Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ЭКЗОГЕННЫХ АКЦЕПТОРОВ И ДОНОРОВ ЭЛЕКТРОНОВ НА ОБРАЗОВАНИЕ МЕТАНА МЕТАНОГЕННЫМ СООБЩЕСТВОМ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ЭКЗОГЕННЫХ АКЦЕПТОРОВ И ДОНОРОВ ЭЛЕКТРОНОВ НА ОБРАЗОВАНИЕ МЕТАНА МЕТАНОГЕННЫМ СООБЩЕСТВОМ"



СРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУКШ НАРОДОВ- : . АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИ1СКОЙ ССР .л.

■ срдаи трудового ^ институт- микрошолоши и аируоалопш т. д.к. забошгного ■

■ ■ -1'- На правах-рукописи -

■■ ' ■ ■ ■- ■ . „ V - ' -'■■-," ■■

ДАНЬКО Ярослав Николаевич

/ ■ ' .■ удк: 579,05.22 ''. 1 ■

; влияние раешиадх экэогшшх акцепторов и донага ; электронов на образование метана 'мстанэгешш ": . соовцесгвом ■

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание"учёной степени • .'■■!.. кандидата биологических наук -

Киев - 198Й

. Работа внполнеш в Институте ми1фобйологии и вирусолопт , 'им.' Д.К.Заболотиого АН УССР.. : , ''..'.'" V >

Научйый руководитель - доктор биологических наук, /. V- ; профессор Ю.Р. МАЛАПЕЛКО

. Официальные оппоненты: доктор биологйческих наук, ~ ."'..

- , профессор Б. С. ПАЯрСАВА.

■ Ч ' . кандидат биологических наук, ' - ' " ' старший научный сотрудник

.".../ ' V>"' .иХ козлом

Ввдудая организация - Институт макробиологии им. А.Кир-хенштейна All Латв ССР, г. Рига

Защита диссертации состоится S6& 9 ч. .30 мин; на "заседании специализированного совета Д.016,05.01 по защите : докторских диссертаций при. Институте микробиологии и в'ирусояо-гии им. Д.К.Заболотного Ail УССР по адресу! 262627, г.Клев, ул. Заболотного, 154 ■".' ; ,ч

Сдиссертацией можно ознакомиться в библиотеке 'Института 'микробиологии и вируеологаи йм, Заболотного АН УССР'

,„ Автореферат разослан 1088 г; ■ ':■

-В»

1 Ученый секретарь : специализированного совета кандидат биологических наук.

Э.А. Коваленко .

ОКЩИЯ ХАРАКТЕРИСТИК РАБОТЫ - -'/-Л;

' Актуальность.теми. Проблемы сохранения окружающей среда и получения энергии относятся и нате время к острейшим. Весомый вклад в их решение может шести использование анаэробных микроорганизмов для анаэробного разложения промышленных й бытовых отходов и стоков,' а .также отходов живо^оводческих комплексов, что является наиболее радикальным и ¿флективным' способом их очистки с одно Я стороны, а с другой, что также немаловажно^ оСес-■ печивает конверсию значительной части органических вепрств в метан. Анаэробная I биотехнология позволяет вовлекать в энергетический банк общества коше-нетрадиционные' возобновляемые источники энергии, способствует увеличению продовольственных и кормовых ресурсов, осуществлению производств^ препаратов, предупреждал)-щих заболевания человека и животных,: обеспечивав? становление и развитие безотходных производств, 'сокращение, а в идеале н пол- ■ ное исключение вредных воздействий техногенных производств на окружагацую среду - от1фыдае .водоёмы, грунтовые воды, воздушый ; бассейн' И Т.П.

' V Использование анаэробных микробных технологий переработки техногенных-отходов и Производства энергоносителей невозможно , без глубокого и всестороннего изучения процессов и условий функционирования. микробных сообществ, осуществляющих в отсутсстие кислорода де градацию ор гениче сккх веща с тв. Анали з литературных . данных позволяет предположить, 'ЧТО одним из ключевых параметров анаэробных процессов является контроль окислительно-восстанови- ■ телыв» условий среди, которое существенным образом влияют на - ; ~ " ход метаболических процессов, В то же время вопрос о воздействии окислительно-восстанови тельного потенциала на физиологическое : состояние датанобразутарх, микроорганизмов, истоке являются

В«т;мьиав

Яенкй»

■ , емь'кох'чгзсьа.ч.

. - (в. К. А.'

. .',;-ключваш||э1венрм в анаэробной Строфической Цепи биоконверсия. во-' . зобновляемых источников сырья:практически не изучен. , ' . ' --'. Цель и задачи^ исследованнЯ..Цедью настаяшэй.работы било . .•'.' '; ■;! изучение процесса образования мотана мвтаногеншм сообвуэством *. 'в зависимости от окислительно-восстановительно го потенциала ■'среда¿-С - ■ у-'-'-:;-1 У,;':' '■*

• ; Исходя из указанной цели, оснояшми задачами исследования явились.следующие: «г '• ■., ^ ■'

'• I/ изучениегвлияния различных'экзогенных „ащеяторов элвкт-" 'ромов - молекулярного кислорода, ферривдаивда калия, • нитрата и • Л''сульфата на процесс "микробного образования мётана с- точки зрения • их воздействия на окислительно-восстановительный потенциал среда; .

2/ определение'верхних лимитиругар<х значений омтслительно-восстановительного потенциала для процесса мэтанобразсвАния; •

; 3/ изучение оеобенностеЙ процесса метанобразомния в 'обла- '■ \ сти сверхнизких; значений окисштелыю-восстаковительногопо'геи-. ■ - циала /-420 Ш/; > ■ ■-':. 4/ разработка рекомендаций по интенсификации процвоса >*ета-" но гене за на основе контроля окислительно-восстановительно го : 1 ■ потенциала конвертируемой среда; -'-Гг ■■';■''-V ' '"

, 5/: модификация средств и методов контроля окислительно-восстановительного потенциала среда.4 . ■'"■■■- '

Научная 'новизна. Получены следующие: осноиме результата:., ; . ;:;■ ■ ' .Определены; значения окисдательно-восстаяовитэльного потен- ■ ;

- ц:ш1а (^да, <кнтабируюи^е процесс метаногенеза в метано генном'- •• . \ 'сообп^зстве. Покаэано, что 'метаногенез протекает при значениях ■ -

■, :■. оксслительно-восстановительного потенциала среды в диапазоне •

- от -Г/0 до -425 мО. ' ; ^-'-г. - Ч- ;";'■■"■ \л ,г:л -_'/■:■. .)'■{ ■ ' --. ■'-'. Показано, что понжение ок:;слительио-восстанови1елысого

. , потенциала 'среды,до- ив и более является- причиной ингибиро- "* . ;; вания метанобразования веществами, обладающими электронакцептор-

'•. НЫМИ свойствам. .'■■;7:^ Л'-"-_.Х"*---'.-^.-:/-.':' ■'■■';-.г--1-" .'*'.. "Г ' ' ■■ '.

'-; . : ' Установлено, что метаболизм первичныханаэробов в метано- .. . ."--,/■: генном сообществе может,приводить на .только'а снижению, но и к поБщоэнив.оштедительно-росстановителшогапотенциала^ среда и ". • • оказивать соответственно как стимулкрумрв, так и шгибирукг» ■' ' щее влияние на процесс иетаногенеэа, Показано, что повышение ' -

• о ююлите л ьно-восстанови тельного* потенциала 'в средах»" содержащих -■■;■"■ й .нитрат обусловлено бакте1щальной*диссимвляциошю^^ :

цией, а но физико-химическими Свойствами нитрат-иона. • ' Установлено» что пошшение о кислительно-восс тан о вйте льно го.■■-■:-.'потенциала до -50 мВ,; взываемое нитратредукцае й; ■ подавляет; Г"'-'- ; -■ - бульфидогенез. • . - ' • • • ; • •'. , . ' •'••-"''. ; .":- ■'., ; .Сверхнизкйе значения. окислительно-восстановительного ■ по- > -

• тенциала /-420 к©/, получаемые с Помощью цитрата титана/Ш/, ■-■_.: ';'„•. ингибнруют образование молекулярного водорода факультативными •■■'■/*

. и облигатныыи анаэробами в культурах' ЕвеЬ«г1оЫ» оо!1 К-12

и С1оаЪг141иа 11Лиа вЪигепа в, а" та ютев" ые тано генном.сообща- '" стве. Обнаружено, что сверхнизкие значения-окислительно-восста- . ; новительнОЬ) потенциала; подавляют .также образование бутирата■/;'■ Г

первичными анаэробами в метаногенном сообществе и приводят к ' ; : ~ прекраг-ению потребления ацетата ацетатиспольэущкми метаноге- _ ■■._■

\-V V ■ V: Практическая- значимость работа;, Установленние .зависимости ••'.' интенсивности процесса ыетаногемэза от величины бкислителыю- ; •' :'; восстановительного потенциала среда позволяют осупрствить эф- V,. ■" ^октитюе' решение проблем мониторинга, управления и оптимизации - .' - - активности ыикробдах сообществ,,осупротв ляюпри штаногенную дер-, *. ■ -

радацию органических веществ. - :: ,:л '' . V ':-. ■■?.'

. Разработаны рекомендации по условиям хранения метаиогенннх' сообществ, Предназначенных для- инокулирования проиэсодствсндак .'мотантенков на этапе »вода' в эксплуатацию о Юль» о блеяния их запуска.- .■'-.'■.■:■' .-/ : ' '■'■■' ■ ■

Модифицирбвшш и разработаны'метода изучения и яультивиро--вания алаэробш« микроорганизмов. , , •-■. * •'■■■'■■' V

■■. - Апробация -работ,- результаты исслёДо ванн й' доклады валис ь На Всесоюзной конференции. "Микробиологические:методы защиты окру-' яаюврй среМ" /Пущино,-1983/, республиканском совещании по технической биоэнергетике "Биогаз-67" /Юрмала» 1987/» конференциях молодых, исследователей ШВ АН УССР,-/Киев,/ 1906,1980/, конкурсе научных работ сотрудников 11МВ АН УССР /Киев; 1987/.

Публикация рвзультатов иселеддваний. Основные результата исследований отражены, в.двух статьгос и снести" тезисах. . ■■-

.'' Структура и объём работы. ДчссертацИотая раОота состоит из введения, шести глав и шводов. Она' изложена на 136 страницах, иллюстрировала ЭО рисунками и одной таблицей..Использовано 116-литературных источников: '42 отечественных- и 74 зарубежных, '

'/.- ; . • содатшЕ РАБОТЫ ж , V'

г ' Материалы и методы-исследования,' Влияние окислительно-вос-. ..становитвльного потещиала'на образование .метана и других продуктов^ штаболиэма изучали на метаногенном сообществе- we тан тенка Бортнической станции а»раЦии.7г« 'Киев/. Такой выбор обгекта; исследований обусловлен тем, что дляпонимания процессов; происхо-

В шполнении работы-принимали участие канд. биол. наук Д.В. Чершшенко и канд. биол. Hayrt A.R.' Таеттрев, '

дящих при анаэробной микробной конверсии органических веществ, как отметил Г.А.Заварэиы, не престклше исследования на чистух ' культурах, й. исследование всей совокупности организмов, развивающихся.» накопительной .культуре й связанных между собой трофическими отношениями, может оказаться б.олее ценным*1 /Завар-эин,19£Б/; . -.Г:' '-■V' V';; :

.Дял культивирование метано генного- сообщества использовали среду следующего составам liiagHPO^?,О г, КН^Рр4-1,0 г, Ш4С1 -0,5 г, Mg Clg-O,I Г, CaCI2-0,I г, глюкоза 1,0 г,' раствор витаминов по Волину /Жилина, Заварэин, I97S/« раствор шкроэлемен-. тов по Пфошгагу /Жилина,йаварэин,1978/, дистиллированная вода ~ 1,0 литр,* pH 7,2-7,3. Шраиртание проводили в термостате при

' В опытах использовали культуру Clostridium lituaeburent*, : получешую из муаоя культур ИКЮСВ АН. УССР и культуру EieherioM coli K-I2 иэ ыузея культур КМВ АН УССР. Их культивирование про* . водили на ШВ при 3?°С. ci. ШиавЪигеш* шращивали во флаконах объёмом "120 мл под резиновыми,пробками в атмосфере аргона, В качестве восстановителя добавляли сероводород иэ {»ссчёта 25 мл сероводорода на Х-литр культуральной сред! / Hungat« ,1909/. : В.coli К-12 выращивали в пробирках под ватно-марле во й про б ко Й, .; Опыты' проводили в культиваторе! для изучения"ростовых,процессов' микроорганизмов.¿ анаэробньрс условиях,' объёмом 400 мл» . Кислород иэ культиватора удаляли кипячением среда при продувке . газовой фазы аргоном. Для потенциометрического определения -зна-: чаний окислительно-восстановительного.потенциала-/0ВП/ среда

использовали мономер универсальный,ЭВ-74 с платиновым измерите-^ > льшм электродом 5Г10-1 и хлорсеребряшм елзктродом сравнения , : - 5Ш-ШЗ. Значения [il определяли' с помощью электродной пары, со-

' стоящей, иэ.измерительного алеятрода5СЛ-63-0? и ввпоШг&твяыют 1.'"

■ ■ ...щммз. . .• . ;;'■.; -

: ■.■-*■■:'По тетушке тричес^Ье .определение сульфид-иона' производит ; сульфидсеребряным электродом / Сур1опк* ,1986/. Концентрация'' . . нитрата определяли с помощью ион-солектижого электрода Ш-.ТОд-, .'<■ 01 или колориметрически по реакции с феполдисульфоновой кисло- " . ■';■>''■ -той Д1етаболиэм микроорганизмев^ 19Ш/.:" Концентрацию^^ растворён-¿ ' ' 'ного кислорода определяли полярографически'/Гуланян и др.^ 1973/.' : ; Концентрацию глюкозы определяли колориметрически при покосит : нолсерного метода / ОиЪв1«-в« ,1956/..Оптическую плотность - ч:; ' • культуральной жидкости определяли На фотоэлектроколоркметре ■ ФЭК-56П при Х»540 ш в кювете с длиной светового пути 0,5 см.

Гаэошй анализ производили на хроматографе ЛХМ-СВД. Для оп- . редслекия Н^, Я^«- С^, СН4 использовали стальную колонку длиной • .1,5 м.и диаметром 3 мм, заполненную молекулярными ситами 5А, ; .

фракция 0,25...0,06 мм^ Для определения (Х>2 использовали сталь- , л; _ ную колонку длиной 2,5 м и диаметром Э мм, заполненную полнеор-бом-1. Температура колонок Э0°С, газ носитель - аргон, скорость "' протока 30 мл/мин, детектор - катарометр, ток детектора 80 *А. ; : Пробы' газовой фазы отбирались шприцем, объём проб», вводимой в . .'-хроматограф 0,5 мл. ■"■■■■■.;.',.^У-Г''

• Шределе ние летучих'жирных кислйт и спиртов производили на

хроматографеСЬгои-б. Для определения., ацетата,.. бутирата^■ мета— -, нола, этанола использовали стеклянную колонку длиной 2,4 и .иди-".' аметром 3 мм^: заполненную носителем оорвгоп снм '.Температура - " коленок - 190°С, испарителя - 220°С, детейтора - 200°С. ГЪэ но- 1 сигель - гелий, скорость протока 28 мл/мин, детектор - пламенно-ионизйциошс/Я, ток детектора 159 кА. Пробы для определена - .

тучкх жирных кислот и спиртов готовили следующим образом..Нуль-.

туральную1 жидкость,/1,0'мл/ центртфутмровалч при;10000 в ;;.в те-чеине 20 шш' для осаждения - кяе то к1, - Жирные кисло Ш к спирта опре-. деляли в супернатарте • Объём вводишх в хроматограф проб 5-Х0мкл,

-Влияиив окзогерньр^ акцепторов электронов на окислител^но-: ^ ■: восс'тановительшй потенциал срел^ и образование метана ' .'■:'.-- метаногенным "ссюбтестУОМ> 5.. - ^ - • ^'. . :

Изучение влияния окислительно-восстановительного потенциала ; срб1р /ОТЯ/ на клетки микроорганизмов затруднено 'неоднозначно- '.: стью интерпретации получаемнх в опыте Данных. Дело в том, что окислительно-восстановительный потенциал представляет собой хара-; кториствку- конкретной окислительно-восстановительной систеш, .Л:" • следовательно, возникает вопрос о наличии альтернативных ОШ ■ механизмов воздеййтюш. компонентов окислительно-восстановительной систеш на клетки бактерий. Известно, например, что молекулярный-кислород повышает ООП среди, однако, существует не менее пяти . гипотез, -связывающих, действие кислорода' на анаэробных: бактерий с другими факторами / «1975/. _ - ^■'''у .'■'.

• Для решения проблеш ми воспользовались следующим методичест кии подходом, Изучалось воздействие нескольких веирств,' понмкио-щос окнсштельно-восстановительный потенциал, на образование метана мотаногоншм сообществом. Одинаковое влияние на метано гене э различных веществ, шзыващих повышение : ОШ,. моадо, рассматривать как свидетельство в пользу предположения о воздействии на микро-; организй! окислителыю-восстановителшого потенциала среды.

Нами изучено влияние слвдущт. веществ,'обладавших электрон-• акцептирующими свойствами, на' образование : мотана: «{вррицианида . , калия, молекулярного.кислорода, нитрата- и сул14ата.; Веррицианид • г. калия широко используется в микробиологии: для создания. положите-

.' ■ льнах значений ОВП. среды. Введение _ же поеледних - трёх; веществ в определённой степени моделирует реальные ситуации, возникающие . . -.. .■ при работе очистных сооружений, куда они могут попадать со сточ-1Шми водами.предфиятиС!» а молокуляршЛ кислород поступать из. • .-атмосферы; --.'■ --о" -г--/: -.^Т/• *г-: ■

Прежде.чем приступить к изучению влияния окислительно-вос- ■■ . становитвльного потенциала среда, регулируемого с помощью раэлич-' . них доноров и акцепторов электронов, на обраэованко.мстана'ыета-ногенным сообществом,' необходимо рассмотреть процессы, происходящее при развитии метано генного сооб;цества в анаэробной среде . без дополнительного внесения окэо'генкьос акцепторов и доноров электронов. —:."i У • -) ■ -Изучен процесс развития метаногеняого сообщества в анаэроб- \ . ; ной среде без восстановителей и акцепторов влектронов в отсутствие дополнительнее экспериментальных влияний /рас.'I/. ОВП анаэробной стерильной среда, равный IGO. .Л90 мВ,-сразу жо после • внесения инокулша падает,. опускаясь за Э-5 часов до -410.. .-4IS -■ мВ. Основная шеса молекулярного водорода наделяется та время /0-10 часов/, в течение которого ОВП остаётся близким к -400 мВ. Затемобразование .водорода прегфащается\и он,вачитает утилиэ1грог/ ■; ваться метаногенами. При этом концентрация Н2 снижается ла 3 по- ' '.'■- рядка /с 3,2 ммоль/л среды до 0,003 ммоль/л среды/, а ОШ пота-шется иа 150 kffl и стабилизируется на'уровне -260...г«:70 мЗ. -

, Необходимо отметить, что вопреки достаточно широко распрос-транёниым представлениям о детерминированности окислительно-взс- -. ■*'■■■ - становитвльного потенциала среда в микробных культурах только ' _ кислородом л водородом, Цаши опыта свидетельствуют о обратном. Мы изучили влияние на ОВЛ среда изменений концентрации молеку,-я- ■■'. '.'.■' рного водорода в культуре.Clostridium lltusebur«nn« .., Оказалось,

О 20 40 60 60 100 120 140 ISO

■':'■.;'■' '»' . ' > ■■'■..■.."'.' .■■■'■■ Время» ч»

Рисунок I, Динамика OKI, рН, СН4, Н2 и COg при развитии ыетано-генного сообщества в анаэробной среде без дополнительного вне/ сения доноров и акцепторов электронов. j-ОЩ» 2-рН| 3-СН4{ 4-H2j S-COg.

■ что при снижении_концентрацйи Н2 на 4 порядка /с 1,44 ммоль/л среды до 0,0001 ммоль/л среда/, вызываемой барботированием куль-' тура льда Й суспензии аргоном, ОШ в культуре Gi. litueeburenee _ повышается лиаь на 25 »S. Следовательно, нельзя объяснить повышение ОВП на 150 мВ, наблюдавшеесявпредыдущем опыте /рис. I/, - лишь снижением концентрации молекулярного водорода.' ; ■

' Образование метана при развитии ыетаногенного сообщества : ' в анаэробной среде без восстановителей и акцепторов влектронов , начинается через 10 часов после кнокулировэния и косит более или "-. : "менее.Щаженный двухфазный характер /рис. I/. Первая фаза метан-образования связана, в основном, с деятельностью водородиспгль- ■■'..

■ 0Ш, кВ

: шюль/л среда

, 1 ■".

б ■

: Д':; : ; О 20 40 6 0 00 100 . . . .

Д Д : ':-Д ДД '^ДД ■ '■'■' ' ч» ' Д;' ¿¡■■■¿■.■.У-'

Рисунок- 2. Влияние внесения феррицианида калия на;СШ, средьг и образование метана мэтанэгенным сообществом.• • :-.ДДДД Д-Ч: 1-ОШ; 2-рН; '3-Ш4{ 4-Н*>; стрелкой обозначено/внесение-5 мМ ••

■ К3Ре/СГ/б. Д^Д^-Д;../^;:^; ЛД Д -: ДД .-.'ДД.'Ч:/:' ДЧ^-'-ДДД.ДДД

зущеЯ метано генной микрофлоры. Вторая:'фаза образование метата . связана про имуще ственнб ' с метано генной деградацией ацетата/"' ". Для выяснения влияния шеоких значения СВП среди на образование метана метшюгенным1 сообществом, ш использовали, ферршна-нид калия /ИдРе/ОР/^/. Мм. вносили 5 »М анаэробного раствора Д-■: .феррицианида калия через сутки' после начала развития метаногенного. сообщества /рис» 2/. ОШ немедленно 'лоштлея-до'.+456'>¿3, ; нетанепшез шгибировался,: а потребление-водорода сильно з'»??л-

•' *. --.и

ОВД, • ыВ

а,4»Н2,С02~ ш мюль/л среди Р"

О 20 40 60 80 100 120 140 Время, ч.

Рисунок 3, Влияние введения, молекулярного кислорода № ОВП среды и образование мемна мотано генным сообцсством. ; ■''■■"■ , 1-ОВЛ; 2-рН; 3-СН4: 5-00^; стрелкой обозначено' введение ;", .

2,32 ммолъ Оз/л среды. "У1'.'''/■'■' ' ' г ! -

■ . Исследовано влияние молекулярного кислорода на ОВП среды и образование метана "метано генным сообществом. Введение 2,32 ммоль* О^/л среды через сутки после начала роста метаногенного сооб-'' иества вызывало повышение ОВП от -ЗБ0 мВ до +90 к© /рис. 3/. ■ Штаногенез останавливался."^те«, по мере потребления кислорода^ факультатйв1!о-анаэробны1й1 микроорганизмами, входящими в соотав сообщества, происходило снижение ШП,' Достигнув значений, пред--

шествовавших введению С^,^окасянтелъно-восстановительный потен, циал начинал медленно повышаться до тех пор, пока не стабилизировался на уровне -247, i. -¿57 мВ, процесс' метано гене за при этом возобновлялся. V' . ■"'■■^■■■.Ц-

. Изучен1 вопрос о причинах повышения ОВД в средах с нитратом. . Традиционно, шсокий окислительно-восстановительный потенциал сред с нитратом объясняетсятем, что нитрат-ион обладает окис- ■ лительними свойствами и, подобно молекулярному кислороду, вызывает поштение СВП. ' Опытная проверка этого положения показала; его несостоятельность. Ус+ановлено, что нитрат в концентрации ilOO мН не вызывает повышения СШ анаэробно го. "стервдьно го .фосфатного буфера /рН 7,0/, а также анаэробного стерильного фосфатного буфера' /{Н 7,0/, восстановленного сероводородом.до значений ОШ, равных -175 мВ. Таким образом, показало, что наличие цитрата не влияет на окислительно-восстановительный потенциал стерильной среда. •. .'.;'■ j* 1 : / ."

Шло исследовано влияние нитрата на ОВЛ-в культурах бакте- ' рий способных и не способных к нитрат-иитритиому досания. Пока-' зано, что в культуре Beoherlobl* «oil ,К-12, которая способна к нитрат-нитритному дыханию, в среде с 20 М нитрата, натрия происходит быстрое повышение ОШ до *Э20 мВ. В то же время, при росте *»ёоЦ . K-I2 ¿ бескислородном ШБ без нитрата и экзогенных восстановителей наблюдается'снижение 0ВП до -320 мВ. Обли- • гатно анаэробная бактерия Clostridium litueeburene« к дисстм-ляцпонной нитратредукции не способна. Установлено, что в , бескислородной кулът}фально/Г среде »ani^j^ никак не егя-эыеаэтся'ника динамике Окислительно-восстаноЕктельного :потзнци-1 ала. ни на росте, CI.Htueeburenee : и в контроле баз яптрятл в , среде я в опыте, при наличии нитрата в среде 'динамика/ОШ соша-;.

о го 40 во 80 Юо ко;

:у Время, ■ ч. •

■ ; рисунок 4. Влияние внесения: нитрата на" СИ1 среды и образование . .- метана таногенным сообществом, ,'.-.,: . . '-.

• 1-ОВГП 2-рН{ 3-Ш4; 4-Н2; 5-СОг»' б-Р2$ стрелкой обозначено внесение 10 ьй* нитрата натрия. . .'• :

даэт> окислительно-восстановительдай потенциал снижается до -0Е0 . мВ. Тагом образом,' наличке нитрата приводит к повышению ОВП ере-да тольщ)в культурах бактерий, осутчествляющнх нитрат-нитритаое I /*>«ханке, а.п стерильной среде или в среде с бактериями, нз спо-• Ц .'•'собнкмн к ДиссимиляцконноП нитратредукции, наличие нитрат-иона ' "'.'.'■ не оказывает влияния на ОВП. ;

На предполагаем, что диссгаилкционная ширатредуяиия явяя- •-, у стся причиной повышения окислительно-восстановительного лотенци-

ала анэи-^СнэП культуральнэй среда. По-Бл^мему, система нитрат- . ; нитрит становится обратной, а следзвателыю, и окислительно- . ■

- ' г-оссг^!-япте.-шскГ. потенциал нзмэрш.елмлитаь .при наличии.¡Г.ерлепта .

натратредуктазы, а такг-как стандартный олектродннЯ потенциал

пари составляем +9-Ю.мВ ЛЪроковскиЙ и др.¿198?/, то и' -.

в среде в этих условиях, устанавливаются положительные значения ;

Изучено влияние нитрата на образование метана метано генным сообществом. В состав метаногекного'сообщества входят микроорганизмы, 'способные к использованию нитрата и продуктов его восста- •. . новления /1Р[^,1№,1^0/ в качестве терминал ьшхащепторов эвектро-

■ .нов. .Поэтому, после внесения нитрата в культуральную среду начи- : .нается его восстановление. Параллельно с нктратродумдией тблю-:

- дается пошшение ОВП культуральной среда,: достигающее через сут- • ки +110 мВ /рис. 4/. До тех пор, пока продолжается восстановге-ниа нитрата ОШ остаётся в положительной области и лиаь поело исчерпания нитрат-иона окислительно-иосстановителышй потенциал :'■■■■-. снижается до -¡¿70 мВ. Процесс донитр|ф)кации сопровождается об-

■ разованием *^.-Одновременно со скачком ОШ в положительную область останавливается и метаногонеэ /рис. 4/, •

Таким образом, нами обнаружено, что метаболизм Первичных',; ": анаэробов в метаногеином сообществе может приводить не только к снижению, но и к повышению ОВД и оказывать не только положительное, нб и отрицательное воздействие на метаногенез,«Положительный эффект, о бусловленсоэда}гаемнеобходимыхо кислите льна-восстанови- 0 тельных условий среды и накоплением метаногешшх субстратов. С^тг" -А . риц!тельный вффект представляет собой риссимиляционнум нитратре^' У • ; дукци», которая приводит к пошоонию ОВП среды до уровня, лкми-

тирующего метан о гене з. . „.'^-;7. ■;•,->

*■ ' -Ч Изучено влияние сульфата на образование метши метано генным , . ! .сообществом. Сульфат обладает электронакцепторнчми свойствами,

но при внесении.в среду с метаногенным сообществом 5м?Я;сульфата.

■■. V ..V15

: ст» |£:

+100

О;'

-аоо. -400

СН4,Н2,002,Н28 • „ :4 . ушяь/я среди

О 20 40. 60 00 100 120 Л Время,ч.

6,

Рисунок 5. Влияние внесения сульфата на СШ среды, и образование метана ыетаногенным сообществом. ; • ; ; : - . V .'-. 1-ОШ; 2-р!1}3-СН4; 5-С02? 6-Н^. ; стрелкой- обозначено .

внесение 5 Ш сульфата натрия. ;-. Ч'' ■■'"

натрия не тблтгодалссь повнтениа СШ более,-чем до -170 мЗ /рис. 5/. Кг смотря на конкуренцию за субстраты мевду метаногенами и : ' сульфатродукторами полного иншбирогания метаногенеэа, характерного для рассмотренных выше случаев, 1те набладается. Метана об- .. разуется на 25* .кеиыае, чем в контроле без сульфата в'среде. .. ' '' - Исследовано, развитие метаногонного сообгрства при однсг-ре-

менком шосонуш в среду 5 ъЫ нитрата-иатряч и 5'ыМ сульфата пат, рия. Так как концентращм нитрата бралась вдвое меньшей,- чем в-.. -- предмдуи^я опытах» пошаегсю окислительно-восстановительного - - ... .-потенциала среда.происходило, лишь до -55 мЗ /рис. .6/. Метаноге-

®4.Н2.*2."23 ш миоль/* среда и

О -

-200 -

-400 -

О 20 40 6 0 00 100 120, ■■;'■ ВрвМЯ, Ч.

рисунок 6. Влияние совместного внесения.сульфата и нитрата на ОВП среда и образование метана метаногенным сообществом. 1-(®П; 2-рН; 3-Ш4; 4-Н2; б-й^! 6-Н^З ( стрелкой обозначено внесение 5 мМ нитрата натрия и б Ш сульфата натрия.

. нез продолжается некоторое время после внесения ннтрата /т.е. нитрат сам по себе его на ингибирует/ и останавливается лишь

. после того, как повышение СВД сделает метанобразование невозможным.'По^ле исчерпания нитрата ОВП снижается до,-270 мВ й метано гене з возобновляется. Сульфатредукция И метанобраэовакие на чиняются одновременно, причём сульфатредукция начинается на 16 часов позже, чем в том случае, когда в среде присутствует лишь сульфат /рис, 5/, а не сульфат и нитрат одновременно /рис.

'■V Как и 6 продредущем случав, полного ингибирования метан^генеза : ' сульфидогенеэои m кабладается. • •. .. v ■ ■f -':- ■ : " ; '..'

;-"V-изучили действие различных акцепторов электронов на про-' ' ; цесс образования метана метаногенным сообществом. Гироко^распро-'.;'■.: странено мнение, что подавление образования метана экзогенными "7;.--акцепторами электронов происходит, из-того, что'поток олскт— ' ронов от субстрата направляется iia ia восстановление. Предпола- ' ' • гается; что мвтаногенеэ подавляется энергетически более выгод- ■.,

ними процессами и,идёт.лишь после того, как исчерпан запас коночных аиДопторов электронов - нитрата, сульфата »«и трехвалентного •• . . яелоза,'причём последовательность процессов соответствует онер; готическому, выходу .окислительно-восстановительных реакций /Кили-на идр. ,19ф/. Подобное подавление мотаногенеза более выгодными' энергетически'процессами было бы'легко объяснимо, если бы восста- ";. новление CCtj* и альтернативна акцепторов электронов могло осуществляться одним организмом. В этом случае наблюдалось бы пероя-. ; лючение метаболизм с одного процосса на другой, аналогичное переходу дрожжей от анаэробного метаболизма к аэробному, известному •' . под названием эффекта Пастера. Однако, в синтрофюй ассоциации ■"'■■ -подавление мотаногенеза энергетически более шгодным процессом -. мотет .иметь место лиаь в том случае, когда концентрация метано-генных субстратов снизится в результате конкуренции до лимитиру-югтзго метаногеиез уровня,' причём К3 у конкурентов метанобраэую-. . щих бактерий доляла быть меньше. ; ..."'.'•'..' ■'.?

-',. "-'' v B наших огмтах по влияния феррицианида,-молекулярного кис- 7 ^ лорода и нитрата наблюдалась остановка метаногенеза, несмотря на

то, что концентрация такого универсального метаногешюго субстра- . та,4 кпк Н2 была во всех случаях ¡змсокой /рис. 2,3,4/. Следовате- • .: лшо, остановку мутаногенеэа в присутствии указанных ашептороп 1 электронов нельзя объяснить подавлением энергетически более" '

годными процессами, переключением потока электронов и т.п. • •'••.•' .

■- ■' ■' .В то же время, присутствие' в среде сульфвта не приводит, к, полному подавлению 1«1^югенеэа| сул14атредукция.и ыатанобраэо- . ванне вдут параллельно, несмотря на конкуренцию за субстрата ; .меящу организма]^ ^осупрстшшю!^^ - /Результаты леших опытов свздетельстдуют о: том, что полно- ■ стью подавляют метаногенез в метано генном сообществе лить' те ак-. . цепторы электронов, наличие котор« приводит к суврстве/гному повышению ОВП среда /феррициалид, молекулярный кислород, нитрат/, по-вкдимому,' деламцему мотаногенеэ энергетически нешгодшм.

■ Влияние экзогенных доноров »лектронор на образование метана' ■ ' ■ и других продуктов метаболизма матаногепным сообществом. - . ■ Ufa изучили влияние значительных сдвигов ОШ в положительную . ! -■ ■

i'y область,' вызываемых внесением акцепторов электронов, на образование метана метаногенным сообществом. При этом остался не иссле-. ;.'■*, дованным процесс метано гене за в диапазонах ОВД от 100 до' -200 ыВ- ■;■ ... 'и от -400 ¿B и' ниже. • y'V ь.-У'-'i',''; ■■<-

..Для создания в среде значений ОВП -100.,.-200 ы£1 ми использовали хлорид «еле за/П/. Bu бор.этого восстановителя1 обусловлен. следуюираш причинами: /а/ хлорид двухвалентного железа создаёт в ' • бескнслородноЯ среда СШ, равный -160 цЗ;*/б/ железо/11/ не может ' - служить терминальным акцептором электронов для микроорганизмов, , следовательно»; его влияние на метаногеиеэ не мояет обменяться' подавлением знергетически болео' шголсыми процессами и т.п., что .

■ теоретически возможно в случае плесешгя'в среду акцепторов элех-

■ тронов. '■;.'■; vV':V~.i^-SlVV v У-'У ■ УУ-Уу'У'У ■ ■ ' "

При внесении fteC¿» /8,9 ьШ СВЛ сродо пошивется до -200 »©, у . а' затем и до -1Э0 мВ. Метаногенез в мчтаногешом сообществе суце-' 0Ti¿idfQ юггибкруется, а при -Г30 Ш прекратится ъоясо. В пред-.

идущих-экспериментах,1 ?при повытенад ¿кислите льно-восстановите- - : льнаго' потенциала,;^:-ITO ыВ,*вызванном введением сульфата," пол-. но го прекращения образования метана, не'наблюдалось /рйс^ 5/. Следовательно',^ можно ^пйдарожити\что полное подавление, метано гензза происходит при некотором значении ОШ, лежащем мелду -ЕЭО мВ' иv^-TTO-jЛ" f tJ^* : ^

■ ■4 До сих ..пор ш рассматривали влияние на функционирование- метано генного сообщества/значений 0Ш,_ более ^ Шсоких, ^чем те,. ко- . 'тораз устанавлиБаются в ходе - сбраживания, не нарушаемого .экспериментальными воздействиями; Гораздо слабев изучено воздействие .■■■"..■ очень' Низипс /близких кэначениюпотеициала водородного (электрода при данном рй/Луровней окислительногвосстановительного. потенциала на метаболизм микроорганизмов; Для создания таких значения . СШ культуральной среда-tfi. применяли щтрат трехвалентного титана.. . - - '.J.-л'.:..: :..;-.- ■ Исследовало влияние цитрата титана/III/ на'образование метана и других, продуктов метаболизма »втаногенным сообществом» Поело снесения в анаэробную среду 4,2 vti цитрата титата/III/ через некоторое гремя устанавливается ОШ, равный -425 мВ. Нами обнару- -жено,что при росте метаногетюго cooftqecTFi в этих условияхV молекулярного водорода образуется в ЙО-ЭОраэ' меньдо, чем в контроле/рис. 7/. Нами показано, что подавление годородобразевания цитратом тйтана/III/ иаблвдается также в культурах Beoheriohla \ coll К-12 и Clostridia» litue«burene« , в то те время, цитрат тит8на/1У/, не снижающий ОШ, не .влияет на образование Из» Известно, что E.ooll в анпэробнше условиях образует водород за счёт окисления формиата при'участии -фермента формиат-гидроген-ли-азы, а : 01* lltueobui-enee ■ - в результате^ окисления пирувата при участии пируват:ферредокс пн-о ксидоредуктаэи /Готт¡талк,1902/.' То-

0ЕП, мВ

-200

-400

Ту 4: ; ¿гн&о-ЙЛ . 1 \

б

4 - б

О 20 40 60 00 100 120 140 Время, ч.

рисунок 7, Влияние датрата титана/111/ на образование1 метана и ; водорода метано генным сообществом. ■ ': ■

1-СВП; 2-рН; 3-СН4; 4-Н2.

ким.образом, цитрат титана/Ш/ иигибирует, а цитрат титана/1У/ не.ингибирует образование Н2 эткмм микроорганиз^ми, несмотря на _ принципиальдав разлотия ферментативных механизмов генерирования водорода. ■

Ш предполагаем, что ингибиропднио цитратом тнтана/Н1/ об* разования микроорганизмами молекулярного водорода обусловлено снижением окислительно-восстановительного потенциала среды: до уровней, делающих термодинамически'невыгодной реакцию окисления .. формиата или пирувата. \ ■._■..- .

: Наличие в среде цитрата титат/Ш/ сказывается и на процессе метанобразования /рис. 7/. В этих угловилх метаногенеэ нлчи-

налоя интенсивнее, чем в контроле,, затем ситуация менялась, и в конечном итоге метана образовывалось вдвое меньше,.'чем при . развитии сооб.-цества в среде, без цитрата титано/Ш/. *Номи ус- . тановлено, что при развитии.метаногенного сообирства в условиях сверхнизкого ОШ метаногегатя деградация продуцируемого ацетата сильно замедляется. Этим/ по-видимому,'-и объясняется тот факт, ^ что в присутствии цитрата титана/III/. метана'образуется в два раза меньше, .чем в контроле. . - .'■*".. '

Обнаружено также, что'цитрат титана/1П/ полностью подав-' ляет. образование .бутирата первичными анаэробами в метан о генном ■ сообществе". ■■ .,■..'■ ; ' . ■ ■ ,-' ;

ВЫВОДЫ '.-'■'■,..",

: I. Окислительно-восстановительный потенциал является одним из основных факторов, олродоляю!^« физиологическое состояние метано гегаюй популяции; и его следит ширр»о использовать для мониторинга, управления и оптимизации активности микробных консорциумов, осуществляющих метаногенную дегрдацию органических .веществ. .."■ ' ■' . ■ - ■ . ■■

.2.;Биоконверсия органических вепрств в метан наблюдается в диапазоне окислительно-восстановительного потенциала от -170 до -420 ifl. Повышение озямлительно-восстановительного потенциала сред! до -130'мВ приводит к полному прекращении метанобразова-

3. 5!пгибкроззя"е процесса метанобразования минеральными-'акцепторами электронов происходит при повышении отз:слителыю-вос-"станоЕкгэлнюто потенциала среда более, чем до -130 1.0, Акцепторы электронов /;Терр;щианид,.молекулярный кислород, - нитрат/, .вы— , зиварцскз -увеличение окислительно-восстановитель!! о го потенциала более,: чэм до. -130 мВ полностью шгн бир;уют метаногенеэ. Сульфат

нешзывает повышения о кислите льно-вос стано ви те льно го потенций- ■ ла.более,, чем до »170 мВ и ингибирует ыетаногенез незначительно." Увелкче кие ;о делите льно-во с с тано вите льно го потенциала; в среде с нитратом' обусловлено бактериальной диссимиляционно й 'нитратредук-дией, а не физико-химическимц' свойствами нитрата, ' '

4. Метаболизм первичных анаэробов может приводить не только к снижению,.: но ик повышению окислительно-восстановятельного^по-тенциала и' оказывать'. как ■ стимулирующее, Vтак и ингнбирулжре воздействие на метаногрнеСтимулируюсщй эффект' обусловлен созда-7 . нием необходимых окис ли те льно-восс кшовите льных - условий, и накоплением в конвертируемо й ереде* метаногенных оубстратов.' йнгибиру-юще^ воздействие обусловлено протеканием процесса' .циосиыиляцион-ной ш1тратредуй(5ш,';воторая :сопрововдается повы^ окислите-"; льно-восстановительного потенциала выаэ' уровня, ^ Лииитируицэго ыетаногенез..'•'.*• -Х-*' : ^

' - : 5. По Шиюнда: окислите льно-восстановите льно го потенциала,: до -50 ыВ,■ вызываемое нитратредукцией,, подавляет сульфидогенез. ..'• ;б., Сверхнизкие, эначенияокислительно-восстановительного пот' тенциала,: получаемые с. помощью цитрата, трехвалентного титана ингибируют.образование молекулярногб водорода, первичными енаэ- -робами," полно стаю подавлюот образование ~ бутирата пер вичными анаэробами, . замедляют метано генную деградацию .ацетата... '- '

V?,! Модифицированы и разработаны методы изучения, и культивирования 'анаэробна* микроорганиэмов;'' | - ■-- *,' 3;'. . а/ Сконструирован простой культиватор для изучения ростошх процессов микроорганизмор в анаэробных условиях,' позволяющий непрерывно осуществлять измерение значений окислительно-восстанови тельного потенциала; среда, рП, р02,: концентрации сульфид-иона и других показателей в условиях, исключающих .;■ контакт культуральной

" ' жидкости о кислородом воздуха; '•' ! . • .. ; ' 'Ч'"','Г1 ■"

' : -б/ Разработан, изготовлен и агфоб<фован игольчатый электрод ■'■..' . для измерения окислительно-восстановительного потеиутла нри ; '■. • культивировании строгих шюэробов.. ^ ; - ; V • :'г

• в/ Модифицирована техника выделения изолировашшх 1голонкй

.' ■ • • анаэробных бактерий во флаконах. : ^ ' ' . ' ' . ^ ! ' . " • • "!■ -• .г/ Изготовлено приспособление

дли . разлива больших, объемов ' ' питательных сред, поэволяюсрв.избегать контакта среда с кисло-■: родом воздуха: ; /-У^'^г ■ :': "■■."■' .'.

■■-. ' . Списо.к работ. опубликовтгных по теме диссертации; '. >- ,

.'■ ко Ти.Н. 1пГ1и«поео£ аааегоМо ш_1сгоогв«л1вт« 1млюЫ11ва- ■ 1логе»п1о «1во-кгоо аооврЫгаоп Ъ1оооптвгя1оа ///; 10 ЧЬ Сопсгеая о< ги« Нипв«Н«п 8оо1е(7'о< Я1огоМ»1ов7 (8|«ве4, »идоаг 1907)» АЪ^г.-Нипвагу, 1987.-Р. 47.

• • 2. Чернытенко Д.В., Данько Я.Н», Малаюэнко.Ю.Р, Влияние окис- \ " *: . : ' лительно-восстановительного потенциала на сбраживание глю-

- .'.-л • козы анаэробной ассоциацией бактерий // Совесрние по техни-^ ■ :" ческой биоэнергетике"Биогаз-87". /Ермала, ноябрь 1987 г,/г ■'.-■';■

::Тез. докл.-Рига: Эинатне, 1Ш7«-С. 104. ~

3. Данько Я.1Т.," Чернысенко Д.В< Игольчатый электрод для измерения редокс-потенциала сред при культивировании строгих ; • анаэробов //. Совецанке по технической биоэнергетике "Биогаэ- ' ■;■ • 07" 7Гркала, ноябрь 1987 г./: Тез. докл.-Рига: Зинатне, . ;

С--," ■ ".-''.' V

: : 4. - .Чернызвеико Д.В., Данько Я,И., Малашеико Ю.15. Влияние неор-; '.-'■■.''.."V гаинческгас акцепторов электронов,на сбраживание-целлюлозы ;' .. , анаэробными;бактериями // Сспеаанго по техшпоскоП биоэнзр-

■ '. ' .г*>та!<с ''Виогаз-87" /Грьила, ноябрь 1907. г./: Тез. докл.- - : 1

Рига: Зинатно, I907.-C. ЮЭ.

5. Черныгаенко Д.1).;-Данько Я.Н. Влижше низких значений Мх V , на развитие' метано генного" консорциума // Микробио логично-

кие метода защити 01фужаип^Й /среды /Пущино, апрель 1908 г./: • " Тез» докл.-ПущиноГ I988.-C. 125, ' * ■ ',..;'..■ --'■■-'

6, Данько Я.Н., Чернышенко Д.В. Ингибирование молекулярным кислородом образования- метана, мотаногенным консорциумом //

. Микробиологические методы защита окружающей среды /Пущино, , апрель 1900 г./: Тез. доял.-Нувушо; 1938.-С. 02. ., ; 7. Тшигрев A.B., Данько Я.Н,,. Чернишико Д.В. Техника шделе--../ нкя изолированных колоний анаэробных бактерий во флаконах // Микробиол.' журн»-1980.-50,' IP 4.-С. C9-S0. 8. ■ Данько Я.Н., Чернышенко Д.В., Малашенко Ю.Р. Игольчатой .'■.'■■.' электрод для измерения редокс-потенциала сред при культиви- . ровании строгих анаэробов ;// Ыикробиол. журн.-1988,-50, .-.' IM.-С. 95-97. ' ■'. ;

Подп. к печ. 3 /а- U Б4> ¥f£-£& Форм« ¿¿ж/. Печ, ефс. Уса. леч, л. К ¿Я -. Уч,-вм. л, / - ТиражЛ?^, . 3i*. . Б«пл«»о. ■ " : ■■ .'■

Кнгвскм хияжяа* типография ваучноА киягя. К»гв, Репкя», 4.