Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние редокс-состояния дыхательной цепи митохондрий на транскрипцию митохондриальных и хлоропластных генов Arabidopsis thaliana

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние редокс-состояния дыхательной цепи митохондрий на транскрипцию митохондриальных и хлоропластных генов Arabidopsis thaliana"

На правах рукописи

ПОТАПОВА Татьяна Владимировна

ВЛИЯНИЕ РЕДОКС-СОСТОЯНИЯ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ НА ТРАНСКРИПЦИЮ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ И ХЛОРОПЛАСТНЫХ ГЕНОВ АКАВЮОРБШ ТНЛЫА УА

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

Иркутск —2013 005542467

005542467

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерии растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН (СИФИБР СО РАН), г. Иркутск и в институте Биологии/Генетики Университета Гумбольдта, Берлин, Германия.

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Константинов Юрий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

доцент Побежимова Тамара Павловна

доктор биологических наук Щербаков Дмитрий Юрьевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН

Защита диссертации состоится «18» декабря 2013 года в 09.00 часов на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 317. Факс (3952) 510754, e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН.

Текст автореферата размещен на сайте Института: www.sifibr.irk.ru

Автореферат разослан «_» ноября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 003.047.01, кандидат биологических наук

Г.П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Регуляция функций основных энерготрансфор-мирующих органелл растений - хлоропластов и митохондрий - включает как антероградную (от ядра к органеллам), так и ретроградную (от органелл к ядру) передачу сигналов, а также перекрестную связь между хлоропластами и митохондриями. Экспрессия хлоропластного и митохондриального геномов регулируется редокс-сигналами, возникающими при функционировании электрон-транспортных цепей внутри самих органелл. Существование редокс-контроля генетических функций митохондрий и хлоропластов к настоящему времени подтверждено многочисленными исследованиями. Рад аспектов митохондриально-хлоропластных взаимодействий был изучен при исследовании митохондриальных мутантов с нарушениями функционирования хлоропластов (Leister, 2005). Достаточно детально изучены молекулярные механизмы, обеспечивающие изменения экспрессии хлоропластных генов на разных уровнях (транскрипции, трансляции) в зависимости от редокс-состояния пластохинового пула в составе фотосинтетической цепи переноса электронов (Pfannschmidt et al., 2009; Dietz, Pfannschmidt, 2011). При этом регуляция экспрессии митохондриальных генов изучена значительно слабее. До сих пор ответ митохондриального генома на изменение редокс-условий изучался только науровне изменений общей транскрипции в изолированных митохондриях (Konstantinov et al., 1995; Wilson et al., 1996), но не на уровне изменений экспрессии индивидуальных генов органелл в целых растениях. Влияние редокс-состояния митохондриальной электрон-транспортной цепи на транскрипцию хлоропластных генов также не исследовалось ранее. В настоящее время общепризнано, что взаимодействия митохондрий и хлоропластов играют важнейшую роль в нормальном протекании процесса фотосинтеза и формировании биологической продуктивности растений (Dutilleul et al., 2003; Noguchi and Yoshida 2008; Nunes-Ne-si et al., 2011). В связи с вышеизложенным изучение влияния редокс-состояния цитохромного и альтернативного пути дыхания на экспрессию индивидуальных митохондриальных и хлоропластных генов представляет как большой теоретический, так и научно-практический интерес.

Цели и задачи. Цель настоящей работы состояла в исследовании влияния редокс-состояния дыхательной цепи митохондрий на транскрипционную активность и содержание транскриптов митохондриальных и хлоропластных генов арабидопсиса. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние ингибирования цитохромного и альтернативного пути дыхания на транскрипционную активность и содержание транскриптов митохондриальных генов арабидопсиса.

2. Изучить влияние ингибирования цитохромного и альтернативного пути дыхания на транскрипционную активность хлоропластных генов арабидопсиса.

3. Исследовать влияние различий в уровне активности альтернативной оксидазы митохондрий на транскрипцию хлоропластных генов с использованием трансгенных линий арабидопсиса с повышенным и сниженным уровнем активности альтернативной оксидазы.

Научная новизна. В результате проведенных исследований установлено влияние различных редокс-состояний дыхательной цепи натранскрипцию митохондриальных

генов арабидопсиса, что проявляется принципиально разным образом в отношении скорости транскрипции и содержания транскриптов тех же генов. Впервые показано, что транскрипционная активность большинства митохондриальных генов зависит от функционирования альтернативной оксидазы. В то время как ингибирование основного пути переноса электронов приводит к снижению скорости транскрипции, ингибирование альтернативной оксидазы митохондрий ведет к увеличению скорости транскрипции митохондриальных генов. Впервые обнаружены дифференциальные изменения скорости транскрипции хлоропластных генов при изменении редокс-состояния дыхательной цепи митохондрий. Впервые показано, что повышенная активность альтернативной оксидазы митохондрий в трансгенных растениях арабидопсиса полностью снимает ингибирующее действие на хлоропластную транскрипцию, вызванное подавлением цитохромного пути дыхания при обработке цианидом калия.

Научная и практическая ценность работы. В работе детально изучено влияние различных редокс-состояний дыхательной цепи и фотосинтетической электрон-транспортной цепи на транскрипционную активность митохондриальных и хлоропластных генов Arabidopsis thaliana. Получены приоритетные данные о транскрипционном ответе митохондриальных и хлоропластных генов при изменениях редокс-состояния дыхательной цепи. Полученные в работе данные расширяют представления о механизмах редокс-регуляции метаболических процессов в растительной клетке и важны для понимания митохондриально-хлоропластных взаимодействий на уровне экспрессии генов. Выяснение механизмов регуляции экспрессии митохондриальных генов будет способствовать созданию новых генотипов сельскохозяйственных растений с улучшенными хозяйственно-ценными признаками методами генетической и клеточной инженерии. Разработанная автором экспериментальная система, включающая инкубацию срезанных растений с ингибиторами митохондриальной и фотосинтетической электрон-транспортных цепей, выделение органелл и проведение реакции run-on транскрипции, может служить информативным подходом в исследованиях влияния редокс-состояния цепей переноса электронов митохондрий и хлоропластов на транскрипцию органельных генов.

Публикации и апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации были представлены на Всероссийской научной конференции «Факторы устойчивости растений в экстремальных условиях и техногенной среде» (Иркутск, 2013 г.), на I Международном симпозиуме «Молекулярные аспекты редокс-метаболиз-ма растений» (Казань, 2013 г.), на VIII Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Киев, 2013 г.), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений. Годичное собрание Общества физиологов растений России» (Москва, 2013 г.).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 232 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 139 страницах, содержит 22 рисунка и 4 таблицы.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Исследования проводили на 12-дневных растениях арабидопсиса {Arabidopsis thaliana L. [Heynhj экотип Col-0 (дикий тип). Растения выращивали в климатических камерах при температуре 20-23 °С, 16-часовом освещении (130 мкмоль квантов м^с-1) (Lamp Master HPI-T Plus 400W E40) («Philips»), Семена проращивали в кюветах в почве, смешанной с перлитом в соотношении 1:1.

Методы. Инкубацию растений на воде и растворах ингибиторов проводили при постоянном освещении интенсивностью 180 или 270 мкМ квантов м"2с_1 в течение 4 часов. Конечная концентрация ингибиторов в растворе при экспозиции срезанных растений: цианид калия (KCN) - 1 мМ, антимицин А (АА) - 10 мкМ, салицилгидроксамовая кислота (СГК) - 1 мМ, олигомицин - 2 мкг/мл, ротенон - 40 мкМ, 2,5-дибромо-3-метил-6-изопропил-р-бензохинон (ДМИБ) - 25 мкМ, 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-Диметилмочевина (ДХФДММ) - 10 мкМ. В контрольном варианте растения инкубировались в течение 4 часов в водном растворе.

Методы ПЦР и электрофорез ДНК осуществлялись по стандартным методикам (Sambrook and Russell, 2006).

Выделение РНК и Нозерн-блот гибридизация осуществлялись, как описано в Yamburenko et al. (2013).

Для того чтобы определить содержание РНК методом макроэррэй, 5 мкг всей РНК каждого образца были помечены полину клеотидной киназой Т4 (Fermentas, Литва) в присутствии 30 мкКи [32Р]-АТФ (Amersham, Великобритания) согласно инструкциям производителя. Меченая РНК была очищена фенол/ хлороформной экстракцией и осаждением этанолом и растворялась в 150 мкл буфера гибридизации. Процедуры гибридизации, отмывки мембран и анализ данных проводили как в методе run-on, при температуре гибридизации и отмывки 65 °С.

Выделение хлоропластов проводили по методу, описанному в статье (Ефимова и др., 2012) с некоторыми модификациями. Подсчет хлоропластов осуществляли с помощью цитологической счетной камеры под световым микроскопом. Для проведения одной run-on реакции отбирали около 50 млн хлоропластов.

Выделение митохондрий проводили методом дифференциального центрифугирования с последующим разделением в градиенте Перколла как описано в статье (Kühn et al., 2009) с некоторыми модификациями.

Подготовку нейлоновых мембран с иммобилизированными ДНК-зондами на митохондриальные гены и проведение run-on транскрипции осуществляли в соответствии с методами, описанными в работе (Zubo et al., 2008) и (Giegé et al., 2000) соответственно.

Обработку данных run-on экспериментов осуществляли с помощью программ Quantity One и Excel. Данные получены как минимум в 3-кратной биологической повторности, посчитаны стандартные отклонения. В ряде случаев отношения контрольного варианта к опытному выражены в форме десятичного логарифма, для более наглядного представления данных.

генов, обусловленное падением скорости транскрипции всех изучаемых генов. При этом важной особенностью действия ингибиторов основной цепи переноса электронов на скорость транскрипции в митохондриях было подавление этого процесса в более сильной степени под влиянием цианида калия, нежели антимицина А, что можно объяснить более восстановленным состоянием дыхательной цепи при действии цианида калия по сравнению с антимицином А. При обработке растений цианидом калия наблюдалось 6-кратное снижение скорости транскрипции большего числа генов, чем в случае использования антимицина А. При этом наибольшую чувствительность к действию цианида калия продемонстрировали гены пас12, пас15, сохЗ, ссЬ20б, ссЬ256. В случае обработки антимицином А 6-кратное снижение скорости транскрипции наблюдалось только для генов <Ир1, гр15. Такой результат может служить ясным указанием на существование выраженной зависимости скорости транскрипции в митохондриях арабидопсиса от редокс-состояния основной дыхательной цепи органелл.

СС О)

X 0 j

а

=г -0,3

L_

& О -0,6 •-

го

-0,9 --

.д

о

а -1,2 --

а

О

-1,5 -L

(N ^ ^ Ю О) т- И

х х-о

го го го го го го

8 § fisS^Sfcl

м

О) гг

е- Е

F t t t t

о о о о

Рис. 2. Изменение скорости транскрипции митохондриапьных генов при инкубировании проростков арабидопсиса на растворе цианида калия (1 мМ). 12-дневные растения, выращенные при 130 мкмоль квантах м_2с~1, инкубировали на растворе цианида калия (1 мМ). Эффекты ингибиторов показаны по сравнению с водным контролем как десятичный логарифм, вычисленный от среднего значения транскрипционной активности всех исследованных митохондриапьных генов как минимум 3 независимых экспериментов; (0.3 указывает на двойное увеличение, -0.3 указывает на двойное уменьшение в интенсивности митохондриальной транскрипции). Двукратные различия транскрипционной активности в экспериментах рассматривались как достоверные.

1,2. Активация скорости транскрипции митохондриапьных генов при ингибировании альтернативной оксидазы

В отличие от значительного снижения скорости транскрипции под влиянием ингибиторов цитохромного пути митохондриального дыхания, обработка растений салицилгидроксамовой кислотой, напротив, приводила к существенному возрастанию скорости транскрипции для большинства исследуемых генов (рис. 3). При этом более чем двукратное увеличение скорости транскрипции демонстрировали гены субъединиц дыхательного комплекса I (nadl, nad4L, nad5, nad9), комплекса III {cob), комплекса V (atpl, atp6. J, atp9), генов биогенеза цитохрома с (ccb203, ссЬ20б, ссЬ256), генов тРНК (Gin, Туг, Тгр), рибосомальных генов (rpl5, rps4) и orfl07.

0,6

Iii

4

<N^-Jm054-COXJCOCDCO ■a "D "D 't "О "ö x x о о о LT) njroro-oajajOOOcMOJcvj

CCCCOCCOO -Q -Q -Q

8 8 3

т-а> Ф С ¡г, i-p.>mTrNU3N Я Ol N

~ t t с 's t

ra о t о h

Рис. 3. Изменение скорости транскрипции митохондриальных генов при инкубировании проростков арабидопсиса на растворе салицилгидроксамовой кислоты (1 мМ). 12-дневные растения, выращенные при 130 мкмоль квантах м-2с~1, инкубировали на растворе салицилгидроксамовой кислоты (1 мМ). Эффекты ингибиторов показаны по сравнению с водным контролем как десятичный логарифм, вычисленный от среднего значения транскрипционной активности всех исследованных митохондриальных генов как минимум 3 независимых экспериментов; (0.3 указывает на двойное увеличение, -0.3 указывает на двойное уменьшение в интенсивности митохондриальной транскрипции). Двукратные различия транскрипционной активности в экспериментах рассматривались как достоверные.

Таким образом, из полученных результатов следует, что транскрипционная активность большинства исследуемых митохондриальных генов зависит от функционирования альтернативной оксидазы: ингибирование альтернативной оксидазы с помощью СПС вызывало увеличение в той или иной степени скорости транскрипции практически всех генов. Такой результат можег быть истолкован в пользу существования механизма транскрипционного контроля экспрессии митохондриальных генов, основанного на передаче сигналов непосредственно от альтернативной оксидазы к геному митохондрий.

1.3. Эффекты ингибиторов митохондриального дыхания на содержание

транскриптов митохондриальных генов

Чтобы исследовать потенциальную роль редокс-состояния электрон-транспортной цепи в регулировании экспрессии митохондриальных генов не только на скорость транскрипции, но и на содержание митохондриальных РНК, мы количественно оценили влияние антимицина, цианида калия и СГК на уровни транскриптов генов atpl, atp9, /PHK-Ser и /РНК-7>г с помощью Нозерн-блот анализа (рис. 4). Ингибирование альтернативной оксидазы СГК имело противоположные эффекты на гены, кодирующие тРНК и субъединицы АТФ-синтазы. Уровни транскриптов генов тРНК и atp были повышены (особенно atpl), тогда как уровни транскриптов tRNA-Ser и tRNA-Tyr были снижены до 46 % и 39 % по отношению к контролю, соответственно. Обработка KCN (так же как смесью СГК и KCN) незначительно снижала содержание транскриптов.

Интересный результат был получен при ингибировании дыхательного комплекса III антимицином А. В отличие от эффектов антимицина А на скорость митохондриальной транскрипции (рис. 1), мы заметили, что приблизительно в 2,5 раза повышено содержание транскриптов atpl и atp9 после химического подавления активности комплекса III антимицином А. Уровень транскриптов tRNA-Ser и tRNA-Tyr, однако, был снижен (рис. 4) в соответствии с показанным нами ранее подавляющим эффектом антимицина А на скорость транскрипции (рис. 1). 8

СМ ^ ^ Ю О) "О "О "О ТЭ "О "О

со со со со со со

S 0,3

с: с о о о о

CD CD CN О Ш с» см CNI со

Щц

ООО

го го со

>> t^* 7Z

о

ьо %

S. -о.з -I ф

СЕ о

о

т

i'!'S|f|'i i ■ffSP'Plli| i^'t'fl ¥

ч

-0,6

Рис. 6. Изменение содержания транскриптов митохондриальных генов при инкубировании проростков арабидопсиса на растворе цианида калия (1 мМ),

Выявляемое при действии антимицина А повышение уровня транскриптов большинства исследованных генов является, возможно, результатом работы механизма редокс-регуляции генной экспрессии в митохондриях. На основе этого механизма, обеспечивающего активацию экспрессии митохондриальных генов в условиях окисления и ее подавление в условиях восстановления (Konstantinov et al., 1995), можно объяснить обнаруженные различия в действии антимицина А и цианида калия как на скорость транскриции, гак и на уровень транскриптов в митохондриях арабидопсиса. Принципиальные отличия при действии антимицина А, наглядно проявляющиеся в увеличении содержания транскриптов генов (рис. 5), можно объяснить наличием окисленного участка дыхательной цепи слева от точки приложения эффекта ингибитора. В то же время при действии цианида калия дыхательная цепь находится в полностью восстановленном состоянии, что приводит к падению содержания транскриптов. Обнаруженное снижение уровня транскриптов генов тРНК (рис. 5), возможно, является результатом падения в этих условиях уровня внутримитохондриального АТФ, который необходим для работы генов тРНК. Напротив, при обработке цианидом калия наблюдалась тенденция к снижению содержания транскриптов большинства митохондриальных генов, за исключением гена сохЗ, уровень транскриптов которого повышался почти в 2 раза. Следует также отметить существенно более высокую степень подавления транскрипции гена cob, составляющую 4 раза (рис. 6),

Результаты определения уровня транскриптов некоторых митохондриальных генов при обработке растений ингибиторами цитохромного пути (АА, K.CN) и альтернативной оксидазы (СГ'К), представленные на рис. 4, демонстрируют существенные отличия в характере наблюдаемых изменений этого параметра по сравнению со скоростью транскрипции. В этом случае только для гена atpl при обработке СГК наблюдалось достоверное увеличение содержания транскриптов, в то время как уровень транскриптов генов тРНК достоверно снижался (рис. 4). При этом такое разнонаправленное действие СГК на транскрипцию данных генов устранялось при совместной обработке СГК и KCN.

Примечательно, что ответы транскрипционных уровней и скорости транскрипции митохондриальных генов на ингибирование электрон-транспортной цепи отличались друг от друга во многих случаях. В то время как обработка СГК положительно влияла на скорость транскрипции, она оказывала слабые эффекты на содержание мРНК. Обработка K.CN сильно подавляла транскрипцию, но либо не имела эффекта, либо ока-

крипции, ингибирование альтернативной оксидазы митохондрий ведет к увеличению скорости транскрипции митохондриальных генов. Предполагается, что ингибирование потока электронов по цитохромному пути служит сигналом для подавления транскрипции генов, в то время как усиление этого потока, происходящее при ин-гибировании альтернативного пути, вызывает активацию транскрипции.

3. Изменение редокс-состояния основного пути транспорта электронов в митохондриях при обработке проростков ингибиторами дыхания приводит к снижению скорости транскрипции хлоропластных генов. Данный эффект наблюдается только в условиях освещения и полностью отсутствует в темноте, что свидетельствует в пользу роли этого регуляторного механизма в предотвращении сверхвосстановлен-ного состояния хлоропластов на свету.

4. Одновременное ингибирование основного и альтернативного путей дыхания приводит к существенно более выраженному подавлению транскрипции хлоропластных генов. Повышенная активность альтернативной оксидазы в трансгенных растениях арабидопсиса полностью снимает подавляющий эффект ингибиторов цитохромного пути на хлоропластную транскрипцию. Полученные данные говорят об участии обоих путей дыхания в регуляции транскрипции хлоропластных генов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Катышев А.И., Милешина Д.В., Шмаков В.Н., Черникова В.В., Потапова Т.В.. Сидорчук Ю.В., Кулинченко М.В., Дейнеко Е.В., Дитриш А., Вайхе А., Бернер Т., Константинов Ю.М. Перенос генов в митохондрии табака в системах in vitro и in vivo // Материалы докладов в 2-х частях VII съезда Общ. физиол. раст. России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных технологий». - Нижний Новгород, 2011. - Ч. I. - С. 322-323.

2. Потапова Т.В.. Зубо Я.О., Тарасенко В.И., Невинский Г.А., Бернер Т., Константинов Ю.М. Транскрипция митохондриальных генов арабидопсиса при нарушении работы дыхательной цепи митохондрий // Матер. Всероссийской научн. конф. «Факторы устойчивости растений в экстремальных условиях и техногенной среде» (10-13 июня 2013 г.).-Иркутск, 2013.-С. 197-200.

3. Потапова Т.В.. Зубо Я.О., Тарасенко В.И., Невинский Г.А., Бернер Т., Константинов Ю.М. Изучение влияния окислительного стресса на транскрипцию митохондриальных генов у Arabidopsis thaliana // В сб. научн. тр. «Факторы экспериментальной эволюции организмов». — Киев: Логос, 2013. - Т. 12. — С. 157-161.

4. Потапова Т.В.. Зубо Я.О., Ямбуренко М.В., Константинов Ю.М., Бернер Т. Влияние редокс-состояния дыхательной цепи митохондрий Arabidopsis thaliana на транскрипцию митохондриальных генов // Всеросс. научн. конф. с междунар. участием «Инновационные направления современной физиологии растений. Годичное собрание Общества физиологов растений России»: тез. докл. — М., 2013. — С. 126.

5. Константинов Ю.М., Потапова Т.В.. Зубо Я. О., Тарасенко В.И., Гарник Е.Ю., Бернер Т. Редокс-сигналинг в регуляции экспрессии митохондриальных и ядерных генов растений // Матер. I Международного симп. «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений». — Казань, 2013. — С. 42.

6. Гарник Е.Ю., Бельков В.И., Тарасенко В.И., Потапова Т.В.. Корзун М.А., Константинов Ю.М. (Garnik E.Yu., Belkov V.l., Tarasenko V.l., PotapovaT.V., Korzun M.A., 22

Konstantinov Yu.M.). Экспрессия гена глутаматдегидрогеназы gdh2 арабидопсиса индуцируется под влиянием ингибитора синтеза тетрапирролов норфлуразона // Журнал стресс-физиологии и биохимии. - 2013. - Vol. 9, N 4. - Р. 299-309.

7. Зубо Я.О., Потапова Т.В.. Тарасенко В.И., Бернер Т., Константинов Ю.М. Интенсивность транскрипции хлоропластных генов арабидопсиса зависит от уровня активности альтернативной оксидазы в митохондриях // ДАН. - 2013 (принята к печати).

8. Zubo Y.O., PotapovaT.V.. Yamburenko M. V., Konstantinov M. V., Börner Th. Dysfunction of the electron transport strongly affects transcription and transcript levels in Arabidopsis mitochondria // Mitochondrion. - 2013 (submitted).

9. Потапова T.B.. Зубо Я.О., Тарасенко В.И., Бернер Т., Константинов Ю.М. Эффекты различных редокс-состояний дыхательной цепи митохондрий на транскрипцию митохондриальных генов Arabidopsis thaliana // Известия Иркутского государственного университета. Серия «Биология. Экология». - 2013 (в печати).

Подписано в печать 04.11.2013. Бумага офсетная. Формат 60х84'/16-Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,4

_Тираж 100 экз. Заказ № 086-13._

РИОНЦРВХСОРАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon58@gmail.com)