,. .

* »V

с к % "V ^

Рис. 4. Фрагменты 2Д - электрофореграмм. К - контроль. СК - 50 мкМ.

(данные представлены в диссертации). При окрашивании белков на двумерных электрофореграммах высокое содержание этих белков с неизбежностью приводит к тому, что минорные белки не визуализируются. Поскольку РБФК/О не извлекается кислым буфером (рН 4.6-5.2) (в отличие от большинства патоген- и элиситор-индуцируемых белков), то в основной серии опытов мы использовали вариант с извлечением белков 0.025 М натрий- ацетатным буфером (рН 5.2) (.1ш^ е1 а!., 2003) (рис. 3).

На рис. 3 представлена общая картина 2Д-электрофореграмм растворимых белков, на которых обнаруживалось около 600 белковых пятен. В увеличенном виде фрагменты гелей А, Б. В. Г приведены на рис. 4. Обнаружено СК-индуцируемое изменение содержания 32 белков листьев, из которых 13 белков были идентифицированы. Нами впервые было обнаружено СК-индуцируемое повышение содержания глутаминамидотрансферазы (пятно 29), гликозидгидролазы семейства 18 (пятно 17), белка устойчивости к болезням (пятно 23), а также белков пластид -альфа-амилазы (пятно 2), липиддесатуразоподобного белка (пятно 9) и белка 33 кДа фотосистемы II (пятно 22) (таб. 1). Ниже приводится краткое описание функций этих белков.

Глутаминамидотрансфераза - фермент, потенциально усиливающий возможность использования амидогруппы глутамина на синтез пуриновых и цитозинового нуклеозидов. К гликозидгидролазам семейства 18 относятся белки, обладающие хитиназной и, что очень важно, лизоцимной активностью. Они способны гидролизовать бета-1,4-связи в муреине - пептидогликане. входящем в состав клеточных стенок бактерий (Вгиппег е! а!., 1998). Альфа-амилаза может обеспечить образование глюкозы из крахмала, участвующей в процессах биосинтеза различных углеводов и дыхания, интенсивность которого повышается под влиянием экзогенной СК. Липиддесатуразоподобный белок, который в листьях локализован, главным образом, в хлоропластах. заслуживает особого внимания в связи с тем. что десатурация высокомолекулярных жирных кислот необходима для синтеза полиеновых жирных кислот, из которых в ходе липоксигеназных сигнальных реакций синтезируются гидропероксипроизводные, участвующие в синтезе оксилипинов.

Таблица 1. Идентифицированные СК-индуцируемые белки листьев гороха.

х- пятна1 № белка » NCBI2 Идентифицированные Г>ГЛК1Г Экспер. MM/pl4 Теорет. MM/pIs Score' Кратность различия7

2 K¡]92887505 Альфа-амилаза, каталитическая область (Midieago truncatula) 45.0/5.4 46.7/5.17 73 +5,8

3 g¡|2921317 Бета-1,3-глижаиаза 3 (Glycine max) 34.1/4.34 26.1/4.27 159 П

9 £¡11161568 Лппиддесатуразаподобный белок (Lycopersicon escutentum) 33.1/4.66 38.7/8.87 84 П

13 £¡12921317 Бета-1,3-глюканаза 3 0Glycine max) 33.7/5.01 26.1/4.27 124 П

14 gi|2921317 Бета-1,3-глюканаза 3 {Glycine max) 33.1/5.13 26.1/4.27 98 +15,3

15 g¡|2827080 Предшественник малатдегидрогеназы (Medicado truncatula) 40.2/6.55 35.8/6.4 84 -24,6

17 £¡¡92883858 Гликозидгидролаза, сем. 18 (Midicago truncatula) 26.8/4.8 31.4/4.88 229 +7,3

22 »1224916 Белок 33 кДа фотосистемы 11 (Pisum sativum) 20.8/5.59 26.6163 ■73 +1,9

23 gi|436313 Белок, ответственный за устойчивость к болезням (Pisum sativum) 17.0/4.95 16.7/4.94 144 +2,7

29 gí|50252075 Глютамннампдотрансфераза класс-1 домен содержащий белок {Oryza sativa) 33.2/6.5 32.3/6.02 94 П

30 g¡|82949446 Бета-1,3-глюканаза (Sesbania rostrata) 33.2/7.2 36.5/9.03 62 п

31 £¡|8294!M4Í Бета-1,3-глюкаиаза (iSesbania rostrata) 33.2/8.5 36.5/9.03 112 п

32 £¡120687 Хитина за (Pisum sativum) 35.5/7.1 34.5/7.83 167 +62.3

Примечание: 1 - номер пятна на 2Д-электрофореграмме, 2 - идентификационный номер белка в базе NCBI (Национальный центр биотехнологической информации), 3 - идентифицированный белок Pisum sativum L. или гомологичный белок других организмов, 4 - MM/pI - ММ -молекулярная масса белка в кДа и pi определенные в эксперименте, 5 - MM/pI - ММ -теоретическая молекулярная масса белка в кДа и pi из базы данных, б - достоверность поиска белков (Score) в базе данных NCBI (подбаза - растения) с использованием программы Mascot, где предел отсечения составлял 67 (р<0,05), 7 - кратность различия содержания белков соответствует среднему значению величин, измеренных в трех независимых опытах; «+», «-»- повышение и уменьшение содержания белка; П- появление белка, отсутствующего в контроле (р<0,05).

в том числе со свойствами антибиотиков и фитогормонов (Grechkin, 1998). Десатуразоподобный белок может быть также вовлечен в реакции биосинтеза кутана и суберина (Lequeu et al., 2003), которые являются защитными барьерами на пути проникновения патогенных микроорганизмов в растения. Белок 33 кДа фотосистемы II представляет собой магнийстабилизирующий белок, играющий важную роль в функционировании СК-выделяющего хлорофилл-белкового комплекса (Wyman et а!., 2005). Повышение содержания этого белка может обеспечить большую устойчивость фотосистемы II хлоропластов.

Нами также были идентифицированы уже обнаруженные ранее другими авторами (Buchter et al., 1997; Brunner et al., 2003) СК-индуцируемые хитиназы семейства 19, а также изоформы кислых и щелочных бета-1,3-глюканаз (табл. 1).

Хитиназы катализируют расщепление р-1,4-глюкозидных связей, главным образом представленных в хитине - полимере клеточных стенок грибов, бактерий, личинок и взрослых форм насекомых (Hamel et al., 1995; Regalado et al., 2000; Kasprzewska, 2003). Кислые и щелочные бета-1,3-глюканазы гидролизуют (3-1,3-связи в полисахаридах клеточных стенок патогенов (VanLoon et al., 2006). Образующиеся в результате фрагменты полисахаридов обладают элиситорными иммунорегулирующими свойствами. Эти ферменты, так же, как хитиназы, можно считать маркерами защитного ответа растений на действие различных патогенов. Одновременное повышение содержания хитиназ и бета-1,3-глюканаз может быть весьма целесообразным потому, что они вызывают синергическое подавление развития патогенных грибов (Minie, 2008).

Была также подтверждена обнаруженная ранее (Curto et al., 2003) СК -индукция белка, отвечающего за устойчивость к болезням, синтез которого значительно усиливался при действии различных патогенов.

СК вызывала уменьшение содержания 9 растворимых белков, в том числе идентифицированного нами предшественника малатдегндрогеназы. Физиологическое значение последнего трудно объяснить без знания внутриклеточной локализации фермента.

Большинство из перечисленных СК - индуцируемых белков листьев могут принимать участие в защитных функциях растений. Часть из них может разрушать клеточные стенки патогенных микроорганизмов (хитиназа, гликозидгидролаза семейства 18, бета-1,3-глюканазы), другие - повышать устойчивость клеток (белок устойчивости к болезням, белок 33 кДа фотосистемы II) и способствовать активации липоксигеназного сигнального каскада (липиддесатуразаподобный белок).

2.3. Влияние СК 50 мкМ на протеом корней гороха. На 2Д-

электрофореграммах растворимых белков корней проростков гороха обнаруживалось более 900 белковых пятен (рис. 5). СК (50 мкМ) приводила к изменению содержания 27 белков, присутствующих в выделенных зонах электрофореграмм А, Б, В, и Г (рис. 5), из них 9 белков были идентифицированы (табл. 2).

Впервые следующие белки были идентифицированы нами в качестве СК-индуцируемых: бета-субъединица В трансляционного фактора I элонгации (пятна 1, 9), 10,11-редуктаза 12-оксофитодиеновой кислоты (пятно 13), малатдегидрогеназа ци+оплазматическая (пятно 18), нуклеотидсвязывающий белок обогащенный лейциновыми повторами (NBS-LRR type RGA) (пятно 21). К числу известных до наших опытов и идентифицированных также нами СК-индуцируемых белков относятся аскорбатпероксидаза (пятно 14). глутатион-8-трансфераза (пятно 11)

липоксигеназа (пятно 27), АБК-зависимый белок (пятно 26). Ниже приводится краткое описание функций этих белков.

кДа

.Г

кДа

664536- А-

29"

24-

Ы:" 17

Чу

45.....

36- А

2924""

16г

.17,

-19

К 3 / ? «

К * :

«Г/ к ск %а! ? 7

Р 14

Й'Ж.

11 12 #

10'/

и ^ ф

1'5

13 ,4

23 . .24

2« •

Рис. 5. Электрофореграммы растворимых белков коней гороха, а - контроль; б - СК 50 мкМ (обработка в течение 5 сут); в - фрагменты гелей 2Д-электрофореза.

Бета-субъединица В трансляционного фактора I элонгации принимает участие в функционировании рибосом, вместе с факторами инициации и терминации трансляции осуществляя синтез белков на матричных РНК. Повышение его содержания, возможно, отражает тенденцию к усилению синтеза СК-индуцируемых белков. N88X1111 белки содержат нуклеотидсвязывающий домен (МВЭ) и обогащенные лейцином повторяющиеся домены (ЬЯ!*). Их относят к числу адапторных комплексообразующих белков, принимающих участие в функционировании сигнальных систем, например, в узнавании рецепторами экскретируемых патогенами эффекторных белков (ОеУоиг^ « а1., 2006). Малатдегидрогеназа цитоплазматическая - участвует в малат/аспартатном челночном переносе атомов водорода через мембраны (Мшапк е1 а!., 2002),

Таблица 2. Идентифицированные CK - индуцируемые белки корней гороха.

