Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние поверхностно-активных веществ и полисахаридов на ферментативную активность растительной фосфолипазы D

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние поверхностно-активных веществ и полисахаридов на ферментативную активность растительной фосфолипазы D"

На правах рукописи

Чеснокова Наталья Юрьевна

Влияние поверхностно-активных веществ и полисахаридов на ферментативную активность растительной фосфолипазы О

Специальность - 03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владивосток 2005

Работа выполнена в Дальневосточном государственном университете и Институте химии Дальневосточного отделения Российской академии наук.

Научные руководители:

доктор биологических наук профессор Костецкий Э.Я.

Ведущая организация:

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Щипунов Ю.А. доктор биологических наук Хотимченко СВ. доктор биологических наук Попов А.М. ТИНРО-Центр

Защита состоится « 24_» июня 2005 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 005. 005. 01. в Тихоокеанском институте биоорганической химии 'ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс (4232) 314050. E-mail: science@pibok.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеке ДВО РАН (Владивосток-22, пр. 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН)

Автореферат разослан // 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.х.н , с.н.с.

Г.И. Прокопенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Фосфолипаза D (фосфатидилхолин фосфатидогидролаза ЕС 3.1.4.4) относится к группе важных ферментов, которые в живых системах выполняют разнообразные функции от усвоения питательных веществ до синтеза биологически активных соединений. Фосфолипаза D проявляет прежде всего гидролитическую активность, в результате которой происходит расщепление сложноэфирной связи между остатком фосфатидной кислоты и спирта в молекулах фосфолипидов (ФЛ). При этом последний замещается на водород, но возможен перенос остатка фосфатидной кислоты на самые разные гидроксилсодержащие акцепторы, что представляет большой интерес для биотехнологии, так как трансфосфатидилирующая активность фосфолипазы D - может быть использована для синтеза разнообразных лекарственных препаратов (Wijk, 1992).

К особенностям фосфолипаз и фосфолипазы Д в частности, относятся условия их функционирования. Поскольку субстрат сосредоточен в биологических мембранах или мембранных органеллах, они проявляют наибольшую активность на границе раздела фаз. Когда ФЛ находятся в растворе в виде мономеров, ферментативная активность оказывается на минимальном уровне, но резко возрастает после перевода ФЛ в агрегированное состояние (Wilton, Waite, 2002). Другим важным фактором, регулирующим активность фосфолипазы D в растворе, является наличие поверхностно-активных веществ (ПАВ). Введение анионных ПАВ в состав реакционной смеси практикуется с первых работ после обнаружения фермента, поскольку в их присутствии увеличивается как скорость, так и степень гидролиза ФЛ. Между тем, механизм воздействия ПАВ на фосфолипазу D до настоящего времени не установлен. Понимание особенностей функционирования фосфолипазы D в средах с агрегированным субстратом и роли ПАВ представляет значительный интерес как для

фундаментальной, так и прикладной науки, поскольку касается ее эффективного использования в биотехнологии.

Цель и задачи исследования Цель настоящей работы заключалась в выяснении механизма воздействия ПАВ на активность фосфолипазы Б и роли агрегатного состояния субстрата в функционировании фермента.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Выяснить механизм воздействия различных ПАВ (анионных, катионных и с разными полярными группами) на активность фосфолипазы Б из белокачанной капусты в присутствии фосфатидилхолина (ФХ) как субстрата реакции, изменение ее структуры и связывание ПАВ, используя различные физико-химические методы (светорассеяние, УФ-спектроскопию и потенциометрию с ионоселективным электродом на ПАВ).

2. Исследовать функциональную активность фосфолипазы Б в водных растворах с ФХ, находящимся в виде мицелл и везикул, для выяснения зависимости функционирования фермента от агрегатного состояния субстрата.

3. Установить характер воздействия гидрофобно модифицированных полисахаридов, являющихся полимерным аналогом ПАВ, на активность и структуру фосфолипазы Б с помощью различных физико-химические методов (светорассеяния, УФ-спектроскопии и динамической реологии) и провести их сопоставление с низкомолекулярными ПАВ.

Научная новизна работы Впервые систематически исследовано влияние ПАВ на гидролитическую активность растительной фосфолипазы Б, что позволило предложить механизм их регулирующего воздействия на функционирование фермента, в котором белковая макромолекула приобретает оптимальную структуру в результате ее конформационных перестроек под воздействием введенных веществ. Установлена схожесть в

воздействии ПАВ и изменения рН среды на третичную структуру и активность фосфолипазы Б.

Впервые установлено, что полисахариды оказывают заметный эффект на функционирование фосфолипазы Б. Показано, что в отличие от низкомолекулярных ПАВ анионные полисахарид оказывал ингибирующий эффект, тогда как катионные полисахариды и ПАВ взаимодействовали с фосфолипазой Б различным образом. Обнаружено, что воздействие гидрофобно модифицированных полисахаридов на функционирование фермента определяется местом нахождения углеводородных радикалов в макромолекуле, которые присоединяются либо к заряженным функциональным группам, либо к основной цепи, располагаясь независимо от этих групп. Рассмотрен возможный механизм влияния полисахаридов на третичную структуру и активность фосфолипазы Б

Практическая значимость работы Предложенный в диссертации механизм воздействия ПАЗ на фосфолипазу Б позволяет подбирать оптимальные условия для функционирования фермента и прогнозировать его поведение в реакционных средах. Установление характера зависимости гидролитической активности фосфолипазы Б от агрегатного состояния субстрата и рН среды может- быть использовано для оптимизации ' ферментативных процессов в биотехнологии. Повышение активности фермента в присутствии катионных полисахаридов, включая гидрофобно модифицированные, позволяет предложить их в качестве альтернативы ПАВ, поскольку при использовании полимеров упрощается очистка продуктов реакции.

Положения выносимые на защиту:

- влияние различных ПАВ на гидролитическую активность фосфолипазы Б,

- регулирование активности фосфолипазы Б изменением агрегатного состояния субстрата и рН среды,

- механизм воздействия ПАВ на активность фермента,

- воздействие анионного, катионного и гидрофобно модифицированных полисахаридов на гидролитическую активность фосфолипазы D.

Апробация работы. Основные положения были представлены и доложены на региональной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по актуальным проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 1998), 12th Conférence of the European Colloid and Interface Society, Dubrovnik-Covtat, Croatia, 1998. Fist International symposium "Self-Assembly of Amphiphilic Systems", Dresden, 1998.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах.

Структура и объем работы Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, содержащий 152 ссылки. Диссертация изложена на 110 страницах, содержит 7 таблиц, 27 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

- Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследования, отражены научная новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые автором на защиту.

В первой главе рассмотрены типы и структуры ПАВ и ФЛ, а также описаны их свойства и самоорганизация в водных растворах. Приводятся данные по распространению и локализации фосфолипазы D, выделенной из растений, также описаны методы ее выделения и очистки, молекулярные характеристики, физико-химические свойства и кинетические характеристики. Обсуждены особенности взаимодействия ПАВ с белками. Кроме того, рассмотрено фазовое поведение в системах, содержащих белки и полисахариды.

Во второй главе охарактеризованы исследованные вещества. Кроме того, приведены методы выделения и очистки, приготовления растворов, проведения ферментативной реакции и анализа продуктов реакции. Описаны физико-химические методы изучения систем.

Фосфолипаза D выделялась из кочерыжки белокачанной капусты (Brassica oleracea) двумя методами, включая термическую коагуляцию и комбинированный метод по Ламбрехту и Улбрих-Хофмапн (Lambrecht, Ulbrich-Hofmann, 1992). Последний включал гомогенизацию капусты с водой (1:2), центрифугирование при lOOOg, выдерживание супернатанта при 55°С в течении 3 мин и последующее осаждение белка 0,4 объемами этанола при -15°С.

Белок в растворе определяли по методу Бредфорда.

Для получения многослойных везикул навеску ФХ растворяли в хлороформе. Раствор ФХ помещали в круглодонную колбу и высушивали под вакуумом на роторном испарителе. Тонкую пленку ФХ, полученную на стенках круглодонной колбы, диспергировали в буферном водном растворе. Однослойные везикулы получали из многослойных 5-кратным озвучиванием на частоте 22 кГц по 30 с при 5°С в инертной атмосфере.

Для определения гидролитической активности фосфолипазы D к многослойным везикулам ФХ (10 мкМ) в 0,5 мл раствора, содержащего также ПАВ или полисахарид в требуемых концентрациях, добавляли 0,16 мл 0,5 М раствора Са02, 1 мл 0,1 М ацетатного или Трис-HCl буферного раствора и 0,3 мл раствора фосфолипазы D, содержащего 0,06 мг белка. Реакционную смесь перемешивали и инкубировали в термостате при 30°С в течение 30 мин. Реакцию останавливали добавлением к реакционной смеси 2 мл хлороформа и 1 мл метанола. Содержание холина определяли рейнекатным методом.

В главе дано также описание методов УФ-спектральных исследований образцов, рассеяния света и динамической реологии.

В третьей главе приводится сравнительная характеристика препаратов фосфолипазы Б, выделенной и очищенной различными методами. Данные представлены в табл. 1.

По результатам изучения образцов фосфолипазы Б, выделенной разными методами (табл 1), предпочтение было отдано комбинированному методу, который был использован в диссертационной работе.

Таблица 1 Характеристики препаратов фосфолипазы Б

Метод очистки Содержание белка, (мг/мл) Общая активность, № Удельная активность, (ед/мг белка) Выход, % Фактор очистки

Неочищенный супернетант 2,1 0,33 0,16 не определены 1

Термическая коагуляция 0,3 0^9 0,97 83 7

Комбинированный метод 0,2 0,29 1,30 90 9

Фактор очистки - отношение содержания белка в неочищенном препарате фосфолипазы Б к содержанию белка в очищенном

Оптимальные условия функционирования фосфолипазы Б, а также ее активаторы и ингибиторы представлены в табл 2. Там же приведены характеристики ^препаратов фосфолипазы D, выделенной из капусты с различными сроками хранения, и литературные данные.

Таблица 2 Характеристики препаратов фосфолипазы Б, полученных комбинированным методом

Источ-~ ник Время года Содержание белка, (ла/л) Общая активность, (ед/л) Оптимальная температура, (С) Температура денатурации, со Оптимальные значения рН Активаторы Ингибиторы

Настоя щая работа сентябрь-октябрь 300350 976 3,15 33 35 >55 6,0 Са+г, анионные ПАВ Катион ные ПАВ

январь-апрель 200250 290 1,31 33-35 >55 6,0 Саг, анионные ПАВ Катион ные ПАВ

Литературные данные — 198,6 952 4,81 - - 5,5-6,0 Са*г, анионн ые ПАВ Катион ные ПАВ

("0

(*)—ЬатЬгесШ, 1ЛЬпсЬ-Нфпагт, 1992

Показано, что максимальную гидролитическую активность фосфолипаза D проявляла при pH 6,0 и 33-350С. При более высоких температурах наблюдалось снижение активности фермента. При температуре >550С фосфолипаза D денатурировала. В качестве активаторов гидролитической активности фосфолипазы D выступали катионы Са2+ и анионные ПАВ. Катионные ПАВ являлись ее ингибиторами.

Из табл. 2 видно, что выделенный и очищенный в диссертационной работе фермент по основным характеристикам достаточно близок к описанному в литературе (Lambrecht, Ulbrich-Hofinan, 1992).

Основные результаты изучения гидролитической активности фосфолипазы D при разных рН водного раствора полученные в работе, иллюстрируются рис. 1. Было показано, что переход от многослойных везикул (кривая 1) к однослойным (кривая 2) способствовал протеканию ферментативной реакции. Это выразилось в значительном возрастании выхода холина (более, чем в 2 раза). Обнаруженный эффект позволил предложить процедуру перевода

многослойных везикул в однослойные для интенсификации ферментативной реакции.

В работе было также установлено, что добавление к многослойным везикулам анионного ПАВ до мольного соотношения ФХ к ДДС, равного 2, приводило к возрастанию выхода холина в 2 раза (кривая 3). Дальнейший рост концентрации анионного ПАВ в системе до мольного соотношения ФХ к ДДС, равного 1:2, вызывал снижение выхода продукта реакции гидролиза

Рис. 1. Зависимость выхода хсшина при ферментативном гидролизе ФХ от рН в присутствии разных ПАВ и при различных агрегатных состояниях субстрата. 1 - многослойные везикулы, ПАВ отсутствует, 2 — однослойные везикулы, ПАВ отсутствует, 3 — многослойные везикулы с ДДС, мольное соотношение ФХ к ДДС составляет 21,4

- многослойные везикулы с ДДС, мольное соотношение ФХ к ДДС составляет 1 2, 5

- однослойные везикулы с ДДС, мольное соотношение ФХ к ДДС составляет 1 2,5, 6 - многослойные везикулы с ЦГАБ, мольное соотношение ФХ к ЦГАБ составляет 1 2

(кривая 4). При этом наблюдался сдвиг максимума гидролитической активности в кислую сторону и уширение пика.

Воздействие анионных ПАВ также зависело от агрегатного состояния субстрата. Из сопоставления кривых 2 и 5 на рис. 1 видно, что введение в систему, содержащую однослойные везикулы, небольшого количества ДДС вызывало понижение выхода продукта.

Катионный ПЛВ - ЦТАБ -инактивировал фосфолипазу В (кривая 6. рис 1), что находится в согласии с литературными данными.

Результаты изучения активности фосфолииазы В в зависимости от концентрации ПАВ в реакционной смеси показаны на рис. 2 а. Эксперименты проведены с ДДС, холатом натрия и олеатом натрия. Мольное соотношение ПАВ к ФХ варьировалось от 1:2 до 3:1. Сопоставление активности фосфолипазы В в присутствии анионных ПАВ позволило сделать вывод, что их активирующее действие коррелирует с размерами полярной группы, которая возрастала при переходе от олеата натрия к ДДС, а* затем к холату натрия. Наиболее полный гидролиз ФХ происходил в присутствии олеата натрия, имеющего минимальную по размерам функциональную группу (рис. 2 а, кривая 2). Холат натрия, в молекуле которого помимо карбоксильной группы находятся также три гидроксильные, незначительно увеличивал гидролитическую активность фосфолипазы В (рис. 2 а, кривая 3).

Наиболее сложная зависимость ферментативной активности от содержания ПАВ была обнаружена в смесях ФХ с ДЦС. Добавление

небольших количеств ДЦС (мольное соотношения ФХ к ПАВ, около 2), приводило к увеличение выхода продукта (рис. 2 а, кривая 1) Дальнейшее повышение концентрации ДДС до мольного соотношения ФХ к ДДС, равного 1, вело к спаду ферментативной активности фосфолипазы Б, а при мольном соотношении ФХ к ПАВ, равном 1:2, фермент полностью ингибировался

Возможная причина столь сложной зависимости активности фосфолипазы Б от содержания ДЦС была выявлена в ходе исследования фазового состояния субстрата в системе с помощью рассеяния света (мутности) растворами. Соответствующие результаты приведены на рис 2 б. На кривой выделены три области. Область I представляет растворы, в которых субстрат находился в виде везикул. Она простирается до мольного соотношения ФХ к ДДС, равного 2. При достижении указанного соотношения происходил переход во вторую область, в которой сосуществовали везикулы и смешанные мицеллы, состоящие из субстрата и ПАВ (рис. 2 б). При достижении мольного соотношения ФХ к ДДС, близком к 1:1,5, наблюдался переход в область III, в которой находились только смешанные мицеллы из ФХ и ДДС (рис. 2 б).

Из сопоставления зависимостей на рис. 2 а (кривая 1) и 2 б был сделан вывод, что достижение максимальной активности фосфолипазы Б происходило при мольном соотношении ФХ к ДДС, равном 2, при котором в растворе находились везикулы ФХ. Трансформация везикул в мицеллы приводила к спаду активности фосфолипазы Б (кривая 1 рис. 2 а). Наименьшая активность наблюдалась в системе, в которой завершался

СаСЗг, мМ

Рис. 3. Зависимость выхода холина при гидролизе ФХ фосфолипазой О от концентрации СаС12 в присутствии ДДС при мольнсм соотношении ФХ к ДДС, равном 2 Условия эксперимента рН -5,7,Т-37°С

переход от везикул к смешанным мицеллам из ФХ и ДДС. Таким образом, было показано, что агрегатное стояние субстрата имеет определяющее значение в функционировании фосфолипазы D. Изменяя его можно регулировать активность фермента.

Особое внимание в диссертации уделено влиянию солей кальция на активность фосфолипазы D. Они являются важным кофактором, определяющим ее функционирование. Влияние СаС12 на выход холина при гидролизе ФХ в присутствии ДДС показано на рис. 3. Добавление небольших количеств соли (до 40 мМ) приводило к увеличению выхода продукта ферментативной реакции. Кривая проходит через максимум, который находится в достаточно узком диапазоне концентраций СаС12 (3%-42мМ).

Схожая зависимость получена в случае холата натрия. На этом основании высказано предположение, что характер действия катионов Са2+ на протекание гидролитической реакции является одинаковым в присутствии анионных ПАВ. Отличия наблюдались в системах, содержащих катионный ПАВ. Введение и затем постепенное увеличение концентрации ЦТАБ приводило к монотонному увеличению выхода холина. Отсюда следовало, что ингибирующее воздействие уменьшалось с ростом содержания ПАВ.

Изучение поведения систем при добавлении катионов Са2+ показало, что в присутствии анионных ПАВ происходили значительные изменения фазового состояния. При небольших добавках СаС12 появлялась взвесь из мелких частиц. Дальнейшее увеличение содержания соли приводило к формированию хлопьев, а затем выпадению осадка. Такое поведение объяснялось образованием нерастворимых солей анионных ПАВ. В случае систем, включающих везикулы с ПАВ или смешанные мицеллы ПАВ и ФХ, при добавлении соли кальция, происходила их коагуляция и осаждение.

Формирование нерастворимых соединений в реакционных системах обычно приводит к остановке процессов. Однако в случае фосфолипазы D происходило существенное возрастание гидролитической активности. Ее спад происходил только после добавления избыточных количеств соли

кальция (рис. 3). Поскольку формирование осадка сопряжено с образованием компактной структуры, было высказано предположение о включении в нее фосфолипазы Д что по своей сути представляет ее иммобилизацию.

Рис. 4. Структурные формулы додецилдиоксиэтиленсульфата натрия.

додецилсульфата и

Для детального изучения роли соосаждения фосфолипазы D в ферментативной активности, а также связывания и взаимодействия ПАВ с ферментом были взяты два анионных ПАВ, структурные формулы которых приведены на рис. 4. Одно из них представлено ДДС, а другое -додецилдиоксиэтиленсульфатом натрия (ДДОС) При достаточно близкой структуре ДДОС отличался от ДДС тем, что не выпадает в осадок в присутствии солей кальция. Предполагалось, что это позволит выяснить воздействие осаждения на ферментативную активность.

Исследование показало, что ДДОС, эффект которого на фосфолилазу D раннее не изучался, приводил к схожему с ДДС возрастанию выхода холина, когда его мольное соотношение к ФХ варьировало в диапазоне 5:1-2:1. В этой области в системе находились везикулы. При дальнейшем увеличении содержания анионного ПАВ происходило снижение ферментативной активности. Зависимость выхода холина от концентрации ДДОС практически совпадала с той, которая показана для ДДС на рис. 2. Было высказано предположение, что спад в активности фосфолипазы D также вызван трансформацией везикул в смешанные мицеллы. Исследование воздействия ДДОС на фосфолипазу D, позволило подтвердить раннее сделанный в работе вывод, об определяющем значении агрегатного состояния субстрата в ее функционировании.

Эксперименты, проведенные с хлоридом кальция, показали, что воздействие ДДОС на активность фосфолипазы D возрастало с увеличением его содержания в реакционной смеси. Выход холина, полученный при

протекании ферментативной реакции, иллюстрируется данными, приведенными виде кривой 1 на рис. 5. Мольное соотношение ФХ к ДДОС в реакционной смеси было взято равным 2. Добавление небольших количеств СаС1г (до 50мМ) приводило к возрастанию выхода холина. При концентрации СаСЬ, равной 50мМ, достигался максимум гидролитической активности фосфолипазы D.

Изучение оптических свойств растворов, содержащих ФХ и ДДОС, от концентрации хлорида кальция (кривая 2, рис. 5) показало, что как и в случае ДДС, добавление небольших количеств приводило к появлению осадка в реакционной смеси.

Отмечено, что такое поведение имело место только при совместном присутствии ПАВ и ФХ в системе. Когда ДДОС находился один, осаждения не происходило.

В смешанной системе характер осаждения менялся с увеличением концентрации Са02 На рис. 5 отмечены три области. В области I, где происходил рост ферментативной активности фосфолипазы D, образовывался мелкодисперсный осадок, который отличался высокой коагуляционной устойчивостью. Он оставался во взвешенном состоянии на протяжении нескольких недель. С ростом содержания частицы осадка

увеличились в размерах, что приводило к снижению коагуляционной устойчивости. В области П осаждение происходило в течение нескольких часов после смешения компонентов. Выходу кривой 1 на максимум

соответствовало формирование крупных флоккул (область III), оседающих в

течение 3-10 мин после составления реакционной смеси. Полученные данные показали, что и в случае ДДОС существует взаимосвязь между осаждением компонентов и протеканием ферментативной реакции

Для изучения взаимодействия ПАВ с фосфолипазой Б в диссертационной работе был применен потенциометрический метод с

ионоселективным электродом на анионы ДДС. С его помощью определяли реальную концентрацию вещества в растворе. Проведенное исследование позволило установить, что анионы ДДС сорбируются макромолекулой фермеша Результат представлены в виде изотермы связывания ПАВ ферментом на рис. 6. Наличие двух линейных участков с разным наклоном указывало на две стадии связывания ПАВ белком. При небольших концентрациях анионы сорбировались на его поверхности на положительно заряженных группах. По мере увеличения их экранирования происходило усиление электростатических отталкивательных взаимодействий между отрицательно заряженными группами в макромолекуле белка Это приводило к развертыванию глобулы, что соответствовало второй стадии.

На основании результатов потенциометрических измерений было предположено, что изменение гидролитической активности фосфолипазы Б при добавлении ПАВ, вызвано их сорбцией и изменением третичной структуры белковой макромолекулы.

!

иСм-М

Рис. 6. Изотермы связывания ДДС ферментом в растворе, содержащем 820 мкг/мл фосфолипазы £> Кртые построены по результатам двух измерений

Высказанное предположение в работе было подтверждено с помощью УФ-спектроскопии. В качестве иллюстрации служит рис. 7, на котором представлена зависимость разницы поглощения растворов фосфолипазы D от концентрации ДДС (кривая 1) и ДДОС (кривая 2) при 280 нм. Свидетельством конформационных перестроек являлось уменьшение поглощения растворами. В работе отмечено, что оно происходило при

концентрациях ПАВ, при которых наблюдалось развертывание глобулы фермента по данным

потенциометрических измерений (рис. 6).

Сопоставление данных по оптическим свойствам реакционных смесей, сорбции ДДС макромолекулой белка, изменения ее конформации в присутствии ДДС и ДДОС с концентрационными зависимостями гидролитической активности (рис. 3, 5 Ь 6), позволило предположить механизм воздействия ПАВ на фосфолипазу D. В его основу положено изменение третичной структуры макромолекулы фермента, вызванное усилением электростатических отталкивательных взаимодействий при связывании анионов ПАВ. В ходе последовательных перестроек, происходящих при увеличении содержания веществ в реакционной смеси, достигается оптимальная третичная структура, при которой наблюдается максимальная активность фермента.

Предложенный в, диссертационной работе механизм был применен для объяснения функциональной активности фосфолипазы D от рН реакционной среды. Во внимание принят хорошо известный факт о развертывании глобулы белка и даже его денатурации при значительных смещениях от изоэлектрической точки в кислую или щелочную сторону в результате

добавок, соответственно, кислоты или щелочи. Результаты по изучению

гидролитической активности

фосфолипазы D при разных значениях рН раствора в присутствии ДДС и ДДОС показаны на рис. 8 (кривые 2, 3). Было отмечено, что максимальный выход

ш

7 в

рн холина получен не в изоэлектрическои

Рис. 8. Зависимость поглощения растворов при 280 нм в присутствии 120 мкгЛлл ТОЧКв (рН 4,7), В КОТОрОМ ферМвНТ фосфолипазы О (/) и выхода холина

(концентрация фосфолипазы С - 35 мпЛш) {2.3) нах0дился В ВИДв КОМПаКТНОЙ ГЛОбуЛЫ, а от рН водного раствора, содержащего 5 мм ДДС

при смещение рН в щелочную область. Это означало, что оптимальное состояние для функционирования достигалось после информационных перестроек фосфолипазы Б. Данный вывод подтвержден с помощью уФ-спектроскопии. Полученные результаты приведены на рис. 8 в" виде кривой 1. В четвертой главе изучено воздействие полисахаридов на

ферментативную активность фосфолипазы В. В качестве катионных полисахаридов были взяты катионные производные

гидроксиэтилцеллюлозы. В качестве анионного - Х.-каррагинан. Их обозначения, структурные формулы, молекулярная масса (ММ), степень замещения (а) катионными и гидрофобными заместителями приведены в

Рис. 9. Зависимость выхода холина от концентрации полисахаридов 1 кат- ■¡■.Г-, ! 7 ГОЭЦ, 2 кагт-ГФГОЭД 3 ГФ-кат-ГОЭЦ. 4 1сШЛ' -3' Х-каррагинан Условия эксперимента.

концентрация фосфолипазы О - 30 мкг/мл, .л г г

рН - 5,Гт - 37^с Точки представляют в диссертационной работе бьшо

средне арифметические значения выхода

холина, а черточки - средне квадратичное ВПСрВЫС ПОКЭЗсШО, ЧТО добавление

полисахаридов в реакционную смесь оказывало заметное воздействие на активность фосфолипазы Б. Эффект зависел от заряда функциональных групп в макромолекуле, наличия и места присоединения углеводородного радикала. Полученные результаты

приведены на рис. 9, на котором выход холина дается в зависимости от концентрации изученных полисахаридов.

Проведенное исследование показало, что анионный полисахарид - X-карагинан оказывал дезактивирующее действие на гидролитическую активность фосфолипазы Б (кривая 4, .рис. 9), тогда как в присутствии катионного полисахарида кат-ГОЭЦ наблюдался заметный активирующий эффект (рис. 9, кривая 1). Он проявлялся в максимальной степени при концентрации кат-ГОЭЦ 0,15-0,2 мае. %. Дальнейшее увеличение содержания полисахарида приводило к достаточно резкому уменьшению выхода холина.

Таблица 3 Обозначение, структурные формулы, ММ и степень замещения (а) катионными и углеводородными группами в расчете на мономерный остаток

Введение углеводородных радикалов в макромолекулу кат-ГОЭЦ изменяло характер воздействия катионных полисахаридов на гидролитическую активность фосфолипазы D В небольших количествах (до 0,15 мае %) они вызывали некоторое снижение выхода холина (кривые 2 и 3, рис 9) С ростом содержания кат-ГФГОЭЦ (кривая 2) характер его воздействия на активность фермента сохранялся, тогда как ГФ-кат-ГОЭЦ (кривая 5) начинал активировать фосфолипазу D При этом кривая 3 выходила на кривую 1, что говорило о сходстве его воздействия с кат-ГОЭЦ в области высоких концентраций

Сопоставление кат-ГФГОЭЦ с ГФ-кат-ГОЭЦ показало, что эффект гидрофобно модифицированных катионных полисахаридов определялся местом присоединения углеводородных радикалов В одном случае они были присоединены непосредственно к катионным группам, а в другом - к остаткам глюкопиранозы, располагаясь независимо от них (табл 3) Это, как предположено в диссертационной работе, обусловило отличия в характере их взаимодействий с ферментом Отсутствие заметного эффекта на активность фермента при небольших концентрациях ГФ-кат-ГОЭЦ, возможно, было вызвано их удаленностью от активного центра в макромолекуле фософлипазы D Увеличение концентрации полисахарида сопровождалось дальнейшим связыванием и приводило к конформационным перестройкам белковой макромолекулы Отмечено, что при этом наблюдалось увеличение ферментативной активности

Изучение растворов смесей полисахаридов с фосфолипазой D методами светорассеяния, динамической реологии и УФ-спектроскопии показало наличие корреляций между ферментативной активностью и связыванием катионных производных ГОЭЦ с макромолекулой фермента, а также изменением конформации последней

Из сопоставления данных, полученных с помощью различных физико-химических методов, с результатами изучения выхода холина высказано

предположение о возможном механизме воздействия катионных полисахаридов на функционирование фософлипазы Б. Как и ПАВ их введение в реакционную систему приводило к связыванию с ферментом. Поскольку при этом изменялся баланс электростатических взаимодействий в белковой макромолекуле, ее конформация изменялась, что подтверждалось УФ-спектральными исследованиями. Конформационные перестройки сопровождались изменениями ферментативной активности. Ее спад за максимумом на кривых концентрационных зависимостей (кривые 1 и 3, рис. 9) может объясняться либо переходом к менее оптимальной конформации, либо экранированием активного центра макромолекулами полисахаридов.

В диссертационной работе проведено сопоставление ПАВ и гидрофобно модифицированных производных кат-ГОЭЦ по их воздействию на функциональную активность фосфолипазы Б. Последние являются полимерным аналогом первых, поскольку содержат углеводородные цепи. Было отмечено, что между ними имеются как сходства, так и отличия в воздействии на гидролитическую активность фермента. Сходство с катионными ПАВ заключалось в том, что кат-ГФГОЭЦ оказывал сходный ингибирующий эффект на ферментативную активность. В его макромолекуле углеводородные цепи непосредственно присоединены к заряженной группе, как и в молекуле ПАВ. Когда они были присоединены к основной цепи полисахарида, независимо от заряженных групп, как это имеет место в случае ГФ-кат-ГОЭЦ, тогда наблюдалось активирующее воздействие на фосфолипазу Б. Этим катионные производные ГОЭЦ отличаются от ПАВ, в случае которых выход холина возрастал только при добавлении анионных веществ. На этом основании высказано предположение о том, что ПАВ и полисахариды могут различным образом взаимодействовать с фосфолипазой Л.

ВЫВОДЫ

1. Проведено систематическое исследование активирующего воздействия анионных ПАВ на гидролитическую активность фосфолипазы Б и установлено, что их воздействие коррелирует с размерами полярных групп молекулы ПАВ, их сорбцией на макромолекуле фермента, изменением его конформации и осаждением.

2. Предложен механизм воздействия ПАВ на активность фосфолипазы D, связанный с переходом к оптимальной третичной структуре в результате конформационных перестроек, вызванных усилением электростатических отталкивательных взаимодействий при сорбции заряженных молекул ПАВ на макромолекуле белка Аналогичный механизм применим для объяснения зависимости функциональной активности фермента от рН реакционной среды.

3. Установлена зависимость гидролитической активности фосфолипазы Б от агрегатного состояния субстрата. Показано, что скорость и выход продуктов ферментативной реакции возрастают при переводе многослойных везикул ФХ в однослойные, в том числе при введении ПАВ в систему.

4. Показано, что ПАВ оказывают воздействие на функционирование фермента через изменение агрегатного состояние субстрата, вызывая трансформацию везикул в смешанные мицеллы.

5. Найдено, что заряд, наличие и место присоединения углеводородных радикалов в макромолекуле полисахаридов оказывают заметное воздействие на гидролитическую активность фосфолипазы Б.

6. Установлено, что в отличие от ПАВ анионные полисахариды проявляют ингибирующий эффект, тогда как катионные полисахариды и ПАВ взаимодействуют с фосфолипазой Б различным образом

7. На основании проведенных исследований, высказано предположение о механизме воздействия полисахаридов на функциональную активность фосфолипазы Б и предложено использовать их катионные формы в качестве

активаторов фермента взамен анионных ПАВ при проведении биотехнологических процессов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шумилина Е.В., Зонова Н.Ю. (Чеснокова Н.Ю.), Щипунов Ю.А. Влияние поверхностно-активных веществ на активность фосфолипазы DII Биологические мембраны 1998, Т. 15, №4, С. 414-419.

2. Шумилина Е.В., Зонова НЮ. (Чеснокова Н.Ю.), Муханева Ю.А., Щипунов Ю.А. Влияние соосаждения и взаимодействий с анионными поверхностно-активными веществами на активность растительной фосфолипазы DII Биохимия. 1999, Т. 64, вып. 8, С. 1052-1059.

3. Зонова Н.Ю. (Чеснокова НЮ.) Роль агрегатного состояния субстрата в функционировании фосфолипазы D II Тез. докл. региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии и экологии студентов, аспирантов и молодых ученых. Владивосток: изд-во ДВГУ, 2-3 октября 1998, С. 45-46.

4 N. Yu. Zonova (N. Yu. Chesnokova) , A. V. Chesnokov, E. V. Shumihna, Yu. A. Shchipunov. Influence of Amphiphiles of the activity of native and immobilized Phospholipase D II Book of abstracts of 12th Conf. of the European Colloid and Interface Society. Dubrovnik-Cavtat (Croatia), 20-25 Sept. 1998. P. 58.

5. N. Yu. Zonova (N. Yu. Chesnokova), E. V. Shumilina, Yu A. Shchipunov. The Hydrolysis of Lecithin by Phospholipase D in Mixtures with Surfactants // Program and Abstracts of. First International Symposium "Self-Assembly ofAmphiphilic systems". Dresden (Germany), 13-16 Sept. 1998. D31.

Чеснокова Наталья Юрьевна

Влияние поверхностно-активных веществ и полисахаридов на ферментативную активность растительной фосфолипазы О

Автореферат диссертации

Отпечатано по оригинал-макету, подготовленному соискателем, минуя редподготовку Вне плана

Подписано в печать 12.05.05. Формат 60x84/16 Усл.-печ.л 1,4. Уч.-изд.л. 1,5 Тираж 100 экз. Заказ № 99

Издательство Дальневосточной государственной академии экономики иуправления Участок оперативной полиграфии 690950, Владивосток, Океанский пр., 19 тел. 40-66-35Е-mail:rio@psue.ru

1737

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чеснокова, Наталья Юрьевна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Амфифилы и их классификация

1.1.1. Характеристика синтетических поверхностно-активных 10 веществ

1.1.2. Распространение, структура и функция фосфолипидов

1.1.3. Агрегатное состояние фосфолипидов в водном растворе

1.1.4. Воздействие поверхностно-активных веществ на 19 агрегатное состояние фосфатидилхолина в растворе

1.2. Типы фосфолипаз

1.2.1. Распространение, локализация и функции фосфолипазы 27 • D

1.2.2. Методы выделения и очистки фосфолипазы D

1.2.3. Молекулярные характеристики фосфолипазы D

1.2.4. Гидролитическая активность фосфолипазы D

1.2.5. Трансферазная активность

1.2.6. Кинетика и механизм реакций

1.3. Взаимодействие поверхностно-активных веществ с 43 белками

1.4. Взаимодействие полисахаридов с белками

Глава 2. Материалы и методики эксперимента

2.1.1. Материалы

2.1.2. Выделение фосфолипазы D 54 2.2. Методы исследований

2.2.1. Приготовление липидных везикул

2.2.2. Определение гидролитической активности

2.2.3. Определение холина рейнекатным методом

2.2.4. Определение содержания белка в препаратах 56 фосфолипазы D

2.2.5. Съемка УФ-спектров растворов

2.2.6. Измерение мутности растворов

2.2.7. Потенциометрические измерения растворов

2.2.8. Реологические измерения растворов

Глава 3. Влияние поверхностно-активных веществ на ферментативную активность фосфолипазы D 3.1 Характеристики препаратов фосфолипазы D

3.2. Влияние поверхностно-активных веществ на активность 62 фосфолипазы D

3.3. Действие солей кальция на ферментативную активность 67 фосфолипазы D

3.4. Влияние соосаждения фосфолипазы D кальциевыми 70 солями анионных поверхностно-активных веществ на ее активность

3.5. Механизм воздействия анионных поверхностно- 74 активных веществ на фосфолипазу D

Глава 4. Влияние полисахаридов на ферментативную активность фосфолипазы D

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние поверхностно-активных веществ и полисахаридов на ферментативную активность растительной фосфолипазы D"

Актуальность работы. Фосфолипаза D (фосфатидилхолин фосфатидогидролаза ЕС 3.1.4.4) относится к группе важных ферментов, которые в живых системах выполняют разнообразные функции от усвоения питательных веществ до синтеза биологически активных соединений. Фосфолипаза D проявляет прежде всего гидролитическую активность, в результате которой происходит расщепление сложноэфирной связи между остатком фосфатидной кислоты и спирта в молекулах фосфолипидов (ФЛ). При этом последний замещается на водород, но возможен перенос остатка фосфатидной кислоты на самые разные гидроксилсодержащие акцепторы, что представляет большой интерес для биотехнологии, так как трансфосфатидилирующая активность фосфолипазы Д как показано в работах Виджика и Аурича с соавт. (Wijk et al, 1992; Aurich et al, 1997; Aurich et al, 2002), может быть использована для синтеза разнообразных лекарственных препаратов.

К особенностям фосфолипаз и фосфолипазы Д в частности, относятся условия их функционирования. Поскольку субстрат сосредоточен в биологических мембранах или мембранных органеллах, они проявляют наибольшую активность на границе раздела фаз. Когда ФЛ находятся в растворе в виде мономеров, ферментативная активность оказывается на минимальном уровне, но резко возрастает после перевода ФЛ в агрегированное состояние (Wilton, Waite, 2002). Другим важным фактором, регулирующим активность фосфолипазы D в растворе, является наличие поверхностно-активных веществ (ПАВ). Введение анионных ПАВ в состав реакционной смеси практикуется с первых работ после обнаружения фермента (Dawson, Hemington, 1967; Quarles, Dawson, 1969), поскольку в их присутствии увеличивается как скорость, так и степень гидролиза ФЛ. Между тем, механизм воздействия ПАВ на фосфолипазу D до настоящего времени не установлен. Понимание особенностей функционирования фосфолипазы D в средах с агрегированным субстратом и роли ПАВ представляет значительный интерес как для фундаментальной, так и прикладной науки, поскольку касается ее эффективного использования в биотехнологии.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в выяснении механизма воздействия ПАВ на активность фосфолипазы D и роли агрегатного состояния субстрата в функционировании фермента.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Выяснить механизм воздействия различных ПАВ (анионных, катионных и с разными полярными группами) на активность фосфолипазы D из белокачанной капусты в присутствии фосфатидилхолина (ФХ) как субстрата реакции, изменение ее структуры и связывание ПАВ, используя различные физико-химические методы (светорассеяние, УФ-спектроскопию и потенциометрию с ионоселективным электродом на ПАВ).

2. Исследовать функциональную активность фосфолипазы D в водных растворах с ФХ, находящимся в виде мицелл и везикул, для выяснения зависимости функционирования фермента от агрегатного состояния субстрата.

3. Установить характер воздействия гидрофобно модифицированных полисахаридов, являющихся полимерным аналогом ПАВ, на активность и структуру фосфолипазы D с помощью различных физико-химические методов (светорассеяния, УФ-спектроскопии и динамической реологии) и провести их сопоставление с низкомолекулярными ПАВ.

Научная новизна работы. Впервые систематически исследовано влияние ПАВ на гидролитическую активность растительной фосфолипазы D, что позволило предложить механизм их регулирующего воздействия на функционирование фермента, в котором белковая макромолекула приобретает оптимальную структуру в результате ее конформационных перестроек под воздействием введенных веществ. Установлена схожесть в воздействии ПАВ и изменения рН среды на третичную структуру и активность фосфолипазы D.

Впервые установлено, что полисахариды оказывают заметный эффект на функционирование фосфолипазы D. Показано, что в отличие от низкомолекулярных ПАВ анионный полисахарид оказывал ингибирующий эффект, тогда как катионные полисахариды и ПАВ взаимодействовали с фосфолипазой D различным образом. Обнаружено, что воздействие гидрофобно модифицированных полисахаридов на функционирование фермента определяется местом нахождения углеводородных радикалов в макромолекуле, которые присоединяются либо к заряженным функциональным группам, либо к основной цепи, располагаясь независимо от этих групп. Рассмотрен возможный механизм влияния полисахаридов на третичную структуру и активность фосфолипазы D.

Практическая значимость работы. Предложенный в диссертации механизм воздействия ПАВ на фосфолипазу D позволяет подбирать оптимальные условия для функционирования фермента и прогнозировать его поведение в реакционных средах. Установление характера зависимости гидролитической активности фосфолипазы D от агрегатного состояния субстрата и рН среды может быть использовано для оптимизации ферментативных процессов в биотехнологии. Повышение активности фермента в присутствии катионных полисахаридов, включая гидрофобно модифицированные, позволяет предложить их в качестве альтернативы ПАВ, поскольку при использовании полимеров упрощается очистка продуктов реакции.

На защиту выносятся:

- влияние различных ПАВ на гидролитическую активность фосфолипазы Д

- регулирование активности фосфолипазы D изменением агрегатного состояния субстрата и рН среды,

- механизм воздействия ПАВ на активность фермента,

- воздействие анионного, катионного и гидрофобно модифицированных полисахаридов на гидролитическую активность фосфолипазы D.

Апробация работы. Основные положения были представлены и доложены на региональной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы морской биологии и экологии" (Владивосток, 1998); 12th Conference of the European Colloid and Interface Society, Dubrovnik-Covtat, Croatia, 1998. Fist International symposium "Self-Assembly of Amphiphilic Systems", Dresden, 1998.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждения, заключение, выводы и список литературы, содержащий 152 ссылки. Работа изложена на 110 страницах, содержит 7 таблиц, 27 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Чеснокова, Наталья Юрьевна

Выводы

1. Проведено систематическое исследование активирующего воздействия анионных ПАВ на гидролитическую активность фосфолипазы D и установлено, что их воздействие коррелирует с размерами полярных групп молекулы ПАВ, их сорбцией на макромолекуле фермента, изменением его конформации и осаждением.

2. Предложен механизм воздействия ПАВ на активность фосфолипазы Д связанный с переходом к оптимальной третичной структуре в результате конформационных перестроек, вызванных усилением электростатических отталкивательных взаимодействий при сорбции заряженных молекул ПАВ на макромолекуле белка. Аналогичный механизм применим для объяснения зависимости функциональной активности фермента от рН реакционной среды.

3. Установлена зависимость гидролитической активности фосфолипазы D от агрегатного состояния субстрата. Показано, что скорость и выход продуктов ферментативной реакции возрастают при переводе многослойных везикул ФХ в однослойные, в том числе при введении ПАВ в систему.

4. Показано, что ПАВ оказывают воздействие на функционирование фермента через изменение агрегатного состояние субстрата, вызывая трансформацию везикул в смешанные мицеллы.

5. Найдено, что заряд, наличие и место присоединения углеводородных радикалов в макромолекуле полисахаридов оказывают заметное воздействие на гидролитическую активность фосфолипазы D.

6. Установлено, что в отличие от ПАВ анионные полисахариды проявляют ингибирующий эффект, тогда как катионные полисахариды и ПАВ взаимодействуют с фосфолипазой D различным образом.

7. На основании проведенных исследований, высказано предположение о механизме воздействия полисахаридов на функциональную активность фосфолипазы D и предложено использовать их катионные формы в качестве активаторов фермента взамен анионных ПАВ при проведении биотехнологических процессов.

Заключение

Систематическое исследование функционирования фосфолипазы D, выделенной из белокачанной капусты, в присутствии анионных, катионных и с разными полярными группами ПАВ позволило выявить основные особенности их воздействия на гидролитическую активность фермента. Впервые установлена зависимость активирующего эффекта анионных ПАВ от размера их полярной области. Повышение как скорости, так и степени гидролиза субстрата наблюдалось при переходе к веществам с менее объемными функциональными группами.

Изучение активности фосфолипазы D в средах, в которых субстрат (ФХ) находился в виде многослойных и однослойных везикул, мицелл, а также смеси из мицелл и везикул, показало, что она зависит от агрегатного состояния ФХ. В частности, перевод многослойных везикул в однослойные способствовал росту гидролитической активности фермента. Показано, что ПАВ наряду с воздействием на фосфолипазу D также вызывают трансформацию везикул в смешанные мицеллы, что сказывается на активности фермента. Изменение агрегатного состояния субстрата под действием ПАВ дает дополнительную возможность для воздействия на ферментативные процессы.

Исследование воздействия ПАВ на структуру фермента и их связывание белковой макромолекулой с использованием различных физико-химических методов, включая светорассеяние, УФ-спектроскопию и потенциометрию с ионоселективным электродом на ПАВ, позволило предложить механизм воздействия ПАВ на активность фосфолипазы D. Наблюдаемый рост ее функциональной активности объяснен переходом к оптимальной третичной структуре в результате конформационных перестроек, вызванных связыванием заряженных молекул ПАВ. Показано, что схожая картина имеет место при варьировании рН реакционной смеси. Предложенный механизм регулирования структуры фосфолипазы D с помощью введенных ПАВ и изменения рН раствора открывает возможности для подбора оптимальных условий функционирования фермента и прогнозирования его поведение в реакционных средах, что может быть использовано для оптимизации биотехнологических процессов.

Впервые изучен ферментативный гидролиз ФХ под действием фосфолипазы D в присутствии полисахаридов. В их числе находились также производные, содержащие углеводородные радикалы, что представляет собой полимерный аналог ПАВ. Было установлено, что полисахариды оказывают заметное воздействие на активность фосфолипазы D, вызывая как ее повышение, так и понижение. Эффект зависел от заряда макромолекулы, наличия и места присоединения углеводородного радикала. В частности, установлено, что в отличие от ПАВ анионные полисахариды проявляют ингибирующий эффект, тогда как катионные полисахариды и ПАВ могут взаимодействовать с фосфолипазой D различным образом. Это отличает полисахариды от низкомолекулярных ПАВ, в случае которых активирующий эффект наблюдался при добавлении отрицательно заряженных веществ.

Обнаружение воздействия полисахаридов на функционирование фосфолипазы D позволяет предложить их в качестве активирующих добавок при проведении ферментативного синтеза взаимен анионных ПАВ. При этом V они имеют одно важное достоинство перед последними, заключающееся в облегченной процедуре очистки низкомолекулярных продуктов ферментативной реакции от полимеров.

94

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чеснокова, Наталья Юрьевна, Владивосток

1. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества // Л: Химия, 1981.304 с.

2. Абрамзон А.А., Бочаров В.В., Гаевой Г.М. Поверхностно-активные вещества II Справочник. Л: Химия, 1979. 376 с.

3. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты И М: «Высшая школа» 1987. 157 с.

4. Дарбе А. Практическая химия белка// М.: Мир, 1989. 623 с.

5. Жоли М. Физическая химия денатурации белков // М.: Мир, 1968. 364 с.

6. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя IIМ.: Наука, 1981. 296 с.

7. Ивков И.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран IIМ.: Наука, 1982. 224 с.

8. Камман К. Работа с ионселективными электродами II Мир, Москва. 1980. 283 с.

9. Маркина З.Н., Паничева Л.П., Задымова Н.М. Предмицеллярная ассоциация в водных растворах ионогенных и неионогенных ПАВ И Ж. Всес. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. 1989. Т. 34, № 2. С. 245252.

10. Паничева Л.П., Маркина З.Н. Предмицеллярная ассоциация в водных растворах додецилсулъфата натрия II Коллоидн. ж. 1981. Т. 43. № 4. С. 671-677.

11. И.Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов // Изд. Московского университета. 1994. 288 с.

12. Шумилина Е.В., Чесноков А.В., Братская С.Ю., Василевский В.А., Щипунов Ю.А. Иммобилизация фосфолипазы D металлохелатнымметодом на стекле и углеродном волокне // Биотехнология. 1997. № 2. С. 24-31.

13. Щипунов Ю.А. Самоорганизующиеся структуры лецитина II Успехи химии. 1997. Т. 66, № 4. с. 328-352.

14. Abousalham A., Nari J., Teissere М., Ferte N., Noat G., Verger R. Study of fatty asid specificity of sunflower phospholipase D using detergent/phospholipids micelles // Eur. J. Biochem. 1997. V. 248. P. 374-379.

15. Abousalham A., Riviere M., Teissere M., Verger R. Improved purification and biochemical characterization of phospholipase D from cabbage//Biochim. Biophys. Acta. 1993. V. 1158. P. 1-7.

16. Allgyer Т., Wells M. Phospholipase D from Savoy cabbage: purification and preliminary kinetic characterization //Biochemistry. 1979. V. 18 № 24. P. 5348-5353.

17. Almgren M. Mixed micelles and other structures in the solubilization of bilayer lipid membranes by surfactants //Biochem. Biophys. Acta. 2000. V. 77976. P. 1-18.

18. Ananthapadmanabhan K. Protein-surfactant interactions // CRC Press, Boca Raton. 1993. P. 319-365.

19. Antia, N., Bilinski E., Lau Y. Identification and characterization of phospholipase D in a unicellular red alga (fwrphyridium cruentum) И V Can. J. Biochem. 1970. Vol. 48. P. 643-548.

20. Aurich I., Diirrschmidt P., Hirche F., Ulbrich-Hofmann R. Transesterification of alkylphosphate esters by phospholipase D И Biotechnology Letters. 1997. V. 19 № 9. P. 875-879.

21. Aurich I., Diirrschmidt P., Schierhorn A., Ulbrich-Hofmann R. Production of octadecylphospho-L-serine by phospholipase D // Biotechnology Letter. 2002. V. 24. P. 585-590.

22. Beattie F. A colorimetric method for the determination of choline and acetylcholine in small amount //Biochem J. 1935. V. 209. P. 2065.

23. Bergenstahl В., Fontell К. Phase equilibria in system soybean lecithin/water// Progr. Colloid Polym. Sci. 1983. V. 68. P. 48-52.

24. Betgmeyer H. Phospholipases // Methods of enzymatic analysis. 1983. V. 2. P. 280-291.

25. Bosch H. Phospholipases DII Phospholipids. 1982. V. 577. P. 344-350.

26. Bossi L. D., Arrigo P., Pedrocchi-Fantoni G., Mele A., Servi S., Leiros J. The substrate requirements of phospholipase D II J. Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2001. V. 11. P. 433-438.

27. Brauer D., Schubert C., Comer D. Calcium activation of maiz root phospholipase D// Plant Nut. 1991. V. 14. P. 729-740.

28. Brown J.H., Lynch D.V., Thompson J.E. Molecular species specificity of phospholipids breakdown in microsomal membranes of senescing carnation flowers// Plant Physiol. 1987. V. 85. P. 679-683.

29. Burgess D., Downey G. Effect of coagulation bath composition on the composition and texture of casein-carrageenan fibres II J. Food Sci. technology. 1979. V. 8. P. 151-157.

30. Burkhard R., Stolzenberg G. Interaction between sodium dodecyl sulfate andferrycitochrome СII Biochemistry. 1972. V. 11. P. 1672-1677.

31. Carrea G., D'Arrigo P., Piergianni V., Roncaglio S., Secundo F., Servi S. Purification and properties of two phospholipase D from Streptomyces sp.// Biochem. Biophys. Acta. 1995. V. 1255. P. 273-279.

32. Cocera M., Lopez O., Estelrich J., Parra J.L., Maza A. Kinetic and structural aspects of adsorption of sodium dodecyl sulfate on phoshatidylcholine liposomes // Langmuir. 2000. V. 16. P. 4068-4071.

33. Comper W., Lorent T. An estimate of the enthalpic contribution to the interaction between dextran and albumin // Biochemical J. 1978. V. 175. P. 703-708.

34. Cuatrecasas P. Properties of insulin receptor isolated from liver and fat cell membranes II J. Biol. Chem. 1972. V. 247. P. 1980-1991.

35. Daniel L., Sciorra V., Ghosh S. Phospholipase D, turmor promoters, proliferation and prostaglandins II Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1439. P. 265-270.

36. Davidson F., Long C. The structure of the occurring phosphoglycerids II Biochem. J. 1958. V. 69. № 3. P. 458-466.

37. Dawson R. M. The formation of phosphatidylglycerol and other phospholipids by the transferase activity of phospholipase DII Biochem. J. 1967. V. 102. P. 205-210.

38. Dennis E. Micelization and solubilization of phospholipids by surfactants II Adv. Colloid Int. Sci. 1986. V. 26. P. 155-175.

39. Dickerson R., Tokano Т., Eisenberg D., Kallai В., Samson L., Cooper A., Margvliash E. Ferricytochrome СII J. Biol. Chem. 1971. V. 246. P. 1511-1533.

40. Doi O., Nojima S. Phospholipase С from Pseudomonas fluorescens // Biochem. Biophys. Acta. 1971. V. 248. P. 234-244.

41. Dyer I., Ryu S., Wang X. Multiple forms of phospholipase D following germination and during leaf development of castor bean II Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 715-724.

42. Edmond E., Orgston A. An approach to the study of phase separation in ternary aqueous systems II Biochemical J. 1968. V. 109. P. 469-576.

43. Estrela-Lopis I., Brezesinski G., Mohwald H. Influence of model membrane structure on phospholipase D activity // Phys. Chem. Chem. Phys. 2000. V. 2. P. 4600-4604.

44. Exton J. H. New developments in phospholipase D II J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 15579-15582.

45. Exton J. H. Phospholipase DII Biochem. Biophys. Acta. 1998. V. 1436. P. 105-115.

46. Fattal D.R., Andelman D., Ben-Shaul A. The vesicle-micelle transition in mixed lipid-surfactant systems: a molecular model //Langmuir. 1995. Vol. 11. P. 1154-1161.

47. Flora M., Davidson M., Long C. The structure of the naturally occurring phosphoglycerides I I Biochemical J. 1958. V. 69, № 3. P. 458-466.

48. Glick D. Concerning the reineckate method for the determination of choline U J. Biol. Chem. 1944. V. 156. P. 643-651.

49. Gunstone F., Harwood J., Padley F. The Lipid Handbook II Chapman and Hall, London. 1994. 693 p.

50. Hagishita Т., Nishikawa M., Hatanaka T. Isolation of phospholipase D producing microorganisms with high transphosphatidylation activity И Biotechnology Letters. 2000. V. 22. P. 1587-1590.

51. Hanahan D. J., Chaikoff J. L. A new phospholipide splitting enzyme specific for the ester linkage between the nitrogenous base and the phosphoric acid grouping //J. Biol. Chem. 1947. V. 169. P. 699-705.

52. Hatanaka Т., Negishi Т., Kubota-Akizawa M., Hagishita T. Study on thermostability of phospholipase D from Streptomyces sp.// Biochem. Biophys. Acta. 2002. V. 1598. P. 156-164.

53. Hato M., Shinoda К. Krafft points of calcium and sodium dodecylpoly(oxyethylene)sulfates and their mixtures И J. Phys. Chem. 1973. V. 77. P. 378-381.

54. Hawthorne J.N., Ansell G.B. Phospholipids // New Comprehensive Biochem. Elsevier Biomedical Press. 1982. V. 4. 357 p.

55. Hayakawa K., Kwak J. In cationic surfactants II Physical chemistry. Marcel Dekker, New York. 1991. P. 189-248.

56. Helenius A., Mc. Caslin D., Fries E., Tanford C. Properties of detergents I I Methods Enzymol. 1979. V. 56. P. 734-749.

57. Helenius A., Simons K. Solubilization of membranes by detergents II Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 415. P. 29-46.

58. Heller M. Phospholipase D И Adv. Lipid Res. 1978. V. 16. P. 267-326.

59. Heller M., Aladjem E., Shapiro B. Phospholipase D in peanut seeds II Bulletin de la Societi'de chemie biologigue. 1968. V. 50. № 3. P. 13951408.

60. Heller M., Mozes N., Peri J., Maes E. Final purification and some properties of the enzyme II Biochem. Biophys. Acta. 1974. V. 369. P. 397-410.

61. Hirche F., Schierhorn A., Scherer G., Ulbrich-Hofmann R. Enzymatic Introduction of N-heterocyclic and as-containing head groups into glicerophospholipids И Tetrahedron Letters. 1997. V. 38, № 8. P. 13691370.

62. Imamura S., Horiuti Y. Purification of Streptomyces chromofuscus phospholipase D by hydrophobic affinity chromatography on palmitoil cellulose И Biochemistry. 1979. V. 85. P. 79-95.

63. Jones M.N., Brass A. Interactions between small amphipathic molecules and proteins // Food Polymers, Gels and Colloid. Ed. Dickenson. The royal Soc. Chem. London. 1991. P. 65-80.

64. Jones M. N. Surfactant interactions with biomembranes and proteins // Chem. Soc. Rev. 1992. V. 2. P. 127-136.

65. Jonsson В., Lidman В., Holmberg К., Kronberg В. Surfactants and polymers in aqueous solution II Chichester.: John Wiley & Sons 1998. 438 p.

66. Jto A., Sato R. Purification by means of detergnts and properties of cytochrome b5from liver microsomes // J. Biol. Chem. 1968. V. 243. P. 4922-4923.

67. Juneja L., Hibi N., Jnagaki N., Yamane Т., Shimizu S. Comparative study on conversion of phosphatidylcholine to phosphatidylglycerol by cabbage phospholipase D in micelle and emulsion systems II Enzyme Microb. Technol. 1987. Vol. 9. P. 350-354.

68. Juneja L., Hibi N.,Yamane Т., Shimizu S. Repeated batch and continuous operations for phosphatidylglycerol synthesis from phosphatidylchline with immobilized phospholipase DII Appl. Microbiol Biotechnol. 1987. V. 27. P. 146-151.

69. Katan M. Families of phosphoinositide-specific phospholipase C: structure and function // Biochem. Biophys. Acta. 1998. V. 1436. P. 517.

70. Kates M., Sastry P. Phospholipase D // Methods Enzymol. 1969 V. 14. P. 197-212.

71. Kim J.H., Kim Y., Lee S.D., Lopez I., Arnold R.S., Lambeth J.D., Suh P., Ryu S.H. Selective activation of phospholipase D2 by unsaturated fatty acid//FEBS Lettes. 1999. V. 454. P. 42-46.

72. Kruif C. G., Tuinier R. Polysaccharide protein interactions // Food Hydrocolloids. 2001. V. 15. P. 555-563.

73. Kukusho Y., Tsunoda A., Kato S., Machida H., Iwasaki S. Production of various phosphatidylsaccharides by phospholipase D from Actinomadura sp. Stran no. 362II Biosci. Biotech. Biochem. 1993. V. 57, № 8. P. 13021305.

74. Lambrecht R., Ulbrich-Hofmann R. A facile purification procedure of phospholipase D from Cabbage and its characterization // Biol. Chem. Hoope-Seyler 1992. V. 373. P. 81-88.

75. Lapanje S. Physicochemical aspects of protein denaturation // Wiley-Interscience, New York. 1978. P. 453.

76. Lee H., Choi M., Koh E. Purification and characterization of the active site of phospholipase D // Korean Biochem. J. 1989. V. 22, № 4. P. 187193.

77. Li L., Fleming N. Aluminum fluoride inhibition of cabbage phospholipase D by a phosphate-mimicking mechanism II FEBS Letters. 1999. V. 461. P. 1-5.

78. Lichtenberg D., Robson R., Dennis E. Solubilization of phospholipids by detergents II Biochim. Biochys. Acta. 1983. V. 737. P. 285-304.

79. Lichtenberg D., Zilberman Y., Greenzaid P., Zamir S. Structural and kinetic studies on the solubilization of lecithin by sodiumdeoxycholate II Biochemistry 1979. V. 18. P. 3517-3525.

80. Luzzati V., Gulik-Krzywicki Т., Tardieu A. Polymorphism of lecithins // Nature. 1968. V. 218. P. 1031-1034.

81. Makino S., Reynolds J., Tanford C. The binding of deoxycholate and Triton X-100 to proteins Hi. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 4926-4932.

82. Mandal S., Sen P., Charabarti P. In vitro synthesis of phosphatidylinositol and phosphatidylcholine by phospholipase D II Phytochemistry. 1980. V. 19. P. 1661-1663.

83. Matsuzawa Y., Hostetler K.Y. Properties of phospholipase С isolated from rat liver lysosomes //J. Biological Chem. 1980. V. 255, №2. P. 646652.

84. Mazer N.A., Benedek G.B., Carey M.C. Quasielastic light-scattering studies of aqueous binary lipid systems. Mixed micelle formation in bile salt-lecithin solutions //Biochemistry. 1980. V. 19, № 4. P. 601-615.

85. Meijer H.J.G., ter Riet В., van Himbergen J.A., Musgrave A., Munnik T. КС I activates phospholipase D at two different concentration ranges: distinguishing between hyperosmotic stress and membrane depolarization //Plant J. 2002. V. 31. № 1. P. 51-59.

86. Meyuhas D., Bor A., Pinchuk I., Kaplun A., Talmon Y., Kozlov M., Lichtenberg D. Effect of ionic strength on the self-assembly in mixtures of phosphatidylcholine and sodium cholate II J. Colloid Int. Sci. 1997. V. 188. P. 351-362.

87. Miller S., Ding J., Gin D. Nanostructured materials based on polymerizable amphiphiles И Current Opinion Colloid Int. Sci. 1999. V. 4. P. 338-347.

88. Nagao A., Ishida N., Terao J. Synthesis of 6-phosphatidyl-L-ascorbic acid by phospholipase D И Lipids. 1991. V. 26, № 5. P. 390-394.

89. Ne'eman Z., Kahane J., Razin S. Solubilization and enzymic activities of Acholeplasma Laidlawii membrane proteins II Biochim. Biophys. Acta.1971. V. 249. P. 169-176.

90. Nelson N., Racker E. Purification of spinach cytochrome f and its photooxidation by resolved photosystem 1 particles // J. Biol. Chem.1972. V. 247. P. 3848-3853.

91. Nieuwenhuizen W., Kunze H., Haas G. Phospholipase A2 (Phosphotide-Acyl hydrolase, EC. 3.1.1.4) from porcine pancreas И Methods Enzymology. 1974. V. 32. P. 147-154.

92. Nozaki Y., Reynolds J., Tanford C. The interaction of a cationic detergent with bovine serum albumin and other proteins // J. Biol. Chem. 1974. V. 249. P. 4452-4459.

93. Okawa Y., Yamaguchi T. Studies on phospholipase D from Streptomyces II J. Biochem. 1975. V. 78. P. 363-372.

94. Panaiotov I., Ivanova M., Verger R. Interfacial and temporal organization of enzymatic lipolysis // Current Opinion Colloid Int. Sci. 1997. V. 2. P. 517-525.

95. Pappan K., Wang X. Molecular and biochemical properties and physiological roles ofplant phospholipase DI I Biochem. Biophys. Acta. 1999. V. 1439. P. 151-166.

96. Pedersen J.S., Egelhaaf S., Shurtenberger P. Formation of polymerlike mixed micelles and vesicles in lecithin-bile salt solutions: a small angle neutron-scattering study// J. Physical Chem. 1995. V. 99. P. 1299-1305.

97. Qin W., Pappan K., Wang X. Molecular heterogeneity of phospholipase D (PL D) // J. Biolog. Chem. 1997. V. 272, № 45. P. 28267-28273.

98. Quarles R. H., Dawson R. M. A shift in the optimum pH of phospholipase Dproduced by activating long-chain anions II Biochem. J. 1969. V. 122. P. 795-799.

99. Raybin D., Bertsch L., Kornberg A. A phospholipase in Bacillus megaterium unigue to spores and sporangia II Biochemistry. 1972. V. 11. P. 1754-1760.

100. Reynolds J., Herbert S., Polet H., Steinhardt The binding of divers detergent anions to bovine serum albumin II J. Biochemistry. 1967. V. 6. P. 937-947.

101. Reynolds J.A., Tanford C., Stone W.L. Interaction of L-a-didecanoyl phosphatidylcholine with polypeptide of high-density lipoproteinphospholipids-lysophospholipid-serum lipoprotein) II Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74 (9). 3976 p.

102. Rubin M., Tzagoloff A. Purification, characterization and subunit structure of yeast and beef cytochrome oxidase И J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 4269-4274.

103. Rubingh D. N. The influence of surfactants on enzyme activity // Current Opinion in Colloid & Interface Science 1996. V. 1. P. 598-603.

104. Saito M., Kanfor J. Phosphatidohydrolase activity in a solubilized preparation from rat brain particulate fraction // Arch. Biochem. Biophys. 1975. V. 169. P. 318-323.

105. Samant S., Singhal R., Kulkarni P., Rege D. Protein — polysaccharide interactions: a new approach in food formulations // Int. J. Food Sci. Tech. 1993. V. 28. P. 547-562.

106. Sargent M., Lampen J. Organization of the membrane-bound penicillinase of Bacillus licheniformis //Arch. Biochim. Biophys. 1970. V. 136. P. 167-177.

107. Saunders L. Molecular aggregation in aqueous dispersions of phosphatidyl and lysophosphatidyl choline II Biochim. Biophys. Acta. 1966. V. 125. P. 70-74.

108. Scandella C., Kornberg A. A membrane-bound phospholipase Aj purifiedfrom Esherichia coli//Biochemistry. 1971. V. 10. P. 4447-4456.

109. Schurtenberger P., Mazer N., Kanzig W. Micelle to vesicle transition in aqueous solutions of bile salt and lecithin // J. Phys. Chem. 1985. V. 89, №6. P. 1042-1049.

110. Sharma S., Sharma A., Gupta M. One step purification of pianut v phospholipase D by precipitation with alginate // Bioseparation. 2000. V.9. P. 93-98.

111. Shchipunov Yu. A. Lecithin // Encyclopedia of surface and colloid science. Ed. Marcel Dekker. Inc. 2002. P. 2997-3017.

112. Shchipunov Yu., Shumilina E. Extraction of platinum and polladium hydrochloric acid solutions by diamines I I J. Colloid Int. Sci. 1995. V. 173. P. 192-201.

113. Shinitzky M., Dianoux A., Gitler C., Weber G. Microviscosity and order in the hydrocarbon region of micelles and membranes determined with fluorescent probes synthetic micelles //Biochemistry. 1971. V. 10. P. 2106-2113.

114. Shuto S., Imamura S., Fukukawa K., Ueda T. Synthesis of 5-phosphatidylnucleosides by phospholipase D — catalyzed transphosphatidilation //Chem. Pharm. Bull. 1987. V. 36. P. 5020-5023.

115. Singer S., Nicolson G. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes // Science 1972. V. 175. P. 720-731.

116. Small D. The physical chemistry of lipids from alkanes to phospholipids II Handbook of lipid research. Plenum Press New York. 1986. V. 4. P. 672.

117. Snary D., Goodfallow P., Hayman M., Boodmer W., Crumpton M. Subcellular separation and molecular nature of human histocompatibility antigens (HL-A) //Nature. 1974. V. 247. P. 457-461.

118. Snijder H.J., Dijkstra B.W. Bacterial phospholipase A: structure and function of an integral membrane phospholipase II Biochem. Biophys. Acta. 2000. V. 1488. P. 91-101.

119. Subramani S., Dittrich N., Hirche F., Ulbrich-Hofmann R. Characteristics of phospholipase D in reverse micelles of triton X-100 and phosphatidilcholine in diethyl ether // Biotechnology letters. 1996. V. 18, №7. P. 815-820.

120. Sugatani J., Okumura Т., Saito K. Studies of a phospholipase В from Penicillium notatum substrate specificity and properties of active site // Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 620. P. 372-386.

121. Syrbe A., Bauer W., Klostermeyer H. Polymer science concepts in dairy systems — an overview of milk protein and food hydrocolloid interaction //Int. Dairy J. 1998. V. 8. P. 179-193.

122. Takami M., Hidaka N., Suzuki Y. Phospholipase D catalyzed synthesis of phosphatidyl Aromatic Compounds // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. V. 58, № 12. P. 2140-2144.

123. Takami M., Suzuki Y. Synthesis of novel phosphatidyldihydroxyacetone via transphosphatidylation reaction by phospholipase D // Biosci. Biotech. Biochem. 1994. V. 58, № 12. P. 2136-2139.

124. Tang X., Waksman M., Ely Y., Liscovitch M. Characterization andIregulation of Ca -dependent phosphatidylethanolamine phospholipase D activity //Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 3821-3830.

125. Tausk R., Karmiggelt J., Oudshoorn C., Overbeek. Physical chemical studies of short-chain lecithin homologes. 111. Phase separation and light scattering studies on aqueous dioctanoyllecithin solutions II J. Biophys. Chem. 1974. V. 1. P. 175-183.

126. Tolstoguzov V., Vainerman E., Rogozhin S., Kurskaya E., Kalissanov S. Interaction between proteins and sodium alginate in aqueous medium II Die Nahrung. 1974. V. 18. P. 355-362.

127. Tolstoguzov V. B. Protein-polysaccharide interactions I I Food proteins and applications. Ed. Damodaran S., Paraf A. Dekker M. New York, 1997. P. 171-197.

128. Tolstoguzov V. B. Functional properties of protein-polysaccharide mixture II Ed. Hill S.E., Mitchele J. R. 1998. P. 252-277.

129. Tzur R., Shapiro B. Purification of phospholipase D from peanuts // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 280. P. 290-296.

130. Vaskovsky V.E., Gorovoi P.G., Suppes Z.S. Phospholipase D in far -eastern plants //Int. J. Biochem. 1972. V. 3. P. 647-656.

131. Venable M. E., Obeid L. M. Phospholipase D in cellular senescence II Biochem. Biophys. Acta. 1999. V. 1439. P. 291-298.

132. Verger R., Mieras M., De Haas G. Action of phospholipase A at interface //J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 4023-4034.

133. Waite M. The phospholipases // Handbook of Lipid Research. Plenium Press. 1987. V. 5. 562 p.

134. Wang X. M. Multiple forms of phospholipase D in plants: the gene family, catalytic and regulatory properties, and cellular functions // Progress in Lipid Research. 2000. V. 39. P. 109-149.

135. Wells M. A simple and high yield purification of Crotalus adamanteus phospholipase A2 //Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 380. P. 501-505.

136. Wijk G., Gadella Т., Wirtz K., Hostetler K., van den Bosh H. Spontaneous and protein-mediated intermembrane transfer of antiretroviral liponucleotide 3-deoxythymidine diphosphate diglyceride // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 5912-5917.

137. Wilton D. C., Waite M. Phospholipases II Biochem. of Lipids. Lipoproteins and Membranes (4th Edn.). 2002. P. 291-314.

138. Xia J., Dubin P. Protein polyelectrolyte complexes// Macromolecular complexes in chemistry and biology // Ed. P. Dubin, Y. Back, R. Davis, D. Schals, C. Thies. Springer - Verlag, Berlin. 1994. P. 247-271.

139. Yang S., Freer S., Benson A. Transphosphatidylation by phospholipase D // J. Biological Chemistry. 1967. V. 242. № 3 P. 477484.

140. Zwaal R., Roelofsen В., Comfurius P., van Deenen L. Complete purification and some properties of phospholipase С from Bacillus cereus //Biochim. Biophys. Acta. 1971. V. 233. P. 474-479.