Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние препарата "милдронат" на активность лизосомальных ферментов и некоторые другие биохимические показатели в миокарде и головном мозге белых крыс-самцов в условиях острой и хронической гипоксической гипоксии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние препарата "милдронат" на активность лизосомальных ферментов и некоторые другие биохимические показатели в миокарде и головном мозге белых крыс-самцов в условиях острой и хронической гипоксической гипоксии"

РГЬ 11« , . л

МИНЙС^М^ТВОЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РЯЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА И.П.ПАВЛОВА

На правах рукописи УДК; 616.127+616.831 ]-001.8-008.9-085.27

БЕЛЯЕВ Александр Викторович

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА «МИЛДРОНАТ» НА АКТИВНОСТЬ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ И НЕКОТОРЫЕ ДРУГИЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ В МИОКАРДЕ И ГОЛОВНОМ МОЗГЕ БЕЛЫХ КРЫС-САМЦОВ В УСЛОВИЯХ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ.

03.00.01 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Рязань - 1999

Работа выполнена в Рязанском государственном медицинском университете имени академика И.П.Павлова

Научный руководитель -

заслуженный деятель пауки РФ, доктор медицинских паук, профессор В.Г.МАКАРОВА Научный консультант -

кандидат медицинских наук, доцент Л. Г. Чугунова Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор В.П.Пчелинцев

- кандидат медищшскнх паук, Р.А.Лиферов

Ведущая организация

Ярославская государственная медицинская академия

Защита состоится "_"_ 1999 года в "_" часов

на заседании Диссертационного Совета Д 084.67.02. при Рязанском государственном медицинском университете нмепн академика И.П.Павлова ( 391000, РФ, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Рязанского государственного медицинского университета ( 391000, РФ, г.Рязань, ул. Шевченко, д. 34 )

Автореферат разослан "_"_ 1999 года.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

кандидат биологических наук Е.А. Рязанова

ЭСУДЛРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

С] ЯСУ-С/,-общая характеристика работы

Актуальность темы. Повышение жизнеспособности миокарда и головного мозга в условиях патологии является одной из наиболее актуальных задач современной медицины.

Наиболее универсальными механизмами повреждения, лежащими в основе клинических проявлений самых грозных заболеваний жизненно важных органов, являются гипоксия (острая и хроническая) и дистрофия.

Для прояснения механизмов адаптации к гипоксии и дистрофии крайне актуальным является исследование биохимических процессов, происходящих в клетке, и изучение возможностей влияния на них различных лекарственных средств. Современные достижения в области исследования сущности обменных реакций на молекулярном уровне и возможностей их коррекции в условиях патологии определяют все нарастающий лнтерес к практическому использованию средств — регуляторов метаболизма. На современном этапе все больше исследований как клиницистов, так и патобиохимиков эволюционирует в сторону признания необходимости развития теоретических основ и прикладных аспектов метаболической. терапии, поэтому современная медицина вступает на новый, принципиально важный этап своего развития - период систематического исследования возможностей применения средств метаболической коррекции.

Особое место в этих исследованиях в последнее вре.мя занимают работы, посвященные направленной регуляция внутриклеточного уровня свободных жирных кислот, в частности, ингибиторам (3-окисления.

Углубленное изучение эффектов представителя данной группы лекарственных средств - милдроната при гипоксии и катехоламиповой мпокардиодист-рофпи является весьма актуальным, поскольку до сих пор остается неясным вопрос о первичных механизмах протективного действия препарата.

При этом, в частности, необходимость изучения роли лизосомальных ферментов п процессов перекисного окисления липидов в механизме действия милдроната определяется современными представлениями об их резко повреждающем действии на клетки миокарда и головного мозга в условиях патологии.

Целью исследования явилось изучение динамики активности лизосомальных ферментов, ферментов пентозофосфатного цикла и показателей актпв-пости перекисного окисления в связи с назначением милдроната на фоне острой и хронической гипоксической гипоксии и изадриновой миокардподпстро-фии.

Задачи исследования:

1. Исследовать дпнамнку ряда параметров катаболической активности миокарда и головного мозга при назначении милдроната: неседимептируемую, седиментируемую, общую активность и коэффициент лабильности кислой фос-фатазы, р-галактозидазы и катепснна Э.

2. Исследовать дпнамнку скорости спонтанного и ппдуцированпого ПОЛ; неферментного п ферментного типов перекисного окисления липидов в миокарде п головном мозге прп назначении милдроната: образование малонового дпальдегада, аскорбат-зависимого ПОЛ и НАДФ-зависимого ПОЛ.

3. Исследовать динамику показателей активности ключевых ферментов пентозофосфатного цикла в миокарде и головном мозге при назначении милдроната: активность 6-фосфо-глюконат-дегидрогеназы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы.

Научная новизна исследопания. В работе впервые дана характеристика динамики функциональной активности лизосомального аппарата млокарда и головного мозга при назначении милдроната в условиях действия на организм

высотной барокамерной гипоксии и при пзадриновой мпокардиодистроф] При этом установлено протективное влияние милдроната па мембранный ли; сомальный аппарат, проявившееся в снижении коэффициента лабильности ограничении неседиментируемой активности кислых шдролаз.

Уточнено влияние высотной гипоксической гипоксии на динамику акп ности лизосомальных ферментов миокарда.

Выявлена способность милдроната ограничивать скорость индуцирован) го, неферментного и ферментного типов перекисного окисления лииидов, 1 может быть использовано для повышения жизнеспособности и ограничев процесса повреждения миокарда и головного мозга.

Впервые проведено исследование влияния милдроната на пентозофосф ный путь прямого окисления углеводов в условиях дефицита кислорода и ка холаминового повреждения миокарда. При этом установлена способность ми. ропата повышать активность ключевых ферментов пентозного цикла у инта ных крыс и ограничивать снижение активности этих ферментов в услов1 экспериментальной патологии.