№ пятна1 >2 бачка п NCB11 Идентифицированные Gc.ikiij Экснер. MM/pI* Тсорст. MM/pI* Score 5 Кратность различия7

1 «i138232568 Бста-субъсдннмна В трансляционного фактора I элонгацнн (Pisum sativum) 38/4.50 25.3/4.41 241 +3

9 gi ¡38232568 Бста-субъсдншща В трансляционного фактора 1 элошяшш (Pisum sativum) 31.8/4.75 25.3/4.41 164 п

11 ß1)37051105 Глюта i iioii-S-1 раисфераза (Pisum sativum) 25.2/5.04 26.7/5.0 146 +4,2

13 gi144917012 10,1 l'pcivKiaia 12-оксофитоднспопон кнсл01ы (Pisum sativum) 27.1/5.62 41.4/5.80 116 U

14 gi|20648 L-аскорбатисроксидаза (Pisum sativum) 26.5/5.68 27.2/5.52 102 +1.7

18 gil 18202485 Малатдегидрогеиаза цнтоплазчатнческая (Zea mars) 38.1/5.89 35.6/5.77 118 +3,9

21 £¡¡74128891 Нуклеотидсвязывающий обогащенный ленцнповыми повторами белок (Tríticum aestivum) 30.4/5.37 15.2/7.96 67 +2,8

26 £¡120631 АБК- зависимый белок (Pisum sativum) 16.8/5.15 16.6/5.07 81 +3,2

27 £¡¡2459611 Лппоь'сигаша (Pisum sativum) 97/6.39 97.4/6.08 71 +2J

Примечания: И - исчезновение белка в опытном варианте, остальные те же, что и для

таблицы 1

ЛБК-зависимый белок является представителем семейства PR10 белков, у которых обнаружена рибонуклеазная антивирусная активность (Srivastava et al., 2006). Лмпоксигеназы являются ключевыми ферментами липоксигеназного сигнального каскада, катализирующими реакции оксигенирования полиеновых жирных кислот, в результате чего образуются гвдропероксидные производные, а из них - различные биологически активные, в том числе антипатогенные оксилипины (Гречкин, Тарчевский, 1999). 10,11-редуктаза 12-оксофитодненовой кислоты является ферментом липоксигеназного каскада, катализирующим одну из последних реакций в метаболической цепи синтеза жасмоновой кислоты (ЖК). Исчезновение фермента может объяснить обнаружешюе ранее (Pena-Cort'es et al., 1993) подавление экзогенным салицилатом образования ЖК, участвующей в активации защитных ответов при механическом повреждении (раневой стресс) тканей растений и атаке некротрофных патогенов (Schneider et al., 2005; Wasternak, 2007). СК-индуцируемое подавление образования 10,11-редуктазы 12-оксофитодиеновой кислоты должно привести не только к торможению синтеза ЖК-индуцируемых белков, но и к накоплению предшественника ЖК - оксофитодиеновой кислоты (ОФДК), являющейся важнейшим фактором локального иммунитета растений. Аскорбатпероксндаза является одним из ключевых ферментов аскорбат-глутатионового цикла, нейтрализующего образующуюся при «окислительном взрыве» перекись водорода (Mittler, 2002). Глутатион-8-трансферазы участвуют в

детоксикации продуктов, появляющихся при инфицировании растений и действии элиситоров (Coleman et al., 1997; Dixon et al., 1998).

2.4. Определение признаков ПКС. Через сутки после начала воздействия СК (100 мкМ) у корней на расстоянии примерно 4-5 мм от их апекса формировалась перетяжка (рис. 6). Для визуализации погибшей зоны корня использовали краситель -Эванс голубой. Было обнаружено, что зона корня ниже перетяжки мертва, а выше остается живой. Присутствие перетяжки хосвенно указывает на то, что участки корня, находящиеся по ее разные стороны находятся в разных функциональных состояниях.

Рис. 6. Окрашивание Эванс голубым апексов корней гороха. 1 - контроль, 2 - СК (100 мкМ).

В то же время используемая концентрация салицилата (100 мкМ) не являлась токсичной для всего растения, оно оставалось живым и продолжало рост в течение всего эксперимента, но, как отмечалось выше, наблюдалась задержка роста по сравнению с контрольным вариантом, а эффект ПКС проявлялся только в апикальной части корня.

Ультраструктурные исследования, проведенные ранее сотрудниками нашего института (Абдрахимов, Яковлева, 2007) показали, что в погибающих клетках апекса корня происходила деградация клеточного содержимого, накопление в вакуолях осмиофильных гомогенных округлых включений. СК индуцировала конденсацию митохондрий, в ядрах происходила конденсация хроматина (рис. 7 В).

Рис. 7. Ультраструктура клеток корней гороха контрольного (А) и обработанного СК (100 мкМ) (Б - Г) вариантов. Я - ядро, Кс - клеточная стенка, В -вакуоль; стрелками указаны включения, накапливающиеся в цитоплазме и между клеточными стенками (из Абдрахимов, Яковлева, 2007 с изменениями).

Мы предположили, что морфологические изменения, происходящие в апексе корней гороха, являются результатом программируемой клеточной смерти по типу апоптоза.

Выявление фрагментации ДНК. Одним из доказательств гибели клеток по типу апоптоза служит появление фрагментации ядерной ДНК. В погибающих клетках ДНК расщепляется эндонуклеазами, в результате чего образуются нуклеосомные единицы размером преимущественно 180 нуклеотидных пар. На электрофоретических гелях продукты нуклеосомной деградации ДНК напоминают лестницу.

Нами было проведено электрофоретическое разделение ДНК, выделенной из корней проростков гороха, обработанных СК (100 мкМ) в течение 6, 12 и 24 ч. Было обнаружено, что фрагментация ДНК и появление характерной для этого процесса картины (фрагментация ДНК в виде лестницы) начинается уже через 6 ч воздействия

Рис. 8. Электрофоретическое разделение ДНК.

1 - маркеры; 2 - контроль 6 ч; 3 - контроль 12 ч; 4 - контроль 24 ч; 5 - СК 100 мкМ 6 ч; 6-СК 100 мкМ 12 ч; 7 - СК 100 мкМ 24 ч.

СК (рис. 8). Из данных литературы (Repae, MacCabe, 2008) известно, что нуклеосомная деградация ДНК происходит на первых этапах гибели клеток по типу апоптоза. Этим и объясняется тот факт, что морфологические изменения апекса корня появляются лишь через 1-2 сут воздействия СК на растения.

Влияние СК на содержание NO в корнях гороха. Показано (Delledonne et al., 1998), что при развитии реакции сверхчувствительности, при которой происходит ПКС, накапливается NO; причем предполагается, что NO может вступать в реакцию с перекисью водорода, образуя более токсичный продукт - пероксинитрит, способный вызывать апоптоз клеток (Pedroso et al., 2000; Hong et al., 2007). По всей вероятности, синергизм действия NO и АФК способствует развитию реакции сверхчувствительности.

Мы проанализировали, происходит ли накопление NO в апексах корней гороха при действии СК в концентрации 100 мкМ. Содержание NO оценивали по степени связывания специфического флуоресцентного красителя DAF-FM DA с NO. Он

хорошо проникает в растительные клетки, что для других красителеи этого класса осложняется наличием клеточной стенки. Обработка СК приводила к значительному усилению флюоресценции, что свидетельствует о накоплении N0 в апексе корня (данные приведены в диссертации).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в апексах корней гороха при действии СК (100 мкМ) происходит ПКС, вероятно, по типу апоптоза.

2.5. Влияние СК (100 мкМ) на протеом корней гороха. Для проведения протеомных исследований при действии СК (100 мкМ) растения фиксировали через 2 сут воздействия в связи с тем, что уже при этой продолжительности действия СК происходили морфологические изменения апекса корня. Анализ количества и окраски белковых пятен на 2Д-электрофореграммах показал, что СК в концентрации 100 мкМ вызывает значительное изменение содержания 43 индивидуальных растворимых

а б

4 р! 7

кДа

66-

4536-

2924-

20.1-

14.3-

ч 1 - ♦.. .'

Рис. 9. 2Д-электрофореграммы растворимых белков корней гороха: а - контроль, б -СК (100 мкМ) (обработка в течение 2 сут), в - фрагменты 2Д - электрофореграмм.

белков (рис. 9). Как и в случае обработки растений СК меньшей концентрации (50 мкМ), было обнаружено повышение содержания АБК-зависимого белка (пятно 40), изоформ глутатион-Б-трансферазы (пятна 26 и 27), нуклеотидсвязывающего белка обогащенного лейциновыми повторами (пятно 21), и существенное снижение содержания 10,11-редуктазы 12- ОФДК (пятно 24) (рис. 9).

Впервые обнаружено СК-индуцируемое повышение содержания 5-метилтетра-гидроптероилтриглутаматгомоцистеин-8-метилтрансферазы (пятно 3), енолазы (пятно 8), ядерного антигена пролиферирующих клеток (РСМА) (пятно 16), белка 143-3 ^ (пятно 18), предшественника шаперонина апьфа-срп 60 (пятно 4), полиубиквитинподобкого белка (пятно 7) и полиубиквитина (пятно 9) (рис.9, табл. 3).

Таблица 3. Идентификация растворимых белков корней гороха, индуцируемых СК (100 мкМ).

>1 пятна1 № белка в NCBi Идентифицированные белки3 Экспер. MM/pIJ Теорет. MM/pl5 Score' Кратность различия7

3 gi|92876874 5 метилтетрагндроптероил трнглютаматгомоциетеин-Б-метнлтрансфераза (Medicago truncatula) 84.0/6.S 84.2/5.97 99 +1,9

4 gi|1185390 Предшественник шаперонина альфа-српбО (Pisum sativum) S9.5/4.97 61.9/5.15 56 +13,7

S gi|436313 Белок, ответственный за устойчивость к болезни (Pisum sativum) 55.9/5.01 16.7/4.94 111 П

7 gi|810739S7 Полнубнквитинподобньш белок (Solatium tuberosum) 55.0/5.55 8.8/5.73 100 +18

8 gi|42521309 Енолаза (Glycine max) 55.0/5.6 47.7/5.31 134 +10.8

9 £¡1899115 Полиубиквитпн (Solatium tuberosum) 46.0/5.4 11.0/5.78 93 +42

16 gi|3821259 Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) (Nicotiana tabacum) 35.6/4.8 29.4/4.69 196 +35

18 gi]695767 белок 14-3-3 (Vicia faba) 32.0/4.87 29.5/4.82 179 +21

21 gi|74128891 NBS-LRR type RGA (Triticum aestivum) 30.4/5,37 15.2/7.96 «7 +19

24 gi|44917012 10,11-редуктаза 12-оксофитодиеновои кислоты (Pisum sativum) 27.1/5.62 41.4/5.80 116 -2

25 gi120648 L-аскорбатпероксидаза (Pisum sativum) 26.5/5.68 27.2/5.52 102 +3,7

26,27 gi|3705110S Глютатион -S-трансфераза (Pisum sativum) 24.0/5.02 26.7/5.0 146 +30 +32

40 gi|20631 АБК- зависимый белок (Pisum sativum) 16.9/5.01 16.6/5.07 97 +3,4

Примечания те же, что и для таблицы 1

5-метнлтетрагидроптероилтриглутаматгомош1стеии-8-метилтрансфераза

катализирует важную для аминокислотного метаболизма реакцию переноса метальной группы на серу гомоцистеина с образованием метионина. Енолаза принимает участие в гликолизе, и повышение ее содержания может в определенной степени объяснять вызванное СК усиление дыхания корней растений (Гордон и др, 2002). Это необходимо в связи со значительным потреблением АТФ при репрограммировании экспрессии генов и синтеза белков, а также реорганизации метаболизма и структур клеток. Ядерный антиген пролиферируюшнх клеток (PCNA) принимает участие в репликации ДНК и во всех видах репарации поврежденной ДНК (Raynaud et al., 2006). Этот белок образует подобие кольца вокруг молекулы ДНК, на котором закрепляется сложный полимеразный гетсробелковый комплекс. Белок 14-3-3 интересен тем, что он принимает участие в регуляции активности многих белков. Например, в активации белковых факторов регуляции транскрипции, ряда ферментов сигнальных систем клеток, а также в деградации белков вместе с убиквитином (Huber et al., 2002) и в апоптозе. Шаперонин альфа-српбО - в комплексе с шаперонином 10 принимает участие в АТР-зависимом рефолдинге (восстановление нарушенной конформации) белков - важной защитной функции клеток (Macario et al.. 2001), так как при начинающемся апоптозе может нарушаться нативная структура многих белков. Полиубиквитин и полиубиквнтинподобный белок участвуют в протеолизе белков-мишеней в составе 26S протеосомного комплекса (Dong et al., 2006). Особую роль убиквитинирование белков может- играть при начинающемся апоптозе, «распознавая» белки с нарушенной структурой, становящиеся мишенями для убиквитина. В связи с этим, следует заметить, что СК -индуцируемое снижение содержания или исчезновение белков может объясняться не только ингибированием синтеза, но и усилением их деградации, в том числе с помощью убиквитинирования.

Для лучшего разделения белков в области В, для которой характерно одно из самых существенных СК - индуцируемых изменений, мы провели их дополнительное электрофоретическое разделение с использованием стрипов с иммобилизованным узким градиентом рН (3.9 до 5.1), используя различное время воздействия СК на корни. Это позволило установить, что через 2 сут воздействия СК значительно повышалось содержание белка 17 (34 кДа, pi 4.5) (рис. 10). На 5 сут повышалось содержание и другого белка, который обозначен нами как 17а (34 кДа, р! 4.75). Масс-спектры белков 17 и 17а оказались практически одинаковыми, что свидетельствует о том что, возможно, эти белки являются изомерами одного и того же белка.

На рис. 11 приведен масс-спектр белка 17 и установленные аминокислотные последовательности фрагментов. Поиск белка 17 проводили по MS и MS/MS результатам с использованием базы данных NCB1. Оказалось, что в базах данных отсутствует белок с подобной структурой. По всей вероятности, белок 17 является

неизвестным ранее салицилат-индуцируемым белком, роль которого в ответе растений на действие СК должна быть достаточно большой, судя по относительно быстрому и сильному изменению его содержания.

кДа 3,9 1)1 4,5 5,1

292436-

29 2436- 17 17а

Ал

29-

Рис. 10. Фрагменты 2Д-электрофореграмм растворимых белков корней гороха, разделенных в узком диапазоне рН (3.9-5.1). а - контроль, б - обработка СК (100 мкМ) в течение 2 сут, в - обработка СК (100 мкМ) в течение 5 сут.

а)

б)

1136 - YYLQQEHR, 1309 - GGVDDFSGLR, 1422 - DNLDGELNYK, 1858 - SSDLQAVVR, 2728 - WEEQDVDVF, 3223 - DWNVVSLAPTEDF.

Рис. 11. а - MALDI масс-спектр белка 17. б - аминокислотные последовательности фрагментов белка 17.

Обращают на себя внимание принципиальные различия в индукции белков СК между корнями и листьями. Это объясняется как отсутствием в корнях хлоропластов и белков, обслуживающих процесс фотосинтеза, так и отличиями в наборе конститутивных и индуктивных антипатогенных белков корней и надземных органов.

2.6. Возможные причины и последствия СК-нндуцируемого исчезновення 10,11-редуктазы 12-ОФДК. Исчезновение при действии СК (50 мкМ) 10,11-

редуктазы 12-ОФДК может привести к значительным изменениям в направленности сигнальных потоков липоксигеназного каскада (рис. 12). Наряду с известными ранее и обнаруженными нами фактами СК-активации и СК-повышения содержания ферментов ранних стадий липоксигеназного сигнального каскада (липиддесатуразы, фосфолипазы А2, липоксигеназы), ингибирование образования 10,11-редуктазы 12-ОФДК. а следовательно, синтеза жасмонатов, должно, во-первых, вызвать накопление их предшественницы - ОФДК, являющейся сильнейшим фактором локального иммунитета и. во-вторых, привести к перераспределению потоков сигнальных метаболитов в сторону усиления синтеза нециклических летучих и нелетучих оксилипинов, многие из которых обладают свойствами антибиотиков и гормонов. К первым относятся продукты гидропероксидлиазных реакций (летучие соединения семейств гексеналей и ноненалей), пероксигеназных реакций (эпоксидные и гидроксипроизводные гидроперекисей полиеновых жирных кислот), алленоксидсинтазных реакций (кетолы - продукты превращения гидроперокси-линоленовой кислоты), продукты реакций синтеза дивиниловых эфиров. Ко вторым -раневые гормоны - травматиновая кислота и травматин. способствующие заживлению раневых поверхностей.

Сложные липиды (линолеоил) деситуразц^

Сложные лнпиды

(линоленонл) липазы^

Линоленовая кислота

_£_

Гидропероксилиноленаты ^оксофнтодненовая гидрокси- \ Гексанали,

СП

травматиновая

_ 12-ОЩ

^асмонаты

ноненали кислота, травматин протвояные \(антибнотики(раневые гормоны) (антибиотики)

ФДКБ

(системный (системный (локальный иммунитет)иммунитет) иммунитет)

Дивиниловые

эфиры (антибиотики)

Рис. 12. Упрощенная схема липоксигеназного сигнального каскада и участия СК в синтезе ЖК. АОС - алленоксидсинтаза; АОЦ - алленоксидциклаза: ПОГ -пероксидгидролаза; ДЭС - дивинилэстераза; ГПЛ - гидропероксидлиаза; СИБ -салицилат-индуцируемые белки; ЖИБ — жасмонат-индуцируемые белки; ФДКБ -белки, индуцируемые 12-оксофитодиеновой кислотой.

Можно сделать вывод, что ингибирование образования 10,11-редуктазы 12-ОФДК салициловой кислотой не только затрудняет образование одного из ключевых факторов системного иммунитета - жасмоновой кислоты (это становится

нецелесообразным в случае высокого содержания СК- другого ключевого фактора системного иммунитета), но и усиливает локальный иммунитет за счет накопления ОФДК и антипатогенную направленность липоксигеназного метаболизма.

Было обнаружено несколько изоформ 10,11-редуктазы 12-ОФДК; причем большая часть из них не способна катализировать реакцию восстановления ОФДК (Ы^а, 2002). По неопубликованным данным А.Н. Гречкина с сотрудниками, эти изоформы редуктазы способны восстанавливать другие оксилипины - а-, (3-ненасышенные альдегиды- производные полиеновых жирных кислот.

Использованные нами методы исследования не позволяют распознать, какую именно реакцию катализирует выявленная нами 10,11-редуктаза 12-ОФДК, но в любом случае ее исчезновение или снижение содержания должно привести к драматическим последствиям в осуществлении липоксигеназного сигнального каскада, в соотношении различных оксилипинов.

2.7. Возможная роль СК - индуцируемого образования комплексообразующих белков. Одним из важнейших впервые установленных нами фактов является вызываемое СК в концентрации 100 мкМ усиление синтеза совокупности комплексообразующих белков, участвующих в репарации нарушенных структур ДНК (ядерный антиген пролиферирующих клеток), рефолдинге белков (шаперонин 60) и в деградации белков (полиубиквитин и полиубиквитинподобный белок), а также в функционировании сигнальных систем клеток (белок 14-3-3) (рис. 13).

днк

14-3-3—>1

м|НК

РИБОСОМЫ <—ФЭ ШпрнбО \ 3 /

БЕЛКИ г^БЕЛКИ*

<-ПУ

I-

АМИНОКИСЛОТЫ

Рис. 13. Схема участия комплексообразующих белков в репарации ДНК (РСНА-ядерный антиген пролиферирующих клеток); в рефолдинге белков (Шпрн 60-шаперонин 60); в деградации белков (ПУ - полиубиквитин); в сигналинге (белок 14-33). ФЭТ - фактор элонгации трансляции; ДНК* - поврежденная ДНК; белки -деформированные белки; 1 - нарушение структуры ДНК; 2 - репарация ДНК : 3 -нарушение конформации белков; 4 - рефолдинг белков .

Это позволяет считать, что вызванная салицилом ПКС клеток корней сопровождается особым типом неизвестного ранее изменения протеома.

В литературе очень мало информации о том, как изменяются протеомы растений при ПКС (¿^асЫпзку е1 а1„ 2004), поэтому мы не можем в настоящее время судить о том. является ли этот тип изменения неспецифическим, независимым от причины, вызвавшей ПКС. или характерным только для «салицилат - индуцированной ПКС». Для решения этой интереснейшей задачи требуется проведение дополнительных исследований, но уже сейчас можно сделать вывод, что образование белковых структур комплексообразующими белками при «салицилат-индуцированной ПКС», вызванной атакой патогенов или воздействием абиогенных стрессоров, является одной из характерных черт изменений протеомов.

Содержание и активность этих комплексообразующих белков определяют скорость и направленность важнейших метаболических процессов, от которых зависит судьба клеток при ПКС - их гибель или «выздоровление».

Наши исследования показали, что СК вызывает изменения протеомов листьев и корней, проявляющиеся, главным образом, в увеличении содержания защитных белков прямого антипатогенного действия и белков, повышающих устойчивость самих клеток растений. К первым в листьях относятся хитиназы, (3-1.3-глюканазы, глюкозидгидролаза сем. 18: ко вторым - АБК-зависимый белок, белок устойчивости к болезням, глютатион-Б-трансферазы, аскорбатпероксидаза.

Были обнаружены принципиальные различия в ответе протеомов листьев и корней растений гороха на действие СК, что может свидетельствовать и о различиях в механизмах защиты клеток этих органов от патогенов. Из всех идентифицированных СК-индуцируемых белков лишь один белок был характерен и для листьев и для корней (белок устойчивости к болезням).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Листья (СК 50 мкМ)

Рис. 14. Общие и специфические СК-индуцируемые белки в листьях и корнях.

Корни Корни

(СК 50 мкМ) (СКЮОмкМ)

Среди идентифицированных белков корней, подвергнутых действию СК в низкой (50 мкМ) и высокой (100 мкМ) концентрациях, было обнаружено пять общих белков (рис. 14). Естественно, что эти числовые значения будут гораздо больше, если иметь в виду совокупность всех белков, а не только идентифицированных.

На наш взгляд, к числу наиболее важных СК-индуцируемых изменений в протеомах. имеющих особенно важное значение для сигнального метаболизма клеток корней гороха, являются снижение содержания и даже исчезновение 10,11-редуктазы 12-оксофитодиеновой кислоты, а также повышение содержания комплексообра-зующих белков при действии на корни СК в «апоптозной» (100 мкМ) концентрации.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено в среднем 600 белков в листьях и 900 белков в корнях проростков гороха при разделении растворимых белков с помощью двумерного электрофореза. Салициловая кислота (50 мкМ) индуцировала изменение содержания 32 белков в листьях и 27 белков в корнях, а при концентрации 100 мкМ - 43 белков в корнях.

2. Идентифицировано 13 салицилат-индуцируемых белков в листьях, и 23 белка в корнях, из которых 9 белков индуцировалось при действии низкой (50 мкМ) и 14 при действии высокой (100 мкМ) концентраций СК. Среди этих белков были обнаружены как защитные белки прямого антипатогенного действия (хитиназы, бета-1,3-глюканазы, гликозидгидролаза семейства 18). так и белки, повышающие устойчивость к патогенам клеток растения (аскорбатпероксидаза. глутатион-5-трансфераза. белок 33 кДа фотосистемы II и др.).

3. Впервые в качестве салицилат-индуцируемых были идентифицированы 15 белков листьев и корней гороха. Эти белки принимают участие в защитных (гликозидгидролаза семейства 18), сигнальных (нуклеотидсвязывающий обогащенный лейциновыми повторами белок, белок 14-3-3, 10,11-редуктаза 12-оксофитодиеновой кислоты), энергетических (альфа-амилаза, малатдегидрогеназа цитоплазматическая) и других физиолого-биохимических процессах.

4. Впервые обнаружено салицилат-индуцируемое исчезновение 10,11-редуктазы 12-оксофитодиеновой кислоты - фермента синтеза жасмоновой кислоты.

5. Показано, что салициловая кислота в концентрации 100 мкМ вызывает программируемую клеточную смерть клеток апексов корней проростков гороха.

6. Впервые показано, что салициловая кислота в «апоптозной» концентрации вызывает усиление синтеза комплексообразующих белков, учас гвутощих в репарации нарушенных структур ДНК (ядерный антиген пролиферирующих клеток), рефолдинге (шаперонин ерп 60) и деградации (полиубиквитин) белков, а также в функционировании белковых медиаторов сигнальных систем клеток (белок 14-3-3).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Яковлева, В.Г. Салицилат-индуцированное изменение набора и содержания белков в корнях гороха / В.Г. Яковлева, И.А. Тарчевский, A.M. Егорова // Докл. РАН. -2007. - Т. 415, № 6. - С.832-836.

2. Егорова, A.M. Механизм подавления салициловой кислотой синтеза жасмоната у растений / A.M. Егорова, В.Г. Яковлева, И.А. Тарчевский // Сб. мат-в / Объед. научно-тех. изд-во ПНЦ РАН. - Пущино, 2007. - С. 255-258.

3. Яковлева, В.Г. Салицилат- и жасмонат- индуцированное репрограммирование синтеза белков в корнях гороха / В.Г. Яковлева, И.А. Тарчевский, A.M. Егорова // Сб. мат-в / РИО НЦРВХ СО РАМН. - Иркутск. 2007. - С. 338-342.

4. Tarchevsky, I.A. The mechanism of inhibition effect of salicylic acid on jasmonates synthesis / I.A. Tarchevsky, V.G. Yakovleva, A.M. Egorova // Abstracts / НТУУ КП1 ВП1 ВПК Полпехшка. - Kiev, 2007. - P. 63.

5. Яковлева. В.Г. Сравнительный анализ сапицилат-индуцированного изменения набора и содержания белков в листьях и корнях гороха / В.Г. Яковлева, И.А. Тарчевский, A.M. Егорова // Тезисы докл. / Коми НЦ УрО РАН. - Сыктывкар, 2007. -С. 402-403.

6. Егорова, A.M. Салицилат-индуцированные изменения в протеоме корней гороха. Исчезновение 10,11-редуктазы 12-оксофитодиеновой кислоты как причина подавления синтеза стрессового фитогормона - жасмоновой кислоты / A.M. Егорова, В.Г. Яковлева, И.А. Тарчевский // Тезисы докл. / Изд-во Башкирского института развития образования. - Уфа, 2007. -С. 42-43.

7. Тарчевский И.А. Протеомный анализ изменений в корнях гороха вызванных апопоз-индуцируюшей концентрацией салициловой кислоты / И.А. Тарчевский, В.Г. Яковлева, A.M. Егорова // Докл. РАН. - 2008. - Т. 422, № 3. - С. 410-414.

8. Тарчевский. И.А. Молекулярные механизмы подавления салициловой кислотой образования жасмонатов / И.А. Тарчевский, В.Г. Яковлева, A.M. Егорова // Тезисы докл. / Изд-во ФизтехПресс. - Казань, 2008. - С. 43.

9. Яковлева, В.Г. Сачицилат - индуцированное образование компонентов супрамо-лекулярных белковых комплексов / В.Г. Яковлева, A.M. Егорова, И.А. Тарчевский // Тезисы докл. / Изд-во Уральского университета. - Екатеринбург, 2008. С. 451.

10. Яковлева, В.Г. Влияние салициловой кислоты на протеом корней гороха / В.Г. Яковлева, И.А. Тарчевский, A.M. Егорова // Тезисы докл. / Изд-во Арта. Новосибирск, 2008. - С. 196.

11. Егорова, A.M. Протеомный анализ салицилат-индуцированных белков листьев гороха / A.M. Егорова, В.Г. Яковлева, И.А. Тарчевский // Тезисы докл. / Изд-во ФизтехПресс. - Казань, 2009. - С. 292

12. Протеомный анализ салицилат-индуцированных белков из корней проростков гороха / В.Г. Яковлева, И.А. Тарчевский, A.M. Егорова, Н.Е. Мухаметшина // Сб. мат-ов / РИО НЦРВХ СО РАМН. - Иркутск, 2009. - С. 538-541.

Подписано в печать 20.10.09. Формат 60 х 84 1/16. Печать ризографическая. Печ. л. 1,56. Тираж 100 экз. Заказ 71/10

Отпечатано с готового оригинала-макета в типографии Издательства Казанского государственного университета

420008, ул. Профессора Нужина, 1/37 тел.: 233-73-59, 292-65-60

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Егорова, Алевтина Михайловна

Оглавление.

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Протеомные исследования растений.

1.2. Способы защиты растений от патогенов.

1.3. Салициловая кислота в растениях.

1.4. Программируемая клеточная смерть клеток растений.

1.5. Системная приобретенная устойчивость.

1.6. Патоген-идуцируемые и СК-индуцируемые изменения содержания белков.

Глава 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Условия выращивания и обработки.

2.3. Протеомные исследования.

2.3.1. Выделение белков.

2.3.2. Определение количества белка по методу Лоури.

2.3.3.Разделение растворимых белков методом двумерного электрофореза.

2.3.4. Обработка гелей.

2.3.5. Триптический гидролиз белков.

2.3.6. Получение MS и MS/MS спектров белков.

2.3.7. Идентификация белков.

2.4. Определение программируемой клеточной смерти.

2.4.1. Окраска корней красителем Эванс голубой (Evans Blue).

2.4.2 Выделение и электрофоретическое разделение ДНК.

2.4.3. Детекция NO.

2.5. Химические реактивы и материалы.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Влияние СК на рост корней проростков гороха.

3.1.2. Влияние СК на общее содержание растворимых белков в листьях и корнях гороха.

3.2. Влияние салициловой кислоты на протеом листьев гороха.

3.1.2. Салицилат-индуцируемые белки листьев.

3.3. Влияние салициловой кислоты на протеом корней гороха.

3.3.1. Влияние СК (50 мкМ) на протеом корней гороха.

3.3.2.Результаты идентификации СК-индуцируемых белков корней.

3.4. Салициловая кислота как индуктор программируемой клеточной смерти.

3.5. Влияние СК (100 мкМ) на протеом корней гороха.

3.5.1. Результаты идентификации белков корней индуцируемых

1 ООмкМ СК.

3.6. Салицилат - индуцируемое изменение синтеза белков.

3.6.1. Взаимодействие СК с факторами транскрипции.

3.6.2. Возможные причины и последствия СК - индуцируемого исчезновения 10,11-редуктазы 12-оксофитодиеновой кислоты.

3.6.3. Возможная роль СК-индуцируемого образования комплексо-образующих белков.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние салициловой кислоты на протеомы листьев и корней гороха"

Актуальность проблемы. Одним из магистральных направлений исследований биологических систем в последнем десятилетии может считаться протеомика, в том числе протеомика растений. Ее задачей является получение информации о протеомах - совокупности белков организма, изменениях в их наборе и содержании в ходе его развития и при изменении условий существования, в том числе при действии различных биотических и абиотических стрессоров. Задача очень трудная и долговременная, особенно если иметь в виду, что исследоваться должны и растворимые и мембранные белки различных органов и органоидов (ядра, хлоропласты, митохондрии и др.) растений.

О важности протеомного направления можно судить по созданию специальных журналов (Proteomics, Journal of Proteome Research, Journal of Proteomics, Molecular and Cell Proteomics, Current Protein and Peptide Science) и специальных разделов, посвященных протеомике, во многих авторитетных журналах.

Стало традицией публиковать обзоры статей по протеомике растений (Rossignol et al., 2006; Jorrin et al., 2007; Jorrin-Novo et al., 2009). Эти обзоры позволяют видеть, насколько много или мало внимания уделяется протеомным исследованиям в той или иной области биологии растений. Из обзора работ, опубликованных, например, в 2006 году (Jorrin et al., 2007), следует, что из 146 статей по протеомике растений всего три статьи было посвящено влиянию стрессовых фитогормонов и 14 - корням растений. Считается, что последнего совершенно недостаточно и что усиление исследований по протеомике корней (рутеомике - rooteomics) необходимо для анализа особенностей развития различных растений, формирования у них устойчивости к абиотическим неблагоприятным условиям существования и иммунитета к различным патогенам (Mehta et al., 2008). Эти авторы отмечают, что в связи с малой изученностью протеомов корней возникают трудности с идентификацией части белков (в связи с недостаточным набором белков корней в существующих базах данных, по сравнению с белками листьев). С другой стороны, это указывает на необходимость интенсификации исследований протеомов корней и влияния на них изменений условий существования растений.

В повышении устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессорам ключевую роль играют стрессовые фитогормоны, но сведений об их действии на протеомы корней имеется очень мало. О влиянии салициловой кислоты (СК) - ключевого фактора индукции системного иммунитета растений, такие данные практически отсутствуют, поэтому можно сделать вывод, что исследование влияния на протеомы корней СК является актуальным и перспективным.

Работа в этом направлении может внести вклад в познание особенностей функционирования сигнальных систем клеток растений, поскольку изменение протеомов под влиянием СК осуществляется при участии сигнальных систем. Различные сигнальные системы интенсивно изучаются в институте физиологии растений РАН (О.Н. Кулаева, Вл.В. Кузнецов, В.В. Кузнецов и др.,), в институте биохимии РАН (О.П. Кораблева, O.JI. Озерецковская, Н.И. Васюкова и др.), в Сибирском институте физиологии и биохимии растений СОР АН (В.К Войников, JI.A. Ломоватская и др.), институте биохимии и генетики УНЦ РАН (И.В. Максимов, Ф.М. Шакирова и др.), Казанском институте биохимии и биофизики (А.Н. Гречкин, Ф.Г. Каримова, Ф.В. Минибаева, И.А.Тарчевский и др.), Санкт-Петербургском госуниверситете (С.С. Медведев, М.Ф. Шишова и др.). В тоже время, протеомному анализу действия стрессовых фитогормонов, в частности, салициловой кислоты, практически не уделяется внимание.

Цель и задачи исследования. Целью исследований было выяснение особенностей влияния одного из ключевых факторов системного фитоиммунитета - салициловой кислоты на протеомы листьев и корней гороха.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Выявление салицилат-индуцируемых белков листьев и корней гороха с помощью двумерного электрофореза.

2. Идентификация выявленных салицилат-индуцируемых белков с помощью масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS (MS/MS)).

3. Анализ роли СК-индуцируемых белков.

Научная новизна работы. Впервые идентифицированы 15 неизвестных ранее салицилат-индуцируемых белков: бета-субъединица В трансляционного фактора I элонгации, 10,11-редуктаза 12-оксофитодиеновой кислоты, нуклео-тидсвязывающий обогащенный лейциновыми повторами белок (NBS-LRR type RGA), малатдегидрогеназа цитоплазматическая, предшественник шаперонина альфа-српбО, полиубиквитин и полиубиквитинподобный белок, белок 14-3-3, 5 метилтетрагидроптероилтриглутаматгомоцистеин-8-метилтрансфераза, альфа-амилаза (каталитическая область), ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), гликозидгидролаза семейства 18, глутаминамидотрансфераза, липиддесатуразоподобный белок, белок 33 кДа фотосистемы II. Эти белки принимают участие в защитных реакциях, в энергетических процессах растений, в дупликации и репарации ДНК, синтезе, рефолдинге и деградации белков, в сигнальных процессах клеток.

Научно-практическая значимость работы. Результаты проведенных нами исследований вносят вклад в познание молекулярных механизмов действия стрессового фитогормона салициловой кислоты, являющейся одним из ключевых факторов системного иммунитета растений. Был обнаружен целый ряд белков, неизвестных ранее в качестве салицилат-индуцируемых, что позволило расширить представления о механизмах регуляции салициловой кислотой реакций формирования фитоиммунитета. Материалы диссертации могут быть использованы при чтении курсов лекций, и учитываться при подборе компоненов для создания новых эффективных антипатогенных препаратов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в 2006-2009 гг. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН. Исследования являлись частью работ, проводимых по грантам РФФИ, РАН по МКБ, а также гранта для государственной поддержки ведущих научных школ. Автор принимала непосредственное участие в проведении экспериментов и в написании статей и тезисов докладов, выступала на международных и всероссийских конференцях.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007); школе-конференции молодых ученых «Биомика - наука XXI века» (Уфа, 2007); Всероссийской конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007); Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008); Международном симпозиуме «Липиды и оксилипины растений» (Казань, 2008); IV Всероссийском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009); VII Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2009), а так же на итоговых конференциях Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2008 и 2009гг).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Егорова, Алевтина Михайловна

ВЫВОДЫ

2. Идентифицировано 13 салицилат-индуцируемых белков в листьях, и 23 белка в корнях, из которых 9 белков индуцировалось при действии низкой (50 мкМ) и 14 при действии высокой (100 мкМ) концентраций СК. Среди этих белков были обнаружены как защитные белки прямого антипатогенного действия (хитиназы, бета-1,3-глюканазы, гликозидгидролаза семейства 18), так и белки, повышающие устойчивость к патогенам клеток растения (аскорбатпероксидаза, глутатион-8-трансфераза, белок 33 кДа фотосистемы II и др.).

6. Впервые показано, что салициловая кислота в «апоптозной» концентрации вызывает усиление синтеза комплексообразующих белков, участвующих в репарации нарушенных структур ДНК (ядерный антиген пролиферирующих клеток), рефолдинге (шаперонин срп 60) и деградации (полиубиквитин) белков, а также в функционировании белковых медиаторов сигнальных систем клеток (белок 14-3-3).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наши исследования показали, что СК вызывает изменения протеомов листьев и корней, проявляющиеся, главным образом, в повышении содержания защитных белков прямого антипатогенного действия и белков, вызывающих повышение иммунитета самих клеток растений. К первым в листьях относятся хитиназы, (3-1,3-глюканазы, глюкозидгидролаза сем. 18, ко вторым - АБК-зависимый белок, белок устойчивости к болезням, глютатион-S-трансферазы, аскорбатпероксидаза.

Кроме того, обращает на себя внимание повышение содержания некоторых ферментов (енолаза, малатдегидрогеназа), принимающих участие в энергетических процессах, например, в дыхании, которое, как известно, усиливается при действии патогенов, элиситоров и СК. Большую роль в повышении устойчивости фото синтетического аппарата листьев может играть СК-индуцируемое повышение содержания белка 33 кДа фотосистемы II.

Часть белков перечисленных выше групп была известна как СК-индуцируемые из работ других исследователей. Нам удалось впервые идентифицировать 15 белков в качестве СК — индуцируемых.

Несколько СК-индуцируемых белков, проанализированных с помощью масс-спектрометрии, не удалось идентифицировать, так как они не имелись в базах данных уже известных белков. Изучение этих белков, их функциональной роли должно быть продолжено. Особенно это относится к появляющемуся под влиянием СК раньше других мажорному белку 30 кДа, который, по-видимому, играет важную роль в ответе корней растений на действие СК.

Было обнаружено принципиальное различие между корнями и листьями растений гороха в ответе протеомов на действие СК, что свидетельствует и о различиях в механизмах защиты клеток этих органов от патогенов. Из всех идентифицированных СК-индуцируемых белков лишь один белок был характерен и для листьев и для корней (белок устойчивости к болезням). Среди идентифицированных белков корней, подвергнутых действию СК в низкой (50 мкМ) и высокой (100 мкМ) концентрациях, было обнаружено пять общих белков (рис. 34). Естественно, что эти числовые значения будут гораздо больше, если иметь в виду совокупность всех белков, а не только идентифицированных.

Листья (СК 50 мкМ)

СК 50 мкМ) (СК 100 мкМ)

Рис. 34. Общие и специфические СК-индуцируемые белки в листьях и корнях.

На наш взгляд, к числу наиболее важных СК-индуцируемых изменений в протеомах, имеющих особенно важное значение для сигнального метаболизма клеток корней гороха, являются снижение содержания и даже исчезновение 10,11-редуктазы 12-оксофитодиеновой кислоты, а также повышение содержания комплексообразующих белков при действии на корни СК в «апоптозной» (100 мкМ) концентрации.

109

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Егорова, Алевтина Михайловна, Казань

1. Абдрахимов, Ф.А. Влияние салициловой и э/сасмоновой кислот на ультраструктуру корней гороха (Pisum sativum L.) / Ф.А. Абдрахимов,

2. B.Г. Яковлева //Материалы Всеросс. Науч. Конф — Иркутск, 2007. — С. 9-13.

3. Бурханова, Э.А. Сравнительное изучение влияния салициловой кислоты и (2'-5')-олигоаденилатов на синтез белка в листьях табака при тепловом шоке // Бурханова Э.А., Федина А.Б., Кулаева О.Н. / Физиол. Растений. -1999. Т. 46. -№>!.- С. 16-22.

4. Васюкова, Н.И. Индуцированная устойчивость растений и салициловая кислота / Н.И. Васюкова, О.Л. Озерецковская // Прикл. биохим. и микробиол,- 2007. -ТАЗ. С.405-411.

5. Ванюшин, Б.Ф. Апоптоз у растений / Б.Ф. Ванюшин // Успехи биологической химии. -2001.- Т. 41,- С. 3-38.

6. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловер. Д.Г.-М.:Мир, 1988.-538с.

7. Гречкин, А.Н. Липоксигеназная сигнальная система / А.Н. Гречкин, И.А. Тарчевский // Физиология растений.- 1999.- Т.46.-№ 1. С. 132-142.

8. Говорун, В.М. Протеомные технологии в современной биомедицинской науке //В.М. Говорун, А.И Арчаков //Биохимия.- 2002.- Т. 67.- № 10.- С. 1341-1359.

9. Салициловая кислота вызывает диссипацию протонного градиента на плазмалемме растительных клеток / JI.X Гордон, Ф.В. Минибаева, Т.И. Огородникова и др. //Доклады Академии Наук. — 2002. — Т. 387. — Мб,—1. C. 839-841.

10. Общая и молекулярная фитопатология / Ю.Т. Дьяков, O.JI. Озерецковская, В.Г. Джавахия, С.Ф. Багирова. Москва.: Общество фитопатологов, 2001. — 302 с.

11. Насонов, Д.Н. Реакция живого вещества на внешние воздействия. Денатурационная теория повреждения и раздражения / Д.Н. Насонов, В.Я. Александров. -М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1940. 251с.

12. Влияние салициловой кислоты на развитие индуцированной термотолерантности и индукцию синтеза БТШ в культуре клеток Arabidopsis thaliana / E.JI. Павлова, Е.Г. Рихванов, E.JI. Таусон и др. // Физиология растений. — 2009. — Т. 56. —N1. —С. 78-84.

13. Микоплазма-индуцированные и жасмонат-индуцированные белки растений гороха / И.А. Тарчевский, Н.Н. Максюпгова, В.Г. Яковлева, В.М. Чернов // Доклады Академии Наук. 1996. - Т. 350. - С. 544-546.

14. Тарчевский, И.А. Молекулярные аспекты фитоиммунитета / И.А. Тарчевский, В.М. Чернов // Микология и фитопатология. 2000. Т. 34. N 3. С. 1-10.

15. Тарчевский, И.А. Метаболизм растений при стрессе / И.А. Тарчевский. -Казань: Фэн, 2001а. 448с.

16. Тарчевский, И.А. Патоген- индуцируемые белки / И.А Тарчевский // Прикл. Биохимия и микробиология. —20016. — Т.37. — №. 5. — С.517-532.

17. Тарчевский, И.А. Сигнальные системы клеток растений / И.А. Тарчевский. Москва: Наука, 2002. — 294 с.

18. Чернов, В.М. Феноменология микоплазменных инфекций растений / В.М. Чернов О.А. Чернова, И.А. Тарчевский // Физиол. Растений. — 1996. — Т. 43.-№ 5. С. 694-701.

19. Шакирова, Ф.М. Салициловая кислота- индуктор устойчивости растений к неблагоприятным факторам / Ф.М. Шакирова // Агрохимия. 2000. —№ 1.- С. 87-94.

20. Шакирова, Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция / Ф.М Шакирова. — Уфа: Гилем, 2001. 159 с.

21. Comparative proteomics of leaf, stem and tissues of synthetic Brassica napus / W. Albertin, О Langella, J. Joets et al., // Proteomics. — 2009. — Vol. 9. P. 793- 799.

22. Alvarez, M.E. Salicylic acid in the machinery of hypersensitive cell death and disease resistance /M.E. Alvarez //Plant. Mol. Biol. —2000. — Vol.44. — N 3. — P. 429- 442.

23. Fumonisin Bl-induced cell death in arabidopsis protoplasts requires jasmonate-, ethylene-, and salicylate-dependent signaling pathways / T. Asai, J.M. Stone, J.E. Heard et al. //Plant Cell. 2000. - Vol 12. - N 10. - P. 1823-36.

24. Transcriptome analysis of Arabidopsis roots treated with signaling compounds: a focus on signal transduction, metabolic regulation and secretion / D.V. Badri, V.M. Loyola-Vargas, J. Du, F.R. Stermitz //New Phytologist. — 2008. Vol. 179. -P.209-223.

25. Baker, C.J. An improved method for monitoring cell death in cell suspension and leaf disc assays using evans blue / C.J. Baker, N.M. Mock // Plant Cell Tiss. and organ Cult. 1994. - Vol. 39. -P. 7-12.

26. Beisgen, C. Structure and regulation of 0PR1 and 0PR2, two closely related genes encoding 12-oxophytodienoic acid-10,11- reductase from Arabidopsis thaliana/C. Beisgen, E.W. Weiler//Planta. 1999. - Vol. 208. -P. 155-165.

27. Bent, A.F. Plant disease resistance genes: Function meet structure / A.F. Bent //Plant Cell. 1996. - Vol. 8. N10. -P. 1757-1771.

28. Bishop, J.G. Rapid evolution in plant chitinases: molecular targets of selection in plant-pathogen coevolution / J. G. Bishop, A.M. Dean, T. Mitchell-Olds // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2000. Vol. 97. - P.5322-5327.

29. Identification of NPR1-dependent and independent genes early induced by salicylic acid treatment in Arabidopsis / F. Blanco, V. Garretotn, N. Frey et al. // Plant Molecular Biology. 2005. - Vol. 59. -P. 927-944.

30. Early genomic responses to salicylic acid in Arabidopsis / F. Blanco, P. Salinas, N.M. Cecchini et al., // Plant.Mol.Biol. 2009. - Vol. 70. - P. 79102.

31. Brooks, D.M. The Pseudomonas syringae phytotoxin coronatine promotes virulence by overcoming salicylic aciddependent defences in Arabidopsis thaliana / D.M. Brooks, C.L. Bender, B.N. Kunkel // Mol Plant Pathol. -2005. Vol. 6. -P. 629-639.

32. Substrate specificities of tobacco chitinases / F. Brunner, A. Stintzi, B. Fritig, M. Legrand // Plant J. 1998. - Vol. 14. -P. 225-234.

33. Primary structure and expression of acidic (class II) chitinase in potato / R. Buchter, A. Stromberg, E. Schmelzer, E. Kombrink //Plant Mol. Biol. 1997. - Vol. 35. -P. 749-761.

34. The major birch pollen allergen, Bet vl, shows ribonuclease activity / A. Bufe, M.D. Spangfort, H. Kahlert, et al.// Planta. 1996. - P. 413-415.

35. Busam, G. Differential expression of chitinases in Vitis vinifera L. responding to systemic acquired resistance activators or fungal challenge // G. Busam, H.H. Kassemeyer, U. Matern //Plant Physiol. 1997. - Vol.115. N 3. - P. 1029-1038.

36. Canovas, F.M. Plant proteome analysis / F.M.Canovas, E. Dumas-Gaudot, G. Recorbet et al., //Proteomics. 2004. - Vol. 4. -P. 285-298.

37. Salicylic acid production in response to biotic and abiotic stress depends on isochorismate in Nicotiana benthamiana / J. Catinot, A. Buchala, E. Abou-Mansour, J.-P. Mtetraux//FEBSLett. 2008. - Vol. 582. -P. 473-478.

38. Proteome approach to characterize proteins induced by antagonist yeast and salicylic acid in peach fruit // Z. Chan, G. Qin, X. Xu et al.// Journal of Proteome Research. 2007. - Vol. 6. -P. 1677-1688.

39. Functions of defense-related proteins and dehydrogenases in resistance response induced by salicylic acid in sweet cherry fruits at different maturity stages / Z. Chan, Q. Wang, X. Xu et al. // Proteomics. — 2008. Vol. 8. - N 22. -P. 4791-4807.

40. Chen, C. Isolation and characterization of two pathogen- and salicylic acid-induced genes encoding WRKY DNA-binding proteins from tobacco / C. Chen, Z. Chen //Plant MolBiol. 2000. - Vol. 42. -N2.-P. 387-396.

41. Chen, S. Advances in plant proteomics / S. Chen, A. Harmon //Proteomics. — 2006. Vol. 6. -P. 5504-5516.

42. Chen, Z. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid / Z. Chen, H. Silva, D.F. Klessig // Science. — 1993. Vol. 262. - P. 1883-1886.

43. The molecular characterization of two barley proteins establishes the novel PR-17 family ofpathogenesis- related proteins / A.B. Christensen, B. Ho-Cho, M. Naesby et al. //Mol. Plant. Pathol. 2002. - Vol. 3. - P. 135-144.

44. NO way back: nitric oxide and programmed cell death in Arabidopsis thaliana suspension cultures / A. Clarke, R. Desikan, R.D. Hurst et al. // The Plant J. — 2000. Vol. 24. -N5.-P. 667-677.

45. Detoxification of xenobiotics by plants: chemical modification and vacuolar compartmentation // J. O.D. Coleman, M.M.A. Blake-Kalff, T. G. E. Davies // Trends Plant Sci. 1997. - Vol. 2. - P. 144-151.

46. Plant chitinases /D.B. Collinge, K.M. Kragh, J.D. Mikkelsen et al. //Plant J. 1993. Vol. 3. P. 31-40.

47. Pseudomonas syringae manipulates systemic plant defenses against pathogens and herbivores / J. Cui, A.K. Bahrami, E.G. Pringle et al. // Proc.Natl.Aca.Sci. USA.-2005. Vol. 102.-P. 1791-1796.

48. Cullimore, J.V. Perception of lipochitooligosaccharidic Nod factors in legumes / J. V. Cullimore, R. Ranjeva, J-J. Bono // Trends Plant Sci. — 2001. — Vol. 6.-P. 24-30.

49. A proteomic approach to study pea (Pisum sativum) responses to powdery mildew (Erysiphe pisi) / M. Curto, E. Camafeita, J.A. Lopez et al. // Proteomics. -2006. Vol. 6. -P. 163-174.

50. Isolation and characterization of a class of carbohydrate oxidases from higher plants, with a role in active defense / J.H.H. V. Custers, S.J. Harrison, M.B. Sela- Buurlage et al. //Plant J. 2004. - Vol.39. - P. 147-60.

51. Darling, D.L. Role of 14-3-3 proteins in eukaryotic signaling and development / D.L. Darling, J. Yingling, A. Wynshaw—Boris // Current Topics in Developmental Biology. 2005. - Vol. 68. -P. 281-315.

52. A central role for salicylic acid in plant disease resistance / T.P. Delaney, S. Uknes, B.Vernooij et al. //Science. 1994. - V. 266. - N 5188. - P. 12471250.

53. Delledonne, M. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance / M. Delledonne, Y. Xia, R.A. Dixon, C. Lamb //Nature. 1998. - Vol. 394. -P. 585-588.

54. Dixon, D. P. Glutathione-mediated detoxification systems in plants / D.P. Dixon, I. Cummins, D.J. Cole, R. Edwards // Curr. Opin. Plant Biol. 1998. - Vol. 1. -P. 258-266.

55. Dixon, D. P. Plant glutathione transferases / D. P. Dixon, A. Lapthorn, R. Edwards // Genome Biology. 2002. - Vol. 3.-N3. P. 1-10.

56. Regulation of alternative oxidase gene expression in soybean /I. Djajanegara, P.M. Finnegan, C. Mathieu et al. // Plant Molecular Biology. 2002. — Vol. 50. -P. 735-742.

57. Dong, X. NPR1, all things considered / X. Dong // Curr.Opin.Plant Biol. — 2004. Vol.7.-P. 547-552.

58. Dong, W. Protein polyubiquitination plays a role in basal host resistance of barley/W. Dong, D. Nowara, P. Schweizer // Plant Cell. 2006. - Vol. 18. -N. 11.-P. 3321-3331.

59. Dreher, K. Ubiquitin, hormones and biotic stress in plants / K. Dreher, J. Callis//Ann Bot. 2007. -N5.-P. 787-822.

60. Emergence of a subfamily of xylanase inhibitors within glycoside hydrolase family 18 / A. Durand, R. Hughes, A. Roussel et al. // FEBS J. — 2005— Vol. 272-P. 1745-1755.

61. Durner, J. Inhibition of ascorbate peroxidase by salicylic acid and 2,6-dichloroisonicotinic acid, two inducers of plant defense responses / J. Durner, D.F. Klessig // Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 11312-11316.

62. Durrani, W.E. Systemic acquired resistance / W.E. Durrani, X. Dong // Annu. Rev. Phytopathol. 2004. - Vol. 42. -P. 185-209.

63. Eckardt, N.A. Transcription factors dial 14-3-3 for nuclear shuttle / N.A Eckardt //Plant Cell. 2001. - Vol 13. -NIL- P.2385- 2389.

64. Edwards, R. Plant glutathione S-transferases: enzymes with multiple functions in sickness and in health / R. Edwards, D.P. Dixon, V. Walbot // Trends Plant Sci. 2000. - Vol. 5. -P. 193-198.

65. Ellis, R.J. The most abundant protein in the world / R.J. Ellis // Trends Biochem. Sciences. 1979. - Vol. 4. -P. 241-244.

66. Feussner, I. Induction of new lipoxygenase form in cucumber leaves by salicylic acid or 2,6-dichloroisonicotinic acid /1. Feussner, I.G. Fritz, C.J. Wasternack//Info Bot. Acta. 1997. - Vol. 110. -N. 2. -P. 101-110.

67. Feussner, I. The lipoxygenase pathway /1. Feussner, C. Wasternack // Annual Review of Plant Biology. 2002. - Vol. 53. -P. 275-297.

68. Structural and biochemical studies identify tobacco SABP2 as a methyl salicylate esterase and implicate it in plant innate immunity / F. Forouhar, Y Yang, D. Kumar et al // Proc.Natl.Acad Sci. USA. 2005. - Vol. 102. - P. 1773-1778.

69. A mammalian organelle map by protein correlation profiling / L. Foster, J. de Hoog, C. L. Zhang et al //Cell. 2006. - Vol. 125. - P. 187-199.

70. Gaff, D.F. The use of non-permeating pigments for testing the survival of cells // D.F. Gaff, O. Okong'O-Ogola // J Exp.Bot.-1971 -Vol. 22. -N 72. P. 756-758.

71. Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance / T. Gaffney, L. Friedrich, B. Vernooij et al //Science. 1993. - Vol. 261. -P. 754-756.

72. Gibson, C.M. Notes on infection experiments with various Uredineae / C.M. Gibson//New Phytologist. 1904. - Vol. 3. -P. 184-191.

73. Glazebrook, J. Isolation of Arabidopsis mutants with enhanced disease susceptibility by direct screening / J. Glazebrook, E.E. Rogers, F.M. Ausubel //Genetics. 1996. - Vol. 143. -P. 973-982.

74. Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens / J. Glazebrook // Annu. Rev. Phytopathol. — 2005. — Vol. 43. -P. 205-227.

75. A draft sequence of rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica) / S.A. Goff, D. Ricke, T.-H. ban et al //Science. -2002. Vol. 296. -P. 92-100.

76. Gorg, A. Two-dimensional electrophoresis / A. Gorg // Nature. 1991. - Vol. 349. -P. 545-546.

77. Grechkin, A.N. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway/A.N. Grechkin // Prog. Lipid Res. 1998.- Vol. 37-P. 317-352.

78. Hamel, F. Characterisation of a class I chitinase gene and of wound-inducible, root and flower-specific chitinase expression in Brassica napus // F. Hamel, G. Bellemare//Biochim. Biophys. Acta. 1995. - Vol. 1263. -P. 212-220.

79. Hart, G. T. How complete are current yeast and human protein-interaction networks? / G.T. Hart, A. Ramani, E. Marcotte // Genome Biol. 2006. — Vol. 7. -P. 120-125.

80. He, S.Y. Molecular biology of plant-bacteria interacnions / S.Y. He // MS U-DOE Plant Research Laboratory Annual Report. — 2008. — P. 12-22.

81. Nitric oxide function and signalling in plant disease resistance / J.K. Hong, B.~ W. Yun, J.-G. Rang et al. //J Exp. Bot. 2007. -P. 1-8.

82. Horvath, D.M. Identification of an immediate-early salicylic acid-inducible tobacco gene and characterization of induction by other compounds / D.M. Horvath, N.H. Chua//Plant Mol. Biol. 1996. - Vol. 31. -P. 1061-1072.

83. Over expression of a gene encoding hydrogen peroxide- generating oxalate oxidase evokes defense responses in sunflower / X. Ни, D. L. Bidney, N. Yalpanietal. //Plant Physiol. -2003. Vol. 133. -P. 170-181.

84. Huber, S.C. Metabolic enzymes as targets for 14-3-3 proteins / S.C. Huber, C. MacKintosh, W.M. Kaiser // Plant Mol.Biol. 2002. - Vol. 50. - N. 6. -P. 1053-1063.

85. International Rice Genome Sequencing Project. The map-based sequence of the rice genome. Nature. 2005. Vol 436. P. 793- 800.

86. Expression of the 12-oxophytodienoic acid 10,11- reductase gene in the compatible interaction between pea and fungal pathogen / Y. Ishiga, A.

87. Funato, Т. Tachiki et al. //Plant cell Physiol. 2002. - Vol. 43. N 10. - P. 1210-1220.

88. Jones, J.D.G. The plant immune system / J.D.G. Jones, J.L. Dangl // Nature. — 2006. Vol. 444-N16. -P. 323-329.

89. Jonsson, Z.O. Proliferating cell nuclear antigen: more than a clamp for DNA polymerases / Z.O. Jonsson, U. Hubscher //BioEssays. — 1997. — Vol. 19—N. 11.-P. 967-975.

90. Proteomics: a promising approach to study biotic interaction in legumes / J. Jorrin, D. Rubiales, E. Dumas-Gaudot et al. //Euphytica. — 2006. — Vol. 147. -P. 37-47.

91. Jorrin, J. V. Plant proteome analysis: a 2006 update / J. V. Jorrin, A.M. Maldonado, M,A. Castillejo //Proteomics. 2007. - Vol. 7. -P. 2947-2962.

92. Jung, J.L. Sunflower (Helianthus annuus L.) pathogenesis-related proteins (induction by spirin (acetylsalicylic acid) and characterization) / J.L. Jung, B. Fritig, G. Hahne //Plant Physiol. 1993. - Vol. 101. - P. 873-880.

93. Kasprzewska, A. Plant chitinases- regulation and function / A. Kasprzewska // Cellular and molecular biology letters. — 2003. — Vol. 8. — P. 809-824.

94. Kauss, H. Pretreatment of parsley suspension cultures with salicylic acid enhances spontaneous and elicited production of H2O2 / H. Kauss, W. Jeblick //Plant Physiol. 1995. - Vol. 109-N3. -P. 1171-1178.

95. Kazan, K. Jasmonate signaling: toward an integrated view / K. Kazan, J.M. Manners//Plant Physiology. 2008. - Vol. 146. -P. 1459-1468.

96. Proteomic analysis of differentially expressed proteins induced by rice blast fungus and elicitor in suspension-cultured rice cells / S. Y. Kim, K.S. Cho, S. Yo et al. //Proteomics. 2003. -Vol. 3. -P. 2368-2378.

97. Proteomic analysis of pathogen-responsive proteins from rice leaves induced by rice blast fungus, Magnaporthe grisea / S.T. Kim, S.G. Kim, D.H. Hwang et al. //Proteomics. 2004. - Vol. 4. - P. 3569-3578.

98. Koorneef, A. Crass talk in defense signaling / A. Koorneef, M.J. Pieterse // Plant Physiol. 2008. - Vol. 146. -P. 839-844.

99. Kinetics of salicylate-mediated suppression of jasmonate signaling reveal a role for redox modulation / A. Koornneef, A. Leon-Reyes, T. Ritsema et al. // Plant Physiol. 2008. - Vol. 147. -P. 1358-1368.

100. Kurepa, J. Structure, function and regulation of plant proteasomes / J. Kurepa, J.A. Smalle // Biochimie. 2008. - Vol. 90. -P. 324-335.

101. Regulation of cucumber class III chitinase gene expression / K.A. Lawton, J. Beck, S. Potter et al. // Mol. Plant-Microbe Interact. 1994. - Vol. 7. - P. 48-57.

102. Lee, H-L. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid / H-L. Lee, J. Le'on, I. Raskin //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. -P. 4076-4079.

103. Formation of plant cuticle: evidence for the occurrence of the peroxygenase pathway / J. Lequeu, M.L. Fauconnier, A. Chammai et al. // Plant J. — 2003. Vol. 36. -P. 155-164.

104. Li, J. The WRKY70 transcription factor: a node of convergence for jasmonate-mediated and salicylate-mediated signals in plant defense / J. Li, G. Brader, E. T. Palva //Plant Cell. 2004. - Vol. 16. - P.319-331.

105. Loake, G. Salicylic acid in plant defence—the players and protagonists. / G. Loake, M. Grant//Curr.Opin.PlantBiology. 2007. - Vol. 10.-P. 466-472.

106. Early activation of lipoxygenase in lentil (Lens culinaris) root protoplasts by oxidative stress induces programmed cell death / M. Maccarone, G. Van Zadelhoff, G.A. Veldink et al. // Eur JBiochem. 2000. - Vol. 267. -N16.-P. 5078-5084.

107. Salicylic acid: a likely endogenous signal in the resistance response of tobacco to viral infection / J. Malamy, J.P. Carr, D.F. Klessig, I. Raskin // Science. 1990. - Vol 250. -P. 1002-1004.

108. The transcriptome of Arabidopsis thaliana during systemic cquired resistance / K. Maleck, A. Levine, T. Eulgern et al. // Nat. Genet. — 2000. — Vol. 26. -P. 403-410.

109. Marry at, D.C.E. Notes on the infection and histology of two wheats immune to the attack of Puccinia glumarum, yellow rust /D.C.E. Marry at // Journal of Agricultural Science. 1907. - Vol. 2. -P. 129-138.

110. Marrs, K.A. The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants /К.А. Marrs // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1996. - Vol. 47.-P. 127-158.

111. McDowell, J.M. Signal transduction in the plant immune response / J.M. McDowell, J.L. Dangl // Trends in Biochemical Science. — 2000. — Vol. 25. -P. 79-82.

112. Rooteomics: the challenge of discovering plant defense-related proteins in roots / A. Mehta, B.S. Magalhaes, D.S. L. Souza et al. // Current Protein and Peptide Science. 2008. - Vol. 9. -P. 108-116.

113. Miernyk, J.A. Protein folding in the plant cell / J.A. Miernyk // Plant Physiology. 1999. - Vol. 121. - P. 695-703.

114. Malate dehydrogenases (structure and function) / P. Minarik, N. Tomdkovd, M. Kolldrova, M. Antalik // Gen. Physiol. Biophys. — 2002 — Vol.21.-P 257-265.

115. Minic, Z. Physiological roles of plant glycoside hydrolases / Z. Minic // Planta. -2008. Vol. 227. -P. 723-740.

116. Mittler, R. Coordinated activation of programmed cell death and defense mechanisms in transgenic tobacco plants expressing a bacterial proton pump / R. Mittler, V. Shulaev, E. Lam // The Plant Cell. 1995. - Vol. 7. - P. 29-42.

117. Mittler, R. Pathogen-induced programmed cell death in tobacco / R. Mittler, L. Simon, E. Lam //Journal of Cell Science. 1997. - Vol. 110. - P. 1333-1344.

118. Mittler, R. Post-transcriptional suppression of cytosolic ascorbate peroxidase expression during pathogen-induced programmed cell death in tobacco / R. Mittler, X. Feng, M. Cohen //Plant Cell. 1998. - Vol 10. -N 3. - P. 461473.

119. Transgenic tobacco plants with reduced capability to detoxify reactive oxygen intermediates are hyperresponsive to pathogen infection / R. Mittler, E.H. Herr, B.L. Orvar et al. // Proc.Natl.Acad.Sc. USA. 1999.-Vol 96. -N24. -P. 14165-14170.

120. Mittler, R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance / R. Mittler // Trends Plant Sci. 2002. - Vol 7. -P. 405-410.

121. Increase in salicylic acid at the onset of systemic acquired resistance in cucumber / J.P. M'etraux, H. Signer, J. Ryals et al. //Science. — 1990. — Vol 250. -P. 1004-1006.

122. Using quantitative proteomics of Arabidopsis roots and leaves to predict metabolic activity /B.P. Mooney, J.A. Miernyk, C.M. Greenlief, J.J. Thelen // Physiologia Plantarum. 2006. - Vol 128. -P. 237-250.

123. Molders, W. Transport of salicylic acid in tobacco necrosis virus- infected cucumber plants / W. Molders, A. Buchala, J.-P. Metraux // Plant. Physiol. — 1996. -Vol. 112.-P. 787-792.

124. The hypersensitive response; the centenary is upon us but how much do we know? / L.A.J. Mur, P. Kenton, A. J., Lloyd et al. // Journal of Experimental Botany. -2008. -Vol. 59. -N3. -P. 501-520.

125. Comparison of local and systemic induction of acquired disease resistance in cucumber plants treated with benzothiadiazoles or salicylic acid / Y. Narusaka, M. Narusaka, T. Horio, H. Ishii // Plant Cell Physiol. - 1999. -Vol. 40. -N 4.- P. 388-395.

126. Nozu, Y. Proteomic analysis of rice leaf stem and root tissues during growth course / Y. Nozu, A. Tsugita, K. Kamijo // Proteomics. — 2006. — Vol. 6. -P. 3665-3670.

127. Pathogenesis-related protein 10 isolated from hot pepper functions as a ribonuclease in an antiviral pathway / C.J. Park, K.J. Kim, R. Shin et al. // Plant J. 2004. - Vol. 37-P. 186-198.

128. Park, О. K. Proteomic studies in plants / O.K. Park // Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2004. -Vol. 37. -N1. -P. 133-138.

129. Methyl salicylate is a critical mobile signal for plant systemic acquired resistance / S.W. Park, E. Kaimoyo, D. Kumar et al. // Science. —2007. Vol. 318. -P. 113-116.

130. Characterization of salicylic acid-induced genes in Chinese cabbage / Y.S. Park, H.J. Min, S.H. Ryang et al. //Plant Cell Rep. 2003. - Vol. 21. - P. 1027-1034.

131. Pedroso, M.C. A nitric oxide burst precedes apoptosis in angiosperm and gymnosperm callus cells and foliar tissues / M.C. Pedroso, J.R. Magalhaes, D. Durzan //Journal of Exp. Botany. -2000. Vol. 51 -N347. -P. 1027-1036

132. Pedroso, M.C. Nitric oxide induces cell death in Taxus cells /M.C. Pedroso, J.R. Magalhaes, D. Durzan //Plant Sci. 2000. - Vol. 157. -N 2. - P. 173180.

133. Aspirin prevents wound-induced gene expression in tomato leaves by blocking jasmonic acid biosynthesis /H. Pena-Cort'es, T. Albrecht, S. Prat et al. //Planta. 1993. - Vol. 191. -P. 123-128.

134. A novel signaling pathway controlling induced systemic resistance in Arabidopsis / C.M.J. Pieterse, S.C.M. van Wees, J.A.van Pelt et al. //Plant Cell. 1998. - Vol. 10. -P. 1571-1580.

135. Pinto, M P. Lupinus albus 1. Pathogenesis-Related Proteins That Show Similarity to PR-10 Proteins /P. M. Pinto, C. P. P. Ricardo //Plant Physiol. -1995. Vol. 109. -P. 1345-1351.

136. A model for p53-induced apoptosis / K. Polyak, Y. Xia, J.L. Zweier et al. //

137. Nature. 1997. - Vol. 389. -N6648.-P. 300-305.

138. Activation of hsr203, a plant gene expressed during incompatible plantpathogen interactions, is correlated with programmed cell death / D. Pontier, M. Tronchet, P. Rogowsky et al. //Mol Plant Microbe Interact. 1998. - Vol. 11.-N6.-P. 544-554.

139. Proud, C.G. Peptide-chain elongation in eukaryotes / C.G. Proud // Molecular Biology Reports. 1994. - Vol. 19. -P. 161-170.

140. O'Farrell, P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins / O'FarrellP.H. //J. Biol. Chem. -1975. -Vol. 250. -P. 4007-4021.

141. Proteomic investigation of the effect of salicylic acid on Arabidopsis seed germination and establishment of early defense mechanisms / L. Rajjou, M. Belghazi, R. Huguet et al. //Plant Physiology. 2006. - Vol. 141. - P. 910923.

142. Influence of salicylic acid on H2O2 production, oxidative stress, and H2O2-metabolizing enzymes / M. V. Rao, G. Paliyath, D.P. Ormrod et al. // Plant Physiol. 1997. - Vol. 115. -P. 137-149.

143. Raskin, I. Role of salicylic acid in plants /1. Raskin // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. - Vol. 43. -P. 439-463.

144. Two cell-cycle regidated SET-domain proteins interact with proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in Arabidopsis / C. Raynaud, R. Sozzani, N. Glab et al. // The Plant Journal. 2006. - Vol. 47. - P. 395-407.

145. The Lupinus albus class-Ill chitinase gene, IF3, is constitutively expressed in vegetative organs and developing seeds / A.P. Regalado, C. Pinheiro, S. Vidal et al. //Planta. 2000. - Vol. 210. -P. 543-550.

146. Reapae, T.J. Apoptotic- like programmed cell death in plants / T.J. Reapae, P.F. McCabe//NewPhitologist. -2008. Vol. 180. -P. 13-26.

147. Renaut, J.E. Proteomics and low-temperature studies: bridging the gap between gene expression and metabolism // J. Renaut, J.F. Hausman, M.E. Wisniewski//Physiology Plantarum. 2006. - Vol. 126. -P. 97-109.

148. Reymond, P. Jasmonate and salicylate as global signals for defense gene expression / P. Reymond, E.E. Farmer // Curr.Opin. Plant Biol. — 1998. — Vol. 1-N5.-P. 404-411.

149. Rosahl, S. Oxylipins. In Plant Lipids: Biology, Utilisation and Manipulation /S. Rosahl, I. Feussner; ed. D. J. Murphy .- Oxford: Blackwell, 2004. P. 429-454.

150. Ross, A.F. Systemic acquired resistance induced by localized virus infections in plants / A.F. Ross // Viroloy. 1961. - Vol. 14. - P. 348-358.

151. Plant proteome analysis: a 2004-2006 update / M. Rossignol, J.B. Peltier, H.P. Mock et al. //Proteomics. 2006. - Vol. 6. -P. 5529-5548.

152. Systemic acquired resistance / J.A. Ryals, U.H. Neuenschwander, M.G. Willits et al. //Plant Cell. 1996. - Vol. 8. - P. 1809-1819.

153. Ryerson, D E. Cleavage of nuclear DNA into oligonucleosomal fragments during cell death induced by fungal infection or by abiotic treatments / D.E. Ryerson, M.C. Heath // The Plant Cell. 1996. - Vol. 8. - P. 393-402.

154. Caspases. Regulating death since the origin of life / M. Sanmartin, L. Jaroszewski, N.V. Raikhel, E. Rojo //Plant Physiology. — 2005. Vol. 137. — P. 841-847.

155. Sarnighausen, E. Plant proteomics / E. Sarnighausen, R. Reski // Methods in molecular biology. 2007- Vol. 484. -P.29-44.

156. Structural genes for salicylate biosynthesis from chorismate in Pseudomonas aeruginosa / L. Serino, C. Reimmann, H. Bam et al. // Mol Gen Genet. 1995. - Vol. 249-N2. -P. 217-228.

157. Shah, J. The salicylic acid loop in plant defense / J. Shah // Current opinion in plant biology. 2003. - Vol. 6. - P. 365-371.

158. The cassava (Manihot esculenta Crantz) root proteome: protein identification and differential expression / J. Sheffield, N. Taylor, C. Fauquet, S. Chen //Proteomics. 2006. - Vol. 6. -P. 1588-1598.

159. Shulaev, V. Is salicylic acid a translocated signal of systemic acquired resistance in tobacco? / V. Shulaev, J. Leon, I. Raskin //Plant Cell. 1995. — V.7. -Pol. 1691-1701.

160. Shulaev, V. Airbone signaling by methyl salicylate in plant pathogen resistance / V. Shulaev, P. Silverman, I. Raskin //Nature. — 1997. Vol. 385. -P. 718-721.

161. Jasmonate- and salicylate- mediated plant defense responses to insect herbivores, pathogens and parasitic plants / J.L. Smith, C.M. De Morales, M.C. Mercher//Pest.Manag.Sci. -2009. Vol. 65. -P. 497-503.

162. Snyman, M., Modulation of heat shock factors accompanies salicylic acid-mediated potentiation ofHsp70 in tomato seedlings /M. Snyman, M.J. Cronje //JExp. Bot. — 2008. Vol. 59-N8.-P. 2125-2132.

163. NPR1 modulates cross-talk between salicylateand jasmonate-dependent defense pathways through a novel function in the cytosol / S.H. Spoel, A. Koornneef, S.M.C. Claessens et al. //Plant Cell. 2003. - Vol. 15. - P. 760770.

164. Constitutive expression of the pea ABA-responsive 17 (ABR17) cDNA confers multiple stress tolerance in Arabidopsis thaliana / S. Srivastava, M.H. Rahman, S. Shah, N.N. V. Kav // Plant Biotechnology Journal. — 2006. Vol. 4. -P. 529-549.

165. A novel class of oxylipins, snl-O- (12-Oxophytodienoyl)-sn2-0-(hexadecatrienoyl)-monogalactosyl diglycer ide, from Arabidopsis thaliana /

166. B.A. Stelmach, A. Mu'ller, P. Hennig et al. // Journal of Biological Chemistry. -2001. Vol. 276. -P. 12832-12838.

167. Sticker, L. Systemic acquired resistance / L. Sticker, B, Mauch- Mani, J.P. Metraux//Annu. Rev. Phytopathol. 1997. - Vol. 35. -P. 235-270.

168. Stulemeijer, I.J. Post-translational modification of host proteins in pathogen-triggered defence signalling in plant / I.J. Stulemeijer, M.H. Joosten //Mol Plant Pathol. 2008. - Vol. 9-N4.-P. 545-560.

169. Suzuki, R. Slow and prolonged activation of the p47 protein kinase during hypersensitive cell death in a culture of tobacco cells / R. Suzuki, A. Yano, H. Shinshi//Plant. Physiol. 1999. - Vol. 119. -N4.-P. 1465- 1472.

170. Swidzinski, J.A. A proteomic analysis ofplant programmed cell death / J.A .Swidzinski, C.J. Leaver, L.J. Sweetlove // Phytochemistry. —2004. — Vol. 65. -P. 1829-1838.

171. Function of the oxidative burst in hypersensitive disease resistance / R. Tenhaken, A. Levine, L.F. Brisson et al. // A.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1995. Vol. 92. -P. 4158-4163.

172. Plant proteomics. Methods and protocols / H. Thiellement, M. Zivy, G. Damerval et al Totowa NJ, Humana press, 2007.-416p.

173. The complexity of disease signaling in Arabidopsis / B.P. Thomma, LA. Penninckx, W.F. Broekaert, B.P. Cammue // Curr Opin Immunol. 2001. -Vol.13. -№ 1. -P.63-68.

174. Proteomic and phosphoproteomic approaches to understand plant—pathogen interactions / G. Thurston, S. Regan, C. Rampitsch, T. Xing // Physiol. Mol. Plant Pathol. -2005. Vol. 66. -P. 3-11.

175. Tsugita, A. 2D electrophoresis of plant proteins / A. Tsugita., M.Kamo // Methodes in molecular biology. 1999. - Vol. 112. -P. 95-98.

176. Regulation of pathogenesis related protein-la gene expression in tobacco / S. Uknes, S. Dincher, L. Friedrich et al. // Plant Cell.- 1993. Vol. 5. - P. 159-169.

177. A role for salicylic acid and NPR1 in regulating cell growth in Arabidopsis / H. Vanacker, H. Lu, D.N. Rate, J.T. Greenberg//Plant J. 2001. - Vol. 28. -P. 209-216.

178. Van Camp, W. H2O2 and NO: redox signals in disease resistance / W. Van Camp, M. Van Montagu, D.Inzt // Trends Plant Sci. 1998. - Vol. 3. - P. 330-334.

179. Van Loon, L.C. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins / L.C. Van Loon, E.A. Van Strien//Physiol Mol Plant Pathol 1999. - Vol. 55. -P.85-97.

180. Hoist, H.R.M. Schlaman, H.P. Spaink // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. -Vol. 11-P. 608-616.

181. Salicylic acid is not the translocated signal responsible for inducing systemic acquired resistance but is required in signal transduction / B. Vernooij, L. Friedrich, A. Morse et al. //Plant Cell- 1994.- Vol. 6. P. 959965.

182. Vierstra, R.D. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology / R.D. Vierstra // Nature Reviews Molecular Cell Biology. — 2009. — Vol. 10-N6. -P. 385-397.

183. Vlot, A.C. Systemic acquired resistance: the elusive signal(s) / A.C. Vlot, D.F. Klessig, S.-W. Park//Curr. Opin.Plant. Biol. 2008. - Vol. 11. -P. 1-7.

184. Vlot, A.C. Salicylic acid, a multifaceted hormone to combat disease / A.C. Vlot, D'M.A. Dempsey, D.F. Klessig // Annu. Rev. Phytopathology. 2009. -Vol. 47. -P. 177-206.

185. A universal and rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant tissues for proteomic analysis / W. Wang, R. Vignany, M. Scali, M. Cresti // Electrophoresis.-2005. Vol. 27.-P. 2782-2786.

186. Ward, H.M. On the relations between host and parasite in the bromes and their brown rust. Puccinia dispersa (Erikss) / H.M. Ward // Annals of Botany. 1902. - Vol. 16. - P. 233-315.

187. Watanabe, N. Recent advances in the study of caspase-like proteases and Box inhibitor-1 in plants: their possible roles as regulator of programmed cell death/ N. Watanabe, E. Lam // Molecular Plant Pathology. 2004. - Vol. 5. -P. 65-70.

188. Mapping the proteome of barrel medic (Medicago truncatula) / B.S. Watson, V.S. Asirvatham, L. Wang et al. //Plant Physiol. 2003. - Vol. 131. -P. 1104-1123.

189. Progress with the gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium / V.C. Wasinger, S.J. Cordwell, A. Cerpa-Poljak et al. // Electrophoresis. 1995. -Vol. 16. -P. 1090-1094.

190. Wasternak, C. Jasmonates: an update on biosynthesis, signal transduction and action in plant stress response, growth and development / C. Wasternak // Annals of Botany.-2007. Vol. 100. -P. 681-697.

191. White, R.F. Acetylsalicylic acid (aspirin) induces resistance to tobacco mosaic virus in tobacco /R.F. White // Virology. — 1979. — Vol. 99. — P. 410— 412.

192. Whitfield, C.D. Purification and properties of 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine transmethylase / C.D. Whitfield, E.J. Steers, H. Weissbach //JBiol. Chem. 1970. - Vol. 245. -N 2. -P. 390-401.

193. Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defense /M.C. Wildermuth, J. Dewdney, G. Wu et al. //Nature. — 2001. — Vol. 414. -P. 562-565.

194. Wyman, A.J. Structure and activity of the photosystem II manganese-stabilizing protein: role of the conserved disulfide bond / A.J. Wyman, C.F. Yocum //Photosynthesis Research. —2005. — Vol. 85. — P. 359-372.

195. Xie, Z. Harpin-induced hypersensitive cell death is associated with altered mitochondrial functions in tobacco cells / Z. Xie, Z. Chen // Molecular Plant-Microbe Interactions. 2000. - Vol. 13. -P. 183-190.

196. Yalpani, N. Endogenous salicylic acid levels correlate with accumulation of pathogenesis-relatedproteins and virus resistance in tobacco / N. Yalpani, V. Shulaev, I. Raskin //Phytopathology. 1993. - Vol 83. -P. 702-708.

197. Interaction between proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and a DnaJ induced by DNA damage / T. Yamamoto, Y. Mori, T. Ishibashi et al. // J Plant Res.-2005. Vol. 118. -P. 91-97.

198. Yang, W. Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes / W. Yang, H. Steen, M.R Freeman //Proteomics. 2008. - Vol. 8. -P. 832-851.

199. De Yaung, B.J. Plant NBS-LRR proteins in pathogen sensing and host defense/ B.J. De Yaung, R. W. Innes //Nat Immunol. 2006. - Vol. 7 -N12. -P. 1243-1249.

200. Is the high basal level of salicylic acid important for disease resistance in potato? /D. Yu, Y. Liu, B. Fan et al. //Plant Physiol. 1997. - Vol. 115. - P. 343-349.

201. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica) / J. Yu, S. Ни, J. Wang et al. //Science. 2002. -Vol. 296. - P. 79-92.

202. Zarate, S.I. Silverleaf whitefly induces salicylic acid defenses and suppresses effectual jasmonic acid defenses / S.I. Zarate, L.A. Kempema, L.L. Walling//Plant Physiol. -2007. Vol. 143. -P. 866-875.

203. Zhang, S. The tobacco wounding-activated mito gen-activated protein kinase is encoded by SIPK / S. Zhang, D.F. Klessig // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. -1998. Vol. 95. -P. 7225-7230.

204. Virulence systems of Pseudomonas syringae pv. tomato promote bacterial speck disease in tomato by targeting the jasmonate signaling pathway / Y. Zhao, R. Thilmony, C.L. Bender et al. //Plant J. 2003. - Vol. 36. - P. 485-499.

205. Salicylic acid activates nitric oxide synthesis in Arabidopsis /M. Zottini, A. Costa, R.D. Michele et al. //J.Exp. Bot. 2007. - Vol. 58. - 1397-1405.

Информация о работе

Егорова, Алевтина Михайловна
кандидата биологических наук
Казань, 2009
ВАК 03.00.12

Диссертация

Влияние салициловой кислоты на протеомы листьев и корней гороха - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы