Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активность лизосомальных ферментов и состояние электролитного баланса миокарда при острой и хронической гипоксической гипоксии в условиях действия целанида и сензита

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Активность лизосомальных ферментов и состояние электролитного баланса миокарда при острой и хронической гипоксической гипоксии в условиях действия целанида и сензита"

.МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

РЯЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА И.П.ПАВЛОВА

На правах рукописи УДК: 616.127-001.8:616-008.9]-085.22

Винокурова Елена Николаевна

АКТИВНОСТЬ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ И СОСТОЯНИЕ ЭЛЕКТРОЛИТНОГО БАЛАНСА МИОКАРДА ПРИ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ ЦЕЛАНИДА И СЕНЗИТА

03.00.04 - Биохимия 14.00.25 - Фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

■Рязань - 1998

Работа выполнена в Рязанском государственном медицинском университете имени академика И.П.Павлова

Научные руководители - заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор В.Г.МАКАРОВА заслуженный деятель науки РФ, академик РАН Е.А. СТРОЕВ

Официальные оппоненты

- доктор биологических наук, профессор А.Н. КОШАРОВ

- кандидат медицинских наук О.В. КОЛОБАЕВА Ведущая организация

Ярославская государственная медицинская академия

Завдта состоится "_"_ 1998 года в "_" часов

на заседании Диссертационного Совета Д 084.67.02. при Рязанском государственном медицинском университете

имени академика И.П.Павлова ( 391000, РФ, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Рязанского государственного медицинского университета ( 391000, РФ, г.Рязань, ул. Шевченко, д. 34 ) Автореферат разослан "_" _ 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

Е.А. Рязанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ. Гипоксические состояния, возникающие в результате ограничения поступления кислорода в клетку, либо в связи с потерей способности последней утилизировать его в реакциях биологического окисления, играют чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности организма. В клинике гипоксия часто осложняет течение основного заболевания сердечно-сосудистой, дыхательной систем и сочетается с нарушением регуляторных функций и включением типовых и специфических патологических реакций (В.Г. Макарова, 1987; Л.Д. Лукьянова, 1989; В.В. Гацура,. 1993; P. Poole-Wilson, 1983). Решение проблем старения, стрессовых нагрузок, работоспособности организма в конечном счете связано с устранением гипо-ксических состояний и их последствий ( Ф.З. Меерсон, М.Г. Пшенни-кова, 1988; Н.К. Хитров, B.C. Пауков, 1991).

Для прояснения механизмов адаптации к гипоксии крайне актуальным является исследование биохимических процессов, происходящих в клетке, и возможностей влияния на них различных лекарственных, препаратов.

Известно, что одной из общих причин гибели клеток в условиях дефицита кислорода является кальциевая перегрузка (H.A. Федоров и др., 1990) вследствие нарушения энергетического обмена, дестабилизации клеточных и субклеточных мембран и активации процессов перекисного окисления липидов (А.Е.Антипенко и др., 1992).

В свяви с этим представляется интересным изучение антигипок-сического эффекта целанида и сензита, разнонаправленно влияющих на электролитный баланс миокарда. Однако, механизм действия этих препаратов нёльэя объяснить только черев изменение уровня ионов

кальция. Менее изучено их влияние на активность лизосомальных ферментов, которым принадлежит ведущее место в развитии метаболических нарушений при гипоксии: при массивном выходе их в цитоволь наступает усиленный лизис кардиомиоцитов, что приводит к их деструкции ( Л.Е. Панин, H.H. Маянская, 1987; Т.Н. Иванова и др., 1990; R. Wattlaux, S. Wattiaux - De Coninck, 1984). Вследствие этого понятен интерес к проблеме воздействия на различные звенья повреждения клетки, особенно на активность лизосомального аппарата.

Целые исследования является изучение динамики активности лизосомальных ферментов и электролитного баланса миокарда в условиях острой и хрбнической гипоксической гипоксии до и после назначения ряда кардиотропных средств.

Задачи исследования:

1. Изучить в динамике активность лизосомальных ферментов: ß-галактозидаэы, кислой дезоксирибонуклеаэы, кислой фосфатаэы и катепсина Д и общее содержание электролитов в миокарде крыс при острой и хронической гипоксической гипоксии.

2. (Ценить изменения активности некоторых кислых гидролаз и электролитного состава в миокарде в условиях действия целанида и сенвита при нормоксии.

3. Дать характеристику изменений активности изучаемых лизосомальных энзимов и содержания кальция, магния, калия и натрия в сердце крыс при введении целанида и сенвита на фоне действия острой гипоксии.

4. Провести оценку фармакотерапевтической эффективности целанида и сенвита при хронической гипоксической тренировке.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В работе впервые дана характеристика изменений функциональной активности лизосомального аппарата миокарда

при назначении сенэита и целанида в условиях действия на организм "высотной" гипоксии. Впервые установлено, что целанид и сензит оказывают разнонаправленное действие на активность лизосомальных ферментов - в-галактозидазы, кислой дезоксирибонуклеазы, кислой фосфатазы и катепсина Д. При этом сензит снижает активность кислых гидролаз и стабилизирует лизосомальные мембраны, что приводит к ограничению процесса гипоксического повреждения лизосомального аппарата. При назначении целанида выявлена обратная тенденция. Уточнено влияние сензита и целанида на характер изменений электролитного баланса кардиомиоцитов при действии острой и хронической гипоксической гипоксии. Впервые установлена взаимосвязь между выявленными сдвигами баланса электролитов и активностью лизосомальных ферментов миокарда.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты исследования значительно расширяют представления о роли лизосомальных ферментов в реализации эффектов сензита и целанида на метаболизм миокарда при воздействии острой гипоксии и интервальной гипоксической тренировке. При разработке принципов лечения патологических состояний, сопровождающихся дефицитом кислорода в миокарде, необходимо учитывать роль кислых гидролаз в развитии деструктивных процессов.

В целях коррекции биохимических изменений при гипоксическом повреждении сердечной мышцы предлагается использовать сензит, имея в виду выявленную способность препарата ограничивать процесс тканевого повреждения ва счет стабилизирующего влияния на лизосомальный аппарат клеток, и более осторожно подходить к назначению целанида.

Результаты исследования внедрены в учебный процесс и используются при чтении лекций и проведении практических занятий по биохимии и патобиохимии, фармакологии и фармакотерапии на кафедрах

биологической и биоорганической химии с курсом клинической лабораторной диагностики и фармакологии с курсом фармакотерапии Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции "Аллергия, иммунитет и патология внутренних органов" (Рязань, 1995); VI (Новосибирск, 1996) и VII (Москва, 1997) национальных конгрессах по болезням органов дыхания; IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997); межкафедральной научной конференции РязГЫУ имени академика И.П.Павлова (1998).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 120 источников отечественной и 91 источник иностранной литературы. Диссертация иллюстрирована 26 таблицами и 22 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были проведены на 138 белых беспородных крысах-самцах массой 200-240 г. Всего проведено 23 серии экспериментов.

Острую гипоксическую гипоксию моделировали однократной экс-

позицией животных в приточно-вытяжной барокамере с остаточным давлением, соответствующим высоте 8000 м в течение б часов. Перед сеансом гипоксии крысам назначали лекарственные препараты однократно и курсом 5 дней: целанид (ланатозид С) вводили в/и в дозе Змг/кг; сензит (фендилина гидрохлорид) вводили внутрь в форме водной суспензии в дозе 4 мг/кг. Последействие препаратов оценивали спустя 5 дней после окончания их введения.

В режиме хронической гипоксии животных подвергали барокамар-ной тренировке с постепенным подъемом до высоты 6000 м по б часов в сутки в течение 13 дней. На 14-ый день вызывали декомпенсацию содержанием животных на высоте 8000 м в течение 6 часов. Препараты назначались однократно - после выхода из гипоксической камеры и курсом - начиная с 10 дня гипоксической тренировки.

Сразу после окончания сеанса высотной гипоксии у крыс под эфирным наркозом забирали миокард для исследования. Сердце гомогенизировали на холоду в гомогенизаторе Поттера-Эльвейема с теф-лоновым пестиком 90 секунд при 1200 об/мин в 10 объемах 0,15 М раствора хлорида калия. Гомогенат последовательно центрифугировали при 1000 г в течение 10 минут и при 20000 % в течение 30 минут. В полученном супернатанте определяли неседиментируемую активность ферментов, характеризующую состояние лизосомальных мембран. Осадок ресуспендировали в растворе тритона Х-100 для определения седиментируемой активности ферментов. Кроме того, расчитывали коэффициент лабильности, являющийся показателем целостности лизосом, как отношение неседиментируемой активности к сумме седиментируемой и неседиментируемой (общая активность). Энзиматичес-кую активность з-галактозидазы оценивали по гидролизу п-нитрофе-нил-з-Д-галактопиранозида (А.Баррет и М.Хит, 1980). При определении активности кислой дезоксирибонуклеазы и катепсина Д в качест-

ве субстрата использовали ДНК высокополимерную и гемоглобин соответственно (A.A. Покровский, А.И. Арчаков, 1968). Активность кислой фосфатазы определяли по методу Боданского (1982) по гидролизу о-глицерофосфата.

> Содержание белка исследовали микробиуретовым методом (Г. А. Кочетов, 1980).

Общее содержание кальция, магния, калия и натрия в миокарде и сыворотке крови оценивали методом атомно-абсорбционной спектро-фотометрии после предварительного высушивания и минерализации парами азотной кислоты (О.Г. Архипова, 1988).

Данные экспериментов обрабатывали методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Активность лизосомальных ферментов и электролитный баланс миокарда крыс при острой и хронической гипоксической гипоксии.

Острая гипоксическая гипоксия сопровождалась активацией ли-зосомального аппарата и выходом в цитозолъ кислых гидролаз, что проявилось значительным увеличением неседиментируеыой активности ß-галактоаидазы, кислой ДНК-азы, кислой фосфатазы и катепсина Д на 180, 130, 172 и 194% и коэффициентов лабильности ферментов на 170, 122, 148 и 1592 соответственно (таблица 1). Полученные нами результаты изменения функциональной активности лиэосом указывают на тенденцию к повышению расщепления тканевых белков и углеводов под влиянием острой гипоксии субмаксимальной интенсивности, ив меньшей степени - к активации катаболизма нуклеиновых кислот, что согласуется с наблюдениями Макаровой В.Г. (1987), отмечавшей

Таблица 1. Активность лизосомальных ферментов и состояние электролитного баланса миокарда крыс при острой и хронической гипокси-ческой гипоксии ( М ± m ).

1 | Показатели 1 1 Контроль I 1 I Острая | Хроническая |

| п - 6 | гипоксия | I I гипоксия |

|ц-галактозидаза 1 И 1,32+0,08 1 1 | 2,37±0,08*** | 1,94+0,11*** |

21 2,31+0,11 | 1,47+0,06*** | 1,75+0,08** |

31 36,40+1,89 161,70+0,89*** | 52,60+1,73*** |

|Кислая ДНК-аза 11 3,46+0,19 | 4,48+0,23** | 3,98+0,13* |

2| 5,88+0,33 I 5,43±0,33 | 5,16+0,34 |

3| 37,00+2,08 145,20+2,35* | 43,50+1,07* |

|Кислая И 2,98+0,14 | 5,12+0,25*** | 3,40+0,21 |

|фосфатаза 2| 5,80+0,17 | 5,12+0,36 | 4,90+0,19** |

3| 33,90+0,84 150,00+2,60*** | 41,00+2,00** |

|Катепсин Д 1| 3,24+0,10 | 6,27+0,36*** | 5,49+0,41*** |

2| 7,61+0,17 | 6,92+0,35 | 8,29+0,44 |

3| 29,90+0,89 147,50+1,90*** | 39,80+1,06*** |

|Кальций 4| 1,67+0,09 | 3,18+0,21*** | 2,04+0,07** |

(Магний 4| 2,81+0,12 I 2,15+0,13** | 2,67+0,10 |

[Калий 4| 35,47+1,52 124,93+1,88** | 37,29±1,80 |

|Натрий 1 4| 1 55,07+2,35 196,01+5,89*** | | - -..... 1 77,65+2,13*** |

Примечание:1-неседиментируемая активность фермента (нмоль/мг бел-ка*мин); 2-седиментируемая активность фермента (нмоль/мг белка* мин); 3-коэффициент лабильности фермента (%); 4-общее содержание в ткани (ммоль/кг); *- Р<0,05; **- Р<0,01; ***- Р<0,001.

меньшую степень вовлечения кислой ДНК-азы в процесс тканевого повреждения печени при идентичной модели гипоксического воздействия. Значительное возрастание неседиментируемой активности и коэффициентов лабильности маркерных ферментов лиэосомального мат-рикса (о-галактозидазы и кислой фосфатазы) и отсутствие избирательности в изменении активности ферментов с различной субстратной специфичностью - это ранний и чувствительный признак нарушения стабильности лизосом, свидетельствующий о разрыве лизосомаль-ных мембран и выходе гидролаз в цитозоль и кровь , где они оказывают повреждающее действие на окружающие ткани (Л.Е. Панин, Н.Н. Маянская, 1987; Rao К. et al., 1980). Активация лизосом при гипоксии приводит к снижению сократительной способности миокарда в результате ферментативной деструкции сократительных элементов; происходит альтерация кардиомиоцитов: уменьшается количество митохондрий, повреждаются миофибриллы (Г.А. Панченко, 1987). Подобные изменения изучаемых показателей говорят скорее о неуправляемом, чем об адаптационно целесообразном усилении катабодических процессов в миокарде при действии острой гипоксии (Б.Ф. Коровкин и др., 1987; И.И. Антонова, 1994; Б.К. Романов, 1997; L.V. Ravl-chandran et al., 1990).

Одновременно с активацией лизосомальных ферментов изменялся и электролитный состав миокарда: в ткани накапливался кальций и натрий и происходила потеря калия и магния. Существенный рост тотального кальция в наших экспериментах связан, по-видимому с нарушением Са2+-кальмодулинзависимого и ц-АМФ - зависимого протеин-фосфорилирования в саркоплазматическом ретикулуме (А.Е. Антипенко и др., 1992). Кальциевая перегрузка клеток способствует лабилиза-ции лизосомальных мембран, выходу в цитозоль литических ферментов и дальнейшему нарушению функционирования транспортных систем cap-

колеммы и саркоплазматического ретикулума. Избыток кальция поглощается митохондриями в ущерб процессам окислительного фосфорили-рования, что приводит к возникновению энергодефицита и угнетению сократительной способности миокарда (Ф.З. ' Меерсон и др., 1989). Все это доказывает целесообразность применения при острой гипоксии лекарственных препаратов, оказывающих антикальциевый эффект.

Хроническая гипоксия по направленности и степени выраженности метаболических нарушений заметно отличается от острой патологии в результате включения механизмов адаптации.

Длительное прерывистое воздействие гипоксической гипоксии (ИГТ) приводило к увеличению содержания общего кальция и натрия в миокарде, выраженному, однако, в меньшей степени чем при острой патологии. Уровень магния и калия не отличается от показателей в группе контрольных животных. Снижение аккумуляции кальция в кар-диомиоцитах, носит приспособительный характер и связано, вероятно, с активацией кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума 00.В. Архипенко и др., 1992; Ф.З. Меерсон, 1992; 1,еу1пе, КапазеиНг, 1986).

Хроническая гипоксия в меньшей степени чем острая лабилизи-рует лизосомальный аппарат кардиомиоцитов: неседиментируемая активность маркерного фермента кислой фосфатазы соответствует уровню контрольных животных; неседиментируемая активность 0-галакто-зидазы (Р<0,01) и коэффициенты лабильности о-галактозидазы (Р<0,001), кислой фосфатазы (Р<0,05) и катепсина Д (Р<0,01) снижены относительно показателей группы острой гипоксической гипоксии. Одним из механизмов стабилизирующего действия интервальной гипоксической тренировки на лизосомы может выступать нормализация ПОЛ в плазматических мембранах (И.И. Антонова и др., 1994) и уменьшение кальциевой перегрузки цитозоля кардиомиоцитов (А.Е.

Антипенко и др., 1992). Некоторое увеличение уровня неседименти-руемой активности кислых гидролаз после воздействия длительной гипоксии оценивается нами как компенсаторный процесс, направленный на восстановление тканевого гомеостаза, нарушенного в результате действия острой гипоксии.

Таким образом, изменения, обнаруженные нами при гипоксичес-кой декомпенсации после ИГТ, свидетельствуют об адаптивном характере выбранного нами режима хронической гипоксии, что соответствует данным других авторов (В.Г. Макарова, 1987; Ф.З. Меерсон и др., 1992).

2. Изменение активности лизосомальных ферментов и содержания электролитов в миокарде крыс при назначении целанида и сензкта в условиях нормой сии.

Однократное введение целанида сопровождалось увеличением не-седиментируемой активности в-галактозидазы, катепсина Д и кислой фосфатазы и снижением седиментируемой активности в-галактозидазы, кислой ДНК-азы и кислой фосфатазы. Коэффициенты лабильности возрастали для всех изучаемых ферментов (таблица 2). Применение гли-козида приводило к накоплению кальция и натрия и потере магния и калия сердечной мышцей, что по-видимому связано с особенностями механизма действия препарата: целанид ингибирует фермент Na+/K+ -АТФ-азу и стимулирует Na+/Ca2+ - обмен, в результате чего в цито-золе увеличивается.концентрация ионов кальция (И.С.Чекман, 1992). Последние через активацию фосфолипаз и процессов перекисного окисления липидов приводят к дестабилизации лизосомальных мембран (В.Х. Василенко и др., 1989; А.Е. Антипенко и др., 1992; M.Barry, A.Eastman, 1992).

Однократное назначение сензита приводило к снижению неседи-

Таблица 2. Влияние целанида и сензита на активность лизосомаль-ных ферментов и электролитный баланс миокарда крыс (различие с группой биологического контроля в процентах).

1 1 | Показатели | п - 6 ч Целанид (3 мг/кг) 1 1 | Сензит (4 мг/кг) |

однократно i курс 5 дней i |однократно i курс 5 дней|

i II Iв-галактоэидаза|1| 158,3** 162, ^ ** | 55,3*** 63, 6*** 1

1 121 . 77,1** 83, 1* | 104,8 ИЗ, о 1

1 |3! 148,4*** 144, Q*** | 63,7*** 67, 0*** 1

I Кислая ДНК-аза UI 102,0 113, 0 | 47,4*** 49, 1

I |2| 77,4* 84, 7 | 73,8** 80, 8* |

1 131 118,1* 118, 9* | 74,1** 71, л ** 1 4 1

I Кислая |1| 173,2*** 153, | 71,1*** 77, 2** |

|фоефатаза |2| 62,4*** 78, 3** | 100,0 97, 6 ¡

1 131 173,5*** 147, 5*** | 79,1*** 85, 3* |

|Катепсин Д 111 136,4** 156, д*** I 89,5* 87, 0* |

1 12| 99,2 105, 8 | 92,8 96, 5 I

I |3| 123,4* 129, Л ** 4 1 97,3 93, 0 1

|Кальций !4| 164,7*** 194, g*** | 88,6 64, г,*** |

|Магний |4| 66,6** 80, л ** 4 | 95,0 69, 0*** 1

|Калий |4| 76,3** 82, 9** | 88,9 84, 4 I

|Натрий | 14| ■ i 130,5*** 149, 1 д*** 1 94,6 i • 99, 5 I

1 - неседиментируемая активность фермента; 2 - седиментируемая активность фермента; 3 - коэффициент лабильности фермента; 4 - общее содержание в ткани; * - Р<0,05; ** - Р<0,01; *** - Р<0,001.

ментируемой активности всех изучаемых лизосомальных ферментов, седиментируемой активности кислой ДНК-азы и уменьшению коэффициентов лабильности ß-галактозидазы, кислой ДНК-азы и кислой фосфатазы в миокарде крыс. В целом можно отметить способность препарата ограничивать выход кислых гидролаз в цитозоль за счет стабилизирующего воздействия на лизосомальные мембраны кардиомиоцитов. Уровень общего кальция, магния, калия и натрия в миокарде не изменялся.

Курсовое введение сензита сопровождалось уменьшением неседи-ментируемой активности ß-галактозидазы, кислой ДНК-азы, катепсина Д и кислой фосфатазы и седиментируемой активности дезоксирибонук-леазы. Одновременно с этим снижались коэффициенты лабильности ß-галактозидазы, ДНК-азы и кислой фосфатазы. Введение сензита в течение 5-ти дней, в отличие от однократного, сопровождалось значительным изменением электролитного состава миокарда: в кардиоми-оцитах уменьшалось содержание тотального кальция и магния, а уровень натрия и калия оставался неизменным. Стабилизирующее действие сензита на лизосомы, по-видимому связано с его способностью снижать содержание ионизированного кальция в кардиомиоцитах и устранять его токсическое влияние на субклеточные структуры (H.A. Мазур, 1988). Кроме того препарат обладает антиоксидантным эффектом (С.И. Сытник, С.Л. Денисов, 1993; Л.В.Савченкова и др., 1996; D.R. Janero et al, 1988; W. Wegllckl, 1990) и являясь ингибитором фосфодиэстеразы, способствует внутриклеточному накоплению ц-АМФ (С.И. Сытник, С.Л. Денисов, 1993; Л.В. Савченкова и др., 1996). Наши результаты согласуются с данными Сысыкина A.A. и Петрова В.К. (1897), показавшими, что сензит оказывает выраженное стабилизирующее влияние на мембраны эритроцитов при воздействии высокой температуры, гипотонической среды и активации свободноради-

кального окисления.

Курсовое назначение целанида сопровождалось увеличением несе-диментируемой активности в-галактозидазы, катепсина Д и кислой фосфатазы, снижением седиментируемой активности в-галактозидазы и кислой фосфатазы и возрастанием коэффициентов лабильности всех четырех лизосомальных ферментов. Подобные результаты свидетельствуют о дестабилизирующем действии целанида на лизосомадьный аппарат ' клеток,. причем в большей мере снижается степень связывания гидролаз мембранами, так как активность матриксного фермента кислой ДНК-азы возрастает незначительно по сравнению с кислой фосфа-тазой и катепсином Д, присутствующими и в матриксе, и в мембране лизосом. Изменения электролитного состава были сходными с таковыми при однократном введении целанида: в клетках миокарда накапливались кальций и натрий и уменьшался уровень общего магния и калия.

При исследовании последействия целанида изменения электролитного баланса и активности кислых гидролаз были аналогичны курсовой дигитализации, но выражены в меньшей степени. Наблюдалось увеличение неседиментируемой активности и коэффициентов лабильности в-галактозидазы (на 34% (Р<0,01) и 23% (Р<0,05) соответс-. твенно) и катепсина Д (на 49% (Р<0,001) и 23% (Р<0,01) соответственно), содержания общего кальция (Р<0,01) и натрия (Р<0,001) в миокарде. Ниже-уровня.контрольных животных оставались седименти-руемая активность кислой ДНК-азы (Р<0,01) и концентрация общего магния (Р<0,05).

В период последействия сензита показатели активности кислых гидролаз и содержание электролитов в миокарде возвращаются к контрольному уровню; сниженным на 27% (Р<0,001) остается только уровень общего магния.

Так как значительное изменение общего содержания кальция в зердечной мышце сопровождается пропорциональным изменением его активной фазы (В.И. Вовк, 1980), то противоположную динамику активности кислых гидролаз при назначении сензита и целанида вполне можно сопоставить со способностью данных препаратов разнонаправленно влиять на внутриклеточную концентрацию ионов кальция.

3. Изменение активности кислых гидролаз и общего содержания электролитов в миокарде при назначении целанида и сензита на фоне острой гипоксической гипоксии.

Однократное введение целанида на фоне острой "высотной" гипоксии не приводило к выраженным изменениям общего содержания кальция, магния и калия и активности кислой фосфатазы и катепсина Д (таблица 3). Эти показатели значительно отличались от группы контрольных животных и не носили достоверных различий с группой острой гипоксии. Неседиментируемая активность ДНК-азы возростала на 15% по сравнению с контролем гипоксии.

При однократном назначении сензита наблюдалось уменьшение дисбаланса катионов в сердечной мышце: уровень общего кальция и калия полностью нормализовался, а концентрация магния и натрия отличалась от группы контроля гипоксии и имела тенденцию к нормализации. Протективное влияние сензита проявилось и в отношении лизосомального аппарата кардиомиоцитов: "коэффициент лабильности и неседиментируемая активность кислой ДНК-азы соответствовали показателям контрольных животных; неседиментируемая активность кислой фосфатазы отличалась от группы гипоксии, также как коэффициенты лабильности в-галактазидазы, катептина Д и кислой фосфатазы, которые значительно снижались. Таким образом, результаты исследования выявили способность однократного введения сензита частично

Таблица 3. Влияние целанида и сенэита на активность лиэосомальных ферментов и электролитный баланс миокарда крыс при острой гипокси-ческой гипоксии (различие с контролем острой гипоксии в процентах).

1 | Показатели | п - 6 1 Целанид (3 мг/кг) Сензит 1 (4 мг/кг) |

однократно 1 |курс 5 дней 1 1 однократно|курс 5 дней| | 1

1 1 1 10-галактозидаза|11 87,3* | 95,4 89,0 1 1 I 76,4*** |

|2| 127,9** | 115,6 134,7* 1 143,5** |

13| 84,9*** 1 103,1 83,6** | 74,9*** |

(Кислая ДНК-аза 111 115,0* 1 113,0 90,9 1 95,8 1

121 91,5 1 98,7 104,1 1 100,7 |

131 112,6 | 107,5 92,7 1 97,3 |

|Кислая 111 95,1 | 104,9 72,7** I 63,5*** |

|фосфатаза 121 104,7 1 Ю4,7 97,5 1 95,9 |

|3| 95,2 | 100,0 85,2* | 79,6** |

|Катепсин Д Ш 96,2 | 95,2 83,6 | 74,6** |

|2| 98,4 1 91.3 106,4 1 90,2 |

|3| 99,0 | 102,3 87,6* 1 "90,3 |

¡Кальций |4| 101,3 1 И4,2 63,2*** 1 59,1*** |

|Магний |4| 103,3 1 98,1 115,8* | 134,4** |

|Калий |4| 118,4 1 И4,6 131,5** | 142,8** |

|Натрий ■ | 14| 1. 1. 80,2* | 101,9 1 ...._ ., _____ 73,6** ... - _______ | 73,0** 1 | '

Примечание: 1-неседиментируемая активность фермента; 2-седименти-руемая активность фермента; 3-козффициент лабильности фермента; 4-общее содержание в ткани; *- Р<0,05; **- Р<0,01; ***- Р<0,001.

федохранять лизосомальный аппарат миокарда от губительного влия-шя интенсивной гипоксии.

Применение целанида 5-дневным курсом не приводило к положительным изменениям ни со стороны электролитов, ни со стороны ли-эосомального аппарата: все показатели отличались от уровня контрольных животных и не носили различий с группой острой гипокси-ческой гипоксии. Это, а также отсутствие селективности в активации кислых гидролаз, вероятно, Позволяет считать, что при курсовом назначении целанида в условиях острого дефицита кислорода одним из ведущих механизмов повреждения миокарда становится резкая неуправляемая активация лизосомального аппарата, сопровождающаяся деструкцией кардиомиоцитов (H.H. Маянская и др., 1990).

Курсовое назначение сензита перед воздействием острой гипоксии приводило к нормализации общего содержания кальция, магния и калия в сердечной мышце. Повышенным оставался лишь уровень натрия, однако и он отличался от группы животных, перенесших гипоксию. Антикальциевый эффект препарата объясняется его способностью блокировать медленные кальциевые каналы (И.П. Замотаев и др., 1988; Q. Timour, 1992), стимулировать Са2+-АТФ-азу сарколеммы (Е. Carafoli, 1987) и внутриклеточным связыванием с кальмодулином. (J. Ruegg et al., 1985). Большое значение имеет рост магния и калия в миокарде: высокие концентрации ионов магния способствуют стабилизации лизосомальных мембран (Н. Сперелакис, 1990; И.О. Чекман, 1992; R.A. Reinhard, 1991), а дефицит калия сопровождается развитием аритмий (Л.И. Ольбинская, П.Ф. Литвицкий, 1986).

Положительное влияние 5-дневного введения сензита на баланс электролитов сопровождалось. нормализацией активности лизосомальных ферментов в кардиомиоцитах. Неседиментируемая активность ß-галактозидазы, кислой фосфатазы и катепсина Д значительно сни-

жалась по сравнению с контролем гипоксии, также как показатели лабильности з-галактозидазы и кислой фосфатазы. Уровень активности кислой ДНК-азы не отличался от показателей контрольных животных. Таким образом курсовое назначение сензита в условиях дефицита кислорода усиливало кардиопротективный эффект, отмеченный при однократном введении препарата и способствовало нормализации большинства исследуемых показателей.

В период последействия сензита общее содержание кальция и магния в миокарде не отличалось от показателей в группе "высотной" гипоксии. Концентрация калия соответствовала уровню контрольных животных. Неседиментируемая активность и коэффициент лабильности з-галактозидазы оставались сниженными (Р<0,05) по сравнению с группой гипоксии. Активность других ферментов не отличалась от контроля острой гипоксии, однако сохранялась тенденция к снижению большинства показателей.

Не смотря на большую продолжительность действия целанида по ■ сравнению с сензитом, в оценке его последействия мы наблюдали гораздо меньше достоверных остаточных сдвигов в значениях изучаемых показателей: большинство параметров не отличались от уровня животных, перенесших острую гипоксию.

Таким образом, можно отметить, что сензит при острой гипоксии оказывает выраженный протективный эффект, который обнаруживается уже при однократном введении препарата; максимален при курсовом назначении и частично сохраняется при его отмене. Изменения, вызываемые целанидом в условиях дефицита кислорода, носят менее выраженный, но противоположный с сензитом характер.

4. Влияние целанида и сензита на электролитный баланс и активность лизосомальных ферментов миокарда крыс при хронической гипоксической гипоксии.

Недостаточная метаболическая адаптация тканей к дефициту кислорода в результате прерывистой гипоксии предопределяет необходимость поиска путей медикаментозной коррекции биохимических нарушений.

Оценивая действие однократного введения целанида на состояние лизосомальных мембран кардиомиоцитов при гипоксической тренировке, можно отметить отсутствие выраженного влияния на все виды активности и коэффициенты лабильности кислых гидролаз (таблица 4). Электролитный состав притерпевает значительные изменения: увеличивается концентрация общего кальция и натрия и уменьшается уровень магния и калия в сердечной мышце, что может быть связано с отрицательным влиянием лекарственного препарата на транспортные системы сарколеммы и саркоплазматического ретикулума. Дополнительное поступление кальция в миоциты под воздействием целанида уже нельзя рассматривать как целесообразное ввиду уменьшения продукции АТФ митохондриями (В.В. Гацура, 1993), нарушения процесса расслабления миокарда (И.О. Чекман, 1991) и усиления стимулирующего действия кальция на процессы ПОЛ и активацию лизосомального аппарата (А.Е. Антипенко и др., 1992). Эти данные свидетельствуют о целесообразности назначения антагонистов кальция при гипоксии миокарда (В.И. Капелько, 1981).

Сензит, вводимый однократно, практически не влиял на электролитный баланс и состояние лизосомального аппарата миокарда в условиях хронической гипоксической гипоксии.

Курс целанида на фоне ИГТ приводил к усугублению кальциевой и натриевой перегрузки кардиомиоцитов и потере клетками магния и

Таблица 4. Влияние целанида и сенэита на активность лиэосомальных ферментов и электролитный баланс миокарда крыс при хронической гипоксии (различие с контролем хронической гипоксии в процентах).

1 1 | Показатели | п - 6 1 Целанид (3 мг/кг) Сензит 1 (4 мг/кг) |

однократно 1 курс 5 дней однократно|курс 5 дней| ■ ■

1 1 1 | в-галактозидаза|11 100,5 97,4 95,4 1 1 1 81,4* |

1 |2| 95,4 102,3 106,9 1 114,0 |

1 |3| 102,5 97,7 94,5 | 84,2** |

|Кислая ДНК-аза Ш 99,5 102,5 105,0 | 100,0 |

1 |2| 101,0 100,0 100,9 I 106,8 |

1 |3| 99,3 101,6 102,5 1 96,3 |

|Кислая , 111 99,1 103,2 107,1 1 88,5 |

|фосфатаза |2| 88,0 98,8 107,1 | 102,9 |

1 13| 107,1 102,4 100,0 1 91,2 |

|Катепсин Д 111 102,2 122,4* 99,3 1 82,1* |

Г. |2| 88,4 95,9 93,2 1 93,6 |

1 |3| 109,0 115,1** 104,0 1 92,5 |

| Кальций |4| 141,2** 163,2*** 97,6 1 85,8* |

|Магний |4| 72,3*** 85,8* 97,4 I 87,6* |

| Калий-" 141 74,7** 75,4*** 100,6 | 98,3 " |

|Натрий 1 |4| 1.1 110,4 132,5*** . ,1 89,4 | 86,3* | < 1

Примечание: 1-неседиментируемая активность фермента; 2-седименти-руемая активность фермента; 3-коэффициент лабильности фермента; 4-общее содержание в ткани; *- Р<0,05; **- Р<0,01; ***- Р<0,001.

<алия. Это отразилось на функционировании лизосомального аппарата: увеличивалась неседиментируемая активность и коэффициент ла-Эильности катепсина Д.

Курсовое применение сенэита наиболее полно и эффективно кор-регирует биохимические нарушения при хронической гипоксической гипоксии, что проявилось в нормализации неседиментируемой активности о-галактозидазы и кислой фосфатазы и коэффициентов лабильности кислой ДНК-азы и кислой фосфатазы. Уровень общего кальция и калия соответствует показателям в группе контроля, а уровень магния и натрия отличается от показателей в группе гипоксии.

Оценивая последействие сензита на миокард при хронической гипоксии, можно отметить малую выраженность изменений электролитного баланса и состояния лизосом: отличались от контроля гипоксии только показатели общего содержания магния, натрия и коэффициент лабильности катепсина Д (Р<0,05).

Последействие целанида также выражено незначительно, несмотря на большую продолжительность действия препарата и проявиляется в повышении уровня кальция (Р<0,05) и снижении концентрации общего магния и калия (Р<0,05) ниже группы хронической гипоксии.

В целом, проведенные исследования показывают, что острая ги-поксическая гипоксия оказывает дестабилизирующее действие на ли-зосомальные мембраны и приводит к накоплению кальция и натрия и потере калия и магния миокардом. В процессе привыкания к дефициту кислорода (гипоксическая тренировка) выявленные изменения сглаживаются: нормализуется уровень магния и калия и в определенной степени стабилизируется лизосомальный аппарат. Полученные результаты свидетельствуют о выраженных различиях во влиянии сензита и целанида на баланс электролитов и активность лизосомальных ферментов миокарда крыс при нормоксии и в условиях дефицита кисло-

рода, которые проявляются в нормализации нарушений обмена важнейших электролитов и уменьшении гипоксического повреждения лизосом при назначении сензита и противоположных изменениях при применении целанида, причем это действие возникает при однократном назначении лекарственных средств, в наибольшей степени проявляется при 5-дневном введении и минимально в период последействия. Биохимический анализ данных подтверадает необходимость коррегировать применение целанида при ишемии миокарда различными мембраностаби-лизирующими лекарственными препаратами.

ВЫВОДЫ

1. Острая гипоксическая гипоксия приводит к аккумуляции общего кальция и натрия и потере магния и калия кардиомиоцитами, что способствует лабилизации изучаемых лизосомальных ферментов. Хроническая гипоксия (интервальная гипоксическая тренировка), в отличие от острой, в меньшей степени дестабилизирует лизосомальный аппарат миокарда и сопровозкдается тенденцией к нормализации уровня электролитов в сердце.

2. Целанид увеличивает общее содержание кальция и натрия, снижает уровень калия и магния в сердечной мышце и стимулирует активность лизосомального аппарата миокарда крыс, что проявляется в повышении неседиментируемой активности и коэффициентов лабильности З-галактозидазы, кислой фосфатазы и катепсина Д.

3. Курсовое введение сензита приводит к снижению общего содержания кальция в сердечной мышце и подавляет катаболическую активность лизосомального аппарата миокарда при нормоксии, что проявляется в снижении неседиментируемой активности ц-галактозидазы, кислой дезоксирибонуклеазы, кислой фосфатазы и катепсина Д и уменьшении коэффициентов лабильности большинства кислых гидролаз.

4. Предварительное введение целанида не предупреждает активацию лизосомального аппарата при острой гипоксической гипоксии и усугубляет кальциевую перегрузку миокарда.

5. Курсовое введение сензита частично предотвращает выход лизо-сомальных ферментов в цитозоль при острой гипоксии и способствует нормализации содержания кальция, магния и калия в сердечной мышце.

6. Целанид усугубляет кальциевую перегрузку, вызывает потерю магния и калия кардиомиоцитами и увеличивает неседиментируемую активность катепсина Д при хронической гипоксии.

7. Сензит на фоне интервальной гипоксической . тренировки способствует нормализации электролитного баланса и активности кислых гидролаз, предотвращая повреждающее воздействие острой "высотной" гипоксии на миокард.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сравнительная активность антагонистов кальция при гипоксической гипоксии / В.Г. Макарова, К.В. Савилов, E.H. Винокурова, Б.К. Романов // Аллергия, иммунитет и патология внутренних органов: Тез. конф. - Рязань, 1995. - С. 141.

2. Винокурова E.H., Макарова В.Г. Оценка антигипоксического действия сензита // Пульмонология: Сб. резюме VI национального конгресса по болезням органов дыхания. - Новосибирск, 1996. - С. 475.

3. Макарова В.Г., Винокурова E.H. Влияние сензита на активность лизосомальных ферментов миокарда // Современные аспекты экспериментальных и клинической фармакотерапии: Сб. науч. тр. - Рязань, 1996. - С. 69-71.

4. Винокурова E.H. Активность лизосоыальных ферментов миокарда при острой гипоксии и на фоне введения целанида и сензита //Человек и лекарство: Тез. докл. IV Российского национального конгресса. - Ы.. 1997. - С. 26-27.

5. Винокурова E.H.. Макарова В.Г. Роль интерзальной гипоксической тренировки и антагониста кальция сензита при острой дыхательной недостаточности // Пульмонология: Сб. резюме VII национального конгресса по болезням органов дыхания. - М.. 1997. - С. 130.

Издательский код М 08 (03) f , j

Рязмедуниверситет. Ризограф. Заказ /9/дТ.иРаж Ы) экз- I

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Винокурова, Елена Николаевна, Рязань

л /

Г/.-/ ..

и»* ? у

1

щ./

Ч-

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РЯЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени академика И.П.ПАВЛОВА

На правах рукописи УДК 616.127-001.8:616-008.9]-085.22

ВИНОКУРОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

АКТИВНОСТЬ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ И СОСТОЯНИЕ ЭЛЕКТРОЛИТНОГО БАЛАНСА МИОКАРДА ПРИ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ В УСЛОВИЯХ ДЕЙСТВИЯ ЦЕЛАНИДА И СЕНЗИТА

03.00.04. - биохимия 14.00.25. - фармакология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1г

Научные руководители : Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор В.Г.МАКАРОВА Заслуженный деятель науки РФ, академик РАН Е.А.СТРОЕВ

Рязань, 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

рртртттгяшз1 ' 4 г4 тт)

: г t. ■'.' tj-1' ,'.„' 4M У.' зз.з. . а.......... ....г...,..,,....,,.. л. ...... ,

Т"! — —. ~ .-i ТТТ,Г.Т"ГГ..7-. д mТГГ'7 т О

¿ лава х. LiboUi -Jituibr Hi^rai, u>

1.1. Функциональная роль лизосом и их ферментов и возможности регуляции активности лизосомального аппа-

jJclTci KaJIw TKiif'I г. '

1.2. Действие гипоксии и ишемии на активность лизосомальных ферментов и электролитный баланс тканей.21

1.3. Возможности фармакологического влияния на лизосо-мальный аппарат,............................,.. 31

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ_________________..40

2.1. Моделирование гипоксических состояний____.......40

2.2. Условия проведения опытов.......................42

2.3. Методы исследования.............................45

Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ....____.......................49

Раздел 1. Влияние сензита и целанида на электролитный баланс и активность лизосомальных ферментов миокарда интактных животных................ 49

3.1.1. Однократное назначение препаратов._________...49

3.1.2. Курсовое назначение препаратов................58

3.1.3. Оценка последействия препаратов,..............68

Раздел 2. Влияние сензита и целанида на электролитный

баланс и активность лизосомальных ферментов миокарда крыс при острой гипоксической гипок-

пт/гл

3.2.1. Влияние острой гипоксии на биохимические показатели миокарда и сыворотки крови крыс..........73

3.2.2, Однократное назначение препаратов.............80

у.к.а, лурсовое назначение препаратов................ ^

3.2.4, Последействие препаратов...'...................100

Раздел 3. Влияние сензита и целанида на электролитный баланс к активность лизосомадьных ферментов миокарда крыс при хронической гипоксической

гипоксии,................................107

3.3.1. Влияние хронической гипоксической тренировки на биохимические показатели миокарда и сыворотки криви крыс.....а........ ...................

3.3.Однократное назначение препаратов............ 112

3.3.3. Курсовое назначение препаратов...............116

3.3.4. Последействие препаратов..................... 123

Глава 4. ОБСЩЦЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.____.....____.128

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. ......................................... 142

А

- .¿± -

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ- Гипоксические состояние., возникающие в результате ограничения поступления кислорода в клетку, либо в связи с потерей способности последней утилизировать его в реакциях биологического окисления, играют чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности организма. В клинике гипоксия часто осложняет течение основного заболевания сердечно-сосудистой, дыхательной систем и сочетается с нарушением регуляторных функций и включением типовых и специфических патологических реакций (В.Г. Макарова, 1987-, Л.Д. Лукьянова, 1989; В.В. Гацура, 1993; P. Poole-Wilson, 1983). Решение проблем старения, стрессовых нагрузок, работоспособности организма в конечном счете связано с устранением гипо-кеических состояний и их последствий ( Ф.З. Меерсон, М.Г. Пшенни-кова, 1988; Н.К. литров, B.C. Пауков, 1991).

Для прояснения механизмов адаптации к гипоксии крайне актуальным является исследование биохимических процессов, происходящих в клетке, и возможностей влияния на них различных лекарственных препаратов.

Известно, что одной из общих причин гибели клеток в условиях дефицита кислорода является кальциевая перегрузка (Н.А. Федоров и др., 1990) вследствие нарушения энергетического обмена, дестабилизации клеточных и субклеточных мембран и активации процессов перекисного окисления липидов (А.Е.Антипенко и др., 1992).

В связи с этим представляется интересным изучение антигипок-сичеекого эффекта целанида и сензита, разнонаправленно влияющих

на электролитный баланс миокарда. Однако, механизм действия этих препаратов нельзя объяснить только через изменение уровня ионов кальция, Менее изучено их влияние на активность лизосомальных ферментов, которым принадлежит ведущее место в развитии метаболических нарушений при гипоксии: при массивном выходе их в цитозоль наступает усиленный лизис кардиомиоцитов. что приводит к их деструкции ( Л.Е. Панин, H.H. Маянская, 1987; Т.Н. Иванова и др., 1990; R. Wattiaux, S. Wattiaux - De Coninck, 1984). Вследствие этого понятен интерес к проблеме воздействия на различные звенья повреждения клетки, особенно на активность лизосомального аппарата.

Целью исследования является изучение динамики активности лизосомальных- ферментов и электролитного баланса миокарда в условиях острой и хронической гипоксической гипоксии до и после назначения ряда кардиотропных средств.

Задачи исследования:

1. Изучить в динамике активность лизосомальных ферментов: 0-галактозидазы, кислой дезоксирибонуклеазы, кислой фосфатазы и катепсина Д и общее содержание электролитов в миокарде крыс при острой и хронической гипоксической гипоксии.

2. Оценить изменения активности некоторых кислых гидролав и электролитного состава в миокарде в условиях действия целанида и еензита при нормоксии.

3. Дать характеристику изменений активности изучаемых лизосомальных энзимов и содержания кальция, магния, калия и натрия в сердце крыс при введении целанида и еензита на фоне действия острой гипоксии.

4. Провести оценку фармакотерапевтической эффективности целанида и еензита при хронической гипоксической тренировке.

- б -

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В работе впервые дана характеристика изменений функциональной активности лизосомального аппарата миокарда при назначении сензита и целанида в условиях действия на организм "высотной" гипоксии. Впервые установлено, что целанид и сензит оказывают разнонаправленное действие на активность лизосомальных ферментов - в-галактозидазы, кислой дезоксирибонуклеазы, кислой фосфатазы и катепсина Д'. При этом сензит снижает активность кислых гидролаз и стабилизирует лизосомальные мембраны, что приводит к ограничен!® процесса гипоксического повреждения лизосомального аппарата. При назначении целанида выявлена обратная тенденция. Уточнено влияние сензита и целанида на характер изменений электролитного баланса кардиомиоцитов при действии острой и хронической гипоксической гипоксии. Впервые установлена взаимосвязь между выявленными сдвигами баланса электролитов и активностью лизосомальных ферментов миокарда,

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты исследования значительно расширяют представления о роли лизосомальных ферментов в реализации эффектов сензита и целанида на метаболизм миокарда при воздействии острой гипоксии и интервальной гипоксической тренировке. При разработке принципов лечения патологических состояний, сопровождающихся дефицитом кислорода в миокарде, необходимо учитывать роль кислых гидролаз в развитии деструктивных процессов.

В целях коррекции биохимических изменений при гипоксическом повреждении сердечной мышцы предлагается использовать сензит, имея в виду выявленную способность препарата ограничивать процесс тканевого повреждения за счет стабилизирующего влияния йа лизосомальный аппарат клеток, и более осторожно подходить к назначению целанида.

Результаты исследования внедрены в учебный процесс и используются при чтении лекций и проведении практических занятий по бн-

охкмии и патобиохимии по темам: "Обмен сложных белков"» "Патобио-химия энергетического обмена", "Патобиохимия водно-минерального обмена и кислотно-основного равновесия"; фармакологии и фармакотерапии при изучении разделов "Гликозидные и негликовидные инот-ропные средства", "Антиангинальные средства" и "Фармакотерапия ИБС" на кафедрах биологической и биоорганической химии с курсом клинической лабораторной диагностики и фармакологии с курсом фармакотерапии Рязанского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ, Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции "Аллергия, иммунитет и патология внутренних органов" (Рязань, 1995); VI (Новосибирск, 1996) и VII (Москва, 1997) национальных конгрессах по болезням органов дыхания; IV Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1997); межкафедральной научной конференции РязГМУ имени академика И.П.Павлова (1998).

ГЛаВА 1

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Функциональная роль лизосом ш их ферментов и возможности регуляции активности лигосомального аппарата клетки.

Лизосомы были открыты в 1955 году бельгийским ученым Кристианом де Дювом в клетках печени. Они представляют собой особый тип цитоплазматических образований, составляющих вакуольный аппарат клетки и выполняющих наряду с клеточным пищеварением ряд других важнейших функций. Размеры лизосом варьируют от 0,1 до 3 мкм. Ли-зосомы окружены липогликопротеидной мембраной и содержат в латентном состоянии значительные количества гидролитических ферментов. оптимум действия которых располагается в кислой зоне рН. Эти ферменты обладают различной субстратной специфичностью и способны разрушать все основные компоненты живой материи (Покровский А. А., Тутельян Б.А.,1978; Панин Л.Е., Маянская Н.Н., 1987; Антипенко А.Е. с соавт., 1992; Романов Б.К., 1994).

Пользуясь терминологией де Дюва (Ое Ош/е, 1971), вакуольный аппарат клетки, имеющий отношение к внутриклеточному пищеварению, можно подразделить на три основные группы - прелизосомы, собственно лизосомы и постлизосомы.

К прелизосомам относятся образующиеся путем эндоцитоза гете-рофагосомы и образующиеся в процессе аутофагии аутофагосомы, отличительным признаком которых является отсутствие в них лизосо-малъных Ферментов.

- g -

Собственно лизосомы разделяются на две большие подгруппы: первичные и вторичные лизосомы. Первичные лизосомы содержат недавно синтезированные гидролазы, но еще не вовлечены в процессы переваривания каких-либо веществ. Вторичные лизосомы содержат как гидролазы, так и вещества, предназначенные для переваривания, либо уже частично переваренные, либо их остатки. Так как вещества, вовлекающиеся в процесс переваривания, могут быть эндо- и экзогенного происхождения, то и вторичные лизосомы подразделяют на лизосомы аутофагического и гетерофагического типа.

К постлизосомам относятся вакуолеподобные структуры, содержащие только непереваренный материал и не содержащие уже гидролитических ферментов (остаточные тельца) (De Duve, Wattiaux, 1966).

Первичные лизосомы по своему предназначению следует считать строго детерминированными ферментными депо, которые в необходимое время включаются в процесс расщепления чужеродных веществ и самоочищения клетки (Дин Р..1981). Лизосомальные ферменты синтезируются на рибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулума, транспортируются по каналам гладкого ретикулума в аппарат Голь-джи, подвергаются здесь гликозилированию и упаковке и затем отпочковываются от него в виде везикул (первичных лизосом) (Тутель-ян В.А. и др., 1992).

Физиологическая значимость лизосом в организме определяется уникальным набором содержащихся в них ферментов. В организме лизосомы выполняют ряд важнейших функций:

1. Внутриклеточное пищеварение в процессах гетерофагоцитоза и аутофагоцитоза. Гетерофагоцитоз реализуется через зндоцитоз (захват биополимеров- из окружающей клетку микросреды). Аутофаго-цитоз способствует самообновлению структурных компонентов клетки, процессам инволюции, дифференцировки и пролиферации клеток. С ау-тофагией связывают и процессы клеточного повреждения (Тутельян В.А., Васильев A.B., 1990).

Лизосомальные ферменты играют ключевую роль в нормальном обмене тканевых белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот и в обновлении фосфолипидов клеточных мембран (Дин Р,, 1981).

3. Участвуют в реакциях ограниченного протеолиза и посттрансляционной модификации ферментов в клетке (Мертвецов, 1981; Bacclno et ab, 1981): так регулируется активность фруктозодифос-фатазы. гликогенсинтетазы, ацетил-ЕоА-каюбоксилазы, нуклеотидфос-фодизстеразы, пируваткиназы, альдолазы, фосфорилаз А и В, катала-зы и других энзимов.

4. Играют важную роль в биосинтезе, процессинге и секреции ряда гормонов: инсулина (Lundquist, Lovdahl, 1983), соматотропина и простогландинов (Betteridge, Wallis, 1979), тиреоидных гормонов (NakagaMa et al., 1981), а также в реализации их эффектов в клетках-мишенях и деградации пептидных гормонов и гормоноподобных соединений.

5. Активируют биосинтез белка в клетке при повышенной потребности в нем организма (Панин Л.Е., Маянская H.H., 1987; Szego, 1984).

6. Стимулируют новообразование митохондрий и увеличивают энергопродукцию в клетке (Vasdev, Kako, 1980; Фролов B.Ä., 1975).

7. Участвуют в адаптивных изменениях метаболизма и ультраструктур клеток при действии на организм субэкстремальных и экстремальных факторов (Панин Л.Е., Маянская H.H., 1987).

8. Инициируют процесс клеточного деления на уровне активации генома (Rokosova, Bentley, 1980; Gordon, Rothstein, 1981).

9. Участвуют в процессах физиологической, репаративной и заместительной регенерации, в механизмах воспаления и иммунитета (Панин Л.Е., Маянская H.H., 1987).

10= Выполняют детоксикационную функцию, очищал внутреннюю среду организма от чужеродных соединений (Дин Р., 1981).

Ферментный комплекс лизосом хорошо адаптирован к задачам

расщепления большинства сложных веществ и биополимеров, включая белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, пирофосфатные соединения, полисахариды, триглицериды, фосфатиды, афиры холестерина, глюко-протеиды, фосшопротеиды и глюколипиды. Общее свойство лизосомаль-ных ферментов - достаточно низкое значение оптимальных pH их активности (Дингл Дж., 1980). Почти все ферменты лизосомального матрикса и большинство ферментов, связанных с мембранами, относятся к группе кислых гидролаз, в том числе гидролаз эфиров, г ли-козидов и пептидов (эндо- и экзопептидазы). Кроме того, выделяют подкласс энзимов, действующих на ангидриды кислот, и окислительно-восстановительные ферменты (оксидоредуктазы), не относящиеся к классу гидролаз. Характерно, что большая часть ферментных белков в составе лизосом (около 80%) находится в растворенном, неструктурированном состоянии в составе лизосомального матрикса и только 20% характеризуются как связанные с мембранами (Покровский А,А,, Тутельян В.А,, 1976). В настоящее время'число известных лизосом-ных Ферментов достигло 80 и продолжает увеличиваться (Панин Л.Е., Маянская H.H., 1987).

Одной из отличительных особенностей лизосомальных кислых гидролаз является так называемая "структурно связанная латентное ть" (De Duve, 1963), которая зависит от существования мембранного барьера, ограничивающего доступ субстратов к соответствующим ферментам.

Латентность лизосомальных гидролаз поддерживается также наличием большого числа внутриклеточных ингибиторов различной природы. Ингибирующим действием на лизосомальные ферменты обладают ионы цинка (Pfeifer et al., 1980), ряд аминокислот, таких как глютаминовая кислота, аланин, глицин (Mortimore, Poso, 1984), белковые ингибиторы протеина© (Pontremoli et al., 1984). Важное значение в сохранении латентноети лизосомальных ферментов имеет наличие в их углеводных компонентах остатков N-ацетилнейраминовой

- is -

кислоты, при удалении которой изменяются конформация и каталитические свойства гидролаз (Soldstone , Koenig, 1974).

Активация лизосомально-вакуолярного аппарата (ЛБА) достаточно сложна и включает в себя усиление синтеза первичных лизосом de novo, увеличение числа и размеров вторичных лизосом (за счет ау-то- и гетерофагоцитоза), ' повышение активности кислых гидролаз и их доступности субстрату.

Особое внимание исследователей привлекает липидный состав лизосомальных мембран и наличие в них липолитических ферментов. Henning' с соавторами (1974) нашли, что отношение холестерин/фос-фолипиды в лизосомальных мембранах равно 0,52, т.е. на одну молекулу холестерина приходится две молекулы фосфолипидов. Изменение этого соотношения сказывается на стабильности лизосом (Weglickí et al,, 1974)= Жирные кислоты в лизосомах отличаются насыщенностью, что способствует более высокой стабильности мембран (Ли-зенко Е.й., 1982)= В лизосомах найдено достаточно высокое содержание гликолипидов (Bolognsni. et al., 1982), обладающих ингибиру-ющей способностью по отношению к ряду кислых гидролаз: ß-ra-лактозидазе, арилсульфатазе, кислой фосфатазе и другим (Suman et al€, 1979). Важную роль в изменении липидного состава лизосомальных мембран играют их собственные липолитические ферменты.

■Большой вклад в лабилизацию лизосомальной мембраны, сопровождающую процесс активации ЛВА клетки, вносят