Практическая значимость. Полученные результаты дают представлени характере и направленности влияния ингибитора р-окисления милдроната сдвига активности лизосомальных ферментов миокарда и головного мозга т воздействии острой гапоксической гипоксии, адаптации организма к преры стому действию интенсивной высотной гипоксии, изадриновой миокардиоди рофии и о связи этих сдвигов с изменениями углеводного и липидного обм в данных условиях.

Работа углубляет существующие представления о механизмах измепе1 метаболической активности жизненно важных органов в процессе адаптаци] дефициту кислорода и катехоламиновому повреждению. В целях коррекг биохимических изменений при гипоксическом и катехоламиповом повреж нии предлагается использовать милдропат, имея в виду выявленную спос ность препарата ограничивать процесс тканевого повреждения за счет ста лизирующего влияния на лизосомальный аппарат клеток.

Результаты исследования внедрены в учебный процесс и использую при чтении лекций и проведении практических занятий по биохимии в тобпохимиы, фармакологии и фармакотерапии на кафедрах биологи чсско. биоорганической химии с курсом клинической лабораторпой диагностик] фармакологии с курсом фармакотерапии ФПДО Рязанского государствен го медицинского университета имени академика И.П.Павлова.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы ли представлены на IV Российском национальном конгрессе «Человек н карство» (1997) и на межкафедральнои научной конференции РязГМУ и ни академика И.П.Павлова (1998).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 178 с: ницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, о сания материалов и методов исследования, изложения результатов собстг ных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указ: ля, включающего 137 источников отечественной и 41 источник нностран литературы. Диссертация иллюстрирована 32 таблицами и 17 рисунками. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были проведены на 108 белых беспородных крьи самцах массой 200-240 г. Всего проведено 18 серий экспериментов.

Острую гппокспческую гипоксию моделировали однократной экспозицией животных в приточно-вытяжпой барокамере с остаточным давлением, соответствующим высоте 8000 м в течение 6 часов (В.Г.Макарова, 1987).

В режиме хронической гипоксии животных подвергали барокамерной тренировке с постепенным подъемом до высоты 6000 м по 6 часов в сутки в течение 13 дней. На 14-й день вызывали декомпенсацию содержанием животных на высоте 8000 м в течение 6 часов (В.Г.Макарова, 1987).

Некротизирующая мпокардиоднстрофпя вызывалась подкожным введением 1% раствора изопреналина (изадрин) в дозе 120 мг/кг веса животного за 24 часа до забоя (Строев Е.А. и др., 1988, Кременецкая Т.В., 1994).

Милдронат вводился в виде 10% раствора в суточных дозах 50 мг/кг веса животного и 100 мг/кг веса животного внутрпбрюпшнно, курсами по 7 и 14 дней (Тёмная Е.В., 1990, Бодарецкая О.И., 1991). Контрольные животные получали инъекции изотонического раствора NaCl.

Животных забивали под легким эфирным наркозом путем декапитации. Немедленно выделенные органы промывались холодным 0,15 М раствором КС1, а затем высушивались на фильтровальной бумаге. На торсионных весах типа ВТ-500 производилось взвешивание миокарда желудочков и головного мозга, после чего они подвергались гомогепизации в соотношении 1/10 с холодным раствором 0,15 М КС1 в стеклянном гомогенезаторе типа Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком.

Головной мозг гомогенизировали в течении 30 секунд при 1000 оборотах в мипуту и выполнении 9 поступательных движении, миокард гомогенизировали 60 секунд при 1500 оборотах в минуту и выполнении 20 поступательпых движений.

Полученный гомогенат центрифугировали дважды: 10 минут при 1500 g (на центрифуге ЦЛР-1) и 30 минут при 20000 g (на центрифуге К-24). Оппсап-пые процедуры проводились на холоду (не выше 4°С).

Конечный супернатант (цитозольная фракция с примесью легких микро-сом) использовали для определения песедпментируемой активности (НА) лизо-сомальных ферментов. Осадок, полученный при втором центрифугировании, и представляющий собой грубую фракцию лизосом, ресуспепдпровали в 0,15 М КС1 с добавлением 0,1% трптопа Х-100, в объеме, равном трем первоначальным массам органа и оставляли в таком состоянии на 1 час до полной солюбилиза-ции ферментов. Затем в иолученпом растворе определяли седиментируеадую активность (СА) ферментов лизосом. Таким образом, активность лизосомальпых ферментов определяли в 2 фракциях, как НА п СА. Кроме того, рассчитывали величину общей активности (OA) как простую арифметическую сумму СА и НА. Дополнительно, для каждого фермента, определялось отношение НА/ОА, представляющее собой так называемый коэффициент лабильности (КЛ) лизо-сомальной мембраны, который характеризует степень ее проницаемости для отдельных гидролаз и косвенно указывает на относительное распределение данного фермепта между первичными и вторичными лпзосомами (Винокурова Е.Н., 1998).

Активность катепсипа D определяли методом Ансона по скорости образования свободного тирозипа и ТХУ-растворнмых пептидов при гидролизе денатурированного мочевиной при 60°С бычьего гемоглобина (Строев Е.А., Макарова В.Г., 1986; Пляхин И.В., 1996). Активность катепсина D выражали в мкмоль тирозипа/мг белка*час.

Определение активности ß-галактозидазы проводилось по методу А.А.Покровского (Романов Б.К., 1994), основанному на снектрофотометриче-ском определении 4-нитрофепола. Активность ß-галактозидазы выражали в нмоль 4-нитрофенола/ мг белка*мип.

Определение активности кистой фосфатазы проводилось спектрофото-метрически по методу Боданского (Пляхпн И.В., 1996). Актпвпостъ кислой фосфатазы выражали в мкг фосфора/мг белка*мин.

Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-ФГДГ) определяли в супернатанте, используемом для определения НА ферментов лизосом, по методу Koniberg в модификации Bergmeyer (Пляхин И.В.,1996).

Активность 6-ФГДГ и Г-6-ФДГ, а также суммарную (общую) их активность выражали в нмоль НАДФ*Н/мг белка*мип.

Определение содержания малонового диальдешда (МДА) в тканях и степень активации ферментативио-зависимого перекисного окисления лшхидо! (ПОЛ) и неферментатпБНо-зависпмого ПОЛ проводилось по методике, опасна-нон И.Д. Стальной, Т.Г. Гарингвили, 1972. Количество МДА выражали в нмол! МДА /гр. ткани. Активность ферментативно-зависимого ПОЛ и нефермента-тивно-зависимого ПОЛ оценивали в пмоль МДА/ гр.ткани*мин.

Содержание белка в гомогепате определяли микробиуретовым мстодол (Строев Е.А., Макарова В.Г., 1986).

Статистическую обработку результатов проводили в Microsoft® Office Professional для Windows®95 при помощи статистических функций таблпчногс процессора Microsoft Excel методами вариационной статистики с использовали ем t-крнтерия Стьюдента. При оценке достоверности в группах эксперимен тальной патологии в условиях назначения милдроната сравнение проводил! дважды: с группами коптроля соответствующей модели и с группой биоконтро ля. Вероятность большую 0,95 в обоих случаях считали достаточной для вывод; о достоверности различий между вариационными рядами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние милдроната на метаболизм миокарда и головного мозга итакт пых крыс. Полученные в наших исследованиях данные свидетельствуют прежде всего о первоочередной и значительной активации углеводных путей обмена ; интактпых животных на фойе применения милдроната, что согласуется с дан ными других исследований, и по-видимому, является общим свойством всех из вестных ингибиторов ß-окисления (Шутенко Ж.В., 1988, 1991).

На сегодняшний день наиболее вероятен следующий механизм данног явления: подавление окисления жирных кислот в ß-положении в цикле Кнооп - Линена приводит к развитию относительного дефицита внутримитохондри ального ацетил-КоА. Это обусловливает снижение содержания цитрата в ре зультате уменьшения его конденсации из оксалоацетата и ацетил-КоА.

Поскольку цитрат является естественным ингибитором ключевого фер мента гликолиза - фосфофруктокиназы, то происходит активация гликолиза н уровне фосфофруктокиназнои реакции. Это приводит к смещению редокс потенциала в сторону восстановленных форм, что и является причиной актив; ции NADP*H зависимых процессов, таких как микросомальпого окпслепш синтеза белка, холестерина и его производных, жирных кислот, структурных резервных липидов.

Применение милдроната у интакгных животных в наших исследования вызывало избирательную активацию глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в ткал

головного мозга при назначении его кратчайшим курсом в минимальной из применяемых доз, в то время как активность 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы оставалась сопоставимой с контролем во всех сериях. В миокарде не отмечалось подобной избирательности в эффекте милдроната - при его назначении (также уже в минимальной дозе) достоверно повышалась общая активность ферментов пентозного цикла.

Менее выраженной оказалась в наших исследованиях способность милдроната влиять па состояние перекисного окисления липидов интактных крыс. Только при назначении препарата 14-дневпым курсом происходило в целом равновыраженпое снижение скорости спонтанного ПОЛ, посившее специфичный для каждого из исследуемых органов характер. В миокарде при назначении милдроната торможение спонтанного ПОЛ проявлялось уменьшалось содержание малонового диальдегида, а в головном мозге отмечалось торможение неферментного аскорбат-зависимого ПОЛ.

Способность вызывать описанные изменения может быть отнесена к позитивным свойствам препарата, поскольку пеферментное ПОЛ носит более деструктивный характер, чем ферментное ПОЛ, и его ограничение при применении милдроната у интактных животных делает перспективным оценку проявления этого же эффекта (защиты клеточных мембран от свободнорадикальной деградации) в условиях патологии.

Кроме того, по мнению Н.В.Литвиненко (1992), ферментное ПОЛ - это первичный процесс, чрезмерная активация которого индуцирует развитие более деструктивного пеферментного ПОЛ.

Видимо, милдронат действует именно на этом уровне, что в условиях патологии будет предотвращать переход ферментного переокисления в неферментное.

Это может быть связано с повышением под влиянием милдроната внутриклеточной концентрации молекул, способных по мнению Т.В.Якимовой (1990), принять на себя часть свободных радикалов - иолпненасыщенных жирных кислот (в том числе и тех, что будут синтезированы в больших количествах при активации милдронатом работы пентозного цикла), и таких ионогенных соединений, как у-бутиробетаин, синтез которого также напрямую активируется милдронатом (Шутенко Ж.В. и др., 1988, 1991). Отмеченные у милдроната потенциальные антиокспдаптпые свойства подтверждаются также достоверным снижением в миокарде на фоне его применения содержания одного из продуктов переокислення жпрпых кислот - малонового диальдегида.

Милдронат в наших исследованиях не вызывал достоверных изменений показателей функциональной активности лизосомальных ферментов у иптакт-ных животных.

Таким образом, проведепие экспериментов по введению милдроната пн-тактпым крысам позволяет сделать заключение о первичности активирующего влияния препарата на активность ключевых ферментов пентозофосфатпого цикла, с последующим ограничением процессов перекисного окисления липидов в миокарде и головном мозге, что может стать основанием для оценки фар-мако-биохимических механизмов действия милдроната при различных патологических состояниях.

Влияние милдроната на метаболизм миокарда и головного мозга крыс при острой гипоксической гипоксии. Резкое усиление катаболической активности лизосомального аппарата миокарда и головного мозга при острой гипоксии, сопровождающееся достоверным увеличением неседиментируемой активности и коэффициентов лабильности всех изучаемых кислых гидролаз с одновременной

тенденцией к снижению седиментируемой активности, полученное па наше модели острой гипоксии, не противоречит данным других авторов (Макаро! В.Г., 1987; Молчанова JI.B. и др., 1994; Романов Б.К, 1994, Винокурова Е.Е 1998), выявивших лабплизирующее влияние интенсивной гипоксии па лизос« малыше ферменты в тканях сердца, мозга и печени. Происходит перераспред ление ферментов лизосом между осаждаемой и неосаждаемой фракциями тк; невого гомогената, что является результатом лабилизации мембран и освобоя дения гидролаз из лизосом (Knop et al., 1993).

Значительное возрастание неседиментируемой активности и коэффицие] тов лабильности лизосомальных ферментов — кислой фосфатазы, ß-галакт зпдазы и катепсина D, и отсутствие избирательности в изменении активное! ферментов с различной субстратной специфичностью - это ранний и чувств] тельиый признак нарушения стабильности лизосом, свидетельствующий о ра рыве лизосомальных мембран и выходе гидролаз в цитозоль и кровь (Паш JI.E., Маянская. H.H., 1987; Корнеев A.A. и др., 1993; Rao et al., 1994), где ou оказывают повреждающее действие на окружающие ткани. Активация лизос с прп гипоксии приводит к снижению сократительной способности миокарда результате ферментативной деструкции сократительных элементов; происходи альтерация кардпомиоцитов: уменьшается количество митохондрий, поврежд ются мпофибриллы (Панченко Г.А., 1987). Деструкцией нервных клеток и м жуточного вещества сопровождается гиперактивация лизосомального аппарата ткани головного мозга (Поборский А.Н., 1991; Крапивин C.B. и др., 1993; Tiu кин B.C. и др., 1994)

Таким образом, в развитии метаболических нарушений, имеющих мес прп острой гипоксии миокарда, важная роль принадлежит лизосомальным фе ментам, которые способствуют переходу обратимых изменений в необратимые, в дальнейшем принимают участие в ремоделировапип пекротизированщ структур-

Острая гипоксическая гипоксия в нашем исследовании приводила к в) ражепному угнетению активности фермептов нентозофосфатного цикла (болы в головном мозге). Наблюдалось снижение активности 6-ФГДГ, и ещё болыд (в 1,5-2 раза от уровня нормы) снижение активности Г-6-ФДГ и общей акта поста ферментов.

Подобный результат нашего исследования не совпадает с мнением ря авторов (Атучина Н.В., 1990; Бурбелло А.Т. и др., 1995) о том, что остр стрессовое воздействие, независимо от этиологии (гипоксия, гппероксия, гип термия и др.), способствует повышению активности Г-6-ФДГ выше уровня активности у интактных животных.

Это может быть связано с тем, что конечный результат изменения акта иости ферментов, в том числе и углеводного обмена, зависит от целого ря факторов. Так, о противоположном влиянии различных режимов адаптации непрерывной и периодической гипоксии на антиоксидантные ферменты и фс менты пентозного цикла сообщает Меерсои Ф.З. с соавт. (1992), а влияние р; личной индивидуальной чувствительности крыс к гипоксии на характер пзь нения окислительного метаболизма отмечает в своей работе Корнеев A.A. с < авт. (1990).

Мы считаем, что при жестком режиме острой гипоксии (как и при яаш экспериментальной модели) активация ПФЦ приводила бы к избыточной п] дукцин NADP*H, который будет преимущественно расходоваться на поддерг ние процессов переокисления, и следовательно, в гппоксических условиях

активация ПФЦ, а его угнетение на начальном этапе адаптации к гипоксии является более естественным механизмом, который в дальнейшем теряет свой приспособительный характер (что мы и зафиксировали), реализуясь в повреждающий фактор, нуждающийся в фармакологической коррекции. Подобная теоретическая посылка имеет помимо нашего, ряд и других экспериментальных подтверждений (Дубенко А.Е., 1991; Крапивин C.B. и др., 1993).

НАДФ-завпсимое п аскорбат-зависимое переокисление во всех сериях достоверно превысило контрольные показатели. Преобладание ферментного типа пероксидного окисления вполне объяснимо, если учесть его первичный характер — НАДФ-завпсимое окисление, по мнению Л.Д.Лукьяновой (1990), постоянно протекает в клетке и его активность может рассматриваться как регу-ляторный механизм.

Предварительное профилактическое назначёпие мплдроната перед острой гипоксией сопровождалось в наших исследованиях дозо- и курсозависимым ограничением неседдментируемой активности, коэффициентов лабильности и приростом седиментируемой активности всех изучаемых лизосомальных ферментов и в миокарде и в головном мозге, принявшем абсолютно достоверный характер при предварительном назначении милдроната в дозе 100 мг/кг курсом 14 дней. Именно в такой дозировке препарат милдронат достоверно ограничивал процесс острого гппокспческого повреждения лизосомального аппарата миокарда и головного мозга.

Протектпвный эффект мплдроната проявился также и при оценке его влияния на систему перекпспого окисления. При этом наблюдались те же самые тендепцпи, которые былн выявлены при применении препарата у интакт-ных крыс - преимущественного ограничение накопления малонового диальдеш-да в миокарде и торможение максимально деструктивного неферментагавного аскорбат-зависимого ПОЛ в головном мозге. Иными словами, механизмы ограничения спонтанного ПОЛ реализовались в условиях экспериментальной патологии, приведя к ограничению индуцированного ПОЛ па наиболее уязвимых участках.

В отношении активности ферментов пептозофосфатного цикла также повторилась тенденция субстратной н органной специфичности. Повторяя профиль избирательной активации отдельных ферментов, милдронат при острой гипоксии также стабилизировал положение наиболее уязвимых участков углеводного обмена, сдерживая угнетение активности Г-6-ФДГ в головпом мозге и активпость 6-ФГДГ и общую активность в миокарде (активность 6-ФГДГ в миокарде приводилась к нормальному уровню).

Таким образом, вызванпые милдронатом взаимосвязанные сдвига в балансе углеводного обмепа и цепного свободнорадикального процесса в условиях нормы и при острой гипоксии, одновременно с ограничением повреждающего действия лизосомальных кислых гидролаз при гипоксии, служат реальным доказательством наличия антигипоксической активности (по критериям Лукьяновой Л.Д., 1990) у данного препарата.

Фармакодипамика антигипоксического действия 'милдроната представляется следующей: при снижении биосинтеза карпптппа происходит повышение биосинтеза гамма-бутиробетаина, обладающего вазодилятирующим действием. Это приводит к реализации противоишемического действия милдроната, который при остром инфаркте миокарда замедляет некроз ткани и укорачивает реабилитационный период. Данный эффект в настоящее время является доказанным и внесен в описание фармакодинамики препарата в Регистр Лекарственных Средств России 1998 года.

Метаболическое же сопровождение и сущность этого эффекта было уста новлено нами в опытах на иптактиых крысах и подтверждено затем в условия гипоксии. Милдронат прежде всего значительно активирует анаэробный пентс зофосфатный путь окисления глюкозы, являющийся в том числе важнейши; поставщиком НДДФ*Н2, являющегося «восстановительной силой» при восстг новительном синтезе в цитоплазме. Возможно, что именно это (если судить а динамике проявления данного эффекта в наших исследованиях) приводит к oi рапичеппю процесса спонтанного и индуцированного перекисного окислени лппидов (в первую очередь, фосфолипидов биомембран, в том числе и лизосс малышх мембран). Очевидно, что данные процессы имеют определенную oj гапную специфичность (с чем мы и связываем преимущественное влияние мш дроната на активность Г-6-ФДГ и неферментный тип ПОЛ в головном мозге причем специфика профиля фармакотераиевтической активности милдронат полпостыо покрывает особенности метаболических расстройств, вызванпых эк< периментальной патологией. То есть, по сути, назначение милдроната при ос рой шпоксии можно назвать прицельной метаболической фармакотерапие данной патологии.

Влияние милдроната на метаболизм миокарда и головного мозга крь при хронической гипоксической гипоксии. Хроническая гииоксическая ranoi сия отличалась в наших исследованиях от острой гипоксии в основном мен] шей степенью выраженности однонаправленных метаболических нарушений результате включения механизмов адаптации кардиомиоцитов.

Меньшая выраженность изменений изучаемых нами показателей по, тверждает интенсивно разрабатываемые в течение последнего десятилетия ni ложепия об адаптирующем влиянии прерывистого режима гипоксии (ил «интервальной гипоксической тренировки»), повышающего резистентность тк ней организма к повреждающим факторам (Макарова В.Г., 1987; Меерсон Ф. и др., 1992; Винокурова E.H., 1998). При адаптации к гипоксии возрастает мог ность системы энергообеспечения миокарда, снижается потребление кислород увеличивается активность аятиоксидантиых ферментов, повышается скорос транспорта иопов кальция в цистерны саркоплазматического ретпкулума, но мхтизуется сократительная функция миокарда (Меерсон Ф.З. и др., 1992).

Использование ступенчатой схемы адаптации к гипоксии приводило наших исследованиях к органоспецифическому изменению профиля активное; лизосомальных энзимов. Как и при острой гипоксии, в миокарде отмечало более выраженное изменение активности катепсина D, а в головном мозге - к слой фосфатазы. Неседиментируемая активность этих ферментов возрастала с ответственно на 84,4% и 61,6% выше уровня цормы (при острой гипоксии 131,8% и 102%). Приросты коэффициентов лабильности составили соответс веино 47,3% и 42,8% (при острой гипоксии - 79,4% и 62,5%). Изменения фун ционального состояния ß-галактозидазы ие носили органоспецифического i рактера и лишь отражали общую картину выраженного хоть и в меньшей <п пени, но все же носящего характер деструктивного процесса. Это может бы доказано отсутствием специфичности между ферментами различной мембранв матрпкеной локализации, однотипным нарастанием неседиментируемой акта ностп и коэффициентов лабильности, как показателем завершенности патоло1 . ческого процесса (Винокурова E.H., 1998).

Особенность влияния хронической гипоксии на систему перекиснс окисления проявилась в меньшей степени выраженности активации фермент!

го и неферментного ПОЛ и в более высоком уровне малонового днальдегида в миокарде, чем в головном мозге.

В гомогенатах головного мозга обнаруживалась большая степень угнетения ферментов пентозофосфатного цикла (преимущественно угнеталась активность Г-6-ФДГ) по сравнению с миокардом. В целом же хроническая гипоксия вызывала снижение показателей углеводного обмена примерпо на 10% меньшее, чем при острой гипоксии.

Подобные изменения говорят о более выраженном срыве компенсаторных механизмов при «подъеме» на высоту 8000 метров в последний день хроппче-ской гипоксии именно в головном мозге (исключение составляет уровень катаболизма белков, оцениваемый по активности катепсина 0).

Введение милдроната параллельным с гипоксией курсом в 14 дпей приводило к достоверному снижению показателей несёдиментируемой активности и коэффициентов лабильности маркерных ферментов гапоксического повреждения - катепсина О в миокарде и кислой фосфатазы в головном мозге. Примечательно, что в миокарде показатели активности р-галактозидазы, не столь остро реагировавшей в наших исследованиях на дефицит кислорода, практически прпводшшсь к значению биологической нормы.

Специфичность влияния »милдроната на процессы перекиспого окисления проявилась при фармакотерапии хронической гипокснческой гипоксии наличием дозозависимого эффекта милдропата на ПОЛ в миокарде и отсутствием до-зозависимости в головном мозге. При этом происходило торможение индуцированного ПОЛ в миокарде (уровень МДА снижался в миокарде со 176,6% при контроле гипоксии до 138,1% при назначении милдроната в дозе 100 мг/кг), в головном мозге милдронат в любых дозах тормозил и ферментное и неферментное ПОЛ.

Уменьшение содержания МДА в миокарде при назначении милдроната на фоне хронической гппоксическоп гипоксии свидетельствует об уменьшении высвобождения арахндоновоп кислоты из фосфолипидов мембран, т.о. применение милдроната при хронической гипоксии исключает из патогенеза простагланди-иовый механизм альтерации (вазоконстрикция, повышение агрегации тромбоцитов и др.).

. Кроме того, при гипоксическом поражении миокарда возможно снижение уровня названных кислот на фоне обогащения фосфолипидов мембран жирными кислотами (Банкова В.В., 1990).

Курсо- и дозозависпмый фармакологический эффект милдроната по ограничению угнетения активности ферментов пентозофосфатного цикла приводил к равновыражепному повышению активности 6-ФГДГ, Г-6-ФДГ и общей активности в миокарде и преимущественному повышению активности Г-6-ФДГ в головном мозге относительно контроля хронической гипоксии. Все изменения активности ферментов пентозофосфатного цикла носили достоверный характер, что с учетом нервопричинности именно изменений углеводного обмепа в динамике рассматриваемых нами метаболических изменений служит дополнительным, хотя и косвенным доказательством базового характера данных изменений.

Как было упомянуто выше, рассматривая механизм антиоксидантного действия милдроната, нельзя не учитывать и тот факт, что введение его в организм ведет к внутриклеточной концентрации такого ионогенного соединения, как гамма-бутиробетаин, способного принимать и отдавать заряжеппые частицы, что также способствует ограничению ПОЛ (Симхович Б.З., 1988; Шутенко Ж.В. и др., 1991; Борисова И.Г., 1992).

Применение мнлдроната при гипоксии, стимулируя углеводный обмен в иелтозофосфашом цикле и посредством этого оптимизируя соотношение НАДФ'/НАДФ*Н, ограничивая ПОЛ, стабилизируя фосфолипиды мембран способствует нормализации функционирования мембраносвязаных ферментные систем, в том числе и лизосомальной системы, что ведет к отмеченному нами снижению катаболической агрессивности лизосом в целом.

Влияние мнлдроната на метаболизм миокарда крыс при изадрииово* миокардиодистрофии. При некротизирующей дистрофии миокарда, вызванное изадрином, происходит перераспределение кислой фосфатазы, р-галактозидазь и катепсина D между осаждаемой и неосаждаемои фракциями тканевого гомо генага. В связи с этим, наблюдается рост неседимептируемой активности и по вышение коэффициента лабильности, что является результатом повьгшенш проницаемости лизосомальных мембран и освобождения из лизосом ферменти в цитоплазму и кровь. С данными результатами согласуются литературные со общения о росте неседимептируемой активности лизосомальных ферменто] миокарда при повреждении его изопротеренолом (Кремепецкая Т.В., 1996).

Установлено, что при введении изадрина за сутки до забоя крыс неседи монтируемая активность маркерного фермента лизосом - кислой фосфатаз! поднимается ца 67,4% выше уровня биологического контроля, равновыражёнш с кислой фосфатазой изменялась активность катепсина D - на 67,3%%, а ß-галактозидазы - только на 44,6%. Таким образом ß-галактозидаза оказалась ме нее чувствительной к катехоламин-индуцированпому повреждению миокарда.

Это можно объяснить, как было указано ранее, различной оргапизацие] ферментов в лизосомах, они распределены как в матрнксе, так и в мембран« например, большая часть общей активности ß-галактозидазы находится в мат риксе лизосом, а кислая фосфатаза и катепсип D имеют смешанную мембраннс матриксную локализацию (Винокурова E.H., 1998).

При этом известно, что в процесс освобождения мембраносвязанной част кислой фосфатазы из лизосомальной мембраны вовлечен катепсин D, которы путем ограниченного протеолиза способствует её освобождению из мембраны. < целью ограничения повреждения миокарда под действием изадрина, теоретиче ски могут использоваться ингибиторы лизосомальных ферментов (наприме пепстатии), по их практическое применение ограничено из-за выраженных пс бочных эффектов (Кременецкая Т.В., 1996).

Таким образом, в развитии метаболических нарушений, развивающихс нри повреждении миокарда, важную роль играют лизосомальные ферменты, к< торые способствуют переходу обратимых изменений в необратимые, а в дал! нейшем принимают участие в разборке некротизированных структур.

В настоящее время известно, что функция и структура лизосом способ! изменяться под действием такого фактора, как цАМФ. Существует мнение, чт этот циклический нуклеотид участвует в регуляции мембранных структур лиз( сом и влияет (вероятно, через протеинкппазу) на активность лизосомальпь ферментов. В кардпомиоцитах преобладает цАМФ, нарабатываемая ферменто фосфоднэстеразой, которая активируется кальцием и кальмодулином, связа] ными с транспортной карнитиновой системой (Дедухова В.И. и др., 1995). процессе фосфорилирования мембран лизосом принимают участие иротеиню пазы, как цАМФ-зависимые, так и цАМФ-независимые через модулпруемь чувствительными к Са2+ механизмами (Макарова В.Г. и др, 1987, 1994; Вин курова E.H., 1998).

Изадриповая дистрофия миокарда в нашем исследовании прежде всего повлияла на уровни изменений параметров перекисного окисления липидов и активности ферментов пентозофосфатного цикла.

Катехолампновая индукция перекисного окисления липидов проявилась увеличением МДА на 160,7% выше уровня нормы, повышением ферментного ПОЛ на 124,7% и неферментного ПОЛ на 79,9%.

Угнетение активпости ключевых ферментов пентозного цикла проявилось, также как и при шпоксическом повреждении, преимущественным угнетением активности Г-6-ФДГ (56,8% к уровню биологического контроля), снижались также значения общей активности ферментов, п в мепылей степени, что вполне понятно - активность 6-ФГДГ (68,2%).

Таким образом общая картина изадринового повреждения отличалась в наших исследованиях от модели острой гапоксшг большим влиянием на системы ПОЛ и гликолиза и меньшим вовлечением лизосомальпого аппарата.

При введении милдроната в дозе 100 мг/кг курсом 7 дней снижаются коэффициенты лабильности кислой фосфатазы, р-галактозидазы и катепсина В, а при назначении милдроната в дозе 100 мг/кг 14 дневным курсом происходит достоверное снижение неседиментпруемой активности всех трех изучаемых в нашей работе ферментов.

НАДФ-зависимое ПОЛ оказалось более чувствительным к терапии милд-ронатом: его активность достоверно снижалась почти в 2 раза уже прп 7-дневном назначении препарата в дозе 50 мг/кг. С другой стороны, аскорбат-завпсимое ПОЛ прп назначении 14 дневным курсом также практически приводилось к уровню биологического контроля.

Это, вероятно, объясняется тем, что милдронат способствует уменьшению содержания соединений, обладающих детергептными свойствами, и, прежде всего, ацил-КоА-производных жирных кислот н ацилкарнитпнов (Шутенко Ж.В., 1991).

При этом, в отличие от предыдущих моделей патологии при изадриновой миокардиодистрофии не удалось проследить зависимости между активностью ферментов пентозного цикла и состоянием перекисного окисления. Активность Г-6-ФДГ п 6-ФГДГ достоверно повышалась только прп 14 дневном курсе назначения милдроната. При этом, так же, как и при гипоксическпх состояниях, в большей степени влияние милдроната проявилось на изменении активности Г-6-ФДГ.

Такпм образом, профилактическое назначение мплдроната способствует активации ферментов пентозофосфатного цикла и создает условия для ограничения индуцпроваппого ПОЛ, на фоне чего отмечается ограничение катаболнче-ской активности лизосомального аппарата миокарда.

Выявленные нами изменения содержания активности лпзосомальных ферментов под влиянием регулирующего лппидный и углеводный обмен мплдроната являются частным проявлением общих структурно-функциональных сдвигов, возникающих в организме при медикаментозной коррекции данным препаратом гипоксическпх и токсических состояний.

Таким образом, можно предположить, что в механизме действия милдроната важное значение имеет выявленная в нашем исследовании способность препарата ограничивать процесс активации лизосомальных ферментов в условиях катехоламиновой миокардиодистрофии и гипокспческого повреждения миокарда и головного мозга.

Возможной основой для проявления данного эффекта может служить, наряду с прочими факторами модуляции мембранпого аппарата лпзосом, стиму-

ляцпя милдронатом активности ферментов иентозофосфатного цикла и ограш;

чение перекиспого окисления линидов в кардиомиоцитах и головном мозге.

ВЫВОДЫ

1. Внутрибрюшшшое введение милдроната белым крысам-самцам сопровоя дается дозо- и курсозависимой активацией глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназ: и 6-фосфо-глюконат-дегадрогеназы, снижением уровня малонового диальд< гида в миокарде, торможением нефермеитного типа нерекисного окислени линидов в головном мозге, не сопровождаясь изменением активности лизосс мальных ферментов.

2. Острая гпноксическая гипоксия вызывает повреждение лизосомального ai парата миокарда и головного мозга, что проявляется повышением неседиме1 тируемой активности и коэффициентов лабильности кислой фосфатазы, ß галактозидазы и катепсина D, сопряженными с угнетением активности фе] ментов пентозного цикла, в первую очередь, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназ] и активацией индуцированного перекисного окисления липидов.

3. Хроническая интервальная гапоксическая гипоксия вызывает однонапра: ленные с острой гипоксией изменения параметров метаболизма, выраженнь в меньшей степени.

4 . Профилактическое назначение милдроната ограничивает процесс пшока ческого повреждения миокарда и головного мозга кислыми гадролазами, чг. связано с тенденцией к нормализации изучаемых показателей углеводного липидного метаболизма.

5. Изадриновая некротизируюшая миокардиодистрофия вызывает подавлеш активности ключевых ферментов иентозофосфатного цикла и индуцирует п рекпсное окисление липидов, что сопровождается повышением неседимент руемой активности и коэффициентов лабильности кислых гидролаз в ми карде.

6. Предварительное 14-дневное введение милдроната уменьшает угнетение а тивности ферментов пентозофосфатного цикла, оказывает антиоксидантнь эффект и тормозит катаболическую активность кислой фосфатазы, [ галактозидазы ц катепсина D.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Беляев A.B., Макарова В.Г., Орлов В.В. Новое направление фармаколог ческой коррекции токсического поражения печени. В кн.: Современные г пекты экспериментальной и клинической фармакотерапии. Сб. научн. тр дов. - Рязань. - 1996

2. Беляев A.B., Макарова В.Г. Влияние милдроната на активность перекиси го окисления липидов в миокарде крыс. В кн.: Диагностика и реабилт ция физического состояния человека. Сб. научн. трудов. - Рязань. - 1997

3. Беляев A.B., Макарова В.Г. Влияние милдропата па активность фермент лизосом при острой гипоксии. В кн.: Материалы IV национального кс гр" 'са «Человек и лекарство». -Москва. - 1997.

Значения исследуемых показателей метаболизма миокарда и головного мозга (в процентах от контроля) в группе интактных животных на фоне 14-дневного назначения милдроната в дозе 100 мг/кг

Показатели Миокард Головной мозг

1. Показатели активности лизосомальных ферментов

1.1. Кислая фосфатаза

НА -5,91 + 1,68

СА -0,97 +3,39

ОА -2,60 +2,89

КЛ -3,30 -0,33

1.2. р-галактозидаза

НА 0,00 -8,01

СА + 10,07 -1,34

ОА +7,00 -5,22

КЛ -6,79 -6,38

.3. Катепсин Б

НА -6,03 -2,01

СА -4,76 +2,77

ОА -0,76 + 1,30

КЛ -5,51 -2,93

. Показатели перекисного окисления липидов

МДА -33,91* -3,62 .

Аскорбатзависимое ПОЛ -6,31 -23,31*

НАДФ-зависимое ПОЛ +2,80 -7,45

. Активность ферментов пентозофосфатного цикла

6-ФГДГ +50,00* +4,59

Г-6-ФДГ +48,40* + 178,06*

ОА +49,00* +94,71*

[римечания: НА — неседиментируемая активность; СА — сегментируемая активность; ОА — общая активность; КЛ — коэффициент лабильности; * — достоверпось различия.

Значения исследуемых показателей метаболизма миокарда и головного мозг (в процентах от контроля гипоксии) при острой гипоксической гипоксии н фоне 14-дневного назначения миддроната в дозе 100 мг/кг

Показатели Миокард Головной мозг

1. Показатели активности лизосомальных ферментов

1.1. Кислая фосфатаза

НА -36,69* -34,90*

СА +17,04* +17,29*

ОА -4,67 +3,68

КЛ -28,70* -31,78*

1.2. р-галактозидаза

НА -32,72* -18,87*

СА +29,36* +20,19

ОА + 19,41 +8,22*

КЛ -41,06* -27,79*

1.3. Катепсин Б

НА -36,98* -34,47*

СА +20,00* +11,57*

ОА +5,80 + 1,90

КЛ -35,18* -22,93*

2. Показатели перекисного окисления лшшдов

МДА -58,39* -50,01*

Аскорбатзависимое ПОЛ -22,96 -33,31*

НАДФ-зависимое ПОЛ -48,77* -41,59*

3. Активность ферментов пептозофосфатного цикла

6-ФГДГ +19,18* + 12,63*

Г-6-ФДГ -4,63 +25,23*

ОА +12,66* +18,37*

Примечания: НА — неседиментируемая активность; СА — седиментируемая г тивностъ; ОА — общая активность; КЛ — коэффициент лабилы сти; * — достовернось различия.

Значения исследуемых показателей метаболизма миокарда и головного мозга (в процентах от контроля гипоксии) при хронической гипоксической гипоксии на фоне 14-дневного назначения милдроната в дозе 100 мг/кг

Показатели Миокард Головной мозг

1. Показатели активности лизосомальных ферментов

1.1. Кислая фосфатаза

НА -22,08* -22,19*

СА -0,68 -7,69*

ОА + 1,85 -13,62

КЛ -11,80* -19,27*

1.2. р-галактозидаза

НА -20,69* -14,66*

СА +2,35 +10,12

ОА -4,36 -3,92

КЛ -13,61* -8,97

1.3. Катенсин Б

НА -26,56* -14,60*

СА +2,34 +5,83*

ОА -5,01 +0,15

КЛ -16,30* -12,89*

2. Показатели перекисного окислепия липидов

МДА -38,55* -23,01 •

Аскорбатзависимое ПОЛ -14,11* -21,88*

НАДФ-зависимое ПОЛ -33,01* -39,60*

3. Активность ферментов пентозофосфатного цикла

6-ФГДГ + 15,31* + 18,79*

Г-6-ФДГ + 14,11* +23,87*

ОА + 14,99* +21,29*

Примечания: НА — неседпментируемая активность; СА — седимептпруемая активность; ОА — общая активность; КЛ — коэффициент лабильпо-стп; * — достоверпось различия.

Значения исследуемых показателей метаболизма миокарда (в процентах о контроля миокардиодистрофии) при изадриновой миокардиодистрофии и фоне 14-дневного назначения милдроната в дозе 100 мг/кг

Показатели Миокард

1. Показатели активности лизосомальных ферментов

1.1. Кислая фосфатаза

НА -25,94*

СА +10,79*

ОА +45,41

КЛ -25,30*

1.2. р-галактозидаза

НА -12,90*

СА +23,28*

ОА -12,56

КЛ -27,49*

1.3. Катенсии И

НА -28,91*

СА +23,22*

ОА +3,09

КЛ -29,48*

2. Показатели перекисиого окисления липидов

МДА -81,84*

Аскорбатаависимое ПОЛ -65,21*

НАДФ-зависимое ПОЛ -109,32*

3. Активность ферментов иентозофос« >атного цикла

6-ФГДГ +11,57*

Г-6-ФДГ +20,52*

ОА + 15,50*

Примечания: НА — неседиментируемая активность; СА — седиментируемая ;

тивпость; ОА — общая активность; КЛ — коэффициент лабилы сти; * — достоверпось различия.