Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние рН среды на развитие in vitro преимплантационных эмбрионов свиньи

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние рН среды на развитие in vitro преимплантационных эмбрионов свиньи"

^ HKPATfiCbKñ ШЛЕМ! S ЙГРЙРНИХ НйЭК

^^ IHCTHTST TBñPÜHHHUTBfi

г*

Ka правах рукописи

ДЕНИСSK ПЙ8/1С ВЗКТОРОВИЧ

УДК 591.1:635.4:612

В1ШВ pH СЕРЕДОВйЕА НА РОЗВИТОК IS UITRO доишлйншшйх ElfGPtOHIS cbbhi.

Спец1альн1сть: 03.00.13 - ф!з1олог1й людини í тварин

Яв-т о-реферат дисертацП на здобуття науковогп ступеня кандидате б1олог:чних наук

SapKlB - 1397

Дисартац1еэ г рукопис.

Робота виконгна д лаборатор!1 ф1з1ологп та бхоххм!Т гнституту саикарства ЗкраГнськаУ акадекП' аграрних наук

Науновий кер!вник - доктор Й!ОЛОг1чних наук.

Мартинвнно Й1на Йнтонтвна

0ф1ц!йн: опоненти: професор, доктор б{ологхчних наук Бугров Ояексхй Дмитрович, кандидат й!олог1чних надк йгай Костянтин Дмитрович

Пров1дна органгзац!я: Полтавський схльськогосподарський !нсгитут

Захист в1дбудеться М^10_____ 1997 р.

о"$}?*гоят1. на зас1данн! спец!ал1зовано]' Ради Д 02.30.01 при 1нститдт1 тваринництва ЗАЙН. 312120. и. Харк1В, п/в Кулинич1

3 дисертац1еп мо!на ознайоаитись д б!бл1отец1 1нституту тваринництва ЯАЙН. 312120, м. Харк1в. п/в Кулинич!

Автореферат раз!сланий ___ ^дд^

Знаний секрегар спецгалтзованоТ Ради

Безуглий М.Д.

ЗЙГЙЯЬНЙ XfiPñKTEPKCTKKñ РОБОТЕ 'Йктдалыпсть теки. Осктльки в свинарствт не вирзвек* про5-zexyi Kexipypri4Horo одераакня íü6píqkíe i ïx kpiokohcepsôiiiï, на сьогоднх единим варгснтсм забезпеченьь- експерг«е>чтальнс" бгзк для гекно-тнкенерних робп в цiñ галуз! тваринництва е ствсрення пост1йно д!ичого пжубатора ооципв - екбр10к1в. Але i цг£ варÎ-снт кг £ к к g р и с т о в и с т ь.с я через нестаб^льн! ! дине низы-;} результата куяьткгиганиа ем6р1он;з sin стгдП' зиготн (п'-сля ззшт'днен-ая oquhtís in vitrej.

¡; = тод культури екбргонгв ссавц!в in vitro було започатповс-ко роботами fi. Brachst (1312) нз кролях. Лротзгом бЬтьтз sk 80 poHîB з того чесу кет од ефектявно використовдвзвея для вкр'сення лроблекних питань Oísíobotí'í, еябр1олог!Т, SinxiKîT того (?.. Brächet, 1313: G. Pincus, 1930; ILK. Shîtten, Í355; ß.B. Квас-ницкий, Л.А. Конюхова, 195В; K.L. Erinster. 19S3; D.C. Hhittin-ghaE. Í371; fl.R. Hen i no. O. Kright,'1982; й.'8. tonino et ai., i933; Сlîî. Youngs et al., 1993 та íhsí). Яротзгоа дсього цьогс периоду иетсд невшкко рзгЕивазся в -напрянкд визченкя видсспеци-^Фтчнмх потреб ç«rtpîogiB. Йроте головне залягаешься-' кезв!нник: ■ еыбртони in vitre розвивашться ri рве." His in vivo. Гчим з 6тлье ранньоТ стад И" почкнаетьея кдльтивдваннз, тки'швчий рездльтат.

Ми звернули gear g на" те,'до sei досл!дники налагаться п!д-тримдвати паранетри середозива кдльгивузання по иозлибост! ста-С!льнимк. При цьомд вони виходять Í3 концепцП' гонеостазу, dcho-ви sko'í фактично бдло закладено Клодом Бернароы це g 1Б?8 - 1879 роках, яка i донин! залишаеться теоретичниы п1дгрднтям багатьох надкових теорий i иедико-б^лог{чноГ практики. Mix тиы. з кожним рокои з'являеться все б1лме poSíT, akí охоплеють класи тварин. що знаходяться на все 5 i ль ta висодих" цаблгх еволвц!йноУ екали, i skí незаперечно св!дчать про перевагд кдльтивдвання 01ооб'ект!в

в примуссво осцилвйчих уаовах кад такими в прииусово СТабШзо-ваних (F.W. Vent, 1944: З.Й. Заар. 1966: Л.И. Суценя. 1978; А.С. Константинов. В.Б. Здано&ич, 1985; 1986; fi.С.Константинов, Д.Г.Тихомиров. iSBS.'JS.ft. Кузнецов. B.C. Вечканов, 1993). Та на-скзльки наи втДомо, цьоГо ще не було показано tTODOBHO ембр1он1Б ccaBqiB.

Критичний анал!з л!тератури Ярив1в нас до припущення про . осцшшючу природа г'оиеостазу, як!й не вЩпов!давть стаб1льн! умови культури in vitro. ^ .

Проблема розвитку нетоду кулътивування ембр!он1в в багато-граннов. IcHijB чинало роб!т, що стосуиься вивчення впливу того чи iHBoro параиетра середовища на розвиток ембр!он1в. Пмук у цьоиу напрямку Kir би збагатити кami знання це на акийсь втдсо-ток, але для вир1тцення проблени у шлоыу нак здавалось доц!льн1-иин застосувати принципово новий п!дх!д: наблизити уиови in vitro до унов осцилвючого гоыеостазу in vivo. 3 дтеа метов було об-рако один з наШлыг лаб1льних в <?i3iíuiori4Ho лрипустивих ыеках параметров ртдкого середовица орган1зид i його шйтин - рН.

йета i завдання досл1двень. Метов досл!днень Х>ула розробка ефективного нетоду-культивузання еыбр!он!в cbhhí на ochcbí вивчення впливу зкхн рН середовитца .на Тх розвиток. Для досягнемш поставлено! нети було окреслено такл завданкя:

- вивчити постиортальн! зм!ни рН р!диии репродуктивного тракту евин!;

- розробити методику прииусово! исциляцП* рН культурального передовика в заданих иенах:

- досл1дити розвиток €m6píohíb при стаб!лмшх значениях рН в д1-апазонах: 7,2 -7.6: 7.6 -8.« i 7.8 - B.t: •

- дослШти розвиток еибр!он!в при рН, осцилюючоиу з д!апазонах 7.4 - 8.3 i 7.6 - 8.0:

- 4 - -

- зизначитц краздЛ для розвитку etsGpioHiB nepion, осцклацп pli: 12 - fil 24 - годинний:

- дослтдитк задежигль роззщкц ембр1тзн1в В1Д природи дзерела оециляцп pH ( склада газозоз фази):

- провести порхзняльний чагенатичний аналтз розвитку eûôpioHÎB за уиов craöiльного i осцилпгачсго pfi.

Наукова новизна.

- розроблено ПРИНЦИГТОВО НОВИЛ - осциляторний - М8Т0Д культиву-вання амбр10Н13 cbuhi in vitro, що за результативнтстя знахо-диться на piBHi краздх cbîtobmx аналогов;

- сформульоаано ochqbhî теоретична полозэння,. на яких заскозу-еться новкй метод, i висцнцтз ггпотезу про осцидзшчий характер гомеостазд:

- уперпе експерннектально доведено ноял;шсть успгшного розвитку smôpiohîb б чкозах pH, ссщшзпчого з кеках згд 7Д до S.3;

- уперпз здгрзано розвиток in vitro 1-клпинних ембрiohîb cbhhî до стад!! бластоциети, яка зазериияа данудац!а;

нперие вивчено розвиток enfipiOHiB в умовах осцилкгачого рй в залезност! згд дзерела Яого асциляцП" (складу газова'Г фази);

- доведено, зо осцлляцгя pH середовида культивування in vitro значно роззяряв пристосувалый моглизост! гмЗр!он{з i сгияулаг ïx розвиток.

Практична заачгняа.

- розроблено принцяпоЕО hobî'îî - осциляторний - аетсд культура ?мбр zoHîs Iii vitro, акий за безпэчуе г с т о г н у i в!рог!дну стиннля-цги (г = 0,7; Р < 0,05) ïx розвитку i моае бути зикористанкП в роботах иирокого прс-фтлз з кл!т;шш б10техкологГГ;

- T80psTii4Hi розробки цодо природи осцялаючого резину культура 6ioo6'sKTiE in vitro i одерзанг з експеряментах результата ао-луть бути використанг з учйовсиу прсцесг пЦготовки спец!ал{ст?з

з кл!тинзоТ б1отехнолог1Г, у спец!альних та вищих учбових закладах. ' .

Основн! волмешя дисертацИ, 50 виносяться на захист: .До{мялангац!йн! ембр!они cemt розвивавться In vitro в уловах осцшишчого рй краде,- His при стаб}льному рй. • Результативность культивдвання ембрicHtB П1Двищуеться за рахунок використання са-ме осцшшШ" рН. а на висских (луаних) його значень. Теоретич-не обгрдктдвання осциляторного ыетодд культури in vitro. .

йяробацгя. йатер!али досл!джень по тем! дисертацп допов!-дались г одержали позитивна оц!нку на: XII з'Гзд! УкраГнського Ф1з1олог1чного товариства iM. 1.П. Павлова (Льв1в, 198S); Всесоюзна науково-техн1чн1й конференцН "Применение биотехнологий в аивотнозодстве,-растениеводстве и ветеринарной медицине" (ЛенинГрад. 1988); ХШ з'Гзд! Якра'1'нського ф!з!олог!чного товариства i*. Г.П. Павлова (Харк!в, 1990 J г надково-виробнич!й конференц1Т "Новые методы селекции и биотехнологии в аивотноводстве" (Киев,19913; Всесовзнгй конференц!Г иолодих вчених "Современные кетой исследования в свиноводстве" (Полтава, 1991); науково-ви-робнич!й конференцН "Эффективность селекционно-племенной работы и технологии производства продуктов свиноводства" (Chfsinau, ,1993);' П niiflepsaBHift науково-практичн1й конференц!У "Селекци-- онно - генетические и - биотехнологические проблемы разведения крупного рогатогог скота" (Брест, 1995).

Особкстий внесся здобувача. Здобувач самостхйно проэгв вс! теоретичн! досл1д.яення i експерииенти з культивдвання ембр!он1в. В роботах по одержаннв eadpioHiB для дослшв брала участь xi-рцрг1чна бригада дабораторП' ф{з1олог!У 1нституту свинарства SftfiH. 1з спгльних пдбл!каЩй здобувач використав для оформления роботи ли®е свои частииу резулътат!в.

Структура та обсяг дисертацП'. Робота викладена на 181 сто-piH«l машинописного тексту, вклвчае 16 таблкиь, 13 налвнк1в. Дисертацзя складаеться з вступи, критичного анал}зу л!твратцри i постановки питания, опису матер1ал1в та нетод!в досл1двення, ре-зультапв власних дослгдкень та i'x обговорення. висновкхв, п!д-сумку i практичних рекоиендац!й. Список л!тератури вклвчае 433 джерел, у тому числ1.2В4 1нозв«них.

мйтер1йл та методика дошдйень

Досл1дження проводилися у 1986 - 1995 роках в лабораторП' ф!з!ологИ'.1нститдтд-свинарства SfiflH та Anljsal Science Research Center (flSRC) ун1верситету штату liccypi, СШЙ. Об'ектом дослЦ-вень були 7S8 до1мплантац!йних ен6р1он1в, одерканик х!рург!чно в!д 86 свиней. Ембр1они п!сля викивання потрапляли в терностато-ван1 (37 - 39°С) i стерильн1 уиови 1 оц!нввзлись за морфолог!ч-ник станом. Як середовице \'х культивуваняя в 1С ВЙЙЙ використо-вували модиф!кований наии б!карбонатний розчин Крвбса-Р1нгера, який виготовляли !з в1тчизняних реактив!в, счиденкх вдасноручно, 1 доповнпвали iO'4 одерждваноГ за власнии иетодои снроватки плода корови; в' ftSRC готували середовиве 5И.ттена (H.K.Hhitten. "3.D.Biggers, 1968). Рении.ста15!лъного рН п!дтримувалй використо- , внпчи загально прийнят! газов! csuiei С02 з поварам або cgnie СОг, Ог i N2. в пропорц1ях. потр1бних для створення певното р!в-ня рН. Осциляторний рекии рН фориували за власнов методикою, ви-користовуячи т! к c&ut газов! фази f спец!ально- сконструйоване обладнання. Культура тривала при 37 - 39°С до припинення розвит-кв еибр!он1в. Загальна схвна дослШв зобраяена на рисунку 1, Б1о*етричну обробку иатер!ал!в зд!йснввали за Е.К.Меркурьевой (1964) на н!крокалькулятор} "Электроника МК 51", а також на коип'втер! IBM ЙТ - 286 за програкэми, складешши Г.£.1ван!*ен-ком, використовувчи ь якост! числових показник!в число одшшь

Рисунок 1 .

С к е ï a t о с i f i i í к ь

: Визначення рН-властивостей р!дини репродуктивного тракту : ----------------------------т-------------------------------

: Очищения реактив!в: : : Приготування сироваткк :

—: Приготування культурального.середовица :--

-----------------_Т-------------------

: При осцилвючому рК :—: Культура . :— : При стабЬчьнрму pH : -----т---------------- : еибрхошв ; ----т--------:---------

-----7-

Динам1ка

Л1апазон

fl: 7,4 - 6.3 : Б: .7,6 - 8.0 :

IlepioÄ : 12 та 24 год. ;

---------- ; СОг в HOBtrpi

Дкерело :—: С02. 0г, N2

7.2 - 7.6 :

----: 7.5

7,6 - в.-О

—7,8 - В.О

: UopiBHSHHa резцльтат1в двох иетод!в :

розвитку ембр:.он1в за Юа]апа11еп(1г<зп ( 1985 ), а такоз фактичнч кхлькт клпин (яде?) пхсля притшення розвитку.

РЕЗЗЛЬТАТИ ДОСЛШЕНЬ Лослгдзення постмортальних зн!н кислотно-лузаих властивос-тей Р1дикй репродуктивного тракту сзин: показала, чо птсля вида-яенна натки ацидоз в 'и рогах так стр1мко зростае. но бу^ераа емкгсть розчину Люльбекка-виявляеться недостатньоз (таблица 1).

Таблица 1.

рН матачноТ рхднни в залезгностт вгд способу зберезення дослТдяуваного матергалу протягом транспортування.

Я п/п :Катер¿ал, цо :Час вхд забои: :

гтранспор- :до вим1раван-: п : У ± и : Р групп гтуеться : ня рН, год. : : :

гматки, капов- : г : а :

1 :нек! буферниы : 1,5 - 3.5 : 8 :3,96 ± 0.0? : < 0,001 :розчинок : : : :

:пул зиив1в у : : аб:

2 герметичному : 4,0 - 5,0 : 2 :7.05 ± 0,18 : < 0,05 :Флакон1 : : :

тнтактн! матки

1.5 - 2,0

5.95 1 0,13

0,001

Значения Ц + а з однаковими суперскрттами В1др1зняэться з в1рог1дн1стз Р < 0,01.

При цьому р{88Нь закислення пов'язаний з добовоя б1оритм1кою: в пополуденну пору в!н значно вищий, "ни в ' дополуденну. Дослан показали, чо лине-одеряаний протагоы не б!лме, нта птвгодини, пул з*ив{0 э яЙцепровод!в 1 иатки у флакони, що герметично за' кривапться, дозволяв транспортдеакня еибр!он1в з утриманняы рН • на р(8н! 7,05 1 0,18 протягом '5 годин в1д забою.

Культивування еибр!он1в при р!зних значениях поспйного рН з д!апаэону 7,6 - 8,0 показало з!рог1дний негативний вплив такого залувнення середовища. Р1зниця ы(г розвиткои ембр1он!в з двои серШ доелшв за умов стаб!льного рй нев!рог1дна (таблица 2). Головне в полягае у тону, до в умовах луаного рН ембр!они розвивалися значно г!рге, н$з при оппшальних його величинах, як в досл!дах серП* Й (Р < 0,001), так 1 серП' Б (Р < 0,001). Ана-л!э результат^ розвитку за покаэниками проценту ембр!он1в. но досзглй пэвнсУ кл1тинно1' стад1Г (таблица 3), такоя св!дчить про галькувчий вплив постШо п1дтрииувана\* залуаеност! середовияа, причояа чим старее «ибрЮнк, тих менаа \"х пристосовна *оалив1сть подо рН середовияа. .

Одержан! результат«, а таког критичний анал1з л!тератури привели нас до висновйу про необх1дн!сть прнпципоао нового пЦ-ходу до вир1»ення питания кулмдридоШлантаЩйних амбр 1 он!в 1п %чиго. Вро поставлено за мзту розробитн'в1дпов1дкнй осцклятор-кий реянм рй,' для чого опечатку игобхЦшо йуло вир1вити питания т«хн1чного 1 методичного плану: а/ винайти спос1й, «о забезпечу-вав би осцил5ц1в рН в задано«? режим!, б/ розробкти и&тодику до-сл1д!8ння динамки рН в створенН» систем! його осцилящу.

Перзе заедания бро вкрШне ялахок конструввання систеии нап1впрошшнх газоэях камер 1 скляних каиер крыивувзння р!з-них ой,?*1е. забвзпечуеалн два вар{анти аипл1туди осцилац!Т рН при застосрзнк! розробланоУ нами системи фориування газових

Таблица 2.

Порхвняння результатов двох сер!й ?осл!д1в залевност! розвитку eüSpiDHIE в i д разного pitnss пост ifinoro pH.

:Почат-

:кова :--

: кл!-:

:тикка:-

: ста-: 7.5 : Д1я :-

Cepia fl

CepiE Б

РН

PK

. : 7,0 - 8.0 : Р

:nl : Mi ± к1 :п2: К2 г ы2

: 7.2 - 7.5 : 7.6 - 8,0 : Р :пЗ : КЗ t мо :n4;M4 ± и4 :

: : а: : в; : : cd: : :-

: 1 :53 :2,3о±0,10 :23:2,78±С,14 :>0,05 : 77:3,14+0.15 :24:2,0±0,С6:<0.00

: а: : в : : : с : :

: 2 :24 ;2,4б±0.1б : Э: 2,0+0,0 :<0,01 : 62:2,25±0,17 : 2:3,0+1,41:>0,05 : ■ : : а: : . в: : : d : ;

: 4 :27 :1.56±0,10 :24:l,08+0,06 :<0.001:133:2.25i0,l0 : -: - : -

:Разои:104:2,48±0.03 :5о;1 ,ЭЗ±0.12 :<0,001:278:2.50+0.08 :26:2.1±О,Ю:<0.С0

й ± к - число сдкниць розвитку. Вгрогхдн'сть pxsHKL'i Kii значениями, со в»да®1йзшъ pisiscs' кглтшним стад1як, псзнзченэ сдакоеики cynepcspiirrasxi.

Таблица 3.

Розвиток в процентах 1 - 4-кл1тинних екбр!окхв евин! при р!зних значениях С7аб1льного pH.

:Початкова : рЯ- :кя1тинна :стадхя -.: К1льк1сть (процент) ек5р1он1в, so двигл! N : в1дпов1еноГ кпНтшноУ стад!У

: 4 : PS : IM : Б : - БР

:7.2-?,6: 1 :?,6-8.0: 130 ;125 (S6) : 65 (63) : 43 (33) :14 (11) : I (0.8): 47 : 45 ( 95) : 18 ( 33) : 2 ( 4.3): 0 : 0 :

:7.2-7,8: 2 :7.Б-8.0: 85 : 65 (100): 55 (65) : 39 (45) :14 (16) : 2 С2.3): 11 : 11 (100): И (100): 1 (9,1): 1 (9.1): 0 :

:7.2-7,6: 4 :7.б-8.0: 166 : - :166 t1005:117 (70) :38 (22) :11 (6.6): 24 : - : 24 (100): 1 (4,2): 0 . :0

:7,2-7,6: Разом :7.6-8,0: 382 : - :307 ( 80) :199 ( 52) :64 (17) :14 ( 3,7): 82 : - : 53 (65) : 4 (4.9): 1 (1.2): 0 :

РМ та ПМ - рання та п!зня иорули; Б - бластоциста; БР - бластоциста. цо розиярюеться.

- и -

Фаз. Для вир1«енння другого завдання було розроблено методику удаваного культивування, що дозволило встановити в!рог1дн! ек-стрекальн! значения рН,. в меяах яких BiH осци'люе протягом доби, тобто дтапазок рН, i побудувати за середн!ми значениями в!дпо-в!дн! граф!ки (рисунок 2 13). OTse, було розроблено два основ-них реяими осциляц!У рН в середовищ! культивування ембр!он1в: в диапазонах 7.6 - 8,0 та 7,4 - 8,3, ! постало питания, визначити, який з них Е ефективн!вим.

Анал!з результат!в за числом одиниць розвитку (таблица 4) не показав BiporiflHoT переваги будь-якого з двох вар!ант!в осци-ляторного режиму, йле анал!з за показникани дол! (%) екбр1он1в. що досягли певное кл!тинно"1 стад!У (рисунок 4),св}дчить, що про-цес утворення ! компактизац1У морул в!дбуваеться на 207. частое в диапазон! рН 7,6 - 6.0. Проте з переходом до стадтУ поляризованной" бластоцисти. коли зародок уяе не иоана прир!внввати, до однокл!тинних орган!зм!в чи кл!тинноУ суспенз!У в культур!, б1льв сприятливии виявляеться реши осциляцП* j»H в ширвоиу д!а-пазон!: 7,4 - 8,3. Саме в цих уыовах . був зареестрований випа-док.коли одна з бластоцист.як! завершили денудац!ю, ц!лу добу продовнувала розвирюватися.

Б процес! в1дпрацшвання осциляторного ревиму ми прийшли до висновку про необх!дк!сть визначення ефективност! двох основних пер1од!в осциляц1У рН: 12-ти та 24-годинного. Результати такого досл!дження, п!дсуыован! в таблиц! 5. св!дчать про в!рог!дну перевагу 24-годинного пер!оду. .

Враховуючи ту обставину. цо разом з осциляц!ев в газов!й фаз! СОг (яка эастосовувалась нами для осциляцГУ рН) осцилпе й вм!ст в н!й 0г. вавливо було з'ясувати, осциляц!я якого компонента газовоУ'фази вносить. найб!лышй вклад в стимуляиШ розвитку ембр!он!в in vitro. .3 uien метов були проведен! досл!ди за

2 V 6 8 10 \г Щ % 18 20 22 14

рисунок ?.. Иогодшш.ч протягои доби динам1ка осцилюичого рН середовица кулугивування ембр101пв шип (д1апазон коливань ?,6 -8,0, "пе1пция!нива" камора).

I

м

n

? I) И Ю !2 1'/ 1Ь и 20 22 24с Рисушж '5, Погодинна притягои дайн дшшика осцилюичого рII середоБИЦе! культив'шаннч ии11р1нн!в сьшп (дыиач.н (млиьлни , 4 •

М. "1пС\ьЧНОВ,Г' |Г1г!;;)-0.

"Ь

Таблица 4.

Роэвиток в единицах розвитку 1~кл!тинних еибр!он1в свин{ при дэох д!апаэонах осшшшН' рН,

• ♦ « » ;Д1апаэон: : РН : • , п ; Число одиниць розвитку 1-кл1тинних ембр!он!в евин! при двох д!апазонах ■ ; ! . осциляцй' рН :

* ; г : 4 : РМ ; ПН : РБ ; БП ; БР : БПВ * ! БВ ;

;?,а-8,0 ; 81 ; 2,0+0 :2.6*0,1 ¡3,2*0.1 :3,5+0.2 ¡3,8+0,2 ¡4.0+0,2 ¡4,1*0,2 ¡4,1*0,2 ;

;?,4-8,3 : 43 : 1,0*0 ; 2,0*0 :2.4*0,1 ¡2,8*0,2 :3.г±0,2 ¡3,8*0,3 ¡3,810,4 .-3,940,4 ¡4,0*0,4 :

: Р ; 7 >0,05 : >о!о5 : >р,05 : >0,05 ; >0,05 ' : >0.05 : >0,05 : >0.05 ! >0,05 ;

¡Разам : 124 : 1,0*0 ! 2,0*0 ;2;5±0,1 ;3,0±0,1 ¡3,4*0,1 ¡3,7*0,2 ¡4,0*0,2 ;4,0±0.2 ¡4,1*0,2 :

РМ та ПИ - раиня те п!зня морули; РБ ~ рання бластоциста; ОП, БР, БПВ та БВ - бластоциста що; по-ляррзувалзся; розвирибться; почала вирдити э гора ре11ис1с1а; вийила з неу помести.

шо

1Ш

00 40

го

а

ЕШ pi

Рисунок 4. Розвиток однокл!тикних ембр1он!в при двох д!апазонах осциляцхГ рН с у. eafipioHiB. що ДОСЯГЛИ 81ДЛ0В1ДН01' КЛ1ТИНН0"£ стад,!! 3

однакових ров реаиму осциляцП: з 24-годинним пэргодом, з д!а-

пазон! рН 7,6 - 8,0. Експериыенгн нэ виявили перезаги яодноУ з

газових фаз в стимдляцИ розвитку ембр1он{в: додаткова осциляц!я

02 не п!двищила результативностг дослШв. Це дае п1дстави при-

пдстити. що максимально 1"стиидляуИ розвиткд in vitro мояна дс-

сягти за допоиогов осциляцИ" бддь-якого параметра середовища Yx

розвиткд, ! в цьоку проявляеться неспециф1чн!сть р!стстинулнгачо-

го впливд осциляц!! 3<feHf®Hix oasropis.

. Лля лор i внял ь но Г оШнки результатов культивдвання еыбр{он!з за дмов пост1йного i осцилшвчого рН. ми пгддали б!оыетричн{й об-робц! зс! дан! наиих досл!дяень. в яких розвиток ембр1он1в вив-чався при бддь-яких значениях стаб!льного рН в оптимальному д!а-пазонi 7,2 - 7,5, а такая дан!, як! ии отрииали» примусоао осци-лпвчи рК а р!зних дтапазонах в!с 7Д до 8,3, вклячно. Рездльтати гакога анал!за Стаблиця б? св!дча7ь про В1рог!дно. б!лья 1нтен-сивний розвиток ембр!он1в в середовищГ з осцшшвчик рН. [¡ей фе-

Таблица 3,

Розвиток р процентах 1 - 4-кл1тинних ембр!он1в евин! in vitro в середотщ! рН якого осцилве з 12- та 21-годишши передом.

;Пер!од;Почат-: :ос«и- ;кова ; :ляцП' :кл1- ; п : рИ, ;тинна : ; год, :стад!я: К1льк1сть (процент) еибр!он!в, чо дасагли в1дпов!дно1' кл!тшшоТ стад!У

2-кл » - » - » 4-кл : РИ ; ПИ ; РБ ♦ ♦ ' БП : БР впв Бй

: 12 J ;29 : 29/100 2 : 2 ; -4 : 9 : -Разок :40 : 29/100 ;21/72,4 :16/55,2 : 5/17,2 2/юо : 2/юо : о : 9/100 : 9/100 ; 7/77,8 - : 32/80 :25/62,5 : 12/30 з/ю.з : 1/3,4 7/77,8 : 5/55.G 10/25 : В/15 0 0 0

24 1 :35 : 35/100 2 ; 3 5 -4 ; 8 : ~ Разо* ;46 : 35/100 :30/В3,7 :23/63,7 :13/37,1 : 4/11,4 : 2/5,7 з/юо : з/юо : З/юо ; З/ЮО : 2/ов,7 : 1/зз,з : 8/100 : 8/100 : 8/ЮО : 8/ЮО : 8/мо :41/8Э,1 :34/73,9 :24/52,2 :14/30,4 .41/23,9 0 : . : о : : 1/12,5 :1/12,5 : 1/2,2 : 1/2,2 .*

:Всього:ВВ

:73/84,9 :59/68,В ;36/41,9 ;24/32,В :17/19.0 : 1/1,2 ; 1/1,2 ;

РМ та ПН - рання та п!зня иорцли; РБ - рання бластоциста; БП, БР, Б(|В та БВ - бластоциста, ^о: гш-ляризувалася; розширветьса: внходнть з zona pellucida; виЛнла з не\' повести.

Таблица 6.

Розвиток 1 - 4-кл1тинних ембр!он!в евин! а середовивах з пост!йнин* та осцилюючим** рН.

:Початкова:Характерис-: Число :кл!тюша : тика : ембр!-:стад!я : рН - : он!в

Число

одиниць

розвитку

Cv

1 :пост!йний : 130 :осцилвечий : 235

: 3.07 ± 0,'10 : 100 : 36 :<0.001: : 3.93 ± 0,13 : 128 : 50": :

Р

2 :пост!йкий : 86 : 2,31 ± 0,13 : 100 : 53 :<0,001:

: :осцилввчий : 17 : 4.29 ± 0,36 : 186 : 35 : :

: 4 :пост!йний : 168 : 2.14 ± 0.09 : 100 : 53 :<0.001:

: госцилюючий : 52 :.4,26 ± 0.19 : 199 : 31 : :

.: Разом :пост!йний ; 382 : 2.49 + 0,06 : 100 : 47. :<0,001:

:осцилввчий :■' 304 4,01 +'0,13': 161 г 48 : :

* - д!апазон значень лост!йного рН - 7.2 - 7,6;

** - д!апазон значень осцилввчого рН - 7,3 - 8.3.

номен властивий як I - 4-кл!тинним ембр!онаи. так 1 окремо коя-н!й з кл!тинних стад!й.

Характерно, цо ембр!они, як! розвивалися в режим! осциляцП" рН, значно дал! просувались стад!йно, аж до виходу !з zona pel-luclda, н!ж за умов оптимального пост!йного рН, де розвиток об-межувався стад!ев резгирення бластоцисти (таблица 7). Та найваи-лив!иим е те. чо за умов осциляцН" рН з 1-кл!тинних ембр!он!в

Таблиц!? 7.

Розвитик 1 - 4-кл1тшших ембр1ои1в спин! при поптШюну* та осцилнгшиу** pH.

:Почат-:Харак-'. :кова :терис-—-tkjtt- :тика : h ¡мша- :рй :стад1я: t

KlflbKÎCTb i процент CH6pÍO!llB , tío ДОСЯГЛИ В1ДП0П{ДН(П ItnÎTHHIlOÏ стадИ'

It

РМ

ПН

п : г : п ; t

Iii'

п : у. : п : у.

ПИП

OD

п : у. : и : 7.

'$• i : пост.: 130 í ; octi. : 235

123 : ~9ß 228 : 97

05 : 65 : 43 î 33 148 ; 03 : 132 : 80

14 : Il : 1 : 0.8

82 : 35 : 34 : и

о : о : о 3,4: 5 : 2.1

12 i höct.: 88 : i : осц, : 17

88 : 100 17 : 100

SB : ès : ЗЭ : 45 17 : 100 : in : ее

H : 16 : 2 : 2.3 H : 85 : о : 35

о : о : о о : о : о

î A. : вост.: 166 : : осц. : 52

16В : loo : il? : 70 52 : loo : 52 : loo

о : о : -jo 9,0: 4 : 7,7

0:0:0 4.3: g : 3,0

РШ та RV - раиня та nfarta иорули; Б - Оласточиста; БР, БИВ, DB - блпетоципта, яо: розяирпеться виходить з zona peílticfda: вийила з ие\' ПопШств. * - д}апазсн значеиь- пост1йного pH - 7.2 - 7,8

** - диапазон значейь осцилвячого pH - 7,3 - 8,3.

:рвз0* : пост.: 382 î : осц. : 304

307 : 80 : 199 : 52 217 : 71 : 199 : 05

36 : 22 : 11 : 0,8

44 : (35 : 25 : 40

64 : 17 : И : 3.7

13? : 45 : со : 21

0 5

о

13

Б

утворявалося бластоцист в 3,2 рази 61льм, н1и при. стаб!льноау рН, причому частииа Yx навпъ завершувала денудаци.

йгя наявнтсти осциляторного резиму рН i штенсивн1стн> розвитку ембрiOHiв гснуе високий позитквний корелятивний зв'азок:. г - 0.7; Р<0,05.

Висновузчи про ггозятивний щодо роззитку ембр iOHi в вплиз осциляцИ' p(i серодовища. ми маемо, довести, ао цэй результат був .обновлений саме осцилягорнии рехиыоа, а не високкки (лугними) р!внями рН per se. Составления результат1в досл!д1в, наведених в таблиц!. 2, св!дчить. но за умов поспйного рН лдяких значекь (згд 7,0 до 8,0! середШй !ндекс дробления Bapise в!д 1,93 з 0.12 до 2.1 ± 0,1, тод{' йк при оптимальному пост!йнону рН (7.2 -7.6) Bin склада« близь ко 2,50 t, наапакн, за умов осциляШ' рЯ в д!апазон1 7,3 - 8,3 екбр!оки розвивавтьсз значно {нтансивн1з!е: середне число оДйкиць розвитку дор18нюе 4,01 i 0,11 (таблица 6). Це лор!вняння дае змогу зрсбити висновок про стимулвгачий вплив на розвиток емйр1он1в саке осцяляц1Т рН, а не його високих (луя-них) значень.

Отже, розроблений наки режим культивдвання до!мплантац1йних еибр!он!в в умовах везперерзно i ц!леспря«овано осцилзшчого параметра середовища- рН - дозволяе визначити його як осцилятор-ний метод культивдвання.

Той факт,- що застосування осцилзцп рН середовища Ictotho сприяе розвитку ембр!он!в. св1дчить, на наш погляд. про доц!ль-н}сть перегляду {снуючого п!дходу до-умов культивдвання б!олс-Пчних об'ект{в взагал!.

Наша дява про необхтдн1сть створення осцнляторноГ системи культивдвання живих о'б'ект!в грунтуеться, кр!м 1нпого, на 1сну-ванн{ кехан1зм!в в!драхунку часу в кл!тин1, нев!д'екйих вЦ са-кйх основ 1"1 1снування (PiUendrigh C.S., 19S0; Sunning E.,Hoser

Г., 1972; ¡¡jus D. et al., 1974; Гудвин 5., 1979). ! хоча фгзго-лог!я годинникового механизму до к1кця не з'ясована, для нас ваяливим е той факт, що конкретн! параметра хронологтчноТ про-

• грани зстановлввться пгд впливом зм!н ряду зовшин!х i внутр!в-Hix фактор1в.

Виходячи з уявлень Ршаина Й.В. ( 1940). Иыалыаузена И.И. (1946), Зтерн Я.С.(1947), Губина Г .Д. и Вайнерта Д. (1991), про те. до гоаеостагичнг механтзми розвиваються у фтло- i онтогене-з1, нами зроблено виснозок про максимальну нестаб{льн1сть зов-HiUHboro i внутр!шнього середовица орган!зму на • самому початку його.розвитку, а такоа про ыаксимальну роль у чей час неспеци-Ф1чних параметргв середовица, зокреиа тих, що визначавться гонами та 1ншгаи молекулами з малов молекулярной масои. Однгея з найхарактгрн1вих особливостей nepeöiry б!олоПчних npoueciB на Bcix структурних р 1внях аиво'Г матерП" е закономерна Тх орган!за-uia у час{, яка проявляеться в ритм!чних (цикл!чних) зм1нах г назвност! безя1ч1 механ!зм!в стабШзатор{в i осцилятор1в, почи-навчи з субкЛтинного р!вня (Bunning Е., Moser I., 1972; Njus D. et al., 1974; Pittendrigh C.S.. 1960; Катинас Г.С., 1980; йашоф В.. 1984; 1у И., 1982). На п!дстав{ цього ми д1йвли припущення,

* що нестаб1льн!сть розвитку на ембр1ональн!й стадП повинна мати осциляторний характер.

Головка вгдзнака розвитку ембргона in vitro - це недостача осциляцП' параметр!в середовища, яка мае бути i д1йсно !снуе протягом розвитку in vivo. Ось чому включения в режим культури in vitro осциляцН" HasiTb одного з параметров середовища - pH -(i пов'язаних з ним параметр$в) стимулнвало розвиток eMöpiMiBt саме через наблигення цих умов до природних in vivo.

3 теоретично! точки зору перевага осциляторного методу культури мояе полягати у слтдувчому;

а) у забезпеченост! ритм!чност! ф1з!олог$чних процес1в, зокреиа у циркадному ритм i. який е необхЦним фактором розвитку in vivo (Романов 10.й.. 1980; йиофф ft.. Вивер Р.. 1984; йгадЕанян Н.П., Набатура H.H.. 1989);

б) у почергсгвому забезпеченн} протлгом пер!оду культивування bíühocho неоднакових потреб б!олог1чно р1знояк!сних як ембр!о-híb однхеТ генерац!Т"(Квасницкий ft.В., 1949, 1950; Мартыненко К.А., 1975, 1977; 1990), так i бластонер!в будь-якого окремого ембртона (Дыбан п.П. и др.. 1976: Smith R.. Johnson К.. 1268; Kiransea N. et al.. Í989);

в) у забе'зпеченост! б1льноТ р1знонан1тност1 унов, а отве, 1 иов-ливост! ix виборы енбр!онами поблизу критичннх пер1од1в, коли иае Miene р}зка зм!на умов розвитку;

г) у залученн! до Функц1онування велнчезноУ р1зйокан{тност} Функц1онально под!бних молекул, цо потребувть децо р!зних умов для прояву максимально!" активност!;

д) у створенн! досить виейкого р!вня Ф1з1олог1чного стресу í. як HaciífloK, у спшдляцП* !ндукц!1' надлишкового анабол!зму завдяки флвктушвчому автоколиваннв метабол!чних циклтв, яке вШуваеть-ся. зг!дно праць Арвавскбго Н.А.£1976. 1981, 1982). починаичи з моменту утворення зиготи.. .

Результат« досл!дшень переконувть нас у тому, чо ембр1они ссавц1в yse на самому початку онтогенезу вимагавть осциляц!? умов середовида для свого нормального розвитку, а це фактично в!дбивае умови Yx розвитку In vivo, йдяе.для репродуктивноУ сис-теми самйц! характерной е найб1льва нестаб1льн1сть параметр1в як д 4aci (репродукгивн! цикли),, так i у простор! (б!ох1м1чне дифе-ренц1ивання р}зних в1дд!л1в репродуктивного тракту). 1 взагал! фтз!олого-01ох!м1чн! процеси в матц! визначалться надзвичайно великою цикл1чнов лаб1льн!ств гомеостазу (Коваленко В.Ф., 1987,

1995). 5езл!ч факт1в, одерканих !ншими дослхдниками, св!дчать про тс, ço кояек момент стаб1льност1 гивиго, отже î гомеостазу у Uiлону, iCHye завдяни робот i механизму эворотного негативного зв'язку. Сптвставлення bcîx иих обставик з фактами, одержанный наки. дозволяе висунути гипотезу, ео гомеостаз у ссавц1в мае но-, сити характер осцилевчого.

ВЙСНОВКЙ

1. рН яйцепров1дно-иатково'1 р!дини. виыгрякий через 0.5 год.ш'с-ля забою CBHHi, на 1,0 —.1,86 од. рН ненший за величина, рекомендован! вл!тератур1 для культивування еыбр!он!в ссавцгв, у тому ЧИСЛ1 Й СВИН1._

2. Спос!б збер!гання 1 транспортування одержаних на бойн! ембр1-ohîb у. репродуктивному тракт! свин1, заповненому середовищем Дяльбекко, непридатний для використання через недостатнв бу-ферчу вмк!сть останнього.

3. В уиовах культури Jn vitro при стаб1льному рН залужнення се-редовища вице рН 7,6 веде до зупинки розвитку перевахно вке на стад!'1" морули.

4. рИ середовива в створен1й нами систем! культивування ембр!о-н!в in vitro осцилве в д!апазон! 7,6 - 8,0 при великому об'ем! (1-2 ил) середовива i 7,4 - 8.3 - при малому (0.3 мл), з 24-годинним пергодом.

5. 1-кл!тинн! ембр!они евин! розвиваються.и однаковов результа-тивн!сти - в середови«!, рН якого осцилве з 24-годинним nepio-дом як в д!апазон! 7,6 - 8,0, так i '7.4 - 8.3.

6. 24-годинний пер!од осциляцГг рН в д!апазон1 7,3 - 7,9 забез-печуе в!рог1ДНо б!ль« !нтенсивний розвиток 1 - 4-кл1тинних ембр!он!в g пор!внянн! з 42-годинним пер!одом.

?. 1 - 4-кл!тинн! ембр!они розвивавться з однаковов реЗультатив-hictjd всередовиц!. осциляц!я рН якого викликаетьса осциляц!-

-22 ~

ев концентрац!Г С02 як у сдпрозод! з ocmuismiea концгйтрацп Ог, так i без неГ.

8. Розвиток e«6pioH*B за унов осцидяц1\' рй в1доуваЕтьса з ihtsh-CHBHicTD. набдиаенон до максимально!' за показ киками числа одиниць розвитку, незалезно вЦ початковоТ ял1тинноГ стадп.

9. Застосдвання примуссвоТ осциляцп рй зкачно розгкрсе в луанд сторону рН-дхапазон gcniarooro роззитку eMfipiOHis (7.4 - 8.3) у nopiBHSHKi з гиапазонок оптимально пзстхйних значекь рН (7,2 - 7.б), рекомендованях в лттератур^

Ю.Лузн1 значения рН i утримання-Гх стабхльними бхля 3.0 не по-кращуютъ розвитку ембргонгв у порхвняннг з загальноприйняти-. ми фгз!олог1чни.чи незами стабильного рЯ. тодх. як введения луяних значень рН за циоз його осцилзц!'1 в!рог1дно покрацуе разультати культцри ембр}сшз.

П.йхя наявн!стз осциляторного резииу рй i 1нтенсивн!стп роззитку еибр{он{в хснуе високий позитивний' корелятивний зв'з-зок: г = 0.7: Р < 0.05.

практичя1 решщщи

t. 3 нетоаг кра^о! зберезеност! еыбрхон1з, одеряаних в уновах боЗн1, дсцгльно зикористовуватя тзарин, забитих в дсполуден-ну пору, збиразчя знивя еабр!он!з g пул i транспортузчи Гх герметично укипорешши-

2. Для сти«улзц1'1 розвитку In vitro до {«плантации;« е«бр1ок!з сван! (i !нзих.ccaBiiiB). рекомендуемся осциляторний метод Yx кдльтивування: в середозкгц, pfi якэго осцилве з меяах 7.4 -8,3 з 24-годинним перходом.

3. Застосдвання осциляторного методу культури in vitro особливо • реканендуеться в роботах по одерканка еибр!ок!в !з загшдне-

них in vitro ооцит1в, як такий, цо забезпечуе успхзниЯ розвиток зигот до стадГГ бластоцисти.

- - 23 -

4, Прспонуеться перевгрка еф,вктивност{ еикорнстання осциляторно-го методу в роботах з щпгинних 1 тканинких культур.

5. Отриман: дант про осаблизостх роз?итку еабр:он1в в середови-ках з посгШшн т осцилвдчик рй кс®уть бути використанх у вузах при чктанн! лекцхйвих курс*е з фхзЬлогг! ладиви 1 тва-рия, еыбргологП, цитологГь

СПИСОК ОПЖШОВШ« РОБГТ ПО ТШ ДЙСЕРЩИ

1. Денисок П.В. Культивирование свиных эмбрионов как элемент' клеточной биотехнологии // Тез. докл. Всес. науч.-техн. конф, "Применение биотехнологий в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине" И - 13 акт. 1993 г..'г. Ленинград.. -«.. 1988. - С. 41 - 43.

2. Денисюк Е.В., Иартыиенко Н.й. Культивирование 8 - 16-клеточ-ннх эмбрионов свиней в среде лабораторного изготовления // Свиноводство. - Киев: Нрокай, 1989. - Вып. 45. - С. 63 - 70.

3. Денисшк 1Г.В. Одераання та використання сироватки кров: плода, велико! рогато'! худоби для культивуванкя до!мплантацхйних за-родк!в евин! // Свинарство. - КиУе: Зрояай, 1991. Вип. 47. С. 82 - 84.

4-. Денисак О. Культивирование вне организма одноклеточных за-брионов свиньи // Ковке методы селекции и биотехнологии в животноводстве. - Киев: йссоцхац1я "Чкрадна'Ч 1991. - 2, С. 49 - 50. '

5. Денисяк О. Культивирование вне организма ' однгзклеточтех (и дзуклеточных) эмбрионов свиньи // Тез. докл. Врес. кокф. молодых ученых "Современные метода исследования в свивдвод-стве". - Полтава. 1991. - С," 38 - 93.

6. Ленисзк П.В., Марткненко Н.й, Цосдеубойнце кислотно-основные свойства жидкостей репродуктивного тракта свиньи в связи с культивированием эмбрионов // Эффективность селе,кци.онно^пле-

менной работы и технологии производства продуктов свиноводства. Chisinau: flgroinforEreclasa. 1933. С. 70 - 71.

7. Денисюк П.В. Cnociб культивування до1мплантац1йних eM6pioHiE ссавЩв поза орган!зыом. - Заявка на патент в!д 23.04.1993 N 93111521. Патент N 10067 ft.

8. Денисвк П.В.. Чирков О.Г., Мартиненко Я.А. Розвиток екрано-ваних та неекранованих райн1х е«бр{он1в свин1 в культурах поза орган!зиом У/ Всеукр. конф. з ф!з1олог1У 1 б!ох1ий" тва-рин. Тези допов1дей. - Льв1в. 1394. - С. 5В.

9. Денисвк П.В., Чирков О.Г.. йартиненко Н.й. Полтавська методика культивування ен5р!он!в свян! // Свинарство. - КиГв: Нрояай. 1995. - Вип. 51. - С. 19 - 22.

10.Денисвк О. , Мартыненко fl.fl. Культивирование преинплантаци-онных эмбрионов в среде с осциллирующим рй // Тез. докл. 2-ой Межгосударственной конф. "Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота" 23 - 25 мая.1935 г..г. Брест. - Брест,.1395. - С.52 - 53.

11.Денисвк Л.В., Мартыненко Н.й. Принципиально новый метод культивирования доинплактационных эмбрионов млекопитающих // Доклады НЙН Экраины. - 1995. - Н 11. - С. 148 - 149.

12.Лобченко В.О., Денисвк П.В. Культура ооцит!в та ембр1он!В евин! In vitro з нвтов трансплантацИ // Тези доп. ХП з*\'зд Экр. ф1зголог1чного товариства iM, ¡.П.Павлова. '- Льв1в. 19В6. - С. 237.

13.Лобченко В.О.. Денисвк П.В.. Мартиненко Н.А. Культивування oouHTiB та до1нплантац1йних зародк!в евин! поза орган!змом // 36. мат. XIII з'1"зд Нкр. Ф1з1олог1чного товариства in. 1Л1.Павлова "Розвиток ф1з1ологИ в ЭкраТнсък1й РСР за 1986 -1990 роки" 17 - 21 вересня 1990 р.. Харк1в. - КиГв: Яаукова ддкка, 1930. - 1. - С. 195 - 136.

- 25 -

Денисек ¡I.E. Влияние pH средн на развитие In vitro г.рекиплантационнЕх эмбрионов свиньи. Диссертация ка соискание ученой стегеки кекЕкдзта биологических наук' по специальности О3.00.13 - фкгйология-.человека и еизотнкх. Институт животноводства ЗййН, Харьков, 193?.

Разработан принципиально ноеий - осцилляторный - кето,г, нулстивпрования прбиь'пяантационках эмбрионов'клекопитавщих ссбгг— нои) in vitro в среде с принудительно осциллирувции р!!. Сфсркилировакк основные теоретические полозейис, на которых этот нетсд основывается. Показано, что данный'кетод обеспечивает существенную к достоверную (г = 0.7; Р < 0,05) стикуляции развития I - 4-клеточнкх зкбрискав по сравнению с общепринятым методов культивирования при постоянной pH. Выдвинута гипотеза, что го-меостаз у млекопитающих является осциллирувщим.

Benisyuk ,РЛ. Influence of the nediun pfl on pie preinplan-tation ecbryo development in vitro.

Thesis..on the scientific degree coipetition of candidate of biological sciences in the speciality 03.00.13 - physiolagv of can and anicals. Institute of ftnioal Science of UAfiS, Kharkov, 1997. ■ . "'.-."

& principally new - oscillatory. - method for ваниаПап (pig) preimplantation esbryo culture in vitro in mediim vith forced oscillating pH has been elaborated. The basic theoretical grounds for the ¡¡¡ethod have been formulated. The given method ensures significant and statistically probable Cr = 0.7; P<0.05) stiEulation of 1 - 4-cell eabryo for development in comparison with generally accepted sethod of culture at stable pH. It is hypothesized that homeostasis in maEsals is oscillating.

Кличов! слова: свиня. екбр!он. in vitro, осциляцгя рй, га-зова фаза, осцилвичий гомеостаз.