Влияние разных изоформ ламинина на адгезию и миграцию нормальных и трансформированных кератиноцитов человека

Калмыкова, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние разных изоформ ламинина на адгезию и миграцию нормальных и трансформированных кератиноцитов человека
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние разных изоформ ламинина на адгезию и миграцию нормальных и трансформированных кератиноцитов человека"

На правах рукописи

КАЛМЫКОВА Наталья Владимировна

Влияние разных изоформ ламинина на адгезию и миграцию нормальных и трансформированных кератиноцитов человека.

03.00.25. Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Г.П. Пинаев,

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук М.И. Блинова Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.И. Воробьев

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

кандидат биологических наук A.B. Васильев Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва

Ведущее учреждение: Институт канцерогенеза ОНЦ РАМН,

Москва

Защита состоится " с£-0 " февраля 2004 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.230.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института цитологии РАН Реферат разослан"

января 2004 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор биологических наук И.И.Марахова

гоо? -^ /7SK

2S2t7BO

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Одной из актуальных проблем современной клеточной биологии является изучение механизмов регенерации поврежденных тканей и органов. Примером такой регенерации является заживление кожных ран, которое начинается с миграции клеток в повреззденный участок кожи, с последующим образованием базальной мембраны (БМ) и восстановлением нормальной структуры ткани. Миграция клеток определяется субстратом и растворимыми сигнальными молекулами. Сигнальные молекулы приводят клетки в состояние готовности к миграции, а субстрат позволяет осуществлять сложный двигательный процесс. Взаимодействие клетки с субстратом осуществляется посредством рецепторов. Основным классом рецепторов, взаимодействующих с элементами внеклеточного матрикса (ВКМ) являются интегрины. Через эти рецепторы осуществляется как механическая, так и информационная связь клеток с ВКМ. Участие тех или иных интегринов определяет вид образующихся адгезионных комплексов и, как следствие, миграционные способности клеток. Сигналы, передаваемые через интегрины, также определяют дальнейшую судьбу клетки, останется ли она на БМ или уйдет в диффсренцировку. В этой связи выяснение механизмов миграции клеток, выявление факторов и рецепторов, определяющих данный процесс, является важной задачей клеточной биологии,

Процесс взаимодействия клетки с матриксом является также определяющим

фактором в клеточной заместительной терапии. Это одно из направлений современной

медицины, цель которого состоит в восстановлении структуры и функций поврежденной

ткани путем трансплантации клеток, выращенных in vitro. Наибольшее развитие это

направление получило в терапии кожных повреждений. В качестве кожных заместителей

используют как сами клетки кожи (кератиноциты и фибробласты), так и комплексы клеток о

элементами ВКМ. Использование белков ВКМ важно с двух точек зрения, во-первых, это

позволяет создать при культивировании клеток микроокружение, характерное для данного

типа клеток, во-вторых, при трансплантации на рану элементы ВКМ могут стимулировать

миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента и ,тем самым, способствовать

быстрейшему закрытию раны. В этой связи изучение взаимодействий клеток кожи с

элементами ВКМ является одним из важных вопросов регенеративной медицины. В

настоящее время имеется много данных о взаимодействии кератиноцитов с белками ВКМ.

Тем не менее, практически отсутствуют данные о влиянии на процессы адгезии и миграции

одного из компонентов БМ кожи - чя\пптнаг2У4. Ламинин -2\4 изначально был

РОС ¡1 "•'П;Г|!!АДМ}ЛЙ j I ' >»..'*■ ¡..А

обнаружен в составе мембран скелетных и сердечных мышц и Швановских клеток (Leivo and Engvall,1988, Vuolteenaho et al., 1994). Показано, что мутации в гене, кодирующем а2 цепь ламинина-2\4, вызывают различные нервно-мышечные заболевания (Sewry et al,, 1996а, Tiger et al,, 1997). Отсутствие o2 цепи ламипина в скелетных мышцах сопровождается его отсутствием в коже, что служит надежным диагностическим признаком врожденной мышечной дистрофии (Sewry et al., 1996b). При этом нет никаких данных о структурных нарушениях в коже. По-видимому, отсутствие ламинина-2/4 в коже не сказывается непосредственно на ее структуре, но может повлиять на развитие таких патологических процессов, как опухолевая инвазия и рсэпителизация после повреждения, в основе которых лежит способность клеток к мшрации. В этой связи выяснение роли ламинина-2/4 во взаимодействии с нормальными и трансформироваными кератиноцитами человека представляет несомненный интерес. Для сравнения в работе использовали ламишш-1из EHS-саркомы. Хотя эта изоформа не является компонентом БМ взрослых людей, но ее свойства по отношению к кератиноцитам человека хорошо изучены и известны интегрины, участвующие в этих взаимодействиях.

Цели н задачи исследования

Цеяыо данной работы являлось:

1. Исследование влияния ламинина-2\4 на процессы адгезии и миграции нормальных кератиноцитов человека и клеток эшадермоидной карциномы человека линии А431.

2. - Определение интегриновых рецепторов, которые принимают участие в этих

взаимодействиях.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Сравнить адгезивные свойства двух изоформ ламипина: ламинина-1 и ламинина-2/4 по отношению к нормалг.иым кератиноцитам человека и клеткам эпидермоидной карциномы человека линии А431.

2. Исследовать влияние ламинина-2/4 на процесс миграции клеток.

3. Оцепите вклад различных интегринов и неинтегринового рецептора 67кДа в процессы адгезии и миграции клеток на ламинине-2/4.

4. Определить участие матриксных металлопротеиназ в процессе миграции клеток на ламинине-2/4.

Научная новизна п практическая значимость работы

Впервые исследовано влияние ламинина-2/4 из базальной мембраны кожи человека на миграцию нормальных и трансформированных кератяноцитов человека. Показано, что в отличие от другой изоформы ламинина- ламинина-1, ламинин-2/4 поддерживает миграцию кератиноцитов, вызванную действием эпидермального фактора роста.

Показано, что модифицированный метод миграции Альбрехта-Бюлера может быть применен для количественной оценки процесса клеточнй миграции.

Впервые установлено, какие рецепторы принимают участие в процессах адгезии и миграции эпидермальных клеток на ламинине-2/4. Показано, что в миграции нормальных кератиноцитов на ламинине-2/4 участвуют несколько рецепторов: интегрины а2р1, аЗр1 и аб|34.

Показано, что участие отдельных рецепторов в процессах адгезии и миграции клеток на ламинине-2/4 может быть различным.

Впервые показано, что нормальные кератиноциты и клетки линии А431 отличаются по составу рецепторов, принимающих участие в адгезии и миграции на ламинине-2/4.

Данные, полученные в ходе проведенных исследований, имеют важное теоретическое и практическое значение. Они расширяют современные представления о механизмах миграции эпидермальных клеток и вносят дополнительный вклад в понимание процессов, в основе которых лежит способность клеток к перемещению, а именно, реэпителизации и инвазии. Практическое значение полученных результатов состоит в возможности применения ламшшна-2/4 в составе клеточных трансплантатов с целью быстрейшего закрытия кожных ран и восстановления нормальной структуры ткани.

Положения, выносимые на защиту

1. Различия в адгезии к ламинину-1 и ламшшну-2/4 не зависят от типа клеток: как нормальные, так и трансформированные кератиноциты человека быстрее и эффективнее прикрепляются к ламишшу-2/4, чем к ламинину-1.

2. Ламинин-2/4 , в отличие от ламинина-1, поддерживает миграцию клеток, вызванную действием эпидермального фактора роста.

3. Степень участия определенных рецепторов в процессах адгезии и миграции клеток на ламинине-2/4 может быть различной и зависит от типа клеток.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 статьи. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (С-Петербург, 2000), на 17 международном Конгрессе Европейского Общества Соединительных Тканей (Греция, 2000), на 1-ом съезде общества клеточной биологии (С-Петербург, 2003), на международной научно-практической конференции "Проблемы клеточной и тканевой трансплантологии" (Украина, 2003). Диссертационная работа апробирована на научном семинаре Отдела клеточных культур Института Цитологии РАН 1 декабря 2003 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на/^страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего^?/^наименований. Иллюстративный материал содержитЛ&рисунков и ^таблиц.

Материалы и методы исследований

Ламинин-1 выделяли из Engelbreth-Holm-Sworm (EHS) саркомы мыши, ламинин-2/4 — из плаценты человека с помощью модифицированного нами метода Палма и Фурча (Palm, Furcht, 1983, Черепанова и соавт., 2002). EHS саркому перевивали на мышах линии BALB-С57 (Timpl et al., 1979).

Клеточные культуры:

Первичная культура кератиноцитов человека была получена из кожи взрослых доноров после косметической операции. Выделение кератиноцитов проводилось по модифицированной методике Рейнвальда (Rheinwald, 1980). Выделенные кератиноциты культивировали в смеси сред DMEM и F12 (3:1), с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma), 5 мкг/мл инсулина (Sigma), 5 мкг/мл гидрокортизона (Sigma), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (Sigma), 10 -1° М холерного токсина (ICN-Flow), 5 мг/мл трансферрина (Sigma), 1,8x10 4 М аденина (Sigma), 2x10"u М лиотиронина (Koch-Light). В качестве подложки для культивирования использовали коллаген I типа, полученный из сухожилий крысиных хвостов (коллаген был любезно предоставлен Кухаревой Л.В, Институг Цитологии РАН, С-Петербург), После формирования многослойного пласта проводили стриппинг - удаление верхних дифференцированных слоев кератиноцитов (Jensen, Bolund, 1988). Для этого за сутки до опыта питательную среду заменяли на среду

FAD с пониженным содержанием кальция (0,1 мМ). Пониженное содержание кальция в среде приводит к разборке межклеточных контактов, что облегчает отделение верхних слоев многослойного пласта кератиноцитов. Дифференцированные слои кератиноцитов удаляли током жидкости. Таким образом, в-опытах использовали только керагиноциты базального слоя. Клетки снимали с культуральных флаконов 0.25%-ным раствором трипсина и 0.02%-ным раствором ЭДТА (в соотношении 1:3).

Клетки эпидермоидной карциномы человека линии А431 были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, С-Петербург). Клетки культивировали на среде DMEM (ICN) с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки коров (Биолот). В опытах использовали клетки 5-8 пассажей.

Определение адгезивных способностей клеток.

Для определения адгезивных характеристик ламинина был использован стандартный метод. Метод заключается в подсчете числа клеток, прикрепившихся за определенный срок к субстрату, нанесенному на поверхность лунок 9б-луночной платы (Karecla et al., 1994). В каждую лунку иммунологической 9б-луночной платы, поверхность которой гидрофобна, наносили 20 мкг субстрата (лам-1, лам-2/4, коллаген, БСА) и инкубировали при температуре 4 °С в течение ночи. После этого лунки трижды отмывали PBS н инкубировали с 1% раствором денатурированного БСА на PBS в течение 1 ч при 37 °С, чтобы исключить неспецифическое связывание клеток с субстратом. Перед посевом клеток платы вновь трижды промывали PBS. Клетки снимали с пластиковых флаконов смесыо растворов: 0,25 % раствор трипсина и 0,02 % раствор ЭДТА (в соотношении 1:3) и однократно промывали средой без сыворотки, содержащей соевый ингибитор трипсина (Sigma) (в соотношении 1мг ингибитора на 1 мг трипсина) с последующим осаждением при 1000 g. Затем суспензию клеток в среде без сыворотки вносили в 9б-луночные платы. Для того чтобы исключить влияние вновь синтезируемых белков на процесс адгезии, часть экспериментов проводили с добавлением в среду 25 мМ циклогексимида (Sigma) - ингибитора синтеза белка. Плотность посева составляла для клеток линии А431 и культивируемых кератиноцитов- 40 тыс. клеток на лунку, для первичных кератиноцитов- 100 тыс. клеток на лунку. Через определенные сроки инкубации неприкрепившиеся клетки удаляли, а прикрепившиеся фиксировали в течение 30 мин при комнатной температуре 4 % раствором формальдегида в PBS. Количество клеток определяли колориметрическим методом по окрашиванию клеток генциановым фиолетовым. Клетки окрашивали 0,1% генциановым фиолетовым в течение 10 мин, затем краситель растворяли в 10% уксусной кислоте и измеряли оптическую плотность красителя при длине волны 570 нм (Е 570) на приборе Multiskan. В ряде экспериментов

подсчет числа прикрепившихся клеток производили под инвертированным микроскопом путем подсчета числа окрашенных клеток в каждой лунке. В каждой лунке подсчитывали по 5 полей зрения, в каждом варианте обсчитывали по б лунок. В экспериментах с блокированием рецепторов моноклональными антителами к различным субьединицам интегринов суспензию кератипоцитов перед посевом инкубировали с антителами в течение 30 мин при комнатной температуре.

Определение миграционной активности клеток.

Для анализа миграционных свойств клеток использовали несколько моделей: модель одиночных мигрирующих клеток и модели, характеризующих события in vivo, когда клетки мигрируют из связанных друг с другом клеточных сообществ,

1. Модель миграции одиночных клеток,

Для модели миграции одиночных клеток мы использовали модифицированный нами метод Альбрехта- Бюлера (Albrecht-Buehler, 1977). Покровные стекла покрывали исследуемыми белками (20мкг/мл) в течение ночи при 4°С, затем трижды промывали PBS и наносили 1% денатурированный БСА на 1 час при 37°С. После промывки раствором PBS стекла покрывали слоем латексных микросфер (Sigma). Клетки высевали в бессывороточной среде на стекла в присутствии или отсутствии ЭФР. Через сутки после инкубации клетки фиксировали 3.7% раствором формальдегида и фотографировали в темном поле. О миграционной активности клеток судили по наличию очищенных от микросфер участков, которые образуются в результате перемещения клеток по субстрату, покрытому микросферами. В темном поле микроскопа эта участки выглядят темными на общем светлом фоне из микросфер. Фотоизображения анализировали с помощью компьютерной программы Scion image beta3b. Площадь очищенной от микросфер поверхности определяли как процент от общей площади фотокадра.

2. Модель миграции клеток в рану.

Для определения миграции кератиноцитов использовали также модель миграции клеток в рану. Кератиноциты культивировали до образования полного монослоя (7-9 суток), затем по описанной методике стриппинга удаляли верхние дифференцированные слои клеток и оставляли в среде без сыворотки на 2 суток, чтобы исключить возможное закрытие будущей раны за счет пролиферации клеток. С помощью носика пипетки часть клеток удаляли в виде полоски, моделируя рану на поверхности монослоя. Освободившуюся поверхность покрывали исследуемыми ламининами в концентрации 20 мкг\мл на 1 час при 37° С, промывали PBS и оставляли в среде без сыворотки в присутствии ЭФР и без него. Через 24 часа определяли степень закрытия раны мигрировавшими в нее клетками.

3. Модель клеточной инвазии.

Для определения миграции клеток А431 использовали инвазивную модель. Клетки культивировали до образования небольших колоний из 10-15 клеток. За 2 суток до опыта среду с сывороткой меняли на среду без сыворотки. На поверхность, свободную от клеток, наносили исследуемые белки в концентрации 20 мкг/мл на 1 час при 37 0 С. Затем поверхность споласкивали 3 раза PBS и оставляли в среде с добавлением или без ЭФР. Через 24 часа визуально оценивали результаты. В случае мшрации клеток можно было наблюдать распад колоний. Если клетей не мигрировали, колонии оставались целыми.

Исключение из взаимодействий отдельных рецепторов путем обработки клеток антителами и пептидами.

Для выявления участия отдельных рецепторов во взаимодействиях клеток с ламининами в процессе адгезии и миграции использовали антитела к различным субъединицам интегринов, а также пептиды, соответствующие местам связывания ламинина с определенными рецепторами. В работе использовали следующие антитела: моноклональные антитела к ß4 субъединице интегрина, любезно предоставленные Dr. Engvall (1:40) (The La Jolla Cancer Research Foundation, USA), моноклональные антитела к а 2 субъединице интегрина ( a2\VLA-2a, BD Biosciences) в концентрации 25 мкг/мл, моноклональные антитела к аЗ субьединице интегрина (Р1В5, DAKO) в концентрации 10 мкг/мл, пептид YIGSR (Sigma) , который является сайтом связывания для ламиншгавого рецептора с молекулярной массой 67 кДа (1:40), а также полипептад, соответствующий доменуУ! а2 цепи ламинина, любезно предоставленный Dr. Engvall (1:40). Для исключения отдельных рецепторов из взаимодействия суспензию клеток перед опытом инкубировали с соответствующими антителами или пептидами при комнатной температуре, время инкубации составляло 30 мин.

Для определения участия матриксных метаплопротеиназ (ММП) в процессах миграции клеток на ламинине, опыты проводили в присутствии ингибитора ММП (GM6001, Chemicon). Ингибитор добавляли в среду в концентрации 0,25 мМ непосредственно при посеве клеток.

Электронная микроскопия.

Для приготовления препаратов покровные стекла с клетками промывали PBS и фиксировали 2.5% глютаровым альдегидом (Merck) в течение 2 ч.

Результаты сканирующей электронной микроскопии были получены И.Л. Потокиным (Институт Особо Чистых Биопрепаратов, Санкт-Петербург).

Компьютерная обработка.

Для обработки графического изображения были использованы компьютерная программа Scion Image beta ЗЬ. Для статистической обработки данных были использованы компьютерные программы Microsoft Excel 97и Statistics.

Оценка достоверности различий контрольных и опытных значений проведена с помощью парного критерия Стьюдента,

Результаты

Изучение адгезии нормальных и трансформированных кератинодитов к

иммобилизованным на субстрате ламшшку-1 и ламиннну-2/4

Адгезивные свойства ламинина определяли, используя стандартные методы адгезии в 96-луночных платах, покрытых исследуемыми белками. В качестве сроков адгезии были выбраны 30 мин, 1 ч и 2 ч. Обнаружены следующие различия в прикреплении клеток к исследуемым изоформам ламинина.

03 --а-лам-1

0.05

ЗОмии 1ч

0,45 0,4 0,35 0,3 ,0,25 ' 0,2 0,15 0,1 0,05 0

■ •Д— лам-1

-о—лам-

2\4 •«••БСА

^ i.

2"'

. -fi-30 мин

2ч

Рис. 1. Адгезия культивируемых кератиноцитов человека (А) и клеток линии А431(Б) к ламинину-1 (лам-1), ламинину -2/4 (лам- 2/4) и БСА через 30 мин, 1ч и 2ч инкубации. (Здесь и далее - вертикальные отрезки - доверительные интервалы, р<0,05). Через 30 мин после посева количество культивируемых кератиноцитов, прикрепившихся к ламинину-2/4 было значительно больше, чем к ламинину-1, и с течением

времени (1ч, 2ч) постепенно увеличивалось (Рие.1 А). Адгезия клеток к ламинину-1 при этом достоверно не отличалась от негативного контроля (БСА).

В случае кератиноцитов принято различать клетки первичной культуры (свезкевыделенные из эпидермиса) и культивируемые клегтки. Данное различие основано на том факте, что в процессе культивирования кератиноциты изменяют свои свойства, в частности у них появляется способность к миграции (Takashima, Grinnell, 1985). Эта способность является результатом изменения состава интегриновых рецепторов и их активации в процессе культивирования (Toda et al., 1987, Guo et al., 1991). Для кератиноцитов первичной культуры характер прикрепления к ламинину-2/4 и ламинину-1 оказался сходным с культивируемыми кератиноцитами.

Несколько отличная от нормальных кератиноцитов картина наблюдалась в случае адгезии клеток линии А431 (Рис. 1 Б). Через 30 мин после посева количество клеток, прикрепившихся к ламинину-2/4, было существенно больше, чем к ламинину-1. С увеличением времени инкубации различия в количестве прикрепившихся клеток к различным изоформам ламинина уменьшались и через 2 ч стали недостоверными.

Таким образом, подводя итог определению адгезивных свойств ламининов, можно сказать что, для всех трех типов клеток (кератиноциты первичной культуры, культивируемые кератиноциты и клетки линии А431) ламинин-2/4 является более адгезивным субстратом по сравнению с ламинином-1, но динамика прикрепления клеток с течением времени для каждого типа клеток является различной.

Определение миграционной активности клеток, связанных друг с другом

межклеточными контактами

Различия в адгезивных свойствах ламининов могут определять и различное влияние на клеточную миграцию. Дня проверки этого предположения были выбрана модель миграции клеток в рану.

При поражении кожи происходит нарушение целостности кожного покрова, что в используемой модели воспроизводится путем нарушение монослоя кератиноцитов. Кератиноциты культивировали до образования полного монослоя, затем верхние дифференцированные слои кератиноцитов снимали по описанной в материалах методике стриппинга, далее с помощью носика пипетки часть клеток соскребали в виде полоски -"раны". Свободную от клеток поверхность затем покрывали ламининами, и клетки оставляли

в среде без сыворотки или с добавлением ЭФР в течение 24 ч. Результаты представлены на рис. 2. В контрольном варианте (среда без сыворотки и без ЭФР) наблюдалось небольшое незначительное закрытие "раны " за счет стягивания ее краев. В присутствии ЭФР, но без покрытия поверхности ламининами, наблюдалась активная миграция клеток на раневую поверхность. В тех случаях, где на поверхность наносили ламинины, но клетки инкубировали без ЭФР, состояние "раны" оставалось без изменения. В вариантах с одновременной обработкой поверхности ламининами и добавлением ЭФР наблюдали почти полное закрытие "раны" за счет активной миграции клеток. Разницы в поведении клеток при добавлении ламшшна-1 и ламинина-2/4 в данной модели не обнаружено, миграция клеток и реэпителизация "раны" происходили за счет стимулирующего действия ЭФР.

контр ЭФР Лам-1 Лам-2\4 ЭФР+Лам-1 ЭФР+Лам-2\4

Рис. 2. Модель миграции клеток в рану. 24 ч инкубации.

Таким образом, в модели, когда клетки связаны между собой межклеточными контактами, мы обнаружили, что клетки начинают мигрировать только в присутствии ЭФР, который вызывает распад клеточных сообществ на отдельные клетки. Поэтому в дальнейших экспериментах мы использовали модель миграции одиночных клегок.

Определение миграционной активности одиночных клеток на различных субстратах

Одна из методик, наиболее часто используемая для определения миграционной активности одиночных клеток - методика, предложенная Альбрехтом - Бюлером (А1Ьгес1п-ВиеЫег, 1977). Суть ее состоит в следующем: поверхность предметного стекла равномерно покрывается коллоидным золотом, затем наносится белок и высеваются клетки. Перемещаясь, клетки фагоцитируют частички коллоидного золота, оставляя позади себя участки, очищенные от частиц, так называемые "миграционные треки". Эта методика была модифицирована; вместо коллоидного золота стали использовать латексные микросферы

(диаметром 0,8 мкм). Модифицированный метод применялся в нашей лаборатории для определения миграционной активности первичной культуры кератиноцятов крыс на различных фракциях матригеля (Горелик с соав., 1998).

Сначала предстояло ответить на вопрос, отличаются ли свойства ламининов по их способности влиять на клеточную миграцию. Про ламшган-1 уже было известно, что он ингибирует миграцию кератиноцитов человека (\Voodley е1 а1.,1988). На рис.3 представлены результаты инкубации кератиноцитов на ламинине-1 и ламинине-2/4 в течение 24 ч в бессывороточной среде. Как и следовало ожидать, ламинин-1 не стимулировал миграцию нормальных кератиноцитов. Точно также и ламинин-2/4 сам по себе не стимулировал миграцию клеток. Присутствие небольших очищенных участков вокруг клеток свидетельствует о наличии лишь псевдоподиальной активности.

■'•Ь'к г

" v..-

Рис.3. Культивируемые кератиноциты (б, д) через 24 ч инкубации в отсутствии ЭФР

человека на ламинине-1 (а, с) и ламинине-2/4 (а, б) и в его присутствии (с, д).

В следующей серии экспериментов в среду при инкубации был добавлен ЭФР (10 нг/мл), который является стимулятором миграции эпителиальных клеток. Как видно на рис.3 кератиноциты на ламинине-1 остались неподвижными, но на ламинине-2/4 происходила миграция с образованием треков. Площадь очищенной от микросфер поверхности была подсчитана с помощью компьютерной программы Scion image и представлена в процентах от общей площади препарата (Рис.4).

3 10

* 5

лам-1

г X I лам-1 ЮФР

лам-2/4 лам-2/4+ЭФР

Рис.4. Результаты определения миграции культивируемых кератиноцитов человека на ламинине-1 (лам-1) и ламинине-2/4 (лам- 2/4) в присутствии и отсутствии ЭФР через 24 ч инкубации.

Морфология культивируемых кератиноцитов на субстратах, покрытых ламинииами.

На рис. 5 представлены данные сканирующей электронной микроскопии, позволяющие оценить морфологию культивируемых кератиноцитов, мигрирующих на ламинине-2/4 и неподвижных на ламинине-1. На ламинине-1 кератиноциты не поляризованы, хорошо распластаны, их поверхность свободна от микросфер (Рис.5 а). Кератиноциты, на ламининс-2/4 имеют мобильный фенотип с многочисленными разветвленными филоподиями, вся клеточная поверхность покрыта микросферами, которые клетки, по-видимому, перемещают таким образом в процессе миграции. (Рис.5 б)

В экспериментах с клетками линии А431 мы наблюдали поведение, сходное с поведением культивируемых кератиноцитов человека. Ламинин-1 и ламинин-2/4 сами по себе не стимулировали клеточного перемещения, но при добавлении ЭФР клетки на ламинине-2/4 начинали мигрировать.

а б

Рис. 5. Элекчроиная сканирующая микроскопия кератиноцитов человека на лам-1(а) и лам-2/4 (б) через 4 ч после посева в присутствии ЭФР., увел.ЗОООх

Связь клеток с матриксом осуществляется посредством адгезионных структур, основу которых составляют рецепторы семейства интегринов. Из всех интсгринов, которые имеются у кератиноцитов, с ламинином взаимодействуют только три типа рецепторов: аб|34, а2р1 и аЗР1. Из литературных данных известно, что эти интегрины принимают участие во взаимодействии кератиноцитов человека с ламинином-1 (Кагес1а et.aL.1994, ЕкЫош,1996). Клетки эпидсрмоидной карциномы линии Л431 также имеют интегрины а2р1, аЗр1 и аб(34 и неинтегриновый рецептор 67 кДа ЛР (АкНш е1 а1., 1997).

Перед нами встал закономерный вопрос: какова роль данных рецепторов в адгезии и миграции нормальных кератиноцитов и клеток эпидсрмоидной карциномы линии А 431 на ламинине-2\4.

Изучение вклада интегринов, содержащих 04- и (51- субъединицм, и неинтегрннового рецептора 67 кДа ЛР во взаимодействие клеток с лимишшом-2/4 в процессе адгезии.

Для того чтобы оценить вклад интегринов, содержащих (34- и Р1- субъединицы, и рецептора 67 кДа ЛР в процесс взаимодействия кератиноцитов человека и клеток эпидсрмоидной карциномы линии А431 с ламинином-2/4, клетки были предварительно обработаны ашшелями к р1- и р4-субъединицам интегринов и пептидом УЮЭЯ, взаимодействующим с 67кДа ЛР. После этого изучали адгезию клеток на субстратах, покрытых ламинином.

Влияние предварительной обработки клеток А431 и культивируемых кератиноцитов человека антителами к р4- субъединице интегринов и пептидом УЮвИ на их адгезию к ламинину-2/4.

Результаты адгезии клеток представлены на рис.б.

40 35 .30

ibs •

g-ao-

||5 -\0 5

0 --

АТ64 YIGSR

0,3 0,25

1 !

0,1 ч

0,05 -

(

О 4-

Ь,

I I

АТЬ4 YIGSR

А Б

Рис.б. Адгезия клеток А431 (А) и кератиноцитов (Б) к ламинину-2/4 через 30 мин инкубации без предварительных обработок агентами (к) и с обработкой антителами к р4-субъединице итегрина (АТЬ4) и пептидом УЮБЯ,

При обработке клеток антителами к ß4 субъединице интегринов количество клеток, прикрепившихся на ламинин-2/4, достоверно не изменилось. Противоположный эффект наблюдали при обработке клеток пептидом YIGSR. YIGSR - это уникальная последовательность, содержащаяся в ßl цепи обоих ламининов, которая является минимальным пептидом с адгезивными свойствами. Последовательность YIGSR является специфическим местом связывания для ламининового рецептора с молекулярной массой 67 кДа (Graf et al., 1987). Предварительная обработка клеток пептидом YIGSR, как и ожидалось, вызывала значительное снижение адгезии клеток к ламинину-2/4.

Нормальные кератиноциты человека не имеют 67 кДа JIP, характерного для трансформированных клеток, поэтому обработка клеток пептидом YIGSR, который связывается с этим рецептором, не оказала влияния на прикрепление клеток к ламинину-2/4. В том случае, когда кератиноциты обрабатывали антителами к ß4- субъединице интегрина, количество прикрепившихся клеток к ламинину-2/4 также не изменилось.

Влнянме предварительной обработки клеток линии А431 антителами к п2 и аЗ субъедшшцам интегринов на их адгезию к ламишшу-2/4.

Предстояло ответить на вопрос, принимают ли участие в адгезии клеток линии А431 к ламинину-2/4 р1-содержащие интегрины (аЗр1и а2р1) и в равной ли мере. Для этого опыты по адгезии проводили с предварительной обработкой суспензии клеток линии А431 антителами к соответствующим субъединицам интегринов и полипептидом VI, Полипептид VI соответствует домену VI а.2 цепи ламинина и содержит место связывания с интегрином о2Р1.

Результаты представлены на рис.7.

0,25 0,2 0,15 ■

"Л

си

0,1 0,05

о - -

нь

Рис.7. Адгезия клеток линии А431 к ламинину-2/4 с предварительной обработкой клеток антителами к аЗ субъсдинице интегрина (А'ГаЗ), антителами к а.2 субъединице интегрина (АТа2) и полипептидом VI (Пеп). 30 мин инкубации,

Как видно на гистограмме, исключение из взаимодействий отдельно а2 интегрина (при обработке или антителами к а2 субъединице или полипептидом VI, соответствующим месту связывания с а2р1 интегрином) и отдельно аЗ интегрина достоверно не повлияло на количество клеток, прикрепившихся к ламинину-2/4. Но одновременная обработка антителами к а2 и антителами к аЗ субъединицам интегринов значшельно снизила адгезию клеток.

Изучение вклада интегрпнов, содержащих р4- и р1- субъедшшцы во взаимодействие клеток с ламинппом-2/4 в процессе миграции

Влияние предварительной обработки клеток А431 антителами к р1- н р4-субъедшшцам интегрпнов на их миграцию

Полученные результаты представлены на рис.8.

40 35

1зо Я

§25

«20-* й

В 15 -

10 -

5 -о --

^ ^ ^

V» ъ»

бг

<Т О

Рис.8. Миграция клеток линии А431 на ламишше-2/4 через 24 ч инкубации в присутствии или отсутствии ЭФР после обработки антителами к р1-субъединице интегрина (АТЫ) и антителами к р4-субьединице интегрина (АТЬ4).

Рассмотрим эти результаты подробно. В отсутствии ЭФР обработка клеток антителами к р1-субъдинице интегрина не оказала влияния на поведение клеток А431 на ламинине-2/4, они остались неподвижными. Но обработка клеток антителами к 01-субъдинице интегрина в присутствии ЭФР достоверно снизила миграцию, вызванную стимулирующим действием ЭФР, хотя полностью и не блокировала.

При обработке антителами к р4-субъединице интегрина площадь очищенной от шариков поверхности достоверно увеличилась даже в отсутствии стимулирующего действия ЭФР. При одновременной обработке ЭФР и антителами к р4-субъединице интегрина миграция клеток сильно увеличилась по сравнению со всеми вариантами, что может быть суммарным действием обоих факторов

Оставался невыясненым еще один вопрос, какой из интегринов, содержащих Р1-субьединииу (а2Р1 или аЗр1) непосредственно принимает участие во взаимодействии с ламинином-2/4 в процессе миг-рации.

Влияние предварительной обработки культивируемых ксратиноцитов человека антителами к а.2- и аЗ- субьедшшцам интегринов на нх миграцию.

9,0 8,0 I 7,0

ГО

3 6,0 о

§ 5,0

=1 4,0

* 3,0

2,0

о4

1,0 0,0

К Г 4

Й Й

^ А^

ХК >

/ *

Рис.9. Миграция культивируемых кератиноцитов через 24 ч инкубации на ламинине-2/4 в присутствия и отсутствии ЭФР с предварительной обработкой клеток антителами к аЗ-субъединице интегрина (АТаЗ), антителами к а2-субъединице интегрина (АТа2) и полипептидом VI (Пеп), соответствующим месту связывания с «2р1 интегрином.

Результаты представлены на рис. 9.

Сначала рассмотрим варианты поведения клеток в отсутствии стимулирующего действия ЭФР. Предварительная обработка клеток полипептидом-VI и антителами к а2-субъединице интегрина не оказала никакого влияния на поведение кератиноцитов, клетки ос1ались неподвижными. Но исключение из взаимодействий <хЗр1 интегрина стимулировало клеточное перемещение. Несколько иная картина наблюдалась в присутствии ЭФР. Исключение из взаимодействий аЗр1 интегрина не повлияло на миграцию - разница в площадях миграции не достоверна. Но предварительная обработка клеток антителами к а2-субъединице интегрина ингибировала миграцию, вызванную действием ЭФР. Такой же

эффект произвела и предварительная обработка полипептидом-ЛЛ, содержащим место связывания с а2[31 интегрином.

Влияние предварительной обработки клеток линии А 431 антителами к а2- и аЗ-субъедшшцам ннтегринов на их миграцию Данные представлены на рие. 10.

Рис. 10. Миграция клеток линии А431 на ламинине-2/4 через 24 ч инкубации в присутствии и отсутствии ЭФР с предварительной обработкой клеток антителами к аЗ субъединице интегрина (АТаЗ), антителами к (й субъединице интегрина (АТа2) ч полипептидом VI (Пеп), соответствующим домену, содержащему место связывания с а2р! интегрином.

Сначала рассмотрим поведение клеток линии А431 на ламинине-2/4 в отсутствии стимулирующего действия ЭФР. В контрольном варианте без обработок антителами, клетки оставались неподвижными. Предварительная обработка одними из антител (антитела к а2-субъединице интегрина, антитела к аЗ-субъедшшце интегрина) или полипептидомЛП не влияла на поведение клеток - миграции не наблюдалось. Иные результаты получены в присутствии ЭФР. Исключение из взаимодействия аЗр1 интегрина не влияло на миграцию. Но предварительная обработка клеток антителами к а2-субъединице интегрина ингибировала миграцию, вызванную действием ЭФР. Такой же эффект произвела и предварительная обработка полипептидом-У!. Из этого следует вывод, что в миграции

9,0

8,0-

1 7,0 ' 3 6,0 ■

I 5,0 4

клеток линии А431 на ламинине-2/4 под действием ЭФР основная роль принадлежит интегрину а2р1.

Определение участия ММП в процессе миграции клеток линии А431 на

ламинине-2/4 под действием ЭФР,

Миграция клеток часто бывает связана с активностью ММП, которые расщепляют белки ВКМ (Соловьева, 1998). Особую роль ММП играют в процессах инвазии опухолевых клеток.

Для того чтобы определить, связана ли миграция клеток линии А431 на ламинине-2/4 с активностью ММП, опыты по миграции проводили в присутствии специфического ингибитора ММП (ОМ6001, СИепнсоп). Так как ингибитор находится в растворе ОМЭО, то в одном из вариантов его добавляли в раствор как контроль возможного действия самого раствора БМЭО на миграцию. Результаты представлены на рис. 11.

Как видно на гистограмме, присутствие ингибитора ММП полностью блокировало миграцию клеток А431 на ламинине-2/4 под действием ЭФР, в то время как раствор ОМЭО не повлиял на процесс перемещения.

Рис. 11 Миграция клеток линии А431 на ламинине-2/4 под действием ЭФР в присутствии ингибитора ММП (Инг).

12,0 -

Таким образом, подводя итоги проведенным исследованиям, можно сказать следующее. В миграции клеток линии А431 и культивируемых кератиноцитов человека на ламинине-2/4 под действием ЭФР принимают участие два интегрина; <*2р1 и абр4. Интегрин

аб|54 выполняет функции антимшрздионные и принимает участие в образовании стабильных связей с подложкой. Исключение абр4 из взаимодействий дает клеткам возможность перемещаться.

У рецептора 02(51 функции прямо противоположные: он обеспечивает непосредственное взаимодействие клеток с ламинином-2/4 в процессе миграции. Исключение из взаимодействий самого интегрина а2р1 или места связывания с этим рецептором на молекуле ламинина полностью ингибирует миграцию, вызванную действием ЭФР.

Интегрин аЗр1 играет, по-видимому, разные роли во взаимодействии нормальных и трансформированных кератиноцитов с ламинином-2/4. В случае нормальных кератиноцитов блокирование интегрина аЗр!стимулирует миграцию даже в отсутствии ЭФР, что позволяет предполагать, что рецептор аЗр1, как и абр4 выполняет функции стабилизирующие. В случае клеток линии А431 исключение из взаимодействий интегрина аЗр1 никак не отражается на миграционных свойствах клеток. Это позволяет сделать вывод о том, что данный интегрин не участвует в процессе миграции клеток линии А431 на ламюгане-2/4-.

Выводы:

1 В результате сравнительного анализа процессов адгезии и миграции кератиноцитов на иммобилизованных на субстрате изоформах ламинина установлено, что нормальные и трансформированные клетки значительно быстрее и эффективнее взаимодействуют с ламинином-2/4 , чем с ламинином-1, Выявленные различия в адгезии у исследованных клеток не связаны с синтезом дополнительных адгезивных белков.

2. В отличие от ламинина-1, ламинин-2/4 поддерживает миграцию нормальных и трансформированных кератиноцитов линии А431, вызванную действием эпидермального фактора роста.

3. Последовательное исключение определенных рецепторов клеток из взаимодействия с ламинином-2/4 позволило установить, что адгезия нормальных кератиноцитов осуществляется при участии интегринов а2р1 и аЗр1, в то время как клетки линии А431 используют, помимо указанных рецепторов, еще неинтегриновый рецептор 67 кДА.

4. Установлено, что миграция нормальных кератиноцитов осуществляется при участии трех инте1ринов аЗр1, а2р1и обр4. При этом интегрины аЗр1 и абр4 принимают участие в образовании стабильных контактов с подложкой, а интегрин а2р1 принимает участие в миграции, вызванной действием ЭФР. В отличие от нормальных

кератиноцитов, у клеток линии А431 в миграции принимают участие только два интегрина a2ßl и a6ß4, при этом функции интегрина a6ß4- антимиграционные, а процесс клеточной миграции осуществляется также при участии интегрина a2ßl. 5. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что способность к адгезии и миграции у нормальных и трансформированных кератиноцитов линии А431 зависит от состава поверхностных рецепторов, причем вклад одних и тех же рецепторов в осуществление этих процессов у разных клеток может бьтть различным. Показано, что способность к миграция клеток линии А431 зависит от модуляции ламинина матриксными металлопротеиназами.

Публикации по теме диссертации:

1. Voronkina IV, Gorelik YuV, Are AF, Kalmykova NV, Potokin LV,

Pinaev GP.1999. The peculiarities of attachment and spreading of normal and trasformed epithelial human cells on different extracellular matrix proteins. NATO Science Series, In Intermolecular Cross-Talk in Tumor Metastasis. Ed. by G.G. Skouteris. 311:171-181.

2. Черепанова O.A., Калмыкова H.B., Блинова М.И., Пинаев Г.П, 2000. Адгезия клеток вторичной культуры кератиноцитов человека к изоформам ламинина. Тезисы всероссийского симпозиума «Клеточная биология на пороге XXI века», С-Петербург. Цитология. 43(4):410.

3. Kalmykova N.V., Cherepanova O.A., Gorelik J.V., Blinova M.I., Pinaev G.P. 2000. Laminin-2/4 in adhesion and migration of human keratinocytes. Abst. of XVlIth FECTS Meeting, Greece, J7,

4. Черепанова O.A., Калмыкова H.B., Ворошшна И.В., Аре А.Ф., Горелик Ю.В., Пинаев Г.П, 2002. Различия в характере взаимодействия нормальных и трансформированных кератиноцитов человека с изоформами ламинина. Цитология. 44 (2): 151-158.

5. Калмыкова Н.В., Черепанова O.A., Горелик Ю.В., Воронкина И.В., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2002. Различное влияние ламинина-1 и ламшшна-2/4 на адгезию и миграцию культивируемых кератиноцитов человека. Цитология, 44 (8): 792-798.

6. Калмыкова Н.В, Черепанова O.A., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2003.Стабилизирующая роль интегрина <x6ß4 в процессе миграции эпидермальных клеток на ламшшне-2/4. Трансплантолопя (Киев). 4: 30-32.

7. Калмыкова Н.В, Черепанова O.A., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 2003. Вклад интегриновых рецепторов в процесс миграции клеток А431 на ламинине-2\4 под действием ЭФР. Тезисы 1-го съезда Общества клеточной биологии, С-Петербург. Цитология. 45(9): 882.

Список литературы:

Горелик Ю.В., Дьяконов ИЛ, ¡Сухарева Л.В., Блинова М.И., ПинаевГЛ. 1998. Влияние элементов внеклеточного матрикса на псевдоподиальную активность кератиноцнтов крыс. Цитология. 40(12):1037-1044.

Соловьева Н.И. 1998. Матриксные мегаллопротеиназы и их биологические функции. Биоорганическая химия. 24:245-255.

Черепанова О.А., Калмыкова Н.В., Вороикина КВ., АреА.Ф., Горелик Ю.В., ЛинаевГ.П. 2002. Различия в характере взаимодействия нормальных и трансформированных кератиноцнтов человека с изоформами ламинина. Цитология. 44(2): 151-158.

Albrecht-Buehler G. 1977. The phagokinettiks tracks of3T3 cells. Cell. 11:395-404. Ardini E„ Tagliabue E„ Magniflco A., Buto S., Castronovo V„ Colnaghi ML, Menard S. 1997. Co-regulation and physical association of the 67-kDa monomeric laminin receptor and the абр4 integrin. J. Biol. Chem. 272 (4): 2342-2345.

Ekblom P. 1996. Receptors for laminins during epithelial morphogenesis. Cur.Opin.Cell Biol. 8:700-706.

Graf J., Ogle R.C., Robey F.A., Sasaki M„ Martin G.R., Yamada Y„ Kleinman H.K. 1987. A pentapeptide from the laminin B1 chain mediates cell adhesion and binds the 67 000 laminin receptor. Biochem. 26:6896-6900.

Guo M„ Kim L.T., Akiyama S.K, Gralnick H.R., Yamada Kand Grinnell F. 1991. Altered processing of integrin receptors during keratinocyte activation. Exp.Cell. Res. 195:315-322.

Jensen P., Bolund L. 1988. Low Ca 2+ stripping of differentiating cell layers in human epidermal cultures: an in vitro model of epidermal regeneration. Exp. Cell. Res. 175:63-73.

Karecla P. L., TimplR., Watt F.1994. Adhesion of human epidermal keratinocytes to laminin. Cell adhesion and Communication .2:309-318.

Leivo I and Engvall E. 1988. Merosin, a protein specific for basement membranes of Schwann cell, striated muscle, and trofoblast, is expressed late in nerve and muscle development. PNAS USA 85:1544-1548.

Palm S.L., Furcht L.T. 1983. Production of laminin and fibronectin by Schwannoma cells: cell-protein interactions in vitro and protein localization in peripheral nerve in vivo. J.Cell Biol. 96 :1218-1226.

Rheinwald J.G. 1980. Serial cultivation of normal epidermal keratinocytes. Meth.Cell Biol. 21A: 229-254.

Sewry C.A., Dalessandro M„ Wilson L.A., Sorokin L.M., Naom /., Bruno S., Ferlini A., Dubowitz V., Muntoni F. 1996a. Expression of laminin chains in skin in merosin deficient

congenital muscular dystrophy. Nciropediatrics. 28:217-222.

Sewry C.A., Philpot J„ Sorokin L.M., Wilson L.A., Naom ]., Goodwin F„ Dalessandro M., Dubowitz V., Muntoni F. 1996b. Diagnosis of merosin (laminin-2) deficient congenital muscular dystrophy by skin biopsy. Lancet. 347 (9001): 582-584.

Takashima A. and Grinnell F.1985. Fibronectin -mediated keratinocyte migration and initiation of fibronectin receptor function in vitro. J.Invest. Dermatol. 85:304-308.

Toda K., Tuan T.L., Brown P.J., Grinnell F. 1987. Fibronectin receptors of human keratinocytes and their expression during cell culture. J.Cell Biol. 105:3097-3104.

Tiger C-F., Champliaud M-F., Pedrosa-Domellof F„ Thornell L-E., Ekblom P., Gullberg D. 1997. Presence of laminin a5 chain and lack of laminin al chain during human muscle development and in muscular dystrophies. J. Biol. Chem. 272:28590-28595.

Timpl R., Rohde /-/., Gehron Robey P., Rennard S.I., Foidart J.M., Martin G.R. 1979. Laminin-a glycoprotein from basement membranes. J, Biol. Chem.m 254:9933-37.

Vuolteenaho R., Nissinen M., Sainio K., Byers M., Eddy R., Hirvonen H., Shows T.B., Sariola H., Engvall E,, Tryggvason K. 1994. Human laminin M chain (Merosin): complete primary structure, chromosomal assignment and expression of the M and A chain in human fetal tissues. J. Cell Biol. 124:381-389.

Woodley D. T„ Bachmann P.M. and O'Keffe E.J. 1988. Laminin inhibits human keratinocyte migration. J. Cell. Physiol. 136:140-146.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать О/, ЛОО^ Объем в п.л.

Тираж 100. Заказ -/О,

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства СПбГПУ. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29

Отпечатано на ризографе 1Ш-2000РР Поставщик оборудования фирма "Р-ПРИНТ" Телефон: (812) 110-65-09 Факс: (812)315-23-04

■ь

РНБ Русский фонд

2007-4 17546

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калмыкова, Наталья Владимировна

Введение

Цели и задачи исследования

Положения, выносимые на защиту

Обзор литературы

I Кожа

1. Гистологическое строение кожи

2. Диференцировка кератиноцитов

3. Базальная мембрана кожи человека И

4. Рецепторы кератиноцитов к элементам БМ кожи

5. Ламинин

5.1. Строение и изоформы ламинина

5.2. Организация ламининов в БМ кожи человека

5.3. Появление ламинина в эмбриогенезе

5.4. Ламинин-2/

5.5. Рецепторы ламинина

6. Раневое заживление кожи

II Миграция клеток

1. Молекулярные механизмы миграции

2. Факторы, влияющие на миграцию кератиноцитов

2.1. Внеклеточный матрикс

2.2. Матриксные металлопротеиназы

2.3. Ростовые факторы 42 Материалы и методы 47 Результаты

1. Изучение адгезии нормальных и трансформированных кератиноцитов к иммобилизованным на субстрате ламинину-1и ламинину-2/

2. Адгезия с предварительной обработкой клеток ламининами

3. Определение миграционной активности клеток, связанных друг с другом межклеточными контактами

4. Определение миграционной активности одиночных клеток на различных субстратах

5. Изучение вклада интегринов, содержащих 04- и pi - субъединицы, и неинтегринового рецептора 67кДа во взаимодействие клеток с ламинином-2/4 в процессе адгезии

6. Изучение вклада интегриновых рецепторов, содержащих р4 и pi-субъединицы во взаимодействие клеток с ламинином-2/4 79 7.0пределение участия ММП в процессе миграции клеток линии А431 на ламинине-2/4 под действием ЭФР

Обсуждение

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние разных изоформ ламинина на адгезию и миграцию нормальных и трансформированных кератиноцитов человека"

Формирование тканей и органов в процессе эмбриогенеза и регенерации происходит в результате пролиферации, дифференцировки и миграции клеток.

В эмбриогенезе взаимодействие клеток с элементами внеклеточного матрикса (ВКМ) является критическим фактором. ВКМ появляется в эмбриогенезе очень рано, уже на стадии двухклеточного зародыша появляются первые молекулы ВКМ, представленные al цепью ламинина, что служит свидетельством важности компонентов ВКМ в процессе развития. По мере развития организма состав матрикса меняется в зависимости, как от стадий развития, так и от мест локализации в зародыше. Эти изменения являются результатом деятельности эмбриональных клеток. В свою очередь, определенный набор компонентов ВКМ стимулирует миграцию клеток в эту область и влияет на формирование и характер организации специализированных структур тканей.

Регенерация утраченных или поврежденных органов и тканей также идет с участием ВКМ. Процесс заживления кожных ран неразрывно связан с миграцией в поврежденный участок клеток кожи (фибробластов и кератиноцитов), образованием базальной мембраны (БМ) и последующим восстановлением нормальной структуры ткани. Миграция клеток определяется субстратом и сигнальными молекулами. Сигнальные молекулы приводят клетки в состояние готовности к передвижению, а субстрат позволяет осуществить сложный двигательный процесс.

Процесс взаимодействия клетки с субстратом является определяющим фактором также при культивировании клеток. Для успешного размножения клетки должны сначала прикрепиться и распластаться на подложке. Поэтому для нормального роста и дифференцировки большинства первичных культур клеток необходим определенный субстрат, который складывается из элементов, предварительно нанесенных на подложку, элементов, адсорбируемых из культуральной среды и тех, которые секретируются самими клетками. Подбирая состав культуральной среды и элементов подложки, можно воссоздавать микроокружение клеток и моделировать некоторые аспекты поведения клеток in vivo. Применение подобных подходов дало толчок развитию клеточной заместительной терапии.

Клеточная заместительная терапия - это одно из направлений современной медицины, цель которой состоит в восстановлении структуры и функций поврежденной ткани путем трансплантации клеток, выращенных in vitro. Наибольшее развитие это направление получило в терапии кожных повреждений. В качестве кожных заместителей используют как сами клетки кожи (кератиноциты и фибробласты), так и комплексы клеток с элементами ВКМ. Использование белков ВКМ важно с двух точек зрения, во-первых, это позволяет создать при культивировании клеток микроокружение, характерное для определенного типа клеток, во-вторых, при трансплантации на рану элементы ВКМ могут стимулировать миграцию и пролиферацию собственных клеток пациента и, тем самым, способствовать быстрейшему закрытию раны. В этой связи изучение взаимодействий клеток кожи с элементами ВКМ является одним из важных вопросов регенеративной медицины.

В настоящее время в литературе имеется много данных о взаимодействии кератиноцитов с белками ВКМ. Тем не менее, практически полностью отсутствуют данные о влиянии на процессы адгезии и миграции ламинина-2/4, входящего в состав ВКМ кожи. Поэтому целью данной работы было выяснить, как влияет ламинин-2/4 на процессы адгезии и миграции нормальных и трансформированных кератиноцитов. А также установить, какие рецепторы принимают участие в осуществлении этих процессов.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлось:

1. Исследование влияния ламинина-2\4 на процессы адгезии и миграции нормальных кератиноцитов человека и клеток эпидермоидной карциномы человека линии А431.

2. Определение рецепторов, которые принимают участие в этих взаимодействиях.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Сравнить эффективность прикрепления нормальных и трансформированных кератиноцитов человека к ламинину-1 и ламинину-2/4 .

2. Исследовать влияние ламинина-2/4 на процесс миграции клеток.

3. Оценить вклад различных рецепторов в процессы адгезии и миграции клеток на ламинине-2/4.

4. Определить участие матриксных металлопротеиназ в процессе миграции клеток на ламинине-2/4.

Положения, выносимые на защиту

1. Различия в адгезии к ламинину-1 и ламинину-2/4 не зависят от типа клеток: как нормальные, так и трансформированные кератиноциты человека быстрее и эффективнее прикрепляются к ламинину-2/4, чем к ламинину-1.

Обзор литературы

I Кожа

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Калмыкова, Наталья Владимировна

Выводы:

1 В результате сравнительного анализа процессов адгезии и миграции кератиноцитов на иммобилизованных на субстрате изоформах ламинина установлено, что нормальные и трансформированные клетки значительно быстрее и эффективнее взаимодействуют с ламинином-2/4 , чем с ламинином-1. Выявленные различия в адгезии у исследованных клеток не связаны с синтезом дополнительных адгезивных белков.

2. В отличие от ламинина-1, ламинин-2/4 поддерживает миграцию нормальных . и трансформированных кератиноцитов линии А431, вызванную действием эпидермального фактора роста.

3. Последовательное исключение определенных рецепторов клеток из взаимодействия с ламинином-2/4 позволило установить, что адгезия нормальных кератиноцитов осуществляется при участии интегринов a2pl и а301, в то время как клетки линии А431 используют, помимо указанных рецепторов, еще неинтегриновый рецептор 67 кДА.

4. Установлено, что миграция нормальных кератиноцитов осуществляется при участии трех интегринов a3pi, а2р1и абр4. При этом интегрины аЗр1 и абр4 принимают участие в образовании стабильных контактов с подложкой, а интегрин a2pi принимает участие в миграции, вызванной действием ЭФР. В отличие от нормальных кератиноцитов, у клеток линии А431 в миграции принимают участие только два интегрина a2pl и а6р4, при этом функции интегрина абр4 - антимиграционные, а процесс клеточной миграции осуществляется также при участии интегрина a2pi.

5. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что способность к адгезии и миграции у нормальных и трансформированных кератиноцитов линии А431 зависит от состава поверхностных рецепторов, причем вклад одних и тех же рецепторов в осуществлении этих процессов у разных клеток может быть различным. Показано, что способность к миграция клеток линии А431 зависит от модуляции ламинина матриксными металлопротеиназами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калмыкова, Наталья Владимировна, Санкт-Петербург

1. Васильев А.В., Волошин А.В., Терских В.В.1991. Роль фидерных клеток в прикреплении и росте кератиноцитов человека и крысы. Цитология. 33 (12): 84-89.

2. Васильев А.В., Волошин А.В., Воротеляк Е.А., Терских В.В. 1993. Миграция колоний эпидермальных кератиноцитов человека в культуре. Докл. РАН. 329 2): 232-235.

3. Воротеляк Е.А., Самарова А.В., Васильев А.В., Терских В.В. 1997. Действие эпидермального фактора на миграцию клеток А431. Известия РАН. 6: 734-740.

4. Горелик Ю.В., Дьяконов И.А., Кухарева JI.B., Блинова М.И., Пинаев Г.П. 1998. Влияние элементов внеклеточного матрикса на псевдоподиальную активность кератиноцитов крыс. Цитология. 40(12): 1037-1044.

5. Adams J.C., Watt F.M. 1989. Fibronectin inhibits the terminal differentiation of human keratinocytes. Nature. 340:307-309.

6. Adams J.C., Watt F.M. 1991. Expression of pi, рЗ, p4 and p5 integrins by human epidermal keratinocytes and non-differentiating keratinocytes. J Cell Biol. 115:829-841.

7. Adams J.C., Watt F.M. 1993. Regulation of development and differentiation by the extracellular matrix. Development 117: 1183-1198.

8. Albrecht-Buehler G. 1977. The phagokinettiks tracks of 3T3 cells. Cell. 11: 395-404.

9. Alitalo K., Kuismanen E., Myllyla RA982. Extracellular matrix proteins of human epidermal keratinocytes and feeder 3T3 cells. J.Cell Biol. 94:497-505.

10. Anton E.S., Sandrock A.W., Matthew WD. 1994. Merosin promotes neurite growth and Schwann cell migration in vitro and nerve regeneration in vivo: evidence using an antibody to merosin, ARM-1. Dev. Boil. 164 (1), 133-146.

11. Aplin A.E., Howe A., Alahari S.K. and Juliano R.L. 1998. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors : the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules and selectins.

12. Amer.Soc.Pharm.Exp.Ther.50:197-205.

13. Are A., Pinaev., Burova E., Lindberg U. 2001. Attachment of A-431 cells on immobilized antibodies to the EGF receptor promotes cell spreading and reorganization of the microfilament system. Cell Motility and Cytoskeleton 48 (1): 24-36.

14. Ardini E., Tagliabue E., Magnifico A., Buto S., Castronovo V., Colnaghi M.I., Menard S. 1997. Co-regulation and physical association of the 67-kDa monomeric laminin receptor and the a6p4 integrin. J. Biol. Chem. 272 (4): 2342-2345.

15. Aumailley M., Nurcombe V., Edgar D., Paulsson M., Timpl.R. 1987. The cellular interaction of laminin fragments. Cell adhesion correlates with two fragment-specific high affinity binding sites. J. Biol. Chem. 262:11532-11538.

16. Aumailley M., Gimond C. and Rousselle P. 1996. Integrin-mediated cellular interactions with laminins. In The Laminins, P. Ekblom and R. Timpl, Eds.: 127158. Harwood Academic Press. Amsterdam.

17. Aumailley M. and Rousselle P. 1999. Laminins of the dermo-epidermal junction. Matrix Biology. 18: 19-28.

18. Barrandon Y and Green H. 1987. Cell migration is essential for sustained growth of keratinocytes colonies: the role of transforming growth factors-a and epidermal growth factor. Cell. 50:1131-1137

19. Barnes D.W. 1982. Epidermal growth factor inhibits growth of A431 human epidermoid carcinoma in serum free cell culture. J. Cell Biol. 93: 1-4.

20. Beck K., Hunter I., En gel J. 1990. Structure and function of laminin: anatomy of multidomain glycoprotein. FASEB J. 4: 148-160.

21. Blanton R.A., Kupper T.S., McDougall J.K., Dower S. 1989. Regulation of interleukin 1 and its receptor in human keratinocytes. Proc.Nat. Acad. Sci. USA. 86: 1273-77.

22. Boonstra J., Rijken P., Humbel В., Cremers F., Verkleij A. and van Bergen en Henegouwen. 1995. The epidermal growth factor. Cell Biol. Inter. 19: 413-430.

23. Borradori L., and Sonnenberg A. 1999. Structure and function of hemidesmosomes: more than simple adhesion complexes. J. Invest. Dermatol. 112:411-418.

24. Breuss J.M. 1995 . Expression of the integrin in development, neoplasia and tissue repair suggests a role in epithelial remodeling. J.Cell Sci. 108:2241-2251.

25. Brown G.L., Naney L.B., Griffin J., Cramer A.B., Yancey J.M., et al., 1989. Enhancement of wound healing by topical treatment with epidermal growth factors. N.Engl.J.Med. 321: 76-79.

26. Brown G., Stenn K,S., Falk R.J., Woodley D.T., O'Keefe E.J. 1991. Vitronectin : effects on keratinocyte motility and inhibition of collagen-indused motility. J. Invest. Dermat. 96: 724-728.

27. Burgeson R.E., Chiquet M., Deutzmann R., Ekblom P., Engel J., Kleinmcm #., Martin G.R., Meneguzzsi G., Paulsson M., Sanes J., Timpl R., Tryggvason K., Yamada Y., Yurchenco P.D. 1994. A new nomenclature for laminins. Matrix Biol. 14:209-211

28. Burgeson R.E.and Christiano A.M. 1994. The dermal-epidermal junction. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 651-658.

29. Burridge K, Fath K, Kelly Т., Nuckols G., Turner C. 1988. Focal adhesion: transmembrane junctions between the extracellular matrix and cytoskeleton. Annu. Rev. Cell Biol. 4: 487-525

30. Buss J.E., Kudlow J.E., Lazar C.S., Gill G.N. 1982. Altered epidermal growth factor (EGF) stimulated protein kinase activity in variant A431 cells with altered growth responses to EGF. Proc Natl Sci USA 79: 2574-2578.

31. Campbell K. 1995. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage. Cell 80: 675-679.

32. Carter W.R. Ryan M.C., Gahr P.J. 1991. Epilligrin, a new cell adhesion ligand for integrin a3pi in epithelial basement membranes. Cell. 65:599-610.

33. Chan A.Y., RalfS., Bailly M., Wyckoff J.В., Segall J.E. and Condeelis J.S. 1998. EGF stimulates an increase in actin nucleation and and filament number at the leading of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci., Ill: 199-211

34. Chen J.D., Helmod M., Kim J.P. 1994a. Human keratinocytes make uniquely liner phagokinetic tracks. Dermatology. 188:6-12.

35. Chen P., Gupla K. and Wells A. 1994b. Cell movement elicited by epidermal growth factor receptor requires kinase and autophosphorylation but is separable from mitogenesis. J.Cell Biol. 124:547-555.

36. Chen P., Murphy-Ullrich J. and Wells A. 1996. A role for gelsolin in actuating EGF receptor-mediated cell motility. J. Cell Biol. 134:689-698.

37. Chen M., О'Toole E.A., Muellnhojf M. 2000. Development and characterization of a recombinant truncated type VII collagen "minigen". Implication for gene therapy of dystrophic epidermolysis bullosa. J. Biol. Chem. 275:24429-53.

38. Cheng V.S., Champliaud M.E., Burgeson R.E., Marinkovich M.R. Yurchenco P.D. 1997. Self-assembly of laminin isoforms J.Biol.Chem. 272:21525-21532.

39. Church H.J. and Aplin J.D. 1998. Be Wo choriocarcinoma cells produce laminin 10. J. Biochem.332; 491-498.

40. Clark R.A.F., Lanigan J.M., Delia Pelle P., Manseau е., Dvorak h.F., Colvin R.B. 1982. Fibronectin and fibrin provide a provisional matrix for epidermal cell migration during wound reepithelialization. J. Derm. Dermat. 79:264-9.

41. Clark R.A.F. 1990. Fibronectin matrix deposition and fibronectin receptor expression in healing and normal skin. J.I nvest. Derm. 94:128-134.

42. Clark R.A.F., ed., The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair .Plenum, New York. 1996.p. 95-141.

43. Colognato H., MacCarrick M., O'Rear J.J., Yurchenco P.D. 1997. The laminin a2-chain short arm mediates cell adhesion through both the aipi and a2pl integrins. J.Biol.Chem. 272 (46): 29330-29336.

44. Colucci C., Gianelli G., Grano M., Faccio R., Quaranta V., Zalone A.Z. 1996. Human osteoclast- like cells selectively recognize laminin isoforms, an event that induces migration and activates Ca mediated signals. J. Cell Sci. 109: 1527-1535.

45. Decline F. and Rousselle P. 2000. Keratinocyte migration requires a2pi integrin-mediated interaction with laminin 5 y2 chain. J. Cell Sci. 114: 811-823.

46. Diaz-Gonzalez F„ Forsyth J., Steiner B. and Ginsberg M.H. 1996. Trans-dominant inhibition of integrin function. Mol.Biol.Cell. &:1939-1951.

47. Dowling J., Yu Q.C., Fichs E. 1996. Beta-4 integrin is required for hemidesmosome formation, cell adhesion and cell survival. J.Cell Biol. 134: 559572.

48. Durbeej M., Larsson E., Ibraghimov-Beskrovnaya O., Roberds S.L., Cambell K.P. and Ekblom P. 1995. Non-muscle a-dystroglycan is involved in epithelial development. J.Cell Biol. 130: 79-91.

49. Durbeej M., Henry M., Ferletta M., Cambell K.P. and Ekblom P. 1998, Distribution of dystroglycan in normal adult mouse tissues. J. Histochem. Cytochem. 46:449-457.

50. Durkin M.E., Nielsen F.C., Loechel F., Albrechtsen R., Wewer U. 2001. Regulation of laminin al chain gene expression in human cancer cell lines. Eur.J.Biochem. 268: 3797-3806.

51. Dziadek M., Timpl R. 1985. Ezpression of nidogen and laminin in basement membranes during mouse embryogenesis and in teratocarcinoma cells. Dev.Biol. 11:372-382.

52. Edwards D.R., Murfhy G., Reynolds J.J., Whitham S.E., Docherty A.J.P., and Heath J.K. 1987. Transforming growth factor beta modulates the expression of collagenase and metalloproteinase inhibitor. EMBO. 6: 1899-1904.

53. Ekblom P. 1996. Receptors for laminins during epithelial morphogenesis. Cur.Opin.Cell Biol. 8: 700-706.

54. Ekblom M., Falk M., Salmivirta K., Durbeej M. and Ekblom P. 1998. Laminin isoform and epithelial development. Ann. NY. Acad.Sci. 857: 194-211.

55. Eichner R., T.T. Sun .and U. Aebi. 1986. The role of keratin subfamilies and keratin pairs in the formation of human epidermal intermediate filaments. J. Cell Biol. 102: 1767-1777.

56. Ehrig K„ Leivo I., Argraves W.S., Ruoslanti E., and Engvall E. 1990. Merosin, a tissue- specific basement membrane protein, is a laminin-like protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 3264-3268.

57. Eliceiri B. 2001. Integrin and growth factor receptor crosstalk. Circ Res. 89:1104-1110.

58. Elices M.J., Urry L.A., Hemler M.E., 1991. Receptor functions for integrin VLA-3 : fibronectin, collagen, and laminin binding are differentially influenced by Arg-Gly-Asp peptide and by divalent cations. J.Cell Biol.l 12:169-181.

59. EngelJ. 1989. EGF-like domains in extracellular matrix proteins: localized signals for growth and differentiation? FEBS Lett. 251: 1-7.

60. EngelJ. 1992. Laminins and other strange proteins. Biochem. 30 (44): 1064310651.

61. Engvall E., Earwicker D., Haaparanta Т., Ruoslahti E., Sanes J.R. 1990. Distribution and isolation of four laminin variants: tissue restricted distribution of heterotrimers assembled from five different subunits. Cell Regul. 1: 731-740.

62. Folkman J. 1997. Angiogenesis and angiogenesis ingibition; an overview. EXS. 79:1-8.

63. Fuchs E. 1990. Epidermal differentiation: the bare essentials. J Cell Biol. 111:2807-2814.

64. Fuchs E.J., Dowling J., Segre S.H.Lo, and Q-C.Yu.\991. Integrators of epidermal growth and differentiation: distinct functions of pi and P4 integrins. Curr. Opin. Gen. Dev.7:672-682.

65. Gabbiani G., Chaponnier C, Huttner I. 1978. Cytoplasmic filaments and gap junction in epithelial cells and myofibroblasts during wound healing. J. Cell Biol. 76:561-8.

66. Gailit J„ Clark R. 1994. Wound repair in the context of extracellular matrix. Curr. Opin. Cell Biol.6: 717-725.

67. Gailit J., Welch M. and Clark R.A. 1994. TGF-beta 1 stimulates expression of keratinocyte integrins during re-epithelailization of cutaneous wounds. J. In vest.Dermatol. 103: 221-227.

68. Giannelli G., Falkmarzillier J., Schiraldi O., Stetlerstevenson W.G., Quaranta V.1997. Induction of cell migration by matrix metalloprotease-2 cleavage of laminin-5. Science. 277: 225-228.

69. Gilchrest B. 1983. In vitro assessment of keratinocyte aging. J. Invest. Dermatolog. 81: 184-188.

70. Gloe Т., Riedmayr S, Sohn H.-Y., Pohl U. 1999. The 67-kDa Iaminin-binding protein is involved in shear stress-dependent endothelial nitric-oxide synthase expression. J.Biol.Chem. 274 (23): 15996-16002.

71. Goldfinger L.E., Stack M.S. and Jones J.C.R 1998. Processing of laminin-5 and its functional consequences : role of plasmin and tissue-type plasmincgen activator. J. Cell Biol. 141: 255-265.

72. Goldfinger L.E., Hopkinson S.B., deHart G.W., Collawn S., Couchman J.R. and Jones J.C.R. 1999. The a3 laminin subunit, a6b4 and a3bl integrin coordinately regulate wound healing in cultured epithelial cell and in the skin. J. Cell Sci. 112:2615-2629.

73. Goliger J.A., Paul D.L. 1995. Wounding alters epidermal connexin ezpression and gap junction-mediated intercellular communication. Mol Cell Biol. 6:1491-501

74. GorelikJ. V., Cherepanova O.A., Voronkina I.V., Diakonov I.A., Blinova M.I. and Pinaev G.P. 2001. Laminin-2/4 from human placenta is a better adhesion agent for primary keratinocytes than laminin-1 from EHS sarcoma. Cell Biol. Int. 25 (5):395-402.

75. Graf J., Ogle R.C., Robey F. A., Sasaki M., Martin G.R., Yamada Y„ Kleinman H.K 1987. A pentapeptide from the laminin B1 chain mediates cell adhesion and binds the 67 000 laminin receptor. Biochem. 26: 6896-6900.

76. Grinnel F„ Но C.H., Wysocki A. 1992. Degradation of fibronectin and vitronectin in chronic wound fluid: analysis by cell blotting, immunoblotting and cell adhesion assays. J.Inves. Dermatol. 98: 410-416.

77. Grinnell F. 1992. Wound repair, keratinocyte activation and integrin modulation. J. Cell Sci. 101:1-5.

78. Grondahl-Hansen J., Lund L.R., Ralfkiaer е., Ottevander V. and Dano.K. 1988. Urokinase and tissue-type plasminogen activators in keratinocytes during wound reepithelialization in vivo. J. Invest. Dermatol. 90:790-95.

79. Guo M., Toda K-l. and Grinnell F. 1990. Activation of human keratinocyte migration on type I collagen and fibronectin . J. Cell Sci. 96: 197-205.

80. Guo M., Kim L.T., Akiyama S.K., Gralnick H.R., Yamada K.and Grinnell F. 1991. Altered processing of integrin receptors during keratinocyte activation . Exp.Cell. Res. 195:315-322.

81. HanJ., Jenq W., Kefalides N. A. 1999. Integrin a2{31 recognizes laminin-2 and induces C-erb B2 tyrosine phosphorylation in metastatic human melanoma cells. Connect Tissue Res. 40 (4): 283-293.

82. Hakkinen L., Hildebrand H.C., Berndt A., Kosmehl H and Larjava H. 2000. Immunolocalization of tenascin-C , a9 integrin subunit and av06 during wound healing in human oral mucosa. J. Histochem. Cytochem. 48:985-998.

83. Hay E.D. 1993. Extracellular matrix alters epithelial differentiation. Curr. Opin. Cell Biol. 5:1029-1035.

84. Hintermann E., Bilban M., Sharabi A., and Quaranta V. 2001. Inhibitory role of a6p4-associated erB-2 and Phosphoinositide 3-Kinase in keratinocyte haptotactic migration dependent on a3piintegrin. J.Cell Biol. 153:465-478.

85. Hynes R.O. 1992. Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell. 69: 11-25

86. Huttenlocher A., Sandborg R.R., and Horwitz A.FA99S. Adhesion in cell migration. Curr. Opin. Cell Biol.7: 697-706.

87. Jenq W., Wu S.J., Kefalides N.A. 1994. Expression of a2-subunit of laminin correlates with increased cell adhesion and metastatic propensity. Differentiation 58 (1): 29-36.

88. Jensen P., Bolund L. 1988. Low Ca 2+ stripping of differentiating cell layers in human epidermal cultures: an in vitro model of epidermal regeneration . Exp. Cell. Res. 175:63-73.

89. Jones J., Watt F.M. and Speigt P.M. 1997. Changes in the expression of a5 integrins in oral squamous cell carcinomas. J. Oral Pathol. Med. 26: 63-68.

90. Karecla P. L., Timpl R., Watt F.1994. Adhesion of human epidermal keratinocytes to laminin . Cell adhesion and Communication .2: 309-318.

91. Kaverina I., Krylyshkina O., Small J. V. 2002. Regulation of substrate adhesion dynamics during cell motility. Int.J.Biochem. Cell. Bio. 34: 746-761.

92. Kikkawa Y., Sanzen N. Sekiguchi K. 1998. Isolation and characterization of laminin-10/11 secreted by human lung carcinoma cells. Laminin-10/11 mediates cell adhesion through integrin a3pl. J. Bio. Chem. 273: 15854-15859.

93. Kim J.P. Zhang K., Chen J.D.I992a Mechanism of human keratinocyte migration on fibronectin: unique role of RGD sites and integrins. J. Cell Physiol. 151:443-50.

94. Kim J.P. Zhang K„ Kramer R.H. 1992b. Integrin receptors and RGD sequences in human keratinocyte migration : unique anti-migratory function of alpha3 betal epiligrin receptor. J. Invest. Dermatol. 98:764-70.

95. Kim J.P., ChenJ.D., Wilke M.S. 1994. Human keratinocyte migration on type IV collagen . Role of heparin-binding site and alpha2 beta 1 integrin. Lab Invest. 74:401-8.

96. Kleinman H.K., McGarvey M.L., Hassell J.R., Cannon V.L., Laurie G.M. and Martin G.R. 1986. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25:312-318.

97. Machesky L.M. and Hall A. 1996. Rho: a connection between membrane receptor signalling and cytoskeleton. Trends Cell Biol. 6: 304-310.

98. Mainiero F„ Pepe A., Yeon M., Ren Y„ Gianccotti F. 1996. The intracellular functions of a604 integrin are regulated by EGF. J.Cell. Biol. 134: 241-253.

99. Massague J. 1990. The transforming growth factor-beta family. Annu. Rev. Cell Biol. 6:597-641.

100. Matrisian L.M. The matrix-degrading metalloproteinases. BioEssays . 1992. 14 (7). 455-463.

101. Matsumoto K., Hashimoto K„ Yoshikawa K., Nakamura T. 1991. Marked stimulation of growth and motility of human keratinocytes by hepatocyte growth factors. Exp. Cell Res. 196: 114-120.

102. Mecham R. 1991. Receptors for laminin on mammalian cells. FASEB J. 5: 2538-2546.

103. Mercurio A.M. 1995. Laminin receptors: achieving specificity through cooperation. Trends in Cell Biol. 5,419-423.

104. Mercurio A.M., Rabinovitz I. and Shaw L.M. 2001. The абр4 integrin and epithelial cell migration. Curr. Opin. Cell Biol. 13. 541-545.

105. Mitchison T.J. and Cramer L.P. 1996. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84:371-379.

106. Monical P.L., Kefalides N.A. 1994. Coculture modulates laminin synthesis and mRNK levels in epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts. Exp.Cell Res. 210 (2): 154-159.

107. Nanney L.B. and King L.E. In R.A.F. Clark, Ed., The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair (Plenum, New York) 1996.: 171-194.

108. Nguyen B.P., Gil S.G., Carter W.G. 2000. Deposition of laminin 5 by keratinocytes regulates integrin adhesion and signalling. J. Biol. Chem. 275:3189631907.

109. Niessen C.M., Hogervorst F., Jaspars L.H., De Melker A.A. Delwel G.O., Hulsman E.H.M., Kuikman I., Sonnenberg A. 1994. The a6p4 integrin is a reseptor for both laminin and kalinin. Exp. Cell. Res. 211:360-367.

110. Nelson W. and T.T. Sun. 1983. The 50- and 58-kdalton keratin classes as molecular markers for stratified squamous epithelia : cell culture studies. J. Cell Biol. 97:244-251.

111. Nishimura S.L., Sheppard D.,and Pytela R. 1994. Integrin avp8. Interaction with vitronectin and functional divergence of the cytoplasmic P8. domainJ.Biol. Chem. 269: 28708-28715.

112. O'Connor K.L., Shaw L.M., and Mercurio A.M. 1998. Release of cAMP gating by the абр4 integrin stimulates lamellae formation and the chemotactic migration of invasive carcinoma cells. J. Cell Biol. 143:1749-1760.

113. O'Keefe E.J., Woodley D.T., Castillo G. 1984. Production of soluble and cell-associated fibronectin by cultured keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 82: 150-155.

114. О'Toole, E.A., Marinkovich, M.P., HoeJJler W.K., FurthmayrH., Woodley D.T. 1997.Laminin 5 inhibits human keratinocyte migration. Exp. Cell Res. 233:330339.

115. Palm S.L., Furcht L.T. 1983. Production of laminin and fibronectin by Schwannoma cells: cell-protein interactions in vitro and protein localization in peripheral nerve in vivo. J.Cell Biol. 96 :1218-1226.

116. PalecekS. 1997. Nature. 385:537-540.

117. Parks, W. C. 1995. The production, role, and regulation of matrix metalloproteinases in the healing epidermis. Wounds. 7: 23A-37A.

118. Paulsson M., Aumailley M., Deutzmann R., Timpl R., Beck K., Engel J. 1987. Laminin-nidogen complex. Extraction with chelating agents and structural characterization. Eur.J.Biochem. 166: 11-19.

119. PfaffM., Gohring W., Brown J.C., and Timpl R. 1994. Binding of purified collagen receptors (alpha 1 beta 1, alpha 2 beta 2) and RGD- dependens integrins to laminins and laminin fragments. Eur. J. Biochem 225: 975-984.

120. Pilcher B.K., DuminJ.N., SudbeckB.D., Krane S.M., Welgus H.J., Parks W.C. 1997a. The Activity of Collagenase-1 Is Required for Keratinocyte Migration on a Type I Collagen Matrix. J.Cell.Biol. 137 (6): 1445-1457.

121. Pilcher, B.K., Dumin, J., Schwartz, M.J., Mast, B.A., Schultz, G. S., Parks, W.C., Welgus, H.G. 1999. Keratinocyte collagenase -1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol. Chem. 274(15): 10372-81.

122. Planus E., Galiacy S., Matthay M., Laurent V., Gavrilovic J., Murphy G., Clerici C„ Isabey D., Lafuma C. and d'Ortho M.-P. 1999. Role of collagenase in mediating in vitro alveolar epithelial wound repair. J. Cell Sci. 112: 243-252.

123. Potten C.S. and Morris R.J. 1988. Epithelial stem cells in vivo. J Cell Sci. Suppl 10: 45-62.

124. Rabinovitz I., and Mercurio A.M. 1997. The integrin абр4 function in carcinoma cell migration on laminin-1 by mediating the formation and stabilization of actin-containing motility structures. J.Cell Biol. 139 (7): 1873-1884.

125. Rheinwald J.G. Green H. 1977.Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes. Nature. 265(5593): 421-424.

126. Rheinwald J.G. 1980. Serial cultivation of normal epidermal keratinocytes. Meth.Cell Biol. 21A: 229-254.

127. Rijken P.J., Hage W.J., van Bergen en Henegouwen P.M.P., Verkleij A.J. and Boonstra. 1991. Epidermal growth factor induses rapid reorganization of the actin microfilament system in human A431 cells. J.Cell Sci. 100: 491-499.

128. Romer J., Bugger Т.Н., Pike C., Lund L.R., Flick M.J., Degen L.J., Dano AT. 1996. Impaired wound healing in mice with a disrupted plasminogen gene. Nat Med. 2: 287-292.

129. Rosen E.M., Goldberg I.D. 1989. Protein factors which regulate cell motility. In Vitro Cell Dev.Biol. 25: 1079-1087.

130. Ruoslahti E. 1996. RGD and other recognition sequences for integrins. Ann.Rev.Cell.Dev.Biol. 12: 697-715.

131. Saarialho-Kere, U.K., Kovacs, S.O., Pent land, A. P., Olerud, J., Welgus, H.

132. G., Parks, W.C. 1993.Cell-matrix interaction modulate interstitial collagenase expression by human keratinocytes actively involved in wound healing. J. Clin. Invest. 92: 2858-2866.

133. Saarialho-Kere, U.K., Kovacs, S.O., Pentland, A. P., Parks, W.C., Welgus,

134. H.G. 1994. Distinct populations of keratinocytes express stromelysin-1 and -2 in chronic wounds. J. Clin. Invest. 94:79-88.

135. Sal о Т., Makela M., Kylmaniemi M., Autio-Harmainen H. and Larjava H. 1994. Expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 during early human wound healing. Lab. Invest. Vol. 70. P. 176-182

136. Sanes J.R., Engvall E., Butkowsky R and Hunter D.D. 1990. Molecular heterogeneity of basement membranes : isoform of laminin and collagen IV at the neuromuscular junction and elsewhere. J.Cell Biol. 111:1685-99.

137. Sato Ch., Tsuboi R., Shi Ch-M., Rubin J.S., Ogawa H. 1995. Comparative study of hepatocyte growth factor/scatter factor and keratinocyte growth factor effects on human keratinocytes. J Invest Dermatol. 104:958-963.

138. Schnapp L.M., Hatch N., Ramos D.M., Klimanskaya I.V., Sheppard D. and Pytela R. 1995. The human integrin a8bl functions as a receptor fooor tenascin, fibronectin and vitronectin. J.Biol. Chem., 270: 23196-23202.

139. Sheetz M.P., dan P. Felsenfeld and Galbraith C.G. 1998. Cell migration: regulation of force on extracellular-matrix-integrin complexes. Trends in Cell Biol. 8:51-54.

140. Shaw L.M., Rabinovitz I., Wang H.H-F., Toker A., and Mercurio A.M. 1997. Activation of phosphoinositide 3-OH kinase by абр4 integrin promotes carcinoma invasion. Cell. 91:949-960.

141. Shuger L., Skubitz A.P., Zhang J., Sorokin L., He L. 1997. Laminin al chain synthesis in the developing lung:Requirement for epithelial-mesenhimal contact and possible role in bronchial smooth muscle development. J.Cell Biol. 139:553562.

142. Sewry C.A., Dalessandro M„ Wilson L.A., Sorokin L.M., Naom /., Bruno S., FerliniA., Dubowitz V., Muntoni F. 1996a. Expression of laminin chains in skin in merosin deficient congenital muscular dystrophy. Neiropediatrics. 28: 217-222.

143. Sewry C.A., Philpot J., Sorokin L.M., Wilson L.A., Naom I., Goodwin F., Dalessandro M., Dubowitz V., Muntoni F. 1996b. Diagnosis of merosin (laminin-2) deficient congenital muscular dystrophy by skin biopsy. Lancet. 347 (9001): 582584.

144. Singer A.D. and Clark R.A.F. 1999. Cutaneous wound healing. The New Engl J. Med. 2:738-46.

145. Spinardi L., Einheber Т., Cullen Т., Milner T.A. and Giancotti F.G. 1995. A recombinant tail-less integrin beta-4 subunit disrupts hemidesmosomes, but does not suppress alfa 6 beta 4-mediated cell adhesion to laminins. J. Cell Biol. 129:473487.

146. Staatz, W.D., S.M. Rajpara, E.A. Wayner, W.G. Carter, and S.A. Santoro. 1989. The membrane glycoprotein Ia-II (VLA-2) complex mediates the Mg 2+ -dependent adhesion of platelets to collagen. J. Cell. Biol. 108.:1917-1924.

147. Stepp M.A., Zhu L., Sheppard D. and Cranfill R.L. 1995. Localised distribution of a9 integrin in the cornea and changes in expression during corneal epithelial cell differentiation J. Histochem. Cytochem. 43. 353-362.

148. Stepp M.A. 1999. a9 and p8 integrin expression correlates with the merger of the developing mouse eyelids. Dev. Dyn. 214. 216-228.

149. Sudbeck, B.D., Pilcher, B.K., Welgus , H.G., Parks, W.CA991. Induction and repression of collagenase-1 by keratinocytes is controlled by distinct components of different exstracellular matrix compartments. J. Biol. Chem. 272: 22103-22110.

150. Sun T.T., Tseng S.C.G. Huang A.J.W., Cooper D., Schermer A., Lynch M.H., Weiss R and Eichner R. 1985. Monoclonal antibody studies of mammalian keratins: a review. Ann. N.Y. Acad. Sci. 455:307-329.

151. Takashima A. and Grinnell F.1985. Fibronectin -mediated keratinocyte migration and initiation of fibronectin receptor function in vitro. J.Invest. Dermatol. 85: 304-308.

152. Takashima A., Billigham R.E. and Grinnell F.1986. Activation of rabbit keratinocyte fibronectin receptor function in vivo during wound healing . J. Invest. Dermatol. 86: 585-590.

153. Tiger C-F., Champliaud M-F., Pedrosa-Domellof F., Thornell L-E., Ekblom P., Gullberg D. 1997. Presence of laminin a5 chain and lack of laminin al chain during human muscle development and in muscular dystrophies. J. Biol. Chem. 272: 28590-28595.

154. Tani Т., Lehto V-P., Virtanen 1. 1999. Expression of laminins 1 and 10 in carcinoma cells and comparison of their roles in cell adhesion. Exp.Cell Res. 248: 115-121.

155. Timpl R., Rohde H„ Gehron Robey P., RennardS.I., Foidart J.M., Martin G.R. 1979. Laminin-a glycoprotein from basement membranes. J. Biol. Chem.m 254:9933-37.

156. Timpl R. 1996. Macromolecular organization of basement membranes. Curr. Opin. Cell Biol. 8:618-624.

157. Toda К., Tuan T.L., Brown P.J., Grinnell F. 1987. Fibronectin receptors of human keratinocytes and their expression during cell culture. J.Cell Biol. 105: 3097-3104.

158. Toole B.P. Proteoglycans and hyaluronan in morfogenesis and differentiation. In: Hay E.D., ed. Cell Biology of Exracellular matrix.2nd ed. New York: Plenum Press. 1991.305-41.

159. Vachon P.H., Loechel F, Xu H., Wewer U.M., Engval E. 1996. Merosin and laminin in myogenesis- specific requirement for merosin in myotube stability and survival. J.Cell Biol. 134: 1483-1497.

160. Vanderneut R., Krimpenfort P., Calafat J., Niessen C.M., Sonnenberg A. 1996. Epithelial detachment due to absence of hemidesmosomes in integrin beta-4 null mice. Nat. Genet. 13:366-369.

161. Watt F.M., Green H. 1982. Stratification and terminal differentiation of cultured epidermal cells. Nature. 295:434-436.

162. Watt F.M. 1984. Selective migration of terminally differentiating cells from the basal layer of cultured human epidermis. J. Cell Biol. 98:16-21.

163. Watt F.M. 1987. Influence of cell shape and adhesiveness on stratification and terminal differentiation of human keratinocytes in culture. J. Cell Sci. 8:313-326.

164. Watt F.M. 1989. Terminal differentiation of epidermal keratinocytes. Curr. Opin.Cell Biol. 6:11-07-1115.

165. Watt F.M. 1998. Epidermal stem cell: markers, patterning and the control of stem cell fate. Phil. Trans. R. Soc. Lond .B 353:831-837.

166. Watt F.M. and Hertle D.M. 1994. Keratinocytes integrins. In Leigh ,I.M., Lane , E.B. and Watt F.M. (eds), The Keratinosytes Handbook. Cambridge University Press, UK, p. 153-164.

167. Watt F.M. 2002. Role of integrins in regulating epidermal adhesion, growth and diffferentiation. EMBO J. 21. 3919-3926.

168. Welch M.P., Odladn G.f., Clark R.A.F. 1990. Temporal relationshipa of F-actin bundle formation , collagen and fibronectin matrix assembly , and fibroneciin receptor expression to wound contraction. J. Cell Biol. 110:133-45.

169. Wewer U.M., Engvall E. 1994. Laminins. Meth.Enzymol. 245: 85-104.

170. Wiche G. 1998. Role of plectin in cytoskeleton organization and dynamics. J.Cell Sci. 111:2477-2486.

171. Woodley D. Т., Bachmann P.M. and O'Keffe E.J. 1988. Laminin inhibits human keratinocyte migration . J. Cell. Physiol. 136: 140-146.

172. Woodley D.T., Brigaman R.A., Herzog S. et al. 1990. Characterization of neodermis formation beneath cultured epithelial autograft transplanted on muscle fascia. J.Invest. Dermatol. 95:20-6.

173. Wysocki a.B., Staiano-Coioco L., Grinnell F. 1993. Wound fluid from chronic leg ulcers contains elevated levels of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9. J. Invest. Dermatol. 101: 64-68.

174. Xie В., Bucana C.D., and Filder I.J. 1994. Density-dependent induction of 92-kd type IV collagenase activity in cultures of A431 human epidermal carcinoma cells. 144:1058.

175. Yao C.C., Ziober B.L., Squillace R.M., and Kramer R.H. 1996a. al integrin mediates cell adhesion and migration on specific laminin isoforms. J. Biol. Chem. 271:25598-25603.

176. Yao C.C., Ziober B.L. Sutherland А.е., Mendrick d.L., and Kramer R.H. 1996b. Laminins promote locomotion of skeletal myoblasts via alfa 7 integrin receptor. J.Cell Sci. 109: 3139-3150.

177. Yu X., Miyamoto S., and Mekada E. 2000. Integrin a2bl-dependent EGF receptor activation at cell-cell contact sites. J.Cell Sci. 113:2139-2147.

178. Yurchenco P.D., Tsilibary E.C., Charonis A.S., Furthmayr H. 1985. Laminin polymerization in vitro: evidence for a two-step assembly with domain specificity. J.Biol.Chem. 260: 7636-7644.

179. Yurchenco P.D., Cheng Y.S., Colognato H. 1992. Laminin forms an independent network in basement membranes. J.Cell Biol. 117 (5): 1119-1133.

180. Zhang К and Kramer R.H. Laminin 5 deposition promotes keratinocyte motility. 1996. Exp. Cell Res. 227(2): 309-322 .

181. Zillikens D. 1999. Acquired skin disease of hemidesmosomes. J. Dermatol. Sci. 20: 134-154.

182. Особенно автор благодарен научным руководителям заведующему ОКК д.б.н., профессору Г.П. Пинаеву и к.б.н. Блиновой М.И. без ценных рекомендаций которых и содействия в проведении исследований невозможно было бы написание данной работы.

Информация о работе

Калмыкова, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.25

Диссертация

Влияние разных изоформ ламинина на адгезию и миграцию нормальных и трансформированных кератиноцитов человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы