Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние наследственных факторов на изменчивость уровней маркеров патологии плода (АФП и ХГЧ)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние наследственных факторов на изменчивость уровней маркеров патологии плода (АФП и ХГЧ)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РАМН

на правах рукописи УДК 575.599.9

Чивилев Игорь Викторович

ВЛИЯНИЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ ФАКТОРОВ НА ИЗМЕНЧИВОСТЬ УРОВНЕЙ МАРКЕРОВ ПАТОЛОГИИ ПЛОДА (АФП и ХГЧ).

(03.00.15- генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -1997

Работа выполнена в лаборатории пренатальной диагностики Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель: Доктор биологических наук Т.В. Золотухина

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, С.С. Шишкин кандидат медицинских наук Г.Г. Гузеев

Ведущее научное учреждение: НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится " ^ " 1998 г.

в час, на заседании Диссертационного совета Д. 001.16.01 при Медико-генетическом научном центре РАМН (МГНЦ РАМН) (115478, Москва, Москворечье, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН

Автореферат разослан " 5 ' г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из актуальных проблем медицинской генетики является проблема влияния генетически детерминированных признаков материнского организма на развитие плода. Как известно плацента человека относится к гемохориальному типу. Такое строение плаценты обеспечивает создание самого тесного контакта между кровью матери и плода. Многие метаболиты и питательные вещества проникают из материнской крови в кровь плода, обеспечивая его всем необходимым для роста, их концентрация в крови матери оказывает влияние на развитие плода. С другой стороны существование плацентарного барьера ограничивает трансплацентарный переход целого ряда веществ из крови матери в кровь плода и обратно. Биологически активные вещества из крови матери могут увеличивать или уменьшать проницаемость плаценты, тем самым изменяя скорость обмена различными веществами между материнской и плодной кровью. Для некоторых белков из материнского кровотока, например имуноглобулинов, существуют специальные механизмы транспорта через плацентарный барьер, и от их количества и качественного состава зависит благополучное развитие плода. Исследование данной проблемы представляет интерес для таких различных дисциплин, как генетика, биология развития и акушерство.

Одним из аспектов данной проблемы является изучение влияния генетически обусловленных факторов материнского организма на биохимические параметры, определяемые генотипом плода. Такая возможность предоставляется в связи с тем, что некоторые белки и гормоны, секретируемые тканями плода, не синтезируются в организме взрослого человека. Некоторые из них проникают в материнский кровоток в количествах, достаточных для их обнаружения. Наше исследование посвящено изучению влияния генотипа матери на такие биохимические параметры, определяемые

генотипом плода, как концентрация альфа-фетопротеина (АФП) и хорионического гонадотропина человека (ХГЧ).

Еще один аспект данного исследования связан с использованием АФП и ХГЧ материнской сыворотки в пренатальном скрининге на синдром Дауна (СД) и дефекты нервной трубки (ДНТ) у плода. В настоящее время большинство пренатальных скринируюицих программ использует информацию о материнском возрасте в сочетании со значениями уровней АФП, ХГЧ, которые являются маркерами СД у плода и измеряются как правило во втором триместре беременности в сыворотке матери. Повышенный уровень АФП ассоциирует с увеличенным риском ДНТ у плода. Возрастание уровня ХГЧ в сочетании с понижением уровня АФП у беременной рассматриваются как сигнал о повышенном риске рождения ребенка с СД. В настоящее время имеются данные что, понижение уровня и ХГЧ и АФП у беременной ассоциируют с рождением ребенка с синдромом Эдвардса.

Использование данных биохимических маркеров позволяет формировать фуппу высокого риска по СД для последующей пренатальной цитогенетической диагностики. В результате цитогенетической диагностики, связанной с использованием инвазивных процедур, только у 2% плодов в отобранной группе риска выявляется СД. Использование инвазивных процедур сопряжено с риском прерывания беременности (1.5-2%). Поэтому принятой стратегией пренатальной профилактики СД является формирование среди беременных, в частности, с помощью пренатального скрининга, групп высокого риска, в которых риск рождения ребенка с СД равен или превышает риск прерывания беременности вследствие диагностической процедуры.

Такой подход позволяет обнаруживать до 90% пораженных плодов с ДНТ и до 67% всех беременностей, при которых у плода имеется СД, при уровне ложноположительных результатов скрининга 5%. Низкая эффективность обнаружения пораженных плодов с СД в группе риска и высокий уровень ложноположительных результатов связаны с необъясненной высокой

вариабельностью концентраций используемых в скрининге сывороточных маркеров (СМ) как среди женщин со здоровым плодом, так и среди беременных с пораженным плодом.

Показано, что дпя женщин, имеющих необъяснимые отклонения уровней АФП и ХГЧ и, как следствие, находящихся в группе высокого риска по СД или ДНТ, значительно повышается риск вновь попасть в группу с положительным результатом скрининга в следующую беременность (Dar H., Merksamer R., Berdichevsky D„ David M., 1996). Это означает, что часть женщин может подвергаться инвазивным процедурам каждую беременность при здоровом плоде, тогда как другие будут рожать больных детей, при отрицательных результатах тестирования. Полученные данные говорят о существовании генетической предрасположенности беременной к определенному уровню маркера или о влиянии сходных факторов окружающей среды на женщин во время беременности. Точные причины вариации уровней маркеров и механизмы, приводящие к изменению уровней АФП и ХГЧ остаются до сих пор неизвестными. Однако такие факты как изменение уровней СМ у матерей с сахарным диабетом (Haddow J.E., 1992) и наличие расовых различий в уровнях CM (Crandal B.F., Lebherz Т.В., Schroth P.C., et al., 1983) говорят о возможном влиянии генетически обусловленных факторов организма матери на концентрацию в ее крови маркеров, синтезируемых плодом.

Все вышеизложенное определило актуальность данного исследования, результаты которого смогут внести вклад в изучение взаимодействия материнского организма и организма плода. Кроме того, исследование данной проблемы поможет понять механизмы индивидуальной вариабельности значений АФП и ХГЧ и увеличить эффективность формирования групп высокого риска по СД и ДНТ при проведении пренатального биохимического скрининга. Цель работы

Изучение влияния материнского генотипа на уровень экспрессируемых плодом АФП и ХГЧ в материнском кровотоке в течение беременности. Задачи исследования

1. Изучить корреляции отдельных полиморфных генетических локусов материнского организма с различными уровнями экспрессируемых плодом АФП и ХГЧ.

2. Исследовать связь экспрессируемых плодом АФП и ХГЧ с биохимическими параметрами материнского организма, зависящими от материнского генотипа.

3. Оценить риск иметь отклонения АФП и ХГЧ для женщин с изучаемыми фенотипами.

4. Исследовать возможность увеличения эффективности биохимического скрининга во втором триместре беременности на наличие у плода СД.

Научная новизна.

В работе впервые проведено исследование влияния генетически обусловленных признаков материнского организма на уровень экспрессируемых плодом АФП и ХГЧ, определяемых в материнском кровотоке. Показано достоверное влияние, которое оказыванет материнский организм на концентрацию АФП и ХГЧ в крови матери. Продемонстрирована генетическая предрасположенность беременных к определенному уровню материнского сывороточного АФП и материнского сывороточного ХГЧ. Показано, что полиморфизм отдельных материнских' генов является одной из причин индивидуальной вариабельности значений АФП и ХГЧ во время беременности.

Были исследованы связи между количественными параметрами, напрямую определяемыми рассматриваемыми локусами, и значениями уровней АФП и ХГЧ. Впервые были получены данные о наличии связи уровня ХГЧ с концентрацией общего билирубина в крови, а также о связи уровня АФП с трипсин ингибирующей способностью сыворотки.

Практическая значимость работы.

Полученные данные имеют значение для дальнейшего исследования возможности увеличения эффективности пренатального биохимического скрининга на синдром Дауна. На основании данных, полученных в настоящем исследовании, был проведен расчет риска иметь отклонения в значениях сывороточных маркеров (СМ) у женщин с известными генотипами изучаемых локусов. Было показано, что женщины, несущие определенные генотипы полиморфных генетических локусов, имеют повышенный риск попасть в группу с отклоняющимися значениями АФП или ХГЧ во время беременности по сравнению с беременными, не несущими данных аллелей. Так женщины, несущие редкие факторы локуса ингибитора протеиназ (PI) имеют в 6.3 раза больший относительный риск ложноотрицательного результата обследования на СД. Женщины с резус отрицательным фенотипом и фенотипами АСР1 АА и АСР1 АС имеют в 1.9 и в 1.96 раз, соответственно, больший риск ложноотрицательного результата обследования на СД. Женщины с фенотипами HP 2-2 напротив в 1.9 раза чаще попадают в группу высокого риска по СД.

Проведенное исследование по изучению эффективности коррекции значений АФП и ХГЧ, используя данные о таких параметрах сыворотки как трипсин ингибирующая способность сыворотки и общий билирубин, показало, что использование этих биохимических показателей дает возможность увеличить эффективность сывороточного скрининга на СД у плода.

Полученные в работе результаты позволяют выделить, наряду с уже известными (многоплодная беременность и сахарный диабет), дополнительные категории женщин с отклоняющимися значениями АФП и ХГЧ при здоровом плоде. Так резус фенотип определяется всем беременным женщинам, что позволяет использовать эту информацию без каких-либо дополнительных анализов. Определение фенотипов беременных по локусам PI, HP и АСР в группе высокого риска позволит увеличить эффективность

обследования на СД у плода и снизить число ложноположительных и ложноотрицательных результатов при биохимическом скрининге и, таким образом, более аргументировано осуществлять инвазивные процедуры.

Положения выносимые на защиту.

1. Существование связи между определенным генотипом матери и уровнями сывороточных АФП и ХГЧ, экспрессируемых плодом.

2. Существование корреляции между уровнем АФП, трипсин ингибирующей способностью сыворотки беременной и наличием определенных факторов Р).

3. Существование корреляции между уровнем ХГЧ, концентрацией общего билирубина в крови беременной и наличием определенных фенотипов АСР1.

4. Формирование групп беременных с теми генотипами, при которых повышена вероятность ошибочного теста при скрининге на синдром Дауна.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на межлабораторном семинаре Института клинической генетики МГНЦ РАМН (1997). Материалы работы также представлялись на 2-ом PECO-EUCROMIC конгрессе (конференция по пренатальной диагностике, 1997) и на семинаре «Диагностические аспекты применения ИФА тест-систем «Roche» (1997). Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ. Структура и объем работы. Работа изложена на 136 листах машинописного текста; состоит из введения обзора литературы, материалов и методов, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы (19 отечественных и 141 зарубежных работ). В тексте диссертации 10 рисунков и 30 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Характеристика обследованной группы. Для исследования использовались образцы периферической крови от 2307 беременных женщин, проходивших обследование в окружном центре пренатальной диагностики при 27 родильном доме г. Москвы с июля 1994 до июля 1996 года в сроке беременности от 14 до 22 недель в скрининговом режиме.

Образцы крови сопровождалась анкетой, в которой содержались данные о количестве предыдущих беременностей и их исходах, данные о возрасте женщин, их весе на момент обследования, данные анамнеза и результаты УЗ-обследования. Цитогенетическое исследование плода проводилось в лаборатории пренатальной диагностики МГНЦ РАМН при использовании "прямых" хромосомных препаратов или культур лимфоцитов пуловинной крови по методам, принятым в лаборатории.

Контрольная группа (Ы = 1339) в данном исследовании формировалась путем безвыборочного изучения образцов крови от женщин, сдавших кровь в указанном сроке беременности. При формировании всех последующих групп были исключены женщины с хромосомной патологией плода, с врожденными пороками развития плода, с многоплодной беременностью, а также с другими осложнениями беременности, и беременные с неблагополучными исходами родов. Кроме контрольной группы было сформировано 6 групп: с повышенным уровнем АФП (АФП > 2.0), нормальным уровнем АФП (0.5>АФП>2.0), пониженным уровнем АФП (АФП < 0.5) и с повышенным уровнем ХГ (ХГ > 2.0), нормальным уровнем ХГ (0.5>ХГ>2.0), пониженным уровнем ХГ (ХГ < 0.5).

Материал дпя исследования. Сыворотка венозной крови беременных женщин забиралась из локтевой вены. Образцы сыворотки крови до постановки опыта хранились в при температуре -20 0 С. Сгустки крови, остававшиеся после получения сыворотки, замораживали на -200 С.

Аналитические методы. В сформированных группах исследовано распределение фенотипических и генных частот по следующим полиморфным системам: группы крови АВО и RH, и системы трансферрина (TF), витамин D транспортирующего белка (группоспецифический компонент) сыворотки крови (GC), гаптоглобина (HP), амилазы поджелудочной железы (AMY2), ингибитора протеиназ (PI) и кислой эритроцитарной фосфатазы (АСР1). Последняя была изучена только в контрольной группе и в группах с различным уровнем ХГЧ.

Концентрацию АФП и ХГ определяли твердофазным иммуноферментным методом с использованием тест-систем АО "РОШ-Москва" по стандартному протоколу. Все значения концентраций АФП и ХГ выражали в МоМ. Уровни белков гаптоглобина и ингибитора протеиназ исследовались посредством техники радиальной иммунодифузии с применением агарозных пластинок с преципитирующими антисыворотками фирмы "Behring".

Фенотипы трансферрина и группоспецифического компонента определяли одновременно изоэлектрическим фокусированием в 0.5 мм полиакриламидном геле с иммобилизованным градиентом pH (от 5.9 до 5.0) с последующим окрашиванием кумасси (Cleve Н., Patutschnick W., Postel W. et al. 1982; Gorg A., Weser J., Westermeier R. et al. 1983). Ингибитор протеиназ исследовали изоэлектрофокусированием в 0.5 мм агарозном геле с последующим окрашиванием кумасси (Frants R.R., Noorhoek G.T., Eriksson A.W. 1978). Гаптоглобин разделяли электрофоретически в вертикальном блоке ПААГ (Altland К., Hackler R., Knoche W. 1980). Выявление типов таптоглобина проводили при помощи бензидиновой реакции (Smithies О., Connel G.B. 1959). Амилазу поджелудочной железы исследовали электрофоретически в горизонтальном блоке 1% агарозы с высоким электроэндоосмосом. Проявляли гель раствором люголя (Kompf J., Siebert G., Ritter H. 1979). Кислую эритроцитарную фосфатазу исследовали методом изоэлекгрофокусирования гемолизата эритроцитов в 0.5 мм агарозном геле с амфолином pH 4-6.5 (LKB). Ферментативную активность выявляли при помощи раствора 4-

метилумбеллиферилфосфата (Miller S.A., Nelson M.S., Dykes D.D., Polesky H.F. 1987). Группы крови ABO и Rh определялись общепринятыми методами гемагглютинации с помощью антисывороток СПК ГУЗМ.

Уровень общего билирубина в сыворотке крови беременных определили на наборах фирмы "Sigma" с использованием биохимического анализатора фирмы "Abbot" (модель VP). Трипсин ингибирующую способность сыворотки определяли и расчитывали в соответствии с методом, изложенном в работе (Homer G.M., Zipf R.E., Hieber Т.Е., Katchman B.J. 1960).

Статистическая обработка данных. Частоты генов расчитывались из эмпирического фенотипического распределения методом максимального правдоподобия. Для систем с кодоминантным наследованием, а также для системы ABO в каждой выборке проводилась проверка соответствия наблюдаемых частот фенотипов теоретически ожидаемым с помощью критерия Хг ■ Достоверность различий между выборками оценивали с помощью критерия х2 . 0 случае малого размера выборки - с помощью модифицированного критерия х2 • При статистической обработке полученных результатов наряду с общепринятыми методами для сравнения средних применяли методы численного ресэмплинга (Вейр Б., 1995). Генетические расстояния между изученными группами по совокупности локусов оценивались по методу Nel (Nei М., 1972).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОСВЯЗИ МЕЖДУ ГЕНЕТИЧЕСКИМ ПОЛИМОРФИЗМОМ ОТДЕЛЬНЫХ ПОКУСОВ И УРОВНЕМ СЫВОРОТОЧНЫХ

МАРКЕРОВ.

Для оценки генетических различий между 6 группами с разными уровнями сывороточных маркеров был использован критерий хи-квадрат. При

сравнении фенотипических частот исследуемых локусов в группах с нормальным уровнем АФП и ХГЧ с соответствующими частотами в контрольной группе не было обнаружено статистически достоверных отличий в частотах для всех использованных полиморфных систем. При сравнении контрольной группы и группы с повышенным уровнем ХГЧ по фенотипическим частотам исследованных локусов статистически достоверных отличий также не обнаружено. Между остальными изучаемыми группами и контрольной групой обнаружены статистически достоверные различия по следующим генетическим системам: по частотам фенотипов фактора Резус - между контролем и беременными с пониженным уровнем ХГЧ (Р<0.01); по частотам фенотипов гаптоглобина - между контролем и беременными с пониженным уровнем АФП (Р<0.01); по частотам фенотипов ингибитора протеиназ - между контролем и беременными с повышенным уровнем АФП (Р<0.01); по частотам фенотипов кислой эритроцитарной фосфатазы - между контролем и беременными с пониженным уровнем ХГЧ (Р<0.05). Таким образом обнаружены значимые корреляции между принадлежностью беременной к определенному фенотипу ряда генетических локусов и отклонением уровней АФП и ХГЧ в крови беременных женщин.

С этой же целью - оценить генетические различия между изучаемыми группами - мы провели сравнение между исследуемыми группами по генным частотам (таблица 1). Мы обнаружили статистически достоверные различия по следующим генетическим системам: по генным частотам системы Резус -между контролем и беременными с пониженным уровнем ХГЧ (Р<0.01); по генным частотам гаптоглобина - между контролем и беременными с пониженным уровнем АФП (Р<0.01); по генным частотам ингибитора протеиназ - между контролем и беременными с повышенным уровнем АФП (Р<0.001); по генным частотам кислой эритроцитарной фосфатазы - между контролем и беременными с пониженным уровнем ХГЧ (Р<0.05). Сравнение контрольной группы с группами с нормальным уровнем АФП и ХГЧ и с беременными с

повышенным уровнем ХГЧ не показало статистически достоверных отличий ни по одному из изученных локусов.

Известно, что концентрация гаптоглобина в сыворотке крови у небеременных женщин зависит от их генотипа по гену гаптоглобина (Прокоп О., Гелер В. 1991). Анализ распределения концентрации гаптоглобина в нашем исследовании подтвердил, что во втором триместре беременности его уровень в материнской сыворотке зависит от генотипа матери и уменьшается в ряду Hp 1-1 > Нр2-1 > Hp 2-2. Таким образом и у беременных женщин концентрация гаптоглобина зависит от генотипа по гену гаптоглобина. Исходя из полученных данных о корреляции уровння АФП и концентрации гаптоглобина с генотипом по гену гаптоглобина у беременных была проверена возможная корреляция концентрации гаптоглобина и уровня АФП. Сравнение средних методом численного рисэмплинга позволило обнаружить достоверные (Р<0.001) отличия в концентрации гаптоглобина между группой с нормальным уровнем АФП и группой, характеризующийся пониженным уровнем АФП. То есть, пониженный уровень АФП в крови беременных коррелирует с низкой концентрацией гаптоглобина, что однако нельзя сказать о повышенном уровне АФП и гаптоглобина. Однако, наличие корреляции сниженного уровня АФП с низкой концентрацией гаптоглобина позволяет предположить, что влияние генома матери по локусу гаптоглобина на уровень АФП в материнской крови происходит при участии белкового продукта данного локуса.

Показано, что такие редкие аллели ингибитора протеиназ как PI*Z, PI'S и PI'I приводят к снижению концентрации альфа-1-антитрипсина (ААТ) и трипсин ингибирующей способности сыворотки (ТИСС) в крови (Martin N.G., et al., 1987) в состояниях не связанных с беременностью. Но не было информации об изменениях их концентрации при наличии редких аллелей ингибитора протеиназ у беременных. Мы сравнили концентрации а-1-антитрипсина и трипсин ингибирующей способности сыворотки (ТИСС) в группах с разными генотипами ингибитора протеиназ при помощи критерия медианы и показали,

что у беременных с редкими аллелями ингибитора протеиназ происходит достоверное снижение концентрации ДАТ (Р<0.00001) и ТИСС (Р<0.000025) в крови. Существование корреляций уровня АФП, концентрации ААТ и ТИСС с генотипом ингибитора протеиназ у беременных дало основания проверить гипотезу о корреляции уровня АФП с концентрацией ААТ и с ТИСС. Проведенный корреляционный анализ выявил наличие статистически достоверной отрицательной i корреляции между уровнем АФП и трипсин ингибирующей способностью сыворотки (г =-0.484, