Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние некоторых гормонов, стресса и гипоксии на активность ферментов метаболизма глутатиона

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние некоторых гормонов, стресса и гипоксии на активность ферментов метаболизма глутатиона"

о - ^ Г л »

, , U V л • На правок рукописи

ЯСЬКО МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ ГОРШЮВ. СТРЕССА и гипоксии НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА ШТАТНОМ.

03.00.04, - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степень кандидата иедицинских наук

ТОИСК - 1999

Работа вшюлнона в Ирг.утсноы государственной медицинской университете.

Нацчннй руководитель: доктор медицинских наук, - профессор В.И. Кулинский

Научкий консультант; доктор медицинских наук,

профессор Л.С. Колесничеико.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук.

профессор Т.С. Федорова

кандидат медицинских наук, старший научный сотридник И.Б. Луста.

Бедуыая организация - НИИ Биомедицинской химии РАМН

(Иосква).

Защита состоится " " 1996 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д. 084.28.01. при Сибирском Государственном ыедицинском университете (634050, г. Томск, йосковский тракт, 2).

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Сибирского Государственного медицинского университета

йьтореферат разослан " " 1996 года.

Учений секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

З.И. велобородова

ОШЯ-ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1. Актуальность пробленц.

Восстаяов.^'нный глутатион (ББН) является наиболее рас-иространешша внутриклеточные низкомолекулярнын тиолон. Он зависает клетку от. перекисных соединений, ксенобиотиков-электрофилов и тяаелнх металлов; поддерживает о восстановленной состоянии сульфгидрилыше группа белков, участвует в пролиферации, используется для синтеза лейкотриена С. Главный фермйнтоа иатаболйзна глутатиона' является ^-глутанил-трансфораза (ГГТ). Глутатионпероксидаза СГПО) запицает клетки от активных перекисных соединений. ОкислошшЯ глутатион восстанавливается глутатионредуктазой (ГР). Глутатионтранс-Фераза (ГТ) такяо иояот зависать организн от органических переписей,и является ваяным фериентон метаболизна ксенобиотиков путам их конъвгации с глцтатионои 1йе1зЬег, 1983-1995; Л.С. Колесниченко, В.И. Кулинский, 1989: В.И. Кулинский. Л.С. Колесниченко. 1990, 19933.

Остановлено влияние норадреналина и изопреналина на активность фег онтов метаболизма глутатиона (ФНГ) [Л.С. Колесниченко и др.. 1986- 19941. В то 'не время действие других гормонов на активность ФНГ изучено недостаточно и его ис-следовану-! является очень ванным.' . •

Известно, 'по становление ферментных систем и особенно регуляторные механизмы не возникают сразу при ровдении, а "дозреваит" в процессе онтогенеза. В ряде работ покр^яио влияние возраста на активность ФМГ {И1и-Л1ап-2Ьао еЬ а!..

- ij «.

i У У О : Ssjidegerd ofc ai.. 18Ü9; Thusu et al.. 1931: Kret2Si;htîâr et al., 1390; Pal lardo et al.. 1931; Senklusun et al.. 19il ; Bien et al.. 1990; Kaur et al.. 1390; Taniçut-hi . Cherian . 1990: Sulakhe-Hetmiues et dl.. 19321. Однако действие iiftiiî». опосредувцего влияние катехоломшшв, на активность ФИГ с онтогенезе не исследовали. Мало изучено влиянии на ФйГ экстрсналышх факторов, особенно гипоксии, а это представляется очень цапш.

2. [¡ель и задачи исследования.

Цельи работи являлось изучений влияния горионов и íik-итреыадышх ^акторои внешней среди на активность ФИГ: ГПО, П, ГГТ н ГР. Б соответствии с этой целью были сформулированы сл^дуааии,- задачи:

1. Исследовать влияние агониста «С^-адренорецепторов клофелипа. агоиистов fl-рецепторои адснозина. Н-этилкарбокс-эипцадснозииа. селективного агониста й^-реценторов ииклоге-ксидаденозина и инсулина.

?.. Изучить в течение 1-30 суток после рождения актив-■ ¡(ость ФЙГ и елкяннв на них цйНФ.

3, !itc.':j;ioc.iTb влияние эистремалышх Факторов внешней среда - омоционально-болевого стресса, гиперкашшческой гипоксии ¡i адаптации к гипобарической гипоксии.

3. lla'-i'iüóii новизна.

!$jií!|>;>!4ü ¡í'-Н'Лйш) íUiitajiiio но активность ФЙГ сисудиип и ruf.Himoi!. •i4.ti:r»"îuimx и рсалидешш толерантной стратегии ■ «шюзинл и »то 4Ийлог«в. Установлено воздийствив гиперкап-

шпосиуй гипоксии м адаптации к гипобарической гипоксии на активность ФИГ. Выявлены вазиис отличия дашшх воздействий от реакции на стресс и на катсхоламины. мервне установлены особенности слияния иШФ на активность ФИГ у нрыьат 1-30 суток лизни.

4. Научно - практическое значение.

Полученные результаты расвирявт представление о регуляции системы глутатиоца н ее реакции на экстремальные воздействия. Они иогут послуаить оснопой для целенаправленного воздействия на ФМГ с целью повышения устойчивости организма.

Работа частично поддервана ГНТП "Здоровьо населения России".

. 5. Внедрение результатов. •

Материалы диссертации используются при чтении лекций по пирсу био^инии'для студентов Иркутского Государственного Медицинского Университета и Иркутскогр Государственного Университета.

6. Апробация работы.

Материалы диссертации представлены и обсувдены на конференции молодых ученых ИГЙИ, Иркутск. 1391, 1993. Третьей Неадународной конференции "Экологическая патология и ее накокорр ашя", Чита. 1991. Четвертой конференции "Биоан-7Явксидапт", Москва. 1992, конференции "Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний", Санкт-Петербург. 1993. заседани.. Иркутского отделения Российского Биохимичеткого ооаестве». 199Г». а такяо на Невдународном симпозиуме

—к 6 ~~

"Pharnacoloev of ndreooceptors", Philadelphia. 1994.

?. Публикации.

По тепе диссертации опубликовано il работ, из пик 7 в центральной печати С в той числе 2 статьи в центральных куриалах и i геэисц иеяяународного симпозиума>. . . .'

Ö. Объеи и струкгцра диссертации.

Диссертаций излсшена на 24? страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы о ватериалах и истодах, двух глав собственник исследований, обасго обсуждения, виеодов. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 34 рисунками. Список литературы содержит 410 источников, из них 67 отечественных и 343 зарцйекнах.

S. Полоаення, выносиине на защиту.

1. Пдрепшшн и эмоционально -Солевой стресс активируют-ГШ) п сердци, печени и почках и ГТ в сердце и печени и инги-оприат ГГТ в ночках (адреналин) или печени (стресс). Активность ГР н кс-нцоитрация GSH в органах (кроме повыиения -концентрации ES!i и печени адреналином) не изыенаатса.

Jtar юность ФИГ у крысят 1-30 -уток кизни существенна отличает es, по постепенно ирийлиаается к активности взрослих ирис. Зсфеити цйЫФ на ФИГ обычно отсугствуит или .плае изпрацеии.

3. Инсмл/.н» «иенчзйи и огс аналоги не визываиг геиера-■ >■ !(:!ia.* - ttisiii'ut!, т ¡именяют активность ФПГ в некоторых

■J 11 г а ■ - а .

4. Гипоксия и длительная прерывиста" элаиташм и ной

muse изменяет активность ФЬТ в опреяоленни.ч органах: при

том масс (особенно при адаптации) происходит г.шшчше аи-

тиоиости. Таким образов, сущоствувт два типа реакций ФНГ in гормоны и экстремальные факторы.

НЛТЕРИПЛЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Эксперимент проведен на 249 взрослых ирисах обоего иола иассой 120-240 г н на 76 крысятах 1-30 суток яизн.ч. Гормоны сводили гюдкояно о объеме 0.3 мл на ирнсу

За 15 минут до введения веществ крнс наркотизировали этамипалом натрия в дозе 40 иг/кг (или тиопенталом натрия в дозе 100 ыг/кг)'.

• Эмоционально-болевой -тресс йыэивали по иетодике Бурова и Салииова (1975 г.). но на бозопаенчв плоиадкц временами такяе Тюзхавали ток. что стимулировало схватки неаду крысами. Время нахондения крнс в клетке - 4 часа.

Острив гиперкапническуя гипоксию вызывали с понощыз нашего приспособления, позволявшего изыерять температуру тела коне и в нуянос время моментально, не прерывая гипоксии, забивать крысу декапитациеА.

Адаптация к гипобарической гипоксии осуществляли путем "поднятия" крнс в барокамере на высоту 2-5.5 км в точение б ч 5 раз в неделю в течение 6 недель (Иеерсон Ф.З.. 1986).

Shbothux заиивали декапитациеА., Все последующие - операции проводили мт холоду. Исследуемые органы быстро извлека ли. промокали Фильтровальной бумагой, взвевивзли, измельчали и переносили в пробирку, предварительно погруженную в ем

кость со льдоа. Затем добавляли среду выделения (0,25 ¡1 са-:tapüjö, 0.01 И трис, 1 мй ЭДТЙ: рН=7.5) из расчета 1:4 (вес * : объем). Гомогенизации проводили в течение 3 минут при 2ВЭ0 об/мин. Фракцию иадосадочной иидкости получали центрмфугиро-ваниеи на рефрижераторной центрифуге при 14000 g ь течении 30 минут.

Активность Фериентоп определяли 'в иадосадочной кидкос-ти общепринятыми истодами на спектрофотометре СФ-26: Г110 -по методу Stulls К.Н. et al. (IS??). ГТ - по Habig H.H. et al. (1974). Г Г1 - no Racker E. (1355), ITT определяли с но-нсиыо тест системы LflCHEHfl (ВКН0).

Для исследования влияния цйМФ на активность ФПГ cyiiep-на.таит инкубировали с 3-10"zli HgCl . М0'*М ПТФ. МО-6!! цПЫФ при температуре 30° С (для ГГТ - 37°.С) с течение 10 минут. Через 10 иинут добавляли субстраты и спектрофотоиетрически определяли активность ферментов.

Концентрации белка оценивали на фотометре НФК-3 при 2600 ни по методу Loury et al. (1951) в модификации Ohnishi ot al ( 1978).

Определение концентрации восстановленного гяутатяона проводили с реактивом Зллмана - 5,5-дитиобис-2-нитробензоа -той С ДТИБ ) по Anderson Н.Е. (19Ö9).

Статистический анализ экспериментального материала про-родили по истодам, описанным в руководствах Н. Бейли (19S2) Е.8. Гублера, il.fl. Гспкина ( 1973). и. Закса (197Б). Для наадой серии опытов рассчитывали средний (х). дисперсию (ф, среднюю квадратичную оаибку средней (стандартную ошибку) (S*). Сер'ш сравнивали пи дисперсиям (критерий F) и средни« (критерии t и d).

Различия считали зиэчимшш при V < 0,05; I1 -с 0,1 оцени-

плли как приблияение к значимому уровня (тенденция к изменении показателя).

РЕЗУЛЬТПТИ-СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБШЛЕНИЕ.

1. Влияние адреналина и «¿¿-агониста клофелина на активность ФНГ.

Р...:се были проведены исследования по определении влияния иэонропилнорадреналина. норадреналина и ыезатопа на активность ФНГ ( Л.С. Колесниченко и др., 1986, 1987). Эффекты адреналина не были изучены, a это.необходимо, так как он аоляется главным (а у приматов - единственным) горнонон мозгового веиества надпочечников. Адреналин в дозе 5.5 мкноль/кг за минут вызывал резко вираяеннчю пшергликв-ыив (+9? + 8.7 У., Р < 0.001 ). что подтверждает адекватность выбранной дозы горнона. Адреналин активировал ГПО в сердце, печени и Тючках, активировал ГТ в печени и особенно в сердце и нссколыш сникал активность ГГТ в почках (рис. 1). Адреналин не влиял на активность ФИГ в головной мозге. Это монет быть связано с плохи» проникновенны« адреналина через гематоэниефалический барьер или различным влиянием адреналина на активк^о.ть ФИГ в разных отдадах мозга. Значимое изменение (увеличение) концентрации GSH обнаружено толвко в печени.

Эффекты адреналина совпадают с 'эффектами норадреналина и изопропилнорадюналина'. происходит активация ГТ и ГПО печени и ингнбирование ГГТ почек.

Вызываемое адреналином увеличение активности ГПО в Ъ из 4 исследованных органах и ГТ в 2 из 4 должно приводить к ак-

НО -Щ-

№ EQ 50

20 О -20 •40

Б

л

1—

в Й

А G

rao

А С

гт

А С ГТТ,

ffl

Б Б

Т

- 1

ТОГ^ i

А С ГТ70

А С ГТ

A G ГЛГ

А С

то

а с

IT

А С гп

Сердце

Пзчекь

Почкк

АС А С А С

rao гт ш ——-—^-/

' Головной мозг

с.

Рис. $ Вяиянке адреналина (А) к эмоционально-болевого с?реоса (С) нг акткв;:оо?ь №Т в отзганах крыс . Примечание: А - р<С,1; 5 - р<С,©;- В- р <0,07; Т - р <0,001.

-тивашт 5»апптних сил "оргапиэкз. Таким . :скояаишш

ио толм» йктивирчзт процесс:; перокскяс и . 0.1'.. 19811, но н активируат.формеитп, тормоза«!? ясрок-

сидации и завиваваие организк от активная со«;'"!<-"»к:1 3 чГНО

и ГТ) и ксенобиотиков-электроцилов (ГТ). Торкопояко ГГТ г

*

почка:; моает ппиводить к сберепешш восстановленного глута-тиона, необходимого для обезврзяивания перекнсны;; соедине-ниП 'и конъюгации с ксенобиотикаии-злектрофилаки. Б почках, несмотря на увеличение активности ГПО, не. происхо/ж.: изменения концентрации бЯН, а в печени происходит даие фл..-'чинно концентрации ББН на ОоЦе увеличенной активности Гш» 'Г,

Поскольку- ^-рецепторная регуляция ФИГ олисзедуется цййФ. возникло предполонение, что стимуляция ^-алоенороцеп-торов. снизавашх уровень этого второго посредника [ЗгосЫе. 19ВЭ: КиГГо1о: 1991: КоЬПка. 1992: ЬеПсоуИг. 1933; Ву1игн1, 1934], монет влиять протиьополоано катехолаиинаа. Однако это иредполоаение не- подтвердилось. Введение крысам относительно селективного к^агониста клофелина в обычной дозе (3.75 шшоль/кг) не влияло на активность ФПГ ни в одном из органов. Это говорит об отсутствии «¿¿-рецепторной регуляции ФМГ. Следовательно, катехоланиновая регуляция обмена бБН является ио диэлистической, а однонаправленной.

2. Пктивиость и регуляция ц(ШФ ФИГ у новоронденных крыс.

В большинстве случаев активность ФНГ в 1 сутки постна-тальной йизни ниэе. чои у взрослых нивоткых. Это характерно для ГГТ почек, ГР печени и почек. ГПО печени и почек. ГТ че-чени и почек. Наоборот, активность ГГТ о печени ч крыс в 1 сутки жизни резко выше. чем у взрослых. В сердце активность

ГПО н ГТ -тми ке, как и взрослых. В дальнейоек для ГГ7 печени харакш."-к. монотонное сниаение активности с морализацией к 30 сутнаи. ГР с почках монотонно возрастает, достигая взрослого уроииа к 18-19 суткаи. 'Для остальных зораен-тов зависимость активности от возраста более слонная: на 3-5 сутки активность большинства СШГ сливается (ГПО печени и почек, ГТ всех трек органов, ГГТ почек и печени), однако это не характерно для ГР всех трех органов и ГГТ сердца. ГР печени к 5 сц'ткаи достигает активности взрослых крыс. ГР сердца на 3 н 5 сутки значиио не отличается от активности ,ГР в первые суш: виэни. ГГТ сердца на 3 и 5- сутки значительно превышает активность взрослых крыс.

На 18-30 сутки активность ФИГ,чаще возрастает, достигая уровня взрослых крыс (ГР печени и почек), или прибли-еаетса к нему (П печени и почек и ГГТ почек). ГГТ печени и сердца снимается до уровня взрослых яивотных. |"Т и ГР сердца все вас ниве активности взрослых особей. Таким образов, в большинстве серий происходят фазные сдвиги.

Низкая активность ГПО и ГТ в больоинстве органов в первые сутки связана, вероятно, с низкой экспрессией генов. Это' мовет бить связано с тем. что ксенобиотики и первкисные соединения обезврештаится в иатер'инскоц организие (в основной, в печенн). Следовательно, плод не иундается в ионной деток-сика!1"оН1(ой системе. Поело ряадения в организме новороаден->шго животного происходит экспрессия соответствуащих генов, активное;!> ГТ и ГПО в больвинсгве органов возрастает. Намного более ги^икая активность ГГТ в печени новорондешшх и оп иоследуло"1 репрессия хорошо известны.

цПИФ в первые сутки сникал активность ГПО в печени (на 23 У.) и сердце (на 21 У.). Изменений активности ГПО в почках

Рис. 2 Влияние цАМФ на активность ФПГ у крысяз 1-го месяца яизни (в Примечание: Б - р<0,Сб; В- — р <0,01; Г - р<0,001. Г- I сутки жизни, 2 - 18-30 сутки, 3 - взрослые крысы, 4-3 сутки. Сер. - сердце, печ. - печень, поч. - почки.

.. Ï4 _

на порвсе .г; : ь.. но бнло. Активность ГТ в первас ;;:гки не нзшш >;••.":•.. : пзчзии. но сливалась в сердце Сна 30 и ночках ни. ;:). Активность ГГТ в печени и почка:: о пгрвые сутки визы- Tior действием «Яйф не менялась. На 3 сутин нюни актах" п. ГПО увеличивалась в печени (на 22 X). Активность ГТ : •■еченк н почках не меняется под действием цЩ>. Активность ГГТ на 3 сутки в печени и сердце не аеняется под действиеи цЯ!,'Ф. В почках, происходит увеличение - активности ГГТ (на 2л На 5 сутки активность ГПО в печени и , почках, а такие ГТ ч ГГТ во врех трех органах не пеняют сво^ éjmiD-ность иод ¡-сйс.-онси цАИФ. На 18-19 сутки активность ГТ ,во всех трех органах я ГГТ в печени и почках не аеняет свое активность. i- 2С-дневных крыс цйМФ не влиял на активность ГГТ в печени, печках и сердце (рис. 2).

U взрослых крыс норадреналин. изадрин и цйНФ Iii.С. Ко-лесничснко к др.. 1986, 19871 и адреналин и цАМФ (наши опыты) вызывает однотипные изменения - активацию ГПО и ГТ в печени к сердце и сниаение активности ГГТ в почках. В отличие от этого, у крысят 1-го иесяца низии эффекты цйН© отсутствуй ила г.й':г нзвравены на противополокние. Таким образом, liotaio гс2ор»ть с незрелости регуляторных влияний цййф на ОИГ. Очсмпг.нс» что окончательное становление этой система прочекоцнт первого месяца низки крце.

3. Вп-пи:« сгонйстов аяеиозинових рецепторов на активУ

"..'зиологичоских антагонистов катсхолдшгаов является ci.i.ef.'i',-.:'!! згшшй ;iesклеточный регулятор. Знохииичос-гл'.р эффект .»гоинстоо адсиоаиновик рецепторов изучены кедос-

таточно. а его ооэиоаное влияние на «РУГ не исследовано. В " напей работе использовали три веаества: аденознн о ".озе 300

г

.../кг -= L124 шшоль/кг. циклогексиладенозин (ЦГА) в дозе 2.5 мг/кг - 7,2 икиоль/кг и Н-этнлкарбоксаиидаденозин (НЭКА) в дозе 0,1 мг/кг ^ 0,34 акмоль/кг. Разница d дозировке связана с очень медленный метаболизмом двух последних препаратов. ■

Активность ФИГ в большинстве органов после введения аденоэина не изменяется. Активность ГР и ГГТ увеличивается в селезенке. Активность ГТ увеличивается в костной мозге и снижается в почках.. " "

Селективный А,-агонист ЦГА вызывает сниаение активности ГТ'в почках: наблвдается тенденция к снизеиив активности Г.Т в селезенке. Активность ГГТ. ГПО и ГР не меняется ни в одном органе.

НЭКА вызывал больаее количество сдвигов. Активность ГТ увеличивается в селезенке и наблвдается тенденция к увеличении в костнон мозге. Активность ГГТ сминается в почках и наблвдается тенденция к увеличении в белон ,.;ире. Активность ГР увеличивается в костнон ноэге п имеет тенденции к увеличении в селемнке.

I

Сннаение активности ГТ почек аденоэннои и селективным А^ агонистом ЦГА свидетельствует об участии -рецепторов в этой эффекте. Так кап НЗКА имеет несколько больнее средство к Aj-рецопторам, то совпадение эффектов аденозина и НЗКА (снияонио активности ГГТ почек. .еличение активности ГР селезенки и ГТ п костной г зго) свидстельств"ст об участии Л, ионептпроп о этих Эффектах. Увеличение активности ГТ з костном мозге, вероятно, связано с вовлечение« П^-рсцеито-1"»г\ г«ж rta:t под плиянном НЭКА наблюдается тенденция к чес

- Тб -

личеиив активности ГТ.. Рецепторные механизмы других сдвигов неясны.

йденозин является ФНзиологичь :<им антагонистом катехо-лаыинов. Он спивает мобилизации катехолаиинов из симпатических нервов.~,а такве снивает р-зффе..ти катехолаиинов [Pel leg. Porter. 1990: Collis, fiourani, 1993]. Однако эти два горыо-на не вызывавт противополовных сдвигов активности ФНГ. а активность ГГТ почек снижается под действие« обоих гормонов. Зти данные говорят в пользу того./что нет прямого "противостояния" катехолаиинов и аденозина применительно к ФПГ. Оче-ви„|1о, они действуют независимо.

4. Влияние инсулина на активность ФПГ.

Другим Физиологическим ангагонистой катехолаиинов является "горион покоя" инсулин. Он "сдеряивает" уровень , цАНФ и снивает его эффекты [Теппериен Дв.. Теппериен X.. 1989: Denton R.H.. 1986: Pllkls S.3.. El-Haghrabl H.R.. 1968 1. In vitro инсулин не влияет на активность ГР tShlrner R.H.. Krauth-Shlgel R.L.. 1989]. При экспериментальной диабете активность ГТ в органах спивается, а введение инсулина ее восстанавливает [Carnovale С.Е. et al.. 19901.

В навих исследованиях крысам вводили инсулин в дозе 60 икг/кг (1,5 ЕД/кг) за 1-24 ч до исследования. Это вызывает вырааенную и устойчивую гипогликемию с максимумом (-53 X) через 1 ч, к 24 ч восстанавливается норыоглюкоземия.

Активность ГПО через 1 ч снимется в головном мозге и проявляется тенденция и снижению в селезенке и печени, но не изменяется в сердце, почках и костном мозге. Через 24 ч ни в одном из органов сдвигов не наблюдали (табл. 1).

Таблица 1.

ИЗМЕНЕНИЕ (В У.) (ШШОСТИ ФИГ И КОНШНТРЙЩН &Н В ОРГАНАХ ПРИПРИ ВВЕДЕНИИ ИНСШМНА.

ГПО ГТ ГГТ

ПЕЧЕНЬ

1 час 3 час 5 час 24 час -35+203 +2Л+8.4 +3,4+8.9 -6,7*6.6 +11+8,? +8,0^,4 +15+24 +-32Т23 -28+17 +6,7+28 +1159,9 +0.19*15 +6.4*14 +2.7+6.3

ПОЧКИ

1 час +11+14 -2.4+8.9 б -24+9,9 +7,2+12 б -15+5.4 б -14+4,8 -6,2+7,2

3 час - -4.3+3,3 +14+18 •

5- час 24 час -й+29 -1.8+6.2 -0.45*9.4 +28+22 +4,4+13

СЕЛЕЗЕНКА '

1 час 3 час а -13+7.1-+4,7+{3 -4,1+7.0 +2.9+1Й а -20+11 +19+48 +4.6+10 -1(5+8,7 б -14+6,5 -8.0тё,8

5 час 24 час +14+13 -1,9+26 -6,5+19 +5,1*20 -9.4+35 +14+25

ГОЛОВНОЙ МОЗГ

1 час 3 час б -19+6,7 +2,8+8,5 +2,5+13 в -21+6,2 +28+15 -9,0+13 +25+18 +7,1+10 -16*14 б -34+16/ а -19+11

5 чЗс 24 час +4.1+42 +14+17 б +153+50

ПРИМЕЧАНИЕ: а - о < 0.1: б - р < 0.05; в - р < 0.0

Активность ГТ в головном мозге ¡¡е изменяется через ч: сшшается через 5 ч после введения инсулина: через 24 ч наблвдается тенденция к увеличен ..а а"тивности фермента. В остальных 5 органах активность ГТ ни в одном из сроков не изменяется.'.

Активность ГГТ через 1 ч после введения инсулина сни-кается в почках и имеется тенденция к сниаении в селезенке. Через 24 ч после введения инсулина резко увеличивается, активность ГГТ в головном ыозге. В других органах во все -сроки активность фермента не изменяется.

ГР ни в одной органе не меняет свои активность.

Концентрация СБН через 1 ч после введения инсулина не изменяется. Через 3 ч наблвдается сниаение концентраций ЕБН е почках, чер^ч 5 ч концентрация падает в почках, головной мозге и селезенке. В печени через 3,и 5 ч. в головном мозге и селезенке через 3 ч изменения отсутствуют. Через 24 ч наблюдается тенАзнция к сниаении концентрации Й5Н в головном иозге: в печени, почках и' селезенке изменений нет (табл. 1).

Таким образом, инсулин , не вызывает генерализованных сдвигов активности ФИГ и концентрации ББИ, .- они отиечавтся лишь в некоторые сроки в.отдельных органах: головной мозге, почках и селезенке, но не печени (кроме ГПО на < ч), сердце и костном нозге. Выявленные изменения активности ФЙГ не сов-падавт с принятым разделением органов по чувствительности к инсулину [ Кендыш'И.Н., 1985-1: они'отсутствовали в "высокочувствительных" печени и сердце, а такне костном мозге, но выявлены в "нечувствительном" головном ыозге и в "менее чувствительных" почках и селезенке. Сдвиги ФМГ не являются вторичными по отношении к инсулиновой гипогликемии, так как: 1)

они наблюдаются лиыь о отдельных о,гаиах: 2) их проявления не соответствуат динамике глвкоэн крови. Следовательно, моа-но говорить о самостоятельности регуляции этни гормоном раз личных внуов обнена.

Инсулин является физиологическим антагонистом катехола-„имов. Однако противополоаность действия инсулина, и катехо-ламииов ограничена только ГПО: на ГТ первый в ранние срою, не влияет, а снижение активности ГГТ в .почках вызнвапт оба гормона. Следова!сльпо, влияние инсулина не связано с простим противодействием эндогенный катсхоламинам и является самостоятельный.

Сникеиие активности ГПО в головной иозге и тенденция к еннаенив активности ГПО в печени и селезенке через 1 ч после введения инсулина, вероятно, является неблагоприятным процессом для организма, так как сниаается активность одного из антипероксиднах ферментов. С другой стороны, это монет быть вызвано снижением концентрации переписных соединений в организме.

Сниаение концентрации 0511 в почках череп 3 и 5 ч и в селезенке через 5 ч не сопровоадается изменением активности ФМГ и, следовательно, это связано не с активацией катаболизма, а со сииаениеи синтеза СБН.

Инсулиносий рецептор обладает тирозинкиназной активность«), которая определяет все последующие эффекта инечлина [Иа1п ОЬЬегсИеп еЬ а 1.. 1993 ]. Значение этой рецепторной киназы в обнаруженных нани сдвига?- неясно, но виилне возыов-но, так как ФМГ являются "чбетратами протеипкинази А ' [Л.С. Колссниченко и др., 1986-1990]. а некоторые изоферненты ГТ - и протеипкинази С ГТап1дисЬ1 II.. Руег1п Н.. 19891.

Таким образом, ч действии инсулина на обмен БЗН мояно

различать как ранние, так и поздние эффекты, как это извес-.110 для многих других видов обмена.

5. Влияние стресса на активность ФМГ.

Влияние 1-часового эмоционально-болевого стресса на активность ФМГ и концентрации С5Н представлено на- рис. 1. Активность ГПО увеличивается в печени рецессивной ' ириса,' наблюдается тенденция "к увеличению в сердце рецессивной крысы. печени и почках доминантной крысы. Активность ГТ одина-тво увеличивается в сердце как доминантной, так и рецессивной квысы и в печони доминантной крысы. Активность ГГТ в равной море спивается в печени как доминантной, так и рецессивной крысы. Активность ГР и когчентрация БИН не изменяются ни в одном органе. В головном мозге ни один из изученных показателей не изменяется, что мовет быть связано с исследованием мозга ка: целого и не исключает возможности сдвигов в отделышх нервных структурах. Отсутствие сдвигов изученных показателей в головном мозге мовет быть связано такге с наличием ир'отивополовцой регуляции ФИГ разными нейрогормонами.

Нави данные в целом совпадают с данными по иммобилиза-ЦИонному стрессу 1Л.С.-Колесииченко и др., 19871. Однако мы не наблюдали снивение активности ГГТ в почках, вместо этого произовло снияение активности ГГТ в печени. Нам не удалось пор твердить данные о снижении при стрессе концентрации СИН в тканях [В.И. Кулинский. Л.С. Колесииченко. 1990]. она не изменялась в печени, почках и головне мозге (Р > 0.1-0.9). Вероятно, это связано с больной длительностью стресса, которая нояет вызвать компенсаторное увеличение синтеза ББИ. Совпадение данных па различных моделях стресса подтверждает.

- 2Т -

что возникает одинаковая биологическая реакция - выброс эндогенных катехиламинов и. кап следствие, активации ФИГ системой цйМФ.

Изменения активности ФЙГ стабильны и более устойчивы, чем сдвиги концентрации ОБИ в органах и глшкозы в крови. Это монет быть связано как с противополояными изменениями активности разных ФИГ. так и конпенсаторниии сдвигами биосинтеза ю'Н.

Различные виды стресса и многие ксенобиотики способствуют пероксидании [Иеерсон Ф.З.. 1981, 19911. Активация Г ПО и ГТ при стрессе долина способствовать увеличению устойчивости .рганизаа к перокендацин, а активация ГТ - больвей резистентности к ксеиобиотнкам-электрофилан. Таким образом, изменения активности ФМГ при стрессе носят приспособительный характер.

Ннгнбирование ГГТ. происходящее под влиянием стресса, может замедлить всасывание некоторых аминокислот в кишечнике и реабсорбцив в почках. Это согласуется с такими фактами, как торкоаецке функций яеяудочно-кинечного тракта, синтеза белка и увеличение экскреции остаточного азота под влиянием иатвхоламинии и стресса.

6. Влияние гипоксии и адаптации к ней на активность ФИГ.

Гибель крыс в большинстве случаев наступит через 2-15 минут после создания условий гипоксии. Распределение имеет левостороннюю аснмнетр!...,. Ректальная температура крнс во время эксперимента енняэется.

Кратковрсксшпя < 2-х и 4-х минутная) гиперкапннческаа ; :'Н0К1.:!'т но н.'пя^т !'.< .'-'.тивность ГТ.. П'Т и ГР в сердце, не

чили, почках, головном мозге, селезенке и костной мозге.

■ У погибших от гипоксии крыс происходит активация ГПО в печени, ни нет изменений в других органах. Активность ГТ снижается в почках, но не в других органах. Активность ГГТ проявляет тенденции к снижению в сердце, печени, головном мозге, по не изменяется в почках, селезенке и костной ноэге. Активность ГР спивается в почках и не изменяется в других органах. Концентрация СБН проявляет тенденцию к скикенив в головной мозге и не изменяется .в сердце, печени, почках и селезенке (табл. 2 ).

При длительной адаптации к гипобарической гипоксии (1абл.2) активность ГПО снижается во всех исследованных органах с сердце, печени, почках и головном мозге. • Актив-.ость ГТ снижается в сердце, печени и почках, но. не в головном мозге. Активность ГГТ имеет тенденция к повышении в почках и снижается в головном мозге, но не изменяется в сердцз и печени. Активность ГР такие снижается во всех органах - в сердце, печени, почках и в головном мозге. Концентрация 65Н повивается в сердце, почках и в головном мозге, но не в печени.

Тенденция к снижению активности ГГТ в 3 из 6 изученных органах при гиперкапническсй гипоксии может способствовать сбережении глутатиона. в том числе для реакций, катализируемых ГПО и ГГ. Однако в сердце и головном мозге не происходит активации ГТ и ГПО. Это расходится с сообщением, что активность ГПО спивается при непрерывной, но увеличивается при периодической гипоксии Шеерсон Ф.З., 1991].

Концентрация ББН при гипоксии более стабильна, чем активность ФМГ. Это комет быть связано как с противоположными изменениями активности разных ФПГ. так и с компенсаторными

Таблица 2.

ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ МЕТАШША ШТАТНОМ (В У.) ПРИ ГИПОКСИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ.

СЕРИЯ ГПО ГТ ГГТ ГР 05Н

СЕРЛЦЕ

Гипоксия Адаптация +6,7+13 б -38+14 +7,8+8.6 -22+6,0В -66+35Э +47+29 -9.9+7.2 +23+5,3*" -8,6+5,4 б +20+В.1

■ ПЕЧЕНЬ

Гипоксия Адаптация б +39+17 -75+15*" -8,24*8.5 -27+6.8Г -32+183 +20+20 -4,7+6,5 -33+5,?Г -1.5+6.9 +5,0+9.5

ПОЧКИ

Гипйксия Адаптация +18+11 -62+14Г б -16+7.8 -437?/ -18+14 +48+27 • б -14+5.8 в -37+11 -7.2+6,4 +25+5,98

ГОЛОВНОЙ мозг

Гипоксия Адаптация +6.1+13 в -53+17 -12+10 -16+12 а -41+21 б -29+9,2 4,3+8,3 . -21+4!3Г -15+7.5 б +17+5.7

СЕЛЕЗЕНКА

Гипоксия +25+1? +0.5ЙР3.9 -28+10 +2,0+7,1 -3,6+6,2

костный мозг

Гипоксия ] +35+22 +16+13 +12+15 -

ПРИМЕЧАНИЯ: Гипоксия - острая птсркаппическая гипоксия; адаптация - адаптация к пошбарической гипоксии ГПО - глу-татионперошщаза; ГТ - глутатионтрансфераза: ГГТ - гаи-ма-гл\,гамшрансфераза: ГР - глутатипчредуктаза: СБН - вос-стансвлегпшй глутатион: а - р < 0,1: - р < 0.05: в - р < 0.01: г - р < 0.00!.

- гч -

сдвигами биосинтеза ЁБН.

, Изменения активности ФИГ. характерные для стрессовых

I .

реакций, кроне предсмертной активации ГПО в печени, полностью отсутствует при гипоксии. Диво .> ранние сроки (2-4 кинуты). когда обычно происходит усиленный выброс в кровь кате-холаминов и глюкокортикостероидив и развиваются симпатико-гешше вегетативные сдвиги [Меерсон Ф.З., 1986; Кулинский В.И.. Ольховский И.А., 19921. Очевидно, отсутствие ранних реакций ФЫГ в нааих опытах связано "с использованием барбиту-ратного наркоза, который резко сникает реактивность стволовых вегетативных центров и в результате - мобилизацию кате-.'.оламинов.

Во второй фазе гипоксии наблюдается реализация, стратегии толерантности, сопровоЕдаяяейся сниаением потребления кислорода ц температуры тела (Хг'ачка П.. Соиеро Да.. 1988; Кулинский'В.И.. Ольховский И.А.. 1992]. Снивение активности большинства ФИГ мовет быть связано с действием гормонов, реализующих ст^тегив толерантности [Кулинский В.И.. Ольховский И.А., 19921. •

Длительная адаптация к гипоксии такие происходит по толерантному типу. Однако биохимические механизмы изменений активности ФМГ. вероятно, различны. При острых воздействиях, таких, как гиперкапиическая гипоксия, изменяется активность Ферментов. По-видимому, в результате адаптации к гипобари-чоской гипоксии происходит репрессия больашнетва ФМГ в исследованных органах и индукция ГГТ в почках. Комплексное снижение активности болызинства ФМГ моает быть неблагоприятный. так как приводит к снижению защитных систем организма. Другое возможное объяснение: при-адаптации к гипоксии происходит снижение концентрации активных Форм кислорода и. как

следствие. отсутствие необходимост.. е высокой активности ГПО и ГТ. Необходимо отметить, что повышение концентрации глута-тнона в 3 из 4 органах-- в сердце, почках и головной мозго -является благоприятным фактом.

ВЫВОДЫ.

1. Адреналин, как и другие катехоламины (норадреналнн и изопропилнорадреиалин). увеличивает активность ГПО в сердце, печени и почках и ГР п сердце и печени и ингибирует ГГТ в почках. Активность ГР не изменяется. Концентрация М^Н изменяется (увеличивается) только в печени./-агонист клофелин на ФМГ не.влияет. Это показывает, что катехрламиновая регуля-

г

ция ФПГ носит не дуалистический, а однонаправленный характер - через у, -рецепторы; «¿¿-рецептори не участвуют.

2. Вазальная активность ФМГ у крысят в 1-30 сутю( яиз-ни существенно отличается от взрослого типа. Наиболее характерны низкая активность ГПО в печени и почках. ГТ в печени, почках и сердце. ГГТ в почках и ГР в печени " почках (час»? минимум на 3-5 сутки) и увеличенная активность ГГТ в печени (особенно рез!:.о в первые сутки) и сердце (на 3-5 сутки). Характерные для взрослых крце эффекты цАМФ на ФМГ отсутствует к..и даже (ГПО в ги. |енн и сердце. ГТ в сердце. ГГТ с почках) извращены. Таким образом, система ФМГ как по активности, так и по регулируемости у новореадошшх крыс является незрелой,

3. влияние аденозннэ и его сссктивних к н-рсцепторам гнылосп» и большинство сл"чаев отсутствует или незакономерно. Рйчдко >»ик ишдвт .«кгавн«зсть ГТ (адснозии и цикадгекси .Ч!П!;но:1й1!) и И Т („ ¡' N этилкарбоисамидадсиазин) п П»'Ч'.-)Ч. Ч1"'Ч!|»|« .»г чттипкость ГГТ п костном мозге и ГР п

селезинко (аденозии и Н-этилкарбоксацидаденозин).

4. Инсулин не влияет на активность ГР. не вызывает сдвигов в сердце'. печени и костное мозге, но ъ головном мозге. почках и селезенке как в ранние сроки (1 ч). так и позднее' (5 и 24 ■!). в некоторых сериях изменяет (как правило, снижает) активность ФИГ и концентрации ЁБН. Эти сдвиги не соответствуют разделении органов по .чувствительности углеводного обмена к инсулину и не коррелируют с гипогликемией.

5. Эмоционально-болевой стресс активирует ГПО в"сердце, почеии и почках и ГТ в сердце и печени, ингибирует ГГТ в печени. активность ГР и концентрация £5Н не изменяются. Эти сдвиги совпадают с . эффектами экзогенных кагехолаиинов и. очевидно, опосредованы мобилизацией эндогенных катехолами-1.ов. Эти сдвиги могут иметь защитное значение.

6. 2-4-минутная гипоксия не изменяет активность ФИГ. При гибели от гипоксии спивается активность ГТ и ГР в поч ках и наблюдается тенденция к снижения активности ГГТ в сер-. дце, печени и головной мозге. Длительная прерывистая адаптация к гипоксии снижает активность ГПО, ГТ и ГР в сердце, печени. поч'/ах и головном ыозге. Этот нестрессовый тип реакции, особенно выраженный при адаптации к гипоксии, может сн"жать сопротивляемость организма к пероксидации и ксенобиотикам-электрофилам.

7. Регуляция ФМГ не ограничивается экзо- и эндогенными (стресс) катехол-нннами. Инсулин. Л-агоиисты. острая гипоксия и длительная.адаптация к ней изменяют активность ФИГ. Эти сдвиги носят не генерализованные«, а направленный характер и чаще проявляются снижением активности ФМГ. Таким образом. существуют два типа реакций ФМГ гормоны' и экстре-малыше Факторы..

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Ясько М.В. Исследование активности и регулируемости цАИФ Ферментов метаболизма глутатиона в тканях новоров-денних крис. // Тезиси докладов 58-Й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых ИГИИ. - Иркутск. 1991. - С. 8-9.

2. Колесниченко Л.С., Ясько Н.В. Влияние аденозина на активность ферментов метаболизма глутатиона. // Тезиса докладов Si ИешдународноП конференции "Экологическая патология и ее фармакокоррекция". - Чита, 1991. - 4.2. -С. 149.

3. Колесниченко Л.С., Ясько И.В. Активность и регулируемость цАЫФ ферментов -метаболизма глутатиона (ФМГ) у крысят. // Тезисы докладов 4 конференции "Биоантиокси-дант". - Москва, 1992. - Т.1. - С:' 52-53.

4. Ясько И.В., Глуакова Е.Ф., Филоненко 0.Н. Влияние гипоксии на активность ферментов метаболизма глутатиона в органах крыс. // Тезисы докладов конферекдии молодых ученых "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины'":' - Иркутск, 1993. - С. 43.

5. КулинскиА В.П., Колесниченко Я.С., Нанторова П.С., Мсько Н.В., Бардыаова Т.П. Чувствительность и десенси-тизация ферыентов метаболизма глутатиона (ФМГ) к сАМГ // 2-я конференция биохимиков Узбекистана. - Ташкент, 1993. - С. 53.

6. Колесниченко Л.С.. Ку. шский В.И., Яськс.Н.В., Нанто-рова 11. С. Гормональная и мессендяерная регуляция Ферментов метаболизма глутатиона. // 2-я конференция биохимиков Чзбекистана..- Таикент, 1993. - С. 4?.

7. Колесниченко Л.С., Кулинский В.11., Ясько И.В., Екимов E.H.. ;Станевич О.. Глуикова Е.Ф. Влияние эмоционально-болевого стресса (ЗБС) на активность ферментов метаболизма глутатиона (ФЫ( ) и концентрацию GSH в органах крис. // "Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний". - Санкт-Петербург. 1993. - С. 150. '

8. Кулинский В.И.. Колесниченко. Л.С.. Ясько Н.В.. Глуикова Е.Ф., Станевич Л.И., Белогоров С.Б. Влияние гипоксии и адаптации к ней на активность ферментов ыетаболиэиа глутатиона (ФИГ) в органах крыс. // "Актуальные проблемы патофизиологии экстремальных состояний". - Санкт-Петербург, 1993. - С. 52.

9. Колесниченко Л.С.. Ясько И.В.. Филоненко Ю.Н. Устройс:-»о для создания услоьлй гиперкапнической гипоксии. // Тезисы докладов научно-практической конференции "Изобретательство и рационализация -в медицине". Иркутск, 1994. - С. 23-24.

10. Колесниченко Л.С., Нцлинский В.И., Ясько И.В., Екимов E.H., Станевич Л.И.. Глуикова Е.Ф.. Белогоров С.Б., Филиппова' Г.Т. Влияние эмоционально-болевого стресса, гипоксии . и адаптации к ней на активность Ферментов метаболизма глутатиона (ФИГ). // Вопросы медицинской химии. - 1994. ~ Т.40. N 5. - С. 10-12.

11. Колесгчченко Л.С., Кулинский В.И., Ясько И.В., Пенсионерова Г.ft., Грудинина Й.В. Влияние инсулина и адреналина на активность ферментов метаболизма глутатион. и его концентрации в органах крыс. // Проблемы эндокринологии. - 1994. - Т. 40. H 3-С. 42-44.