Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние салициловой кислоты на протеиназно-иигибиторную систему озимой пшеницы и их участие в формировании устойчивости к фузариозу

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние салициловой кислоты на протеиназно-иигибиторную систему озимой пшеницы и их участие в формировании устойчивости к фузариозу"

КИТВСЬКИЙ УН1ВЕРСИТЕТ 1мон1 ТАРАСА ШЕВЧЕНКА РГБ ОД на правах рукопнсу

ь! ДЕК 1997

МОЛОДЧЕНКОВА Ольга Олапвна

УДК 581.19: 577.156

ВПЛИВ САЛЩИЛОВОТКИСЛОТИ НА ПРОТЕТНАЗНО-1НПБ1ТОРНУ СИСТЕМУ ОЗИМОТ ПШЕНИЦ! ТАТХ УЧАСТЬ У ФОРМУВАНН1 СТ1ЙКОСТ1 ДО ФУЗАРЮЗУ

03.00.04 - 6юх1м!я

АВТОРЕФЕРАТ дисертац» наздобутгя наукового стулвня кандидата бюлопчних наук

КиУв-1997

Дисертацшю е рукопис

Робота виконана в Селекцмно-генвтичному ¡нститут! УААН

Науков1 керщники - доктор бюлопчних наук._

Вовчук Серпй Володимирович чл.-кор. УААН, доктор бюлопчних наук, професор

Левицький Анатол1й Павлович Науково-виробнича асофф "Одеська бютехнолопя" генеральний директор Оф|Ц1йн1 огоненти - доктор бюлопчних наук,

старший науковий спвробтшк Варбанвць Людмила Дмитр1вна 1нститут мкробюлопТ та в1русолопТ ¡мен1 Д.К. Заболотного НАНУ кертник вщдшу бюхми кикрооргашзмш

кандидат бюлопчних наук Волчевська Олександра ввгешвна 1нсгитут хрестоцв1тних культур УААН зав'щуюча лаборатор1ею бютехнолопТ

Провщна установа - 1нститут бюшГГ ¡меж0.В. ПалладЫа НАНУ, м. Ки'Гв

Захист в'щбудеться " 24" грудня 1997 р. о 14 годична заоданн! спефалюованоТ вчено* ради Д 01.01.07 при КиТвському ун1верситет1 'мен' Тараса Шевченка за адресом: 252033, м.КиТв-ЗЗ, вул.Воло-димирська, 64, бгалопчний факультет, ауд. 215.

3 дисертащею можна ознайомитись у б1блютец1 унгаерситету. Автореферат розюланий "24" листопада 1997 р.

Вчений секрета р спецшЬованоТ вченоТ ради, кандидат бюлопчних наук, професор

О.В. Брайон

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальшсть теми. В останж роки в'щчутно загострилась проблема зниження врожаю зернових культур Bifl фуэарюзу, що поставило перед селекцюнерами задачу виведення нових сортов, стйких до цього патогена, Усгих сепекцмноТ роботи в цьому напрямку залежить в!Д ефективносп методе визначвння реакцп р1зних генотншв на проникнення патогена i формування ними мехажзмт слйкосп на р:зних етапах системно-! взаемодн рослина-патоген.

Сучасж дослщження показали, що значну роль в цих провесах Biflirpae система протеТнэзичнпбтори [ Левицький А.П., 1989, Вовчук C.B., 1992, Мосолов В.В., 1988, 1990]. Пэггтидпдролази (КФ 3.4.) рослин вдаграють важпиву роль в регуляцн внутр'ишъоклгтанного обм1ну, зохрема в формуванHi механимв адаптацй' до несприятливих факторе pi3Hoî природи, включаючи i спйкость до фгтоза-хворювакь. Одним з механ1зм1в регуляцм протеолЬу е зм|на активност) бшкових ¡Hri6iTopin протвТназ. На теперешне час вважають, що пщвищення р1вня ¡нпбггор1в протеолггичних ферменлв е одним is захисних механ1зм!в рослин у вщповщь на ¡нфекцто.

S дат, що niA впливом деяких важких метал1в i органЫних кислот в рослинах в'|дбуваються 6ioxiMi4Hi змжи, ангпопчж там, ям спостер1гають nifl час фпчззахворювань [Loon L., 1989, Kesimnn H., 1994]. Найбшьше ¡м'ггуе flira патогена салщилова кислота [Jocelyn М„ 1992, Raskin 1,1992, Keller H., 1996]. Вщомо, що салщилова кислота виконуе роль системного сигнала та ¡ндуктора пов'язаних з патогенезом бтюв, берв участь в реакцм надчутливосп та формуBaHHi сп'йкосп до ряду ф1тозахворювань. Останмм часом з'явились лп-ературн! даш про вопив сал!цилово'Г кислоти на ¡ндукцю протеТназних ¡нпб(тор|'в [Kim Seong-Ryong, 1992]. Проте практично вщсутня ¡нформацт про вплив салщилово! кислоти на проте-¡назноЧнпбггорну систему в зв'язку 3i ст1Ймстю до фгтозахворювань, в тому чисш, до фузарюзу. Тому вивчення змЫ протеТназночнпбгторноТ системи, яю вщбуваються в рослинах тд вплизом сал:циловоТ кислоти в портнянж э даними процесами при фузарюз1 дозволить розробити методи оцЫки рослин на стмистъ до даного фггозахворювання i теоретично сбгрунтувати еколопчно безпечн! способи боротьби э фггозахворюваннями, заснованими на активаци природних захисних механ!зм1В рослини.

Тема дисертацм пов'язана э планом науково-дос/вдних роб!т Bi/winy 6ioxiMiT та фЫолопТ рослин СП i е скпадовою частиною теми 01.03. "Розробити генетичж основи покращення якосп продукцп сшьскогосподарських рослин i шляхи й селекцжного використання".

Мета дослщжень. Метою роботи було вивчення дн сал'циловоТ кислоти на протеТназнсннпбторну систему проростов i зерна озимоТ пшениц1 у зв'язку з Тх можливою участю в формуванм стШкосп до фузарюзу та використанням цих показникш у селекцн.

Завдання досл1джень:

- досл'|дити вплив салщиловоТ кислоти на протеТназно-Ыпбгторну систему вегетативних частин озимоТ пшениц!;

- вивчити особливост! змЫи протеТназноЧнпб'ггорноТ системи озимоТ пшениц'| nifl впливом салщиловоТ кислоти i зараженн! Fusarium graminearum;

- дослщити взаемозв'язок мЬк !ндукц'|ею ¡нпбгтора трипсину пщ д'|ею салщиловоТ кислоти i сшюстю рослин до фузарюзу;

- провести видшення i очистку ¡Hriöiropia трипсину з проростюв озимоТ пшеница вирощених на розчим салщиловоТ кислоти, i з npopocmciB, ¡нфкованих Fusarium graminearum;

- розробити споаб оцжки генотип1в озимоТ пшениц на спйк'кггь до фузарюзу з використанням салщиловоТ кислот

Наукова новизна результата дослщхсань. Вперше проведено пор!вняльно вивчення особливостей 3MiH в систем! протеази-жпбгтори пщ впливом сал!циловоТ кислоти i при фузарюзу

Встановлено, цо збшынення активное™ нейтральних протеТназ вщбувалось як на 1нфекц1йному фош, так i пСд впливом салщиловоТ кислоти. Збтьшення активносп кислих протеаз спосхертали тшьки при д!Т на роспину салщиловоТ кислоти.

Показано, що ждукц]'я ¡нпбгтора трипсину при фузарЬз! i шд впливом салщиловоТ кислоти вщбувалась диференцшовано в!д стшкост! copTia озимоТ пшениц! до фузарюзу. ГПд впливом фузарюзноТ ¡нфекци вщбувалася змЫа компонентного складу ¡нпбгтора трипсину.

Вперше встановлено, що попередня обробка зерна 2 мМ салщиловою кислотою з наступним поавом на ¡нфекцмному фон! призводить до ш'двищання слйкост! сорт!в озимоТ пшениц! до Fusarium graminearum.

Встановлено зв'язок и ¡ж ¡ндукц1ею inri6iTopa трипсину nifl впливом сал1циловоТ кислоти i criüKiono озимоТ пшениц! до фузарюзу.

Видшено i охарактеризовано ¡нпб'ггори трипсину з проростюв озимоТ пшениц!, оброблених салщиловою кислотою та ¡нфжованих Fusarium graminearum.

Практична ц'жжсть результатов дослщжень. На ochobi' одержаних результате розроблено споаб оцики генотигав озимоТ пшениц! на спйюсть до фузарюзу з використанням салщиловоТ кислоти (патент УкраТни N 12639). Перевагою цього способу е його експреснють, висска вдтворювак'.сть i ысжлиз!стъ

юр!вняння результате у рЬних лаборагор1ях. Запропонований метод може знайти шроке застосування лщ час проведения генетичних дослджень, в селекц1йних окладах.

Осиовж положения дисертацП", як5 виносятъся на захист:

- сал1Цилоза кислота визивае зм'ми бток-протеТназного комплексу проростов эзимоТ пшениц диференцмовано В1Д слйкосп сорту;

- за ступеней збтьшення ртня ¡нпбгтора трипсину \ за стиввщношенням тротеази: ¡нп5|тори при дм салциловоТ кислоти 1 фузарюз1 можна судити про спйюсть або сприйнятлив1сгь сортов озимоТ пшениц до фузарюзу.

РеалЬаЫя результап'в досл!джвнь. Розроблений на основ1 проведених цослщжень метод оцЫки генотип1в озимо! пшениф на стШсть до фузарюзу використовусться в пракгичнш селвкцмшй роботт вддшу фгтопатолопТ та внтомолопТ, вщд1лу селекци пшениц! Селекцмно-генетичного ¡нституту \ в роботп колективного альськогосподарського лщприемслва "Батыавицина".

Особистий внасок здобувача. Автором проведено поршняльне вивчення особлизостей змЫ в систем! протеази-тпбггори п'щ впливом салщилово! кислоти I при фузарюзу встановлено зв'яэок «¡ж ¡н дующею ¡нпбгтора трипсину пщ впливом салщиловоТ кислоти I спймспо озимоТ пшениц! до фузарюзу, видшено I охарактеризовано ¡нпбггори трипсину з проростов озимоТ пшениф, оброблених салщиловою кислотою та ¡нфжованих Ризапит дгаттеагит, розроблено споаб оц1нки генотишв озимоУ пшениц на спйюсть до фузарюзу з використанням сал'щилозоТ кислоти. Дольова участь дисертанта у проведених досладженнях та п/бл1кац'|ях становить 80%.

Апробац|'я роботи. Основн|' положения I результати дисертацп були представлен! на мгжнародн1й науково-практичнм конференци "Устойчивое развитие: зафязнение окружающей среды и экологическая безопасность" у Дн)'пропетровську (4-8 грудня 1995 р.), на м1жнароджй науково-практичнм конференци "Рациональное природоиспользование: системный анализ в экологии" у Севастопол1 (9-13 вересня 1996 р.), на мЬкнародн!й науково-практичнм конференци "Актуальные проблемы в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" у Мосш (30-31 жовтня 1996 р.), на загаданы Одеського товариства йох'|м1к!в 24 кв)тня 1997 року, на VII бюхЫчному з7зд| (3-5 вересня) у КиТв1

Публжецн. За материалами дослщжень, представлених в дисертацн, опублмовано 8 наукових друкованих праць.

Об'ем I структура роботи. Дисэртацмна робота складаетъся ¡з встугту, 7 роздш/в, висновюв, списку використаноУ гатератури тадодатю'в.

Робота викпадена на 134 сторшках машинописного тексту, вм!щуе 12 таблицы, 26 рисунюв. Список лператури метить 194 л'ггературних джерел (з них 116 - публ!кацГ| зарубЬкних автор!в).

ОСНОВНАЧАСТИНА

Умови, матер!ал i методика досл!джвнь.

Об'ектами дослщження були зерно i проростки сортщ озимо) пшениц! (Triticum aestivum L.), що в!др»няються по сликоси до фузарюзу: сшю сорти - Обрм, Виипел, Mc.Nair, Ringo Star; сприйнятлив'! - Еритроспермум 4593/88, Корап, nepecsiT, Одеська нашвкарликова. Взаемозв'язок м1ж ршнем жпб!тора трипсину п!д впливом салщилово! кислоти i сшюстю до фузарюзу вивчали, використовугачи колекцш copTie озимо! пшениц!, що вщр!зняються за спйюстю до фузарюзу, яка була надана в1ддшом фгтопатолоп! та ентомолоп! i в'щдшами пшениц! Селекцшно-генетичного ¡нституту.

Попередньо оброблене 1% розчином KMn04 i замочене на протяз! 12 годин в

лроточнШ вод1 нагання пом!щали в ростильн! на фшьтрувальний nanip i пророщували на протяз'| 6 д!б при 24°С на дистильован!й вод!, на середовищ'!, що MicniTb патоген i на 2 мМ салщиловм кислоть Як джерело ¡нфекцп було використовано патогений штам К 90 Fusarium graminearum Schwabe, вирощений на протяз! 14-16 дК> на рдкому картопляно-мальтозному середовищ!'. В дослщженнях було використовано концентрацию суспензн патогену 10 тис.конщй/мл. об'емом 25 мл на 100 зерен у ростильн!.

Обробку рослин сал!циловою кислотою здмснювали 2 способами. Перший cnociö: 6-денш проростки обприскували 0,1-5 мМ розчинами салщиловоТ кислоти ! через 6,12,24 i 30 годин проростки зр1зували, заморожували при -40°С i люфтьно висушувапи. Друтий cnociö: поверхнево стерил!зован1 зержвки пророщували на середовищ!, що мостить 2 иМ розчин салщиловоТ кислоти. Надземну части ну проростов i KopHi в!дбирали на 1 -6 добу, заморожували, люфшьно висушували i розмелюаали.

Для видтення ¡HriöiTopiB трипсину використовували люф!льн! 6-деин! проростки озимоТ пшениц! сорту Обр'м.

Екстракц!ю протеолпгичних фермента з л1оф!л!зованих лроростюв i м!цел1ю гриба проводили охолодженими сольовими розчинами 0,2 М NaCI (0,1 М фосфатний буфер, pH 6,0; pH 7,6) на протяз! 30 хвилин при температур! 4°С у сгшв1Дношенн'| 1:20-1:40 (масса:об'ем). Гомогенат центрифугували при 6000 д, температур! 4°С на протяз! 15 хвилин. В супернатантшй piflUHi визначали акгившсть пептидпдролаз за пдроляом 2%-ного казеЫу (pH 6,0, pH 7,6), 2%-ного гемоглобину (pH 3,5),

синтетичного субстрату М-а-бензоТл-Д1-арп'нЫ-4-нпроан1лщу (БАПА) [Вовчук C.B.,1979].

Активн'|сть ферменте виражали в нанокаталах (для нейтральних i кислих протешаз), мкрокатапах (для БАПАази)( на 1 кг л1офтЬованоТ маси проростов (мщел1ю фиба). За 1 катал приймали ктыясгь ферменту, що катагюуе утворення 1 M тирозину (для нейтральних i кислих протеТназ), розщеплення 1 M субстрату (для БАЛАази) за 1 с ¡нкубацп.

lHrí6ÍTop трипсину екстрагували ¡з зерна або проростов 0,2 M NaCI (0,1 M фосфатним буфером pH 6,0) у сгаввщношенж 1:10-1:20 (маса:об'ем) на протяз'| 60 хвилин. Июля центрифугування при 6000 g на протяз! 15 хвилин супернатантну р!дину профвали 10 хвилин при 70°С i повторно центрифугувапи. В одержаних екстрактах визначали bmíct ¡нпбггора трипсину з використанням синтетичного субстрату БАПА (1М-а-бензоТл-Д1-арпнж-4-нпроанш!д) [Левицький А.П., 1979].

AKTHEHicTb ¡нпбггора трипсину виражали в грамах ¡нактивованого трипсину на 1 кг висушеного матер:'алу. Питому активность ¡нпбггора трипсину розраховували в фамах на 1 кг бшка.

Bmíct бшка визначали колометричним методом Jloypi або спектро-фотометрично за поглинанням при 280 нм.

Юлью'сне визначення вшьних ам'жокислот проводили в екстрактах проростюв колориметрично нЫпдриновим методом.

Ам'шокислотний aHan¡3 бшюв здшснювали на автоматичному аналЬатор1 ам'|нокислот "Hitachi-835" (Япон'да).

Колоночну хроматофаф!ю бшюв проводили, використовуючи методи гель-фтьтрацп та афЫно'Г хроматофафн на устаткуванж ф|рми LKB (Швец!я). Гель-фшьтрацто здйснювали з використанням сефадешв G-10, G-25, G-75. Афннну хроматограф)« вели в колоночному eapiami за методикою [Шульпн М.Н., Мосолов В.В., 1985] i на скляних xiiÜKax з пористом фшьтром пофракц1Йно. В обох випадках використовували аетивовану трипсин-сефарозу 4 В. ¡зоелектрофокусування проводили в анал1тичнш колонц1 8100 ("LKB", Швец!я) об'емом 110 мл у фад1ент! густини розчину сахарози 5-50% при 4°С на npoTH3¡ 48 годин при Hanpy3¡ 1000 В i потужносп струму 3 Вт.

Електрофорез бшив вели в 10,5% (20%) ПААГ при pH 8,3 в присутносп 0,1% flS-Na i в 18% ПААГ при pH 4,3 в присутносп 8 M сечовини [Laemli V.K., 1970]. Як бшки-маркери використовували таку бткову сумш ф1рми "Serva" (ККмеччина), Phosphor¡lase(94 кД), Albumin bovine (67 кД), Ovalbumin (43 кД), Carbonic anhydrase (30 кД), Soybean trypsin inhibitor (20 кД), a-Lactalbumin (14,4 кД).

Мод!ф!кац1Ю залишюв люину проводили за допомогою малеТнового анлдриду [Botler Р., 1969], арпнЫу - 0,1 M 1,2-циклогександюном [Lin Y., 1968]. Для визначення

ti

в'тьних SH-групп в нативному бтку скористалися спектрофотометричним методом Елмана [Ellman G., 1959] з 5,5-дитю-бю-2-нгфобензойнок> кислотою (ДТЫВ).

Статистичну обробку даних проводили за загальноприйнятими методиками, використовуючи стандарты профами математичного забезпечення. Результати в таблицях i фафгах наведено у вигляд! cepeflHix значень з трьох бюлопчних ¡ трьох аналггичних повторностей.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛЩЖЕНЬ

Змша бшок-протвТнззного комплексу озимоТ пшениц| пщ впливом салщиловоТ кислоти

В результат! проведении дослщжень було показано, що обприскування 6-денних рослин роэчинами салщиловоТ кислоти i пророщування рослин на р1зних концентрафях розчимв сашциловоТ кислоти зпричинюе зростання в проростках вм)сту ¡нпбпора трипсину i эм'1ну активносп нейтральних i кислих протеТназ. Максимальний ефекг дм салщиловоТ кислоти спостергали при концентрацп салщиловоТ кислоти, що дорщнюе 2 мМ, через 24 години гмсля обприскування рослин, i на 4-6 добу при пророщуванж рослин (рис.1). Активацю протеТназно-¡нпбггорно! системи ш'д впливом салщиловоТ кислоти супроводжувалась зммою ршня б1льних амЫокислот. Так, при обприскуванн1 рослин 2 мМ салщиловою кислотою bm'ict втьних амжокислот складае 130% по вщношенню до контрольних рослин. При пророщуванж рослин на 2 мМ салщилов^й кислоп' ршень втьних ам1нокислот в надземнм частит проростов починае збльшуватися з 4 доби проростання i на в добу проростання досягае 125% вщ контролю. Ргаень BMÍcrry втьних аминокислот в корЫнях в nepmi 4 доби проростання складае 125% по вщношенню до контроля, а на 6 добу проростання досягае 150% по вщношенню до контролю.

Наступним етапом наших дослщжень було вивчення компонентного складу бтюв 6-денних проростмв, вирощених на 2 мМ розчим салщиловоТ кислоти. AHani3 електрофорефам показав, що бшки контрольних проростюв мютять 27-30 фракцш. Молекулярж маси бшюв знаходились в области вщ 10 до 94 кД- Пщ впливом салщиловоТ кислоти в!дбувалось кшьюсне збтьшення бшкових компонентов i эмачною Mipoio компонент з молекулярними масами в'|д 10 до 29 кД .

3 одержаних результате можна зробити висновок, що салщилова кислота е активатором змЫ в бшок-протеТназному комплекс! озимоТ пшениц^ який бере участь у формуванн! адаптацП' рослин до рших стресових впливт, у тому числ1, в формуванн! спйкоет! до ф!тозахворювань [Серова З.Я., 1992, Ruth F., 1989].

% я(д контролю

ГОЛ"*** rfcm ввприсяущенш

g njpimn чмпм щ—сп*

Рис.1. Вплив салщиловоУ кислоти на активнють ¡HriöiTopa трипсину проростов озимоТ пшениц!

I - активность ¡нпб!тора трипсину в проростках озимоТ пшениц!, обробланих р!зними концентратами салщиловоУ кислоти

II - активжсть mriöiTopa трипсину в проростках озимоТ пшениц! при облрискуванн! розчином 2 мМ салщиловоУ кислоти

III- активжсть 1нпб!тора трипсину в проростках озимоТ пшениц! при проростанн1 на розчим 2 мМ салщиловоУ кислоти

Пор1вняльне вивчення впливу салЩиловоТ кислоти I Fusarium graminearum на зм1ну в протеазнсИнпбГгорно!' систем! озимо/ пшениц!

Вивчення впливу сап'цилово)' кислоти i фузарюзно? ¡нфекцм на активжсть протеаз показало, що як при фузаргазь так i при дГ| салщиловоТ кислоти активжсть нейтральних протеаз пдвищуеться у спйких сортш, а для сприйнятливих сортов вщмЬюно эниження активное™ даних фермент вщносно контролю.

Активн'ють кислих проте7наз у здорових та шфкованих фузар1ями проростках озимоТ пшениц! практично однакова, незалежно вщ стШкосл сорт1в до даного захворювання. В той же час у проростов озимоТ пшеницК вирощених на 2 мМ салщилов!й кислол, було спостережено збшьшення активносл кислих протешаз як у ст1Йких, так i у сприйнятливих сорте.

Визначення активносл Ыпб1тора трипсину дозволило встановити, що сорти озимо) пшеници як! мають вщносну спйюсть до фузарюзу, на ¡нфекцмному фон'| мали битьш високу активность ¡нпб'гтора трипсину в поршнянн1 3i сприйнятливими генотипами.

Салщилова кислота викликае ¡ндукцю ¡нпбгтора трипсину як у спйких, так i у сприйнятливих до фузарюзу сорш. Проте усгШких сорлв цей показник в 1,2-1,4 рази вищий, н!ж у сприйнятливих сортт (рис.2).

Також було в'|дм1чено, що пдвищення активносл протеолггичних ферменпв у тканинах рослини при фузарюз1 i п'|д впливом салщиловоТ кислоти вщбуваеться в лоеднанн! з! збшьшенням аетивносгл iHriSiTopie трипсину, що лштверджуе висловлене paniaie в лаборатори 6ioxiMiï припущення [Вовчук C.B., 1992] про функцюнальний взаемозв'язок системи протеазиннпбгтори.

Очевидно, зм!ну активносл протешаз у ц!й систем! можна розглядати як первинну реакц!ю рослини на дно факторт, що вивчаються. Мвк сортами озимоТ пшениц!, що вйцмзняються за слйюстю, ¡снують у цьому вщношенн'! вдмЫносгп в реакцй'-в!дповщ|. Частиною цих реакцш е ¡ндукц!Я ¡нпб!тора трипсину. ГПдвищення активносл ¡HriöiTopa трипсину е вторинною вщповщдю рослини на стрес, яку треба розглядати як захисну реакцио, спрямовану на локал!зац'ио процесу. Ефективн!сть такоТ реакц°Г|-в1дпов1д1 можна охаракгеризувати як сл'юБЩНошення активное™ протешаз до BMicry ¡нпб!тора трипсину. При цьому встановлено, що як при фузарюзК так i шд впливом салщиловоТ кислоти у вщповдь на пщвищення активносл протеиаз у проростках слйких сорт!в в'щбуваеться бтьш значне пщвищення активностл ¡нпб!тора трипсину ! сшввщношення протеТнази-шпбгори наближаеться до показника контрольних рослин. В той же час у сприйнятливих

1 2 3

1 2 J

Акпшиктъ Ф»гм*нт1»

3000

1 2 3

1 2 3

Акгавнктъ

|НГ16|Г0Р1

TpHnCNH|t,8

1.3 1.1 I.»

0.«

1 2 j 1 г j

Рис. 2. Активнютъ нейтральних(А), кислих(В) протваз (и-кат/кг), ¡нпбггора трипсину (г/кг) (С) в 6-денних проростках озимоТ пшениц!

1 - контрольн! рослини

2 - рослини, ¡нф1кова1м Fusarium graminearum

3 - рослини, оброблвш 2мМ розчином салщиловоТ кислот

i ■ ст'1йк1 сорт

II - сприйнятлив1 сорти

0.3

Таблиця 1.Сл1вв1дношення активного нейтральной протеТиази i ¡нг!б1тора трипсину (М±м) в проростках озимоТ пшениц! при дн Fusarium graminearum та caniivuioeoT кислота

Сорта Fusarium graminearum 2мМ салщилова кислота

Стмю Контроль Опит Контроль Опит

7601127 729±101 Р>0,1 886±180 822±171 Р>0,1

Сприй-нятлив! 10281139 784*103 Р<0,05 1116±185 854±164 Р<0,05

Р1<0,05 Р1>0,1 РК0.05 Р1>0,1

Р - показник достов1рносп рмниц! мЬк опитом \ контролем

Р1 - показник досгов!рносп р'зниц! у поршнянш з'| стШкими сортами

сорттв цей показник в 1,2-1,4 рази вищий у контрольних рослин в поршнянж з дослщними рослинами (Табл.1).

3 цього випливае, що за ступеней зростання вм1сту ¡нпбггора трипсину I за спшвщношенням протеази-Ыпбггори при фузарюз! та дн салщиловоТ кислоти можна судити про спйюсть чи сприйнятлив1сгъ сорт!в озимоТ пшениц1 до захворювання.

Вивчення колекци сортю озимоТ пшеницЬ що в'дозняються за стпйюстю до фузарюзу, дозволило виявити позитивний кореляцшний зв'язок (г=0,71-0,77 при р=0,03) м'вк вм1стом ¡нпбп-ора трипсину в 2-денному пророслому на 2 мМ салщиловЮ кислот) зерн I показниками польовоТ та лабораторноТ фггопатолопчно! оцнки, ям характеризуют спйисть сорту до фузарюзу (Табл.2).

Одержав результата були теоретичним обфунтуванням для розробки лабораторного методу оцмки генотил!в озимоТ пшениц! на стшюсть до фузарюзу з використанням салщиловоТ кислоти. На даний метод одержано патент УкраТни (Ы 12639).

Таблиця 2. Активн1сть 1нпб1тора трипсину в пророслому 2-двнному зерн! сорт)в озкмоТпшениц!, що в1др!зняються за сг1йк1стю до фу*«р1озу

Сорти Енерля пророс-тання,% Зменшення довжини на 5 добу, % Активжеть 1Т в % вщ контролю (2 мМ салщи-лова кислота) Актившстъ IT в % Bifl контролю (Fusarium graminearum)

проростка кореня

СтШ М±м 82,6±2,93 17,8±2,38 31,2±12,3 129,3±5,48 137,2±6,51

Середньо- СТ)Йк1 М±м 74,5±1,21 28,1 ±1,23 48,8±4,3б 104,6±1,14 116,1 ±3,51

Сприй- НЯТЛИВ1 М±м 53,2±3,31 44,3±5,09 68,1 ±2,27 94,7±2,28 102,112,92

г 0,71 0,77 0,74 0,82

±Sr 0,006 0,001 0,003 0,005

при р=0,03

Окр:м цього, ми показали, що попередня обробка зерна 2 мМ салщиловою кислотою з наступним постом на щфекцмному фож п'щвищуе р'шень слйкосл сортпв озимо! пшениц! до фузарюзу. Ргаень спйисгп реестрували за змжою бгамаси проростю'в ¡зростаннням активносп' ¡нпбгтора трипсину (рис.3). Подана реакц'т рослини на дно сал'щиловоТ кислоти + патоген сшдчитъ про те, що при спшьн/й дП цчх двох факторов еадбуваегься складна взаемод1я, спрямована на збереження I падвищення спйкосп' рослин до даного патогену, аналопчна набутому ¡мун!тету.

'/. в1д контролю 200 180 160 140 120 100 во 60 40

О

□ Fusarium Gramlnearum ■ 2 мМ сагацилоеа кислота □ 2 мМ еалЦилова Knoiora+Fusarium Graminearum

А

т

V

'Vt

Ш

щ ff ' и

•

% а1д контролю

гоо

180 1W 140 129 100 «ОЮ 40 20-О

■ Fusarium Gramineatum Я2 мМ салЩилова кислота D2 мМ сал1цилоаа кислота+Füsarium Gramlnearum

В

Рис. 3. Актившсть ¡нпбггора трипсину i бюмаса 6-денних про-ростюв озимоУ пшениц на рпних фонах пророщування (% в1д контролю)

А - актившсть ¡HriöiTopa трипсину В - бюмаса проростов

I - стШк! сорти

II - сприйнятлив! сорти

Вид1лення i (51ох1м1чна характеристика 1нг1б1гор1в трипсину з проростк1в озимо*| пшениц!, вирощених на розчин! сал1цилово'| кислоти та 1нфекц1йному фон1 (Fusarium gramlnearum)

Наступним этапом нашоТ роботи було првпаративне видшення та вивчення бюх1м!чних властивостей !нп'б'гтор!в трипсину з ¡нфкованих Fusarium graminearum i оброблених салциловою кислотою проростйв озимо! пшениц).

Компонентний склад !нп'бгтор!в дослщжували з допомогою афЫноТ хроматофафм на трипсин-сефароз! з наступним електрофорезом в ПААГ. Анал!з одержаних даних показав, що за ¡нпбпх>ром трипсину з проростйв пшениц1 сортового пол'|Морф'|зму не виявлено, тобто Bei дослщжен'! нами сорти характеризувались однаковим компонентним складом ¡HriörropiB. ГНд впливом сал1циловоТ кислоти, як i при фузарюз!, вщбуваеться юлыасне зростання компоненте з молекулярною масою 14 i 20 кД. В ¡нфкованих рослинах виявлено пщвищення BMicry вйх ¡зоформ ¡HriöiTopa трипсину i з'явлання нового бокового компонента з молекулярною масою бпизько 29 кД. Утворення цього б!лка може бути викликане впливом на рослину ферменБв патогена.

Етапи препаративного видшення ¡нпбгторв трипсину складалися з температурно! обробки екстраету, гепыфльтрацй, афнноТ хроматофафП та ¡зоелектрофокусування. В результат проведеного ¡зоелектрофокусування було показано, що видлем нами преларати ¡нпбгтор1в трипсину мклили деюлька компонентов ¡з положениям ¡зоелектричних точок в зонах pH 3,7; 4,8; 5,3; 9 (Рис.4). Основна юльк'кть ¡нпбггорш трипсину була локал13ована в зонах з pH 4,8. Дан! бтки було зйрано для вивчення Тх бюхЫчиих властивостей. Молекулярна маса ¡HriöiTopiB трипсину з pl 4,8 за даними гель-фшьтрацп i електрофорезу дор1внюе близько 20 кД.

Ам!нокислотний анал!з дозволив виявити у склад! iHriörropiB велику кшыасть аспарапновоТ, глутамЫовоТ кислот, вал1ну i низький вмют пстидину, глщину, ароматичних амЫокислот, що характерно для багатьох рослинних iHriöiTopie. Сума кислих ам!нокислот у склад! !нпбггор!в становить 25%, а сума основних амЫокислот -12,9%, що узгоджуеться з положениям ¡зоелектр^ноТ точки основних компоненте iHriöiTopie трипсину в зон! з pH 4,8.

Проба з реактивом Елмана констатувала В1дсутн1сть вшьних SH-фуп в молекулах досл'дакуваних ¡HriöiTopiB.

При вивченя антиферментнопо спектру вадзначвно, що одержан! ¡нпбгтори мали здатн!сть гальмувати активн!сть трипсину i х!мотрипсину, але не були активними у вшношенн! до пепсину, папаТну, еластази i сумарноТ протеази проростов пшениц!.

•"-Актнигь

fenClTopie трипсину

Номер фрмцйГ I

1 • 0,05 M rpic-HCI pH, який и1сткть 1 M NaCI 2 ■ 0,05 M rpic-HCI pH 7,S. який м1стить 8 M сечоаину 3 -0.2 M KCI-HCI pH 2.0

Рис.4. Етапи вид!лення ¡Hri6iTopiB трипсину iî проростк1в ози-iwoï пшениц!

I - гель-фшыра^я ка сгфадека G-75

II - афШна хроматограф'^ на трипсин-сефароз! 4В

III - ¡зоелектрофскусування

Дослщження активного центру показало, що актившсть iHriöhropie трипсину знижуеться гад впливом 1,2-циклогександ'юну й не змЫюеггься в присутносл малеТнового анпдриду, що доводить наявжстъ в активних центрах залишюв aprininy й вщсут*исть залишюв л1зину.

Методом подвмних обврнених величин Лайнувера-Берка було встановлено простий неконкурентный тип дП »нпбггор^в трипсину. Kj видшених mnörropie дор^внюе

2,03 10-7.

Для вивчення захисноТ функцм ¡HriörropiB трипсину дослщжували д1ю препаралв ¡HriöiTopiB трипсину на picr i роэвиток мщел1ю гриба Fusarium gramineanjm. В проведених експериментах шпб'гтори трипсину в концентрацГТ, починаючи з 30 мкг/мл пригнмували picr i розвиток колошй гриба Fusan'um gramineamm i активнють видшених Fusarium gramineanjm протеаэ.

Таким чином, отримаж дан1 показали, що П1Д впливом салЩиловоТ кислот у проростках озимо! пшениц! вщбуваеться акгивацю протеТназночнпблорноТ системи. За ступеней змжи активносп протеТназно-мпб'гторноТ системи при дм салщиловоТ кислота можна судити про сгпйюсть чи спримнятлив1сть сор-пв озимоТ пшениц1 до фузарюзу. На основ! одержаних результатов розроблено cnociö оцЫки генотитв озимоТ пшениц! на спймсть до фузарюзу.

висновки

1. Встановлено, що шд впливом сап'щиловоТ кислота в проростках озимоТ пшенищ зростае активысть ¡нпбгтора трипсину, змЫюеться активысть протеолгтичних ферменпв, вм)ст вшьних амжокислот i компонентний склад бшю'в. Максимальний ефект дм салщиловоТ кислоти спостер1гаеться при концентрацн салщиповоТ' кислоти, що дорвнюе 2 мМ, через 24 години теля обприскування 6-денних проросла'в i на 4-6 добу при пророщуванН рослин на середовищК яке м1стить 2мМ розчин салщиловоТ кислоти.

2. Пор1вняльне вивчення впливу салщиловоТ кислоти i фузарюзноТ ¡нфекцй на протеТ'назно-шпбгторну систему показало, що збтыиення активносп нейтральних протеТназ i ршня ¡нпбгтора трипсину у спйких сорпв озимоТ пшенищ вщбувалося як на ¡нфекцмксму фож, так I п!д впливом салщиловоТ кислоти. Пщвищення активности кислих протеТназ спостергали лльки при дГГ на рослину салщиловоТ кислоти як у спйких, так i сприйнятливих copTie озимоТ пшеницк

3. Встановлено позитивний кореляцшний зв'язок (г=0,71-0,77 при р=0,03) mdk р!внем ¡uriöiTopa трипсину при дГГ салщиловоТ кислоти i показниками польовоТ та лабораторноТ ф1топатолопчноТ о^нки, що характеризуют слйюсть сорлв озимоТ пшениц! до фузарюзу.

4. Попередня обробка зерна салщиловою кислотою з наступним постом на ¡нфекцмному фон! (Fusarium graminearum) призводе до пщвищення стткосп рослин до патогена.

5. ГИд впливом салщиловоУ кислоти вщбуваетъся кшьюсне зростання компоненте ¡нпблора трипсину з молекулярною масою 14 i 20 кД. В ¡нфжованих Fusarium graminearum рослинах виявлено пщвищення вмету Bcix ¡зоформ iHriöiTopa трипсину i поява нового бокового компонента з молекулярною масою 29 .кД, утворення якого можна розглядати як проявления реакцП'-вщповДО рослини на Д1Ю патогена.

6. Методами гель-фльтрацн, аф1нно°1 хроматографм та 1зоелектрофокусування з проростов пшениц!, ¡нфжованих Fusarium graminearum i оброблених салщиловою кислотою, видшено ¡нпбггори трипсину з ¡зоелектричном точкою pl 4,8, молекулярною масою близько 20 кД, аюивним центром аргМнового типу i неконкурентним типом дп. Виявлено пригннення даними ¡нпбпгорами активносп трипсину та хмотрипсину i вщсушстъ впливу на пепсин, еластазу, папаТн. Показано, що вивчен! ¡нпбпгори трипсину не д1яли на власм протеази рослини, проте пригжчували актив^сть ферментш патогена та picr i розвиток колонм фиба Fusarium graminearum, що св!дчить про участь даних iHriörropiB у механомах захисту рослини.

7. Розроблено cnociS оцнки генотипе озимо! пшениц! на сшюсть до фузарюзу з використанням салщиловоТ кислоти. Одержано патент УкраТни на даний метод добору (N 12639).

Список po6iT, опублмованих за темою дисертаци

1. Пат. 12639 Украина, А 01 Н1 / 04. Способ оценки генотипов пшеницы на устойчивость к фузариозу / В.Г. Адамовская, C.B. Вовчук, О.О. Молодченкова, А.П. Левицкий, J1.T. Бабаянц, О.В. Гонтаренко.(Украина); Селекционно-генетический институт. - N 96020534; Заявл. 14.02.96; Опубл. 28.02.97. Бюл. N 1.

2. Вовчук C.B., Адамовская В.Г., Левицкий А.П., Молодченкова О.О. Изменение белок-протеиназного комплекса озимой пшеницы под действием салициловой кислоты II Физиология и биохимия культурных растений. - 1997. - Т. 29, N 5. - С. 363-369.

3. Адамовская В.Г., Молодченкова О.О. Салициловая кислота и Fusarium graminearum - индукторы изменений лротеазно-ингибиторной системы озимой пшеницы: Сб. научных трудов "Проблеми та перспективи розвитку виробництва та споживання хл^бопродукпв". - Одесса, 1997. - С. 73-75.

4. Адамовская В.Г., Молодченкова О.О., Клечковская Е.А., Левицкий ЮЛ. Влияние метаболически активных веществ и Fusarium graminearum на

протеиназно-ингибиторный и углеводный комплексы озимой пшеницы: Сб. научных трудов Института земледелияУААН. - Вып.2. - К., 1997. -С. 120-124.

б.Молодченкова О.О., Адамовская В.Г., Вовчук C.B., Бабаянц Л.Т., Гонтаренко О.В. Содержание ингибитора трипсина в зерне и проростках озимой пшеницы при действии салициловой кислоты / / Научно-технический бюллетень СГИ. - 1997. -Т.87. - N 1,- С.68-73.

6. Роль пептид гид ролаз и ингибитора трипсина в формировании устойчивости растений к стрессовым факторам внешней среды /Вовчук C.B., Адамовсхая В.Г., Тихонов П.С., Молодченкова О.О. Яруды Международной научно-практической конференции "Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность". - Днепропетровск. -1995. -15 с.

7. Вплив ф1зюлопчно-активних речовин на слйистъ озимоТ пшениц'| до фузарюзш /Адамовська В.Г., Клечковська OA, Молодченкова О.О., Димковська С.В, Левицький ЮА, Похиленко Л.1., Слепченко A.I. / Матер1али VII УкраТнського 6iox¡MÍ4Horo зЧзду. - КиТв. -1997. - С. 80-81.

8. Role of proteolitic enzymes system function in mechanisms of biochemical phytoadaptaticn / Vovchuck S.V., Adamovskaya V.G., Klechkovskaya E.A., Molodchenkova О.О. / Труды Международной научно-практической конференции "Рациональное природоиспользование: системный анализ в экологии". -Севастополь: МЫ1сгерство оевгги УкраТни. Севастопольский даржавний техшчний ушверситет. -1995. - 129 с.

Анотац1я

О.О. Молодченкова. Вплив салщиловоТ кислоти на протеТназно-жпбггорну систему озимоТ пшениц! та ïx участь у формуванй ctíükoctí до фузарюзу.

Дисертац!Я на здобутгя наукового ступеня кандидата бюлопчних наук за спекал ы-пстю 03. 00. 04. - бюхМя. - КиТвський уншерситет ¡меш Тараса Шевченка, КиТв, 1997-

ДисертафЮ присвячено вивченню ефекта дПГ салщиловоТ кислоти на протеТназночнпбггорну систему озимоТ пшениц! залежно в'щ слйкосп сорту до фузарюзу.

Показано, що П1д впливом салщиловоТ кислоти у сортах озимоТ пшениц'|, що вщр!зняються по ст'йкосгп до фузарюзу, вщбуваеться змжа активносл ¡нпбгтора трипсину i протеол1Тичних ферментов диференцмовано вщ ctíükoctí сорту. Встановлен позитивний кореляцмний зв'язок мме bmíctom ¡нпбггора трипсину п»д впливом салщиловоТ кислоти i показниками польовоТ та лабораторноТ фкопатолопчноТ оцмки, яю характеризуют сгпйюсть coptíb озимоТ пшениц! до фузарюзу. Попередня обробка зерна 2 мМ сапщиловою кислотою з наступним nocibom на ¡нфекц1йному фон! призводить до пщвищення спйкосп coptíb озимоТ

пшениф до фузарюзу. Вид'мено i охарактеризовано жпбггори трипсину з рослин, оброблених салщилоаою кислотою та жфкованих Fusarium graminearum. На ochobî одержаних результата розроблено cnocfô оцмки генотипе озимо'1 пшениц на стшюсть до фузарюзу з використанням салщиловоТ кислоти й одержан патент УкраТни N12639.

Ключов1 слова: пшеница, стшюсть, фузарюз, протеази, ¡нпб!тор трипсину, салщилова кислота.

Аннотация

О.О. Молодченкова. Влияние салициловой кислоты на протеиназно-ингибиторную систему озимой пшеницы и их участие в формировании устойчивости к фузариозу.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия, Киевский университет имени Тараса Шевченко, Киев, 1997.

Диссертация посвящена изучению эффекта действия салициловой кислоты на протеиназно-ингибиторную систему озимой пшеницы в зависимости от устойчивости сорта к фузариозу.

Показано, что под действием салициловой кислоты в сортах озимой пшеницы, различающихся по устойчивости к фузариозу, происходит изменение активности ингибитора трипсина и протеолитичеоких ферментов дифференцированно в зависимости от устойчивости сорта. Установлена положительная корреляционная связь между уровнем ингибитора трипсина под действием салициловой кислоты и показателями полевой и лабораторной фитопатологической оценки, характеризующими устойчивость сортов озимой пшеницы к фузариозу. Предварительная обработка зерна 2 мМ салициловой кислотой с последующим посевом на инфекционном фоне приводит к повышению устойчивости сортов озимой пшеницы к фузариозу. Выделены и охарактеризованы ингибиторы трипсина из растений, обработанных салициловой кислотой и зараженных Fusarium graminearum. На основании полученных результатов разработан способ оценки генотипов озимой пшеницы на устойчивость к фузариозу с использованием салициловой кислоты и получен патент Украины N 12639.

Ключевые слова: пшеница, устойчивость, фузариоз, протеазы, ингибитор трипсина, салициловая кислота.

Annotation

О.О. Molodchenkova. "Influence of salicylic acid on protelnases-inhibitors system of winter wheat and on the plants resistance to Fusarium Scab". The dissertation for a candidate degree of biological science. The spécialités number: 03.00.04. - biochemistry, Taras Shevchenko University. Kyiv, 1S97.

The dissertation is devoted to effect of action of salicylic acid on proteinases-inhibitors system of winter wheat dependence for varieties resistance to Fusarium Scab.

Changes of the trypsin inhibitor contents and proteolytic enzymes activity under the action of salicylic add has been demonstrated. The level of wheat varieties resistance to Fusarium Scab, affected the rate of these changes. It has been found the positive correlation between a level of trypsin inhibitor under the action of salicylic acid and laboratory and field estimations of plants resistance to Fusarium Scab. Seed treatment by 2 mM salicylic acid before sowing them in the infectious nursery resulted in increasing plants resistance to Fusarium Scab. Trypsin inhibitors from plants, were isolated and characterized. Received results allowed to elaborate a method of estimation the level of resistance of winter wheat genotypes to Fusarium Scab., which based on using of salicylic acid and received patent of the Ukraine N 12639.

Key words: wheat, resistance, Fusarium Scab., proteases, trypsin inhibitor, salicylic

acid.