Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Влияние пробиотиков на гетеротрофную микрофлору и организм рыб в пресноводной аквакультуре

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Влияние пробиотиков на гетеротрофную микрофлору и организм рыб в пресноводной аквакультуре"

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК ІІІСТИ'ГУТ РИЫЮГО ГОСПОДАРСТВА

г а

о од

1 З СЕН

КРИВОРУЧКО Олена Миколаївна

УДК 639.3.043.13:636.087.8

ВПЛИВ ПРОБІОТИКІВ НА ГЕТЕРОТРОФНУ МІКРОФЛОРУ ТА ОРГАНІЗМ РИБИ У ПРІСНОВОДНІЙ АКВАКУЛЬТУРІ

06.02.03 - рибництво

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис «Вплив пробіотиків на гетеротрофну мікрофлору г; організм риби у прісноводній аквакультурі»

Робота виконана в Інституті рибного господарства Української академії аграрних наук.

Науковий

керівник

Офіційні

опоненти

Провідна

установа

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Надія Іллівна Вовк,

Інститут рибного господарства УААН, завідувач лабораторії фізіології та іхтіопатології

доктор біологічних наук, професор Орест Михайлович Арсан,

Інститут гідробіології НАН України, заступник директора, завідувач відділу екотоксикології та гідрохімії

кандидат сільськогосподарських наук, старший науковий співробітник Юрій Олександрович Желтов,

Інститут рибного господарства УААН, провідний науковий співробітник відділу аквакультури

Київський університет ім. Тараса Шевченка, біологічний факультет, кафедра мікробіології та загальної імунології

Захист дисертації відбудеться червня 2000 р. о Ю00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К.26.364.01 в Інституті рибного господарства за адресою: 03680, м.Київ, вул. Обухівська, 135.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту рибного господарства УААН, 03680, м.Київ. вул. Обухівська, 135.

Автореферат розісланий

травня 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук

С.А.Кражан

■ 1 ' 1 загальна характеристика роботи

І І

АКТУАЛЬНІСТЬ ТЕМИ. Серед факторів, що стримують розвиток рибного :подарства, не останнє місце посідають хвороби риб, які призводять до зниження Зопродуктивності, значних економічних збитків, погіршення якості рибної адукції. Підвищені щільності посадки, відсутність достатньої кількості 5роякісних кормів, а в деяких випадках ускладнення екологічної ситуації погіршує Оологічний стан вирощуваних риб, негативно впливає на їх імунну систему, 5Ияг виникненню захворювань інфекційної, інвазійної, аліментарної і »етіологічної природи (Лугаськова, 1997; Силкина, 1997). Відмічається нирення інфекційних захворювань риб, викликаних ентеропатогенними дниками, які, в першу чергу, властиві теплокровним тваринам (Тонгушева, эцева, 1990; Валедская и др., 1991; Вовк, Руденко, 1994; Lalitha et al., 1990; slin, 1992).

У світовій ветеринарній практиці в останні десять років чітко простежується денція до зменшення використання антибіотиків. Інтенсивна антибіотикотерапія ла однією з причин порушення нормального бактеріоценозу та зниження нобіологічної реактивності вирощуваних тварин, в тому числі риб, виникнення истентних штамів збудників, що нивелює терапевтичний ефект (Москаленко, !7; Michel, 1986; Samuelsen, 1994; Van Asshe, 1997). У цьому зв'язку поіііук іктивних препаратів, які коригують механізми імунного захисту та пом'якшують ив несприятливих факторів, а також для попередження спалаху епізоотій, зищення рибопродуктивності та покращення якості рибної продукції є уальним питанням сьогодення (Валова, 1995; Вовк, 1998; Киянова, 1997; Bogutiet 1998; Martines-Diaz, Moreno-Legoretta, 1999).

В медицині і ветеринарії для профілактики і лікування різноманітних проявів ікових захворювань та корекції механізмів імунного захисту досить часто ористовують біологічні нормалізатори мікрофлори, до яких відносяться парати з живих культур бактерій-антагоністів - пробіотики колібактерин, ідумбактерин, лактобацилін (Мостюк и др., 1982; Коршунов и др., 1985; чарова и др., 1987). Все більшого поширення набувають і альтернативні іарати імуномодулюючої та імуностимулюючої дії, зокрема, пробіотики на зві бактерій роду Bacillus - біоспорип, бактерин-СЛ, егітерогермін, зобактерин, бактисубтил. споролакт, субаліи (Смирнов и др.,1987; 1989; 1991; шк и др., 1988; 1993; Харченко, 1993; Поліщук, 1995; Сорокулова, 1996). анній з'явився на ринку лікувальних і профілактичних засобів порівняно івно, однак у медичній та ветеринарній практиці встиг добре себе комендувати (Шуст и др., 1997; Сорокулова, 1998).

Сучасні уявлення про механізми лікувально-профілактичної дії пробіотиків з ерш роду Bacillus свідчать, що вказані препарати пригнічують розвиток

ратогенної та умовно-патогенної мікрофлори, покращують травлення, активізують

специфічні і неспецифічні фактори імунного захисту, в тому числі стимулюють

антивірусну активність за рахунок синтезу інтерферону (Смирнов и др., 1993).

У наявній вітчизняній та зарубіжній літературі відсутня інформація про дію

пробіотиків на основі аеробних спороутворюючих бактерій Bacillus subtilis на

організк та мікробіоценоз пойкилотермних тварин, динаміку їх чисельності у

профілактичному комбікормі для риб при його виготовленні та зберіганні. Вивчення

ж цих питангі є основою створення нового напрямку щодо профілактики

захворювань риб в умовах прісноводної аквакультури.

ЗВ’ЯЗОК РОБОТИ З НАУКОВИМИ ПРОГРАМАМИ, ТЕМАМИ, ПЛАНАМИ. , і .

Тема дисертаційної роботи була складовою частиною тематичного плану Інституту

рибного господарства, що виконувалась за завданням «Розробити систему захисту

риб від інфекційних, інвазійних та аліментарних хвороб з використанням екологічно

безпечних методів» (№ державної реєстрації 0196U021197).

МЕТА І ЗАВДАННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ. Мета роботи - вивчити вплив пробіотиків

на основі аеробних спороутворюючих бактерій Bacillus subtilis на мікробіоценоз риб,

їх фізіологічний і імунологічний статус та науково обгрунтувати можливість

використання субаліну в рибництві для профілактики захворювань риб аліментарної

та інфекційної природи.

Для досягнення цієї мети необхідно було виконати такі завдання:

і — дослідити імуно-мікробіологічні аспекти формування гетеротрофної

мікрофлори риб;

, - вивчити чутливість мікрофлори, виділеної від клінічно здорових і хворих

риб, до біоспорину та субаліну;

- вивчити чутливість мікрофлори, яка контамінує комбікорми для риб, до вказаних пробіотиків та динаміку клітин Bacillus subtilis, що складають основу препарату субаліну, в профілактичному комбікормі та водному ‘середовищі;

т- встановити характер взаємовідносин між бактеріями Bacillus subtilis препарату субаліну та автохтонною гетеротрофною мікрофлорою риб при згодовуванні профілактичного комбікорму;

вивчити вплив субаліну на перебіг експериментальної бактеріальної 1 • інфекції у риб у модельних дослідах;

- дослідити вплив вказаного пробіотику на фізіологічний та імунологічний статус організму риби.

1 ОСНОВНІ ПОЛОЖЕННЯ, ЯКІ ВИНОСЯТЬСЯ НА ЗАХИСТ:

1. Чутливість до пробіотиків та характер взаємовідносин гетеротрофно! бактеріальної флори риб з бактеріями Bacillus subtilis, що складають основу субаліну.

2. Дсщільність внесення субаліну в комбікорми для риб з метою попередження їх

онтамінації патогенною мікрофлорою та хвороб риб аліментарної природи.

3. Обгрунтування можливості використання субаліну в рибництві для активізації бмінних процесів, підвищення загальної резистентності організму риб та рофілактики їх бактеріальних захворювань.

НАУКОВА НОВИЗНА. Вперше встановлено значну активність пробіотиків іоспорину та субаліну щодо патогенної та умовно-патогенної мікрофлори, виділеної ід риб, водного середовища та з гранульованих комбікормів. Виявлено позитивну инаміку клітин Bacillus subtilis пробіотику субаліну у дослідному комбікормі після иготовлення та тривале їх збереження у водному середовищі. Вперше проведено ивчення характеру взаємовідносин між бактеріями Bacillus subtilis, що складають снову препарату субаліну, та автохтонною гетеротрофною мікрофлорою риб, оказано активізацію обмінних процесів та захисних сил організму риб під його пливом.

ПРАКТИЧНА ЦІННІСТЬ РОБОТИ. Використання профілактичного омбікорму з субаліном сприятиме профілактиці хвороб риб аліментарної та актеріальної природи, підвищенню загальної резистентності їх організму, Зсолютного приросту маси, позитивно впливатиме на екологічну стабільність здного мікробіоценозу і об'єктів аквакультури.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідались а вчених радах та звітних сесіях Інституту рибного господарства УААН (Київ, 996-1999 pp.), II з'їзді гідроекологічного товариства України (Київ, 1997), IX іжнародній конференції іхтіопатологів «Diseases of fish and .shellfish» (Родос, реція, 1999), міжнародній конференції молодих вчених "Водні біоресурси та шляхи ; сталого використання " (Київ, 2000).

ПУБЛІКАЦІЇ. За матеріалами дисертації опубліковано 9 робіт.

ОБСЯГ ТА СТРУКТУРА ДИСЕРТАЦІЇ. Дисертаційна робота викладена на 130 горінках машинописного тексту, складається із вступу, огляду літератури, 5 розділів сспериментальних досліджень, заключення, висновків, рекомендацій виробництву, тиску літератури, додатку. Робота ілюстрована 17 таблицями та 18 рисунками, ібліографічний список містить 214 джерел. ,

ДЕКЛАРАЦІЯ ОСОБИСТОГО ВНЕСКУ. Дисертантом особисто проведені ітологоанатомічні дослідження риб, бактеріологічні аналізи гранульованих >мбікормів, водного середовища, вивчені біологічні властивості виділених бактерій і їх чутливість до біоспорину і субаліну, динаміка клітин пробіотиків з аеробних юроутворюючих бактерій у експериментальному профілактичному комбікормі, ідному середовищі та в організмі риб, проведені модельні експерименти, жймалась активна участь у проведенні імуно-гематологічних досліджень, виконана атистична обробка матеріалу. Аналіз отриманих результатів та їх теоретичне ¡грунтування виконано спільно з керівником дисертаційної роботи к.б.н., с.н.с. DBK Н. І.

ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Розглянуті окремі аспекти формування бактеріальної флори риб, участь пробіотиків у становленні нормобіоценозу макроорганізму та механізми їх лікувально-профілактичної дії.

МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Робота виконувалась протягом 1996-1999 pp. на базі лабораторії фізіології та іхтіопатології Інституту рибного господарства УААН.

Об'єктом досліджень були різновікові групи клінічно здорових та хворих риб -короп, білий амур, строкатий товстолоб, вирощених у рибних господарствах України, а також - щука, лящ, судак, окунь, в‘язь, карась, плітка, відловлених з водосховищ дніпровського каскаду.

Клінічний огляд та патологоанатомічннй розтин риб здійснювали за загальноприйнятими методами (Щербина, 1973; Мусселиус, 1983).

Мікробіологічні дослідження проводили за загальноприйнятими методиками на живильному та триптозо-соєвому агарі (Лабинская, 1972; Герхардт, 1983). Визначення лізоцимної активності поверхневого слизу проводили на твердому живильному середовищі з використанням тест-культури Micrococcus lysodeicticus методом модифікованим у лабораторії фізіології та іхтіопатології ІРГ УААН. У дослідах використовували пробіотики біоспорин та субалін (Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова І.Б. та ін., патент 2035185 РФ, МКИ А 61 К 35/66) виробництва ВАТ «Дніпрофарм» (м. Дніпропетровськ). Антагоністичну активність пробіотиків щодо виділених бактерій визначали методом відстроченого антагонізму (Смирнов и др., 1983). У дослідженнях використовували комбікорм для риб рецепту К ІІІ-9 Укр. Дослідна партія профілактичного комбікорму з субаліном була виготовлена на Дніпропетровському заводі рибних гранкормів методом сухого гранулювання. Мікробіологічний контроль зразків комбікорму здійснювали з використанням відповідних методик (Таланов, Хмелевский, 1991).

Експериментальні досліди та виробничу перевірку ефективності дії комбікорму з субаліном проводили на базі Придніпровського тепловодного рибного господарства (ТРГ) на однорічках та дволітках коропа. Дослідження динаміки бактеріальних клітин Bacillus subtilis в організмі риби та впливу субаліну проводили у таких варіантах:

I - дворазова годівля протягом 1 дня, кількість пробіотику у комбікормі - 100 доз/т (кількість клітин Bacillus subtilis в 1 г комбікорму 62,7± 1,86 тис.м.к.);

II - дворазова годівля протягом 1 дня, кількість пробіотику у комбікормі - 1000 доз/т (кількість клітин Bacillus subtilis в 1 г комбікорму 1380±210 тис.м.к.);

III - дворазова годівля протягом 2 днів, кількість пробіотику у комбікормі -1000 доз/т (кількість клітин Bacillus subtilis в 1 г комбікорму 1380±210тис.м.к.).

Модельні досліди з вивчення динаміки клітин пробіотику у водному 5едовищі та впливу субаліну на перебіг експериментальної бактеріальної інфекції, кликаної патогенними аеромонадами, проводили в експерименті в лабораторних овах. Статистична обробка експериментальних даних виконувалась з користанням відповідної комп'ютерної програми.

1 і 1 ОКРЕМІ АСПЕКТИ ФОРМУВАННЯ ГЕТЕРОТРОФНОЇ МІКРОФЛОРИ РИБ ТА ЇЇ ЧУТЛИВІСТЬ ДО ПРОБІОТИКІВ БІОСПОРИНУ ТА СУБАЛІНУ ,, Імуно - мікробіологічні аспекти формування мікрофлори риб. Вивчення іємовідносин пробіотиків біоспорину та субаліну з гетеротрофною мікрофлоррю З неможливе без знання закономірностей її формування та виділення в чисту іьтуру найбільш характерних модельних штамів бактерій для подальших :ліджень. і ,

На основі виконаних експериментів визначено, що у, переважної більшості >опа (до 72%), незалежно від віку, спостерігається тенденція до збільшення числа еротрофних бактерій на слизовій кишки у напрямку до заднього відділу (передній діл - 2,13+0,47 - 6,13± 1,16 тис.м.к./см2, задній - 4,17+0,43 - 16,9±0,08 тис.м.к./см2), пояснюється наявністю антибактеріальних захисних бар'єрів, зумовлених дією ункових та кишкових секретів, які більш активно впливають на мікрофлору у унку та передньому відділі кишки.

Однією з характерних особливостей мікрофлори хворих та ослаблених 'риб ромоноз, бактеріальне ускладення кумулятивного токсикозу, бактеріальний іматит, порушення аліментарної природи) було підвищення її чисельності у .івах зі слизової кишки і з поверхні тіла та зменшення видової різноманітності, іовий спектр в більшості випадків був представлений монокультурою бактерій.

Антибактеріальна дія поверхневого слизу коропа була виявлялена у 100% нічно здорових риб (зона затримки росту тест-культури Micrococcus lysodeicticus новила 2-4 мм). Зниження частоти виявлення лізоцимної активності ерхневого слизу (до 50 - 69%) спостерігалось у ослаблених та хворих особин опа, а також у білого амура (38%) та строкатого товстолоба (15%) при зонах эимки росту 0,5 - 2 мм.

Нами встановлено, що антибактеріальна дія слизу (з поверхні, зябр та кишки) мовлена не лише його лізоцимною активністю, а й наявністю природних бактерій ітагоністів, які були виділені від риб, вирощених у господарствах та відловлених эдосховищах. Антагоністична активність виділених штамів виявлялася не тільки відношенню до тест-культур Micrococcus lysodeicticus та Escherichia coli, але і юсно бактерій, виділених від риб та з води водойм. Так, до шт.9849 були гтивими 64% перевірених культур, що може характеризувати цей штам, як івного природного антагоніста, який приймає участь у формуванні бактеріальної ри риб.

і

Отже, отримані результати свідчать, що у формуванні мікрофлори риб важливу роль відіграють антибактеріальні захисні бар'єри їх кишкового тракту, лізоцим слизу, активність яких визначається загальним фізіологічним і імунологічним статусом риб, та бактерії-антагоністи.

Чутливість гетеротрофної мікрофлори риб до біоспорину та субаліну.

Наступний етап досліджень полягав у визначенні чутливості гетеротрофних бактерій, виділених від риб, до біоспорину та субаліну. Серед 79 перевірених штамів ,84% характеризувались наявністю дезоксирибонуклеазної (ДНК-азної) активності, що досить часто є однією з ознак патогенності бактерій. Зокрема, для 44% бактеріальних ізолятів, виділених від ослаблених та хворих особин коропа, була 1 властива середня та висока ДНК-азна активність (зони деполімеризації дезоксирибонуклеїнової кислоти коливались від 3 - 4 до 5 -11 мм). У штамів, виділених від здорових риб, ДНК-азна активність в абсолютній більшості випадків (близько 80%) не виявлялась або була низькою (зони деполімеризації ДНК складали 1-2 мм). Серед ДНК-азопозитивних бактерій (досліджено близько 70 штамів) чутливими до біоспорину виявилось 33%, малочутливими - 21%, а нечутливими -46%. До субаліну серед цієї ж групи мікроорганізмів високу чутливість виявляли 47%, а кількість малочутливих та нечутливих складала 35% та 18% відповідно.

Від хворих риб було виділено 36 штамів бактерій, серед яких чутливими до субаліну, були 53%, малочутливими - 42% та нечутливими - лише 5%. Чутливість до біоспорину була дещо іншою і складала 25%, 17% та 58% відповідно.

Таким чином, використання пробіотиків у рибництві сприятиме нормалізації і мікробіоценозу риб за рахунок пригнічення розвитку умовно-патогенних бактерій.

динаміка Чисельності клітин bacillus subtilis, що складають

ОСНОВУ СУБАЛІНУ, У ПРОФІЛАКТИЧНОМУ КОМБІКОРМІ ТА ВОДНОМУ

, , СЕРЕДОВИЩІ

' ' Важливою проблемою як у тваринництві, так і у рибництві, що призводить до

значних економічних збитків, є використання для годівлі недоброякісних комбікормів, контамінованих патогенними бактеріями, грибами, продуктами їх життєдіяльності. За даними літератури, в зразках комбікормів, що використовувались в рибних господарствах, ступінь мікозної контамінації 1 визначався станом корму та терміном його зберігання і досить часто значно перевершував допустимі в рибництві норми (Вовк, 1995).

Вивченням антагоністичної дії пробіотиків біоспорину та субаліну щодо контамінуючої комбікорм для риб бактеріальної та мікроміцетної мікрофлори встановлено, що зони затримки росту мікроміцетів субаліном коливалися в межах 10

- 20 мм, а бактерій - до 23 мм, в той час як біоспорин пригнічував розвиток мікроміцетів в зоні 5-7 мм, а бактерій - 7-13 мм. Чутливість до субаліну виявляли

% перевірених культур мікроміцетів, в той час як до біоспорину чутливих було 5% штамів, а малочутливих та нечутливих - 37,5%.

Таким чином, пробіотики доцільно використовувати не тільки для нормалізації робіоценозу риб, але і для захисту комбікорму від розвитку патогенної та умовно-огенної мікрофлори і його псування, що, в свою чергу, сприятиме профілактиці роб риб аліментарної природи. В цьому зв'язку, важливою ланкою у розробці ання використання пробіотиків у рибництві є вивчення динаміки бактеріальних гин субаліну у комбікормі під час його зберігання. Нами встановлено, що після обки комбікорму субаліном в перші два тижні кількість бактеріальних клітор Шиэ эиЫШэ, що складають основу вказаного препарату, на нестерильному кормі зищилась більш як у 2 рази і сягала 906,67+26,03 млн.м.к./г, а на стерильному бікормі залишилась на рівні початкової (510,0± 17,32 млн.м.к./г). Через 38 тижнів зігання дослідного комбікорму цей показник залишався досить високим в обох ¡антах досліду (311,0± 11,15 - 330,0±7,64 млн.м.к./г, рис.1). .

Термін зберігання комбікорму, тижні - * ♦ • - стерильний —ж— нестерильний

Рис.1. Динаміка клітин Bacillus subtilis пробіотику |

субаліну в комбікормі К-ІІІ-9 Укр при зберіганні

- і Загальна бактеріальна контамінація комбікорму для риб, який

іристовувався при виготовленні експериментальної партії з субаліном у

>бничих умовах на Дніпропетровському заводі рибних гранкормів, становила

0+0,37 тис.м.к./г, а мікроміцетна - 5,8±2,77 тис. к.у.о./г. Через 45 днів йЬго

ігання під впливом пробіотику відмічалось зменшення загальної кількості

ерій до 24,7±0,50 тис.м.к./г, тобто майже у 8 разів (на 87,4%), а чисельність

мікроміцетної флори знижувалась до 1,98+0,59 тис.к.у.о./г (на 65,9%).

Таким чином, встановлене нами тривале збереження достатньої кількості клітин пробіотику та зниження загальної контамінації відповідає одній з основних римог до профілактичного комбікорму для його ефективного використання у рибництві.

З метою розробки рекомендацій щодо температурного режиму етапу гранулювання при виготовленні профілактичного комбікорму у промислових умовах визначалась термостабільність клітин пробіотику. Встановлено, що при температурах 50, 60, 70, 85 та 100°С кількість життєздатних клітин зменшувалась на 4%, 8%, 10%, 39%, 85% відповідно. Корекцією температурного режиму на етапі гранулювання комбікорму для риб у виробничих умовах було досягнуто 100% збереження живих клітин Bacillus subtilis. .

При вивченні динаміки чисельності Bacillus subtilis у воді встановлено, що впродовж експерименту (9 діб) відбувалось їх зменшення з 7150±200 тис.м.к./мл до 1950±210 тис.м.к./мл (у 3,6 рази), але, загалом, відмічалась досить тривала наявність клітин пробіотику у водному середовищі. .

ТІким чином, внесення субаліну у комбікорм сприяло значному зменшенню кількості контамінуючої його гетеротрофної мікрофлори, при цьому високий титр мікробних клітин препарату зберігався протягом тривалого часу. Подібна закономірність спостерігалась і при внесенні субаліну у воду, що сприятиме покращенню та встановленню екологічної рівноваги водного мікробіоценозу та об'єктів аквакультури.

, 1 ' ДИНАМІКА КЛІТИН BACILLUS SUBTILIS В ОРГАНІЗМІ РИБИ

Ефективність використання препаратів на основі живих мікроорганізмів тірно дов'язана з часом їх знаходження в макроорганізмі. Оскільки відомості щодо динаміки мікробних клітин пробіотику субаліну в організмі пойкилотермних тварин у доступній нам літературі відсутні, були проведені спеціальні дослідження щодо вивчення даного питання.

У першому варіанті досліду через 48 год кількість клітин Bacillus subtilis на епітеліальній поверхні кишкового тракту риб була на рівні 2,07±0,23 тис.м.к./см2, складаючи 1,4% від загальної кількості гетеротрофних бактерій, зменшуючись через 72 год до 1,5±0,І1 тис.м.к./см2.

У другому варіанті чисельність клітин пробіотику на слизовій оболонці кишки через ^8 год після годівлі профілактичним комбікормом становила 25,33±4,97 тис.м.к./см2, або 18% від загальної кількості мікроорганізмів, зменшуючись через 72 год до 16,67±2,72 тис.м.к./см2.

У третьому варіанті чисельність клітин Bacillus subtilis через 48 год складала 77,31 ±8^42 тис.м.к./см2, або 59,5% від загальної кількості гетеротрофних бактерій, що майже в 3 рази більше, ніж у другому варіанті, та близько як у 36 разів, ніж у

ісршому. Через 72 год кількість клітин пробіотику зменшувалась до 51,33+9,82 ис.м.к./см2.

Загальна кількість гетеротрофних бактерій у хімусі та на епітеліальній оперхні кишкового тракту дослідних риб в усіх варіантах досліду була на рівні або ешо меншою від такої у контрольної групи, коливаючись у межах 41,47±2,12 -

0,83±6,39 млн.м.к./г та 129,50+14,64 - 151,6714,05 тис.м.к./см2 відповідно. Слід азначити, що значний ріст типових колоній Bacillus subtilis (21 - 54% від загальної ількості) спостерігався і у посівах слизу з поверхневих покривів дослідних риб, що відчить про наявність мікробних клітин пробіотику на поверхні тіда.

Динаміка чисельності клітин субаліну, що потрапляють у водне середовище, а епітеліальній поверхні кишкового тракту риб, вивчалась в експерименті за умови ідсутності годівлі, але з безпосереднім внесенням пробіотику у воду. Встановлено, го при 24-годинному утримуванні риб у воді з субаліном кількість клітин Bacillus ubtilis на епітеліальній поверхні кишки становила 11,67+1,67 тис. м.к./см2 за їх исельності у воді 79301400 тис.м.к./мл. Протягом наступних 3 діб експерименту ідбувалась зниження числа клітин препарату на слизовій кишкового тракту риб до ,8311,08 тис. м.к./см2 (у 2 рази), а через 5 та 9 діб - до 3,90+0,30 - 3,0+0,76 ис.м.к./см2 (у 2,9 та 3,9 рази) відповідно. Бактерії пробіотику були виявлені і у осівах з поверхневих покривів, причому їх кількість зменшувалась впродовж ксперименту та складала через 24 год - 88,7% колоній від загальної чисельності, грез 5 діб - 7,1%, а через 9 діб -5,8%.

Отже, протягом експерименту чисельність бактерій препарату на епітеліальній оверхні кишки риб зменшувалась пропорційно їх зменшенню у воді (3,9 та 3,6 рази ідповідно, див. стор.8).

На основі узагальнення результатів досліджень відмічаємо наступне:

- при годівлі риб комбікормом з субаліном спостерігається пряма залежність кількості клітин препарату на епітеліальній поверхні кишкового тракту від їх кількості у комбікормі та частоти годівлі;

- кількісний склад бактерій препарату на слизовій оболонці кишки риб

поступово знижувався, починаючи з третьої доби після годівлі профілактичним комбікормом; ,

- згодовування комбікорму з пробіотиком не впливало негативно на розвиток гетеротрофної автохтонної мікрофлори кишкового тракту дослідних риб;

- чисельність бактерій пробіотику на шкірній та епітеліальній поверхні кишкового тракту риб була прямо пропорційна їх кількості у водному середовищі. При зниженні чисельності Bacillus subtilis у воді відбувалась поступова їх елімінація з організму риб.

ВПЛИВ ПРОБІОТИКУ СУБАЛІНУ НА ОРГАНІЗМ РИБИ

При внутрічеревному введенні патогенного штаму ефективність препарату була низькою (смертність риб до 80%), як у варіанті з внесенням субаліну у водне середовище, так і без нього. При одночасному внесенні патогенних аеромонад (шт.9817) та субаліну у водне середовище загибелі риб не відмічалось, в той час як у варіанті без субаліну смертність однорічок коропа становила 40%. Даний факт пояснюється високою антагоністичною активністю бактерій препарату по відношенню до вказаного патогена (зона затримки росту - 13 мм). Це було підтверджено і у виробничих умовах при згодовуванні комбікорму з субаліном однорічкам коропа з яскраво виявленими клінічними ознаками краснухоподібного захворювання та високою смертністю (до 97%).

Таким чином, внесення пробіотику субаліну у воду з патогенними аеромонадами ефективно захищає риб від виникнення патологічних процесів, а, отже, свідчить про своєрідний контроль клітин Bacillus subtilis над чисельністю популяції бактеріального патогена.

При профілактичній годівлі дволіток коропа комбікормом з кількістю пробіотику 100 доз /т корму за час досліду (3 курси годівлі протягом вегетаційного сезону, кожний курс -10 днів за дворазової даванки корму за схемою: 1 день годівля

- 1 день перерва), кількість гемоглобіну у дослідній групі риб збільшилась на 17,6% і склала 87+3,6 г/л, в той час як у контрольних риб цей показник підвищився лише на 3,8% і становив 81+4,8 г/л. Більш значне підвищення спостерігали у показниках білку та цукру сироватки крові - кількість білку збільшилась за час досліду на 79,3% (до 52,0±3,5 г/л) проти 32,6% (до 40,3+2,3 г/л) у контрольних риб, а концентрація цукру - на 47,6% та 25% відповідно і дорівнювала 81,2+4,9 г/л та 70,0±2,2 г/л. У порівнянні з контролем кількість білку у дослідних дволіток коропа була вищою на 29,03%, а кількість цукру - на 16%. Співвідношення лейкоцитів та еритроцитів у крові дослідних риб складало в середньому 48,2 : 1000, а у контрольних - 45 : 1000, при цьому відмічалась стабільність даного показника у дослідної групи риб при збільшенні на 3% кількості гранулоцитів. Молоді еритроїдні клітини у дослідних коропів відмічались в кількості 9,8%, а у контрольних риб - 6,6% (на початку досліду вони складали 1,8 - 2,0% відповідно). Співвідношення молодих та зрілих форм еритроцитів, підвищення кількості гранулоцитів характеризує активність еритропоезу, яка за умови годівлі риби комбікормом з субаліном була вищою, ніж у контролі, що є підтвердженням активізації обмінних процесів в організмі риби, які отримували комбікорм з субаліном. Крім того, в дослідній групі риб були відсутні форменні елементи крові з деструктивними змінами - гемоліз та анізопойкилоцитоз еритроцитів, які зустрічались у риб контрольної групи. У дослідній групі відмічалось і збільшення абсолютного приросту маси риб на 22,2% проти контрольної (рис. 2).

І

квітень травень червень липень серпень вересень

І

—х—дослід --а-контроль

Рис.2. Вплив пробіотику субапіну на абсолютний приріст маси піддослідних риб

При дворазовій годівлі дволіток коропа комбікормом з субаліном в кількості

0 дбз/ 1000 кг корму протягом 10 діб за схемою 2 дні годівлі - 2 дні перерви (маса и - 31,36±2,92 г) звертає увагу помітне підвищення гематологічних показників у з дослідної групи уже після першого курсу годівлі. Так, концентрація оглобіну в досліді складала 62,5±6,06 г/л проти 55,8+2,49 г/л у контрольних риб і а більшою на 12%, кількість еритроцитів - 1,51+0,13-Ю12 проти 1,13+0,16- 10і2в 1 міст загального білку в сироватці крові - 42,2+10,4 проти 27,8±3,8 г/л (вищий на !%) та цукру - 69,2±11,4 проти 53,7±3,8 г/л (вищий на 28,9%).

У риб, яким згодовували корм з пробіотиком, відмічалось підвищення адгезії герій на лейкоцитах до 22,5% (проти 16,8% у контролі) та зростання! їх зцитарної активності до 35,7% (проти 26,3% у риб з контрольної групи, табл' 1).

Таблиця 1

іунологічні показники риб через 10 днів після годівлі комбікормом з субаліної^ ,

(1000 доз/т корму), п=15

Показники Група риб <

дослід контроль

гзія бактерій на лейкоцитах, % 22,5 16,8

зцитарна активність лейкоцитів, % 35,7 26,3

зліз еритроцитів, % 0 6

(

’ I I

Крім того, в дослідній групі риб відмічалась повна відсутність гемолізованих еритроцитів. Отримані дані є підтвердженням активізації системи імунного захисту організму, оскільки фагоцитарна активність лейкоцитів є однією з основних ланок імунітету (Лукьяненко, 1989; Иванова, 1995).

' Таким чином, використання профілактичного комбікорму з субаліном сприяє активізації обмінних процесів, збільшенню приросту маси, концентрації гемоглобіну, білку та цукру у сироватці крові дослідних риб, активізації еритропоезу, підвищенню фагоцитарної активності лейкоцитів. Підвищенню ефективності дії субаліну на організм риби сприяють збільшення його дози у комбікормі та підвищення температури навколишнього середовища.

, 1 ЗАКЛЮЧЕНИЯ

Проведені наукові дослідження дали змогу встановити високу чутливість мікрофлори, виділеної від риб, з водойм та контамінуючої комбікорми для риб, до пробіотиків біоспорину і субаліну, виявити тривале збереження клітин Bacillus subtilis, що складають основу субаліну, в експериментальному профілактичному комбікормі та водному середовищі, дослідити їх динаміку на епітеліальній поверхні кишкового тракту після, припинення годівлі. При цьому, стримуючи розвиток патогенної та умовно-патогенної мікрофлори, пробіотик не порушував рівновагу автохтонної гетеротрофної мікрофлори риб. Більш того, під впливом субаліну в організмі риб відбувається активізація обмінних процесів, еритропоезу, стимуляція і захисних сил. Вищенаведені закономірності складають біологічну основу наукового обгрунтування можливості використання в аквакультурі пробіотиків з аеробних спороут;ворюючих бактерій.

Нашими дослідженнями встановлено, що у формуванні мікробіоценозу риб не останню роль відіграють антибактеріальні захисні бар'єри кишкового тракту та шкірної поверхні риб, а також бактерії-антагоністи. У формуванні бактеріоценозу риб та захисті організму від сторонніх антигенів важливу роль відіграє с;лиз ^поверхневих покривів, який має складний біохімічний склад - білки, вуглеводи, лізоцим, антитіла, вібріолітична речовина (Лукьяненко, 1989; Кузьмина, 1995; Itami, 1993). Біохімічний склад слизу та шкіри, а отже і концентрація в них лізоциму, залежить від впливу як ендогенних, так і екзогенних факторів та може бути перспективною біоіндикаторною системою, оскільки є критерієм біохімічнного статусу1 риб, зокрема синдрома стресу, до якого більш чутливі рослиноїдні риби (Лебедева, Головкина, 1998; Месада, 1986). Нами встановлено, що у білого амура і строкатого товЬтолоба у порівнянні з коропом частота виявлення та лізоцимна активність поверхневого слизу була нижчою (38% і 15% проти 100 %; зона затримки росту 0,5-2 мм проти 2-4 мм відповідно). У ослаблених та хворих риб (виразковий дерматит, каиіоз, порушення аліментарної природи) відбувалось зниження частоти виявлення лізоцимної активності поверхневого слизу до 50 - 69%. Отримані нами

сіулі.тати узгоджуються з вищенаведеними літературними посиланнями.

Визначено, що у формуванні мікробного ценозу риб приймають участь актерії-антагоністи, які пригнічували розвиток як умовно-патогенних бактерій Escherichia coli та Candida albicans, так і Micrococcus lysodeicticus. За біологічними дастивостями вони віднесені до роду Pseudomonas (виділені зі шкіри та зябер арася, щуки і білого амура) та Bacillus (з кишкового тракту коропа). Бактерії роду lacillus з яскраво виявленими антагоністичними властивостями були виділені і з ишкового тракту клінічно здорового канального сома (Вовк, 1995). Це ще раз ідтверджує роль бактерій-антагоністів у формуванні мікробіоценозу риб та агальновідомі положення про високу антагоністичну активність представників роду lacillus (Смирнов и др., 1983; Харченко и др., 1993).

Враховуючи отримані нами результата та дані літератури про безперечну роль ормальної мікрофлори риб для захисту від бактеріальних патогенів, попередження атологічних процесів та збереження імуно-фізіологічного статусу організму, а акож несприятливий вплив антибіотиків та інших терапевтичних препаратів на його ікроекологічну систему, назріла необхідність принципово змінити стратегію ідбору методів та заходів для корекції порушень мікробіоценозу не тільки їплокровних, що успішно здійснюється, а й пойкилотермних тварин (Мишурнова, ?93). В цьому зв'язку, найбільш ефективними екологічно безпечними препаратами, іо відповідають сучасним вимогам, є пробіотики.

Значна мікозна і бактеріальна контамінація комбікормів може викликати їх гування, і, як наслідок, розвиток аліментарних патологій у риб (Валова, 1995; Вовк, ?95). Як показали наші дослідження, внесення вказаних препаратів у комбікорм, здне середовище сприяло покращенню їх мікробіологічних характеристик, эпереджувало розвиток експериментальної бактеріальної інфекції. Слід відмітити, ,о при зберіганні протягом 45 днів у профілактичному комбікормі з субаліном дбувається зменшення загальної кількості бактерій на 87,4%, а чисельний склад ікроміцетної флори знижується на 65,9%. Поряд з цим, титр мікробних клітин acillus subtilis субаліну залишався досить високим протягом тривалого часу іерігання. Встановлено, що чисельність Bacillus subtilis на епітеліальній поверхні шіки була найбільшою (51,33 - 77,31 тис.м.к./см2) при дворазовій годівлі риб :спериментальним комбікормом з субаліном в кількості 1000 доз/1 т корму тотягом двох днів.

Наявність пробіотику у водному середовищі, де вирощувалась риба, сприятиме :тановленню екологічної стабільності водного мікробіоценозу та об'єктів :вакультури, а отже, позитивно впливатиме і на епізоотичну ситуацію у водоймах, г було підтверджено у модельних дослідах на однорічках коропа. Так, одночасне іесення у воду патогенних аеромонад та субаліну попереджувало розвиток .ктеріальної інфекції у дослідних риб.

Заданими авторів препарату (Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова І.Б. та ін.,

1995) кількість бактерій Bacillus subtilis в 1 дозі пробіотику не повинна бути меншою 1 млрд. клітин. Верхня межа даного показника може збільшуватись до

5 млрд. клітин. Враховуючи даний факт, при підвищенні титру клітин у препараті кількість пробіотику у профілактичному комбікормі необхідно зменшувати. Зокрема, при підвищенні кількості активних клітин в 1 дозі препарату до 5 млрд. на 1 т профілактичного комбікорму необхідно зменшити дозу пробіотику з 1000 до 200, а при середньому значенні титру 2,5 млрд.м.к./дозу - до 400 доз.

Оскільки зниження кількості клітин препарату в організмі риб відбувається на третю добу після припинення їх годівлі профілактичним комбікормом, для раціонального його використання годівлю риб рекомендується нами проводити за схемою: дворазова годівля протягом 2 днів з послідуючими 2 днями перерви.

Використання нових екологічно безпечних препаратів на основі живих бактерій передбачає їх мінімальний вплив на стан автохтонної мікрофлори макроорганізму. Нами встановлено, що згодовування комбікорму з субаліном, дещо зменшуючи чисельність, не порушувало її рівновагу в організмі дослідних риб. Досить важливо, що згодовування профілактичного комбікорму з субаліном сприяло активізації обмінних процесів, наростанню маси риби (на 22,2%), стабілізації та покращенню характеристик крові - збільшенню концентрації гемоглобіну (на 17,6%), білку (на 79,3%) та цукру (на 47,6%), підвищенню загальної резистентності організму риб.

Результати наших досліджень узгоджуються з даними, отриманими при застосуванні пробіотиків на основі спорових бактерій у ветеринарній практиці теплокровних тварин (Шуст, 1990, 1991; Поліщук, 1995; Jenny et al., 1991).

Таким чином, враховуючи взаємовідношення гетеротрофної мікрофлори риб, комбікормів та водного середовища з бактеріями Bacillus subtilis, що складають основу пробіотиків з бацил, та механізми дії вказаних препаратів, їх використання в аквакультурі сприятиме активації неспецифічних факторів імунного захисту, пригніченню умовно-патогенної та патогенної мікрофлори, нормалізації мікробіоценозу риб. Крім того, попередження контамінації комбікормів субаліном запобігатиме їх псуванню та сприятиме профілактиці хвороб риб аліментарної природи, а потрапляння препарату у воду впливатиме на збереження екологічної стабільності водного мікробіоценозу і об'єктів аквакультури.

ВИСНОВКИ

1. У формуванні мікробного ценозу риб важливу роль відіграють антибактеріальні захисні бар'єри кишкового тракту, лізоцим слизу шкірної поверхні, активність яких визначається загальним фізіологічним та імунологічним статусом риб, та бактерії-антагон істи,

2. Пробіотики на основі спорових бактерій Bacillus subtilis біоспорин та субалін виявляють високу активність до патогенної та умовно-патогенної мікрофлори,

виділеної від риб, водного середовища та з гранульованих комбікормів для риб.

. Більш активним виявився препарат субалін, до якого були чутливими 53% ДНК-азопозитивних патогенних та умовно-патогенних бактерій, виділених від хворих риб, в той час як до біоспорину - 25%.

. При виготовленні і тривалому зберіганні профілактичного комбікорму титр мікробних клітин препарату субаліну залишався на високому рівні, при цьому бактеріальна та мікозна контамінація комбікормів для риб знижувалась на 87,4% та 65,9% відповідно, що запобігатиме їх псуванню і сприятиме профілактиці хвороб риб аліментарної природи.

. При годівлі риб комбікормом з субаліном кількість клітин препарату на епітеліальній поверхні кишкового тракту дослідних риб знаходилась у межах 2,07+0,23 - 77,31 ±8,42 тис.м.к./см2 і залежала від кількості препарату у водному середовищі, профілактичному комбікормі та частоти годівлі риб.

. Згодовування комбікорму з пробіотиком, потрапляння бактерій препарату у воду дещо знижувало кількість гетеротрофної автохтонної мікрофлори дослідних риб, але в загальному не впливало на її рівновагу.

. Тривале зберігання клітин Bacillus subtilis при внесенні субаліну у воду попереджує виникнення експериментальної бактеріальної інфекції у дослідних риб та впливатиме на збереження екологічної стабільності водного мікробіоцснозу і об'єктів аквакультури.

. Використання профілактичного комбікорму з субаліном сприяє активізації обмінних процесів, еритропоезу, підвищенню приросту маси, загальної резистентності організму риби.

. Ефективність дії субаліну на організм риби залежить від його дози у комбікормі та температури навколишнього середовища.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ При виготовленні в промислових умовах профілактичного комбікорму з субаліном для збереження максимального числа життєздатних клітин пробіотику необхідно суворо контролювати температурний режим та титри бактерій препарату. Оптимальна кількість субаліну у профілактичному комбікормі для риб повинна визначатися чисельністю живих мікробних клітин Bacillus subtilis в 1 дозі препарату. За їх кількості 1 млрд./дозу для виготовлення 1 т профілактичного комбікорму потрібно внести не менше 100 доз. Оптимальна доза, розрахована по кількості активних бактерій, що потрапляють в організм риб, знаходиться у межах 200 - 400 доз на 1 тонну комбікорму.

Пробіотик субалін рекомендується для попередження контамінації комбікорму для риб патогенною та умовно-патогенною мікрофлорою та його псування, що сприятиме профілактиці хвороб риб аліментарної природи.

Профілактичний комбікорм з субаліном рекомендується використовувати для

активізації процесів обміну, гемопоезу, підвищення загальної резистентності організму риб, профілактики інфекційних хвороб риб, для збереження екологічної стабільності водного мікробіоценозу і об'єктів аквакультури в умовах антропогенного впливу.

5. Для збільшення ефективності профілактичної годівлі при сталих економічних витратах пропонується згодовування комбікорму з субаліном проводити за схемою: дворазова годівля протягом 2 днів - 2 дні перерви при курсі годівлі 10-20 днів у весняний, літній та осінній періоди за температури не нижче 16°С.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ КРИВОРУЧКО (МЕЛЬНИК) О.М.

1. Вовк Н.І., Мельник О.М. Еколого-фізіологічні аспекти формування мікрофлори кишкового тракту риб //Тези доповідей 2-го з'їзду гідроекологічного товариства України. - Київ, 1997.- т.2. - С.37-38.

2. Мельник О.М. Вплив екологічних факторів на бактеріальну флору риб //Таврійський науковий вісник. - Херсон, 1998. - В.7. - С.226-230.

3. Вовк Н.І., Сидоров М.А., Мельник О.М До проблеми якості та санітарії комбікормів, що використовуються в рибництві //Наук, вісник Нац. агр. універс. -Київ, 1998.-№ 12. - С. 122-124.

4. Вовк Н.І., Сорокулова І.Б., Сидоров М.А., Мельник О.М. До питання використання пробіотиків на основі спорових бактерій B.subtilis у рибництві //Рибне господарство. - 1999. -Вип. 49-50. - С. 171-176.

5. Литвинова Т.Г., Вовк Н.1., Стецюк З.О., Архангельський Є.Ю., Мельник О.М. Комулятивний токсикоз старших вікових груп коропа //Рибне господарство. -1999. - Вип. 52-53. - С.140-144.

6. Криворучко О.М. Динаміка автохтонної мікрофлори та клітин B.subtilis пробіотику субаліну на епітеліальній поверхні кишкового тракту риб при годівлі профілактичним комбікормом з препаратом //Рибне господарство. - 1999. - Вип. 54. - С.103-108.

7. Vovk N.I., Sorokulova І.В., Mel’nyk O.M., Sergiychuk T.M. Use the probiotics on the base of Bacillus subtilis in fishery //Book of abstracts Ninth international conference, «Diseases of fish and shellfish» Rhodos, Greece, September 1999. - P.247.

8. Mel’nyk O.M., Vovk N.I. Comparative characteristics of some immunic and bacteriological indices of fish both clinically healthy and weakly //Book of abstracts Ninth international conference, «Diseases of fish and shellfish» Rhodos, Greece, September 1999. - P.289.

9. Криворучко O.M., Перепелиця O.O., Яновська Г.M. Гематологічні показники дволіток коропа при годівлі профілактичним комбікормом з субаліном //Міжн. конф. молодих вчених "Водні біоресурси та шляхи їх сталого використання». Тези допов. - K., 2000. - С. 82-83.

АНОТАЦІЯ

’ИВОРУЧКО О.М. Вплив пробіотиків на гетеротрофну мікрофлору та організм би у прісноводній аквакультурі. Дисертація на здобуття наукового ступеня ндидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 06.02.03 - рибництво, ггитут рибного господарства УААН, Київ, 2000. •

Робота присвячена вивченню можливості застосування пробіотиків на основі зобних спороутворюючих бактерій роду Bacillus в рибництві для попередження нтамінації гранульованих комбікормів для риб патогенною та умовно-патогенною срофлорою, розвитку захворювань риб бактеріальної та аліментарної природи і івищення імуно-фізіологічного статусу риб. Проведеними дослідженнями їедено, що бактеріальні патогени, виділені від риб та з комбікорму, як і громіцетна флора, були чутливими до субаліну. Встановлено, що внесення іаліну в комбікорм ефективно захищає його від розвитку умовно-патогенної рофлори, при цьому титр клітин препарату залишається на високому рівні >тягом тривалого часу. Показано, що згодовування рибі профілактичного ібікорму з субаліном сприяє активізації обмінних процесів та неспецифічної норезистентності організму. Виробництву надані рекомендації з використання 'біотику субаліну в рибництві.

Ключові слова: пробіотики, субалін, мікрофлора, риба, комбікорм, про-актика.

і

АННОТАЦИЯ

1ВОРУЧКО E.H. Влияние пробиотиков на гетеротрофную микрофлору и органі рыб в пресноводной аквакультуре. Диссертация на соискание ученой степени дидата сельскохозяйственных наук по специальности 06.02.03 - рыбоводство, титут рыбного хозяйства УААН, Киев, 2000.

Работа посвящена изучению возможности применения пробиотиков на основе ібньїх спорообразующих бактерий рода Bacillus в рыбоводстве для (отвращения контаминации гранулированных комбикормов для рыб патогенной лгавнопатогенной микрофлорой, предупреждения развития заболеваний рыб ериальной и алиментарной природы и повышения иммуно-физиологического уса рыб.

Проведенные исследования показали, что в формировании микробиоценоза не последнюю роль играют антибактериальные защитные барьеры кишечного га и кожной поверхности рыб, а также бактерии-антагонисты, которые были лены от рыб, выращиваемых в рыбных хозяйствах и выловленных из хранилищ. По литературным данным, биохимический состав слизи и кожи, а эвательно, и концентрация в них лизоцима, зависит от влияния как эндогенных, и экзогенных факторов, и может быть перспективной биоиндикаторной :мой, так как является критерием биохимического статуса рыб, в частности,

і

синдрома стресса, к которому более чувствительны растительноядные рыбы. HaMi показано, что частота встречаемости и лизоцимная активность поверхностной слиз!

1 белого амура и пестрого толстолобика в сравнении с карпом, равно как и ; ослабленных и, больных рыб (язвенный дерматит, кавиоз, нарушения алиментарно! природы), была ниже.

Доказано, что бактериальные патогены, выделенные от рыб и из комбикормг как и микромицетная флора, чувствительны к субалину. В частности, 53% штаммо бактерий, выделенных от больных рыб, были чувствительными к субалину, тогда ка] к биоспорину - 25%, а'количество нечувствительных штаммов составляло 5°/ (против 58% к биоспорину). Чувствительность к субалину выявляли 100% штаммо] микромицетов (против 62,5% к биоспорину).

Установлено, что внесение субалина в комбикорм эффективно защищает его о' развития условно-патогенной микрофлоры. Так, при хранении профилактической комбикорма на протяжении 45 дней общее количество бактерий уменьшалось hi 87,4%, а количественный состав микромицетной флоры снижался на 65,9%. Вместе i тем, титр микробных клеток Bacillus subtilis субалина оставался на высоком уровн! на протяжении длительного времени хранения профилактического комбикорма.

1 При внесении пробиотика в воду клетки Bacillus subtilis равномерно рас пределялись в ее толще и сохранялись на протяжении длительного периода. 'Од (новременное внесение субалина и патогенных аэромонад в воду эффективнс предупреждало развитие экспериментальной бактериальной инфекции, чего hi наблюдалось при внутрибрюшинном введении бактериального патогена. Это дае-основание предположить, что наявность бактерий Bacillus subtilis в водной сред| будет благоприятствовать установлению экологического равновесия водногс I микробиоценоза и объектов аквакультуры.

При скармливании рыбе профилактического комбикорма с препаратом i внесении пробиотика в воду, клетки Bacillus subtilis были выявлены как на поверх ности тела, так и на слизистой оболочке кишечного тракта рыб. При этом отмечалаа прямая зависимость их количества в организме рыб от таковой в комбикорме водной среде и частоты кормления рыб. Установлено, что численность Bacillus subtilis на эпителиальной поверхности кишечника была наибольшей при двуразово»/ кормлении рыб экспериментальным комбикормом с субалином в количестве 100С доз/1 т корму на протяжении двух дней. Значительный рост типичных колони? Bacillus subtilis в посевах слизи с кожных покровов опытных рыб свидетельствует с

1 наявНости микробных клеток пробиотика на поверхности тела, а, следовательно, у

об их влиянии на микробиоценоз кожи. Скармливание комбикорма с субалином несколько снижая численность автохтонной гетеротрофной микрофлоры, ш нарушало её равновесие в организме опытных рыб.

учитывая то> что снижение количества клеток препарата на эпителиальной поверхности кишечника происходило на третьи сутки после прекращения кормление

эфилактическим комбикормом, для экономичного и рационального его юльзования кормление рыб рекомендуется проводить по схеме: двуразовое змление на протяжении двух дней с последующим двухдневным перерывом.

Показано, что скармливание рыбам профилактического, комбикорма с Залином способствует активизации обменных процессов и неспецифической мунорезистентности их организма. Так, у опытных рыб наблюдалось более iHHTenbHoe, по сравнению с контролем, повышение концентрации гемоглобина, пка и сахара в сыворотке крови, увеличение абсолютного прироста массы, гивизация эритропоэза и системы иммунной защиты. Увеличение дозы обиотика вызывало более активный отклик гематологической и имму-логической систем организма подопытных рыб. Производству даны рекомендации использованию пробиотика субалина в рыбоводстве.

Ключевые слова: пробиотики, субалин, микрофлора, рыба, комбикорм,

офилактика.

SUMMARY

vYVORUCHKO E.N. The probiotic influence on the heterotrophic microflora and fish >anism in freshwater aquaculture.

esis for the Candidate of Sciences in Agricultural Degree (equivalent Ph.D.) in sciality 06.02.03 - Fisheries. Institute for Fisheries of the Ukrainian Academy of ;ricultura! Sciences (UAAS), Kyiv, 2000.

The work is dedicated to study possibility of using probiotics on the basis of ^reforming bacteria of the Bacillus genus in fisheries for prevention contamination of inulated fish mixed fodder by pathogenous and conditionally-pathogenous microflora, ;vention development of fish diseases of bacterial and alimentary nature, increasing the munophysiological status of fishes. Results of researches proved, that bacterial thogenes, as well as micromycetes, allocated from fishes and from mixed fodder are isitive to subalin. It was also proved that the entering of subalin to mixed fodder 'ectively protects it from development of the conditionally-pathogenous microflora, thus ; titre of preparation cclls remains on high level during long time. It is shown, that sding fish with preventive mixed fodder with subalin included promotes activization of :tabo!ic processes and unspecific immunic resistance of fish organisms. The practical jommendations on the probiotic subalin use in fisheries are developed.

Key words: probiotics, subalin, microflora, fish, mixed fodder, preventive lintenance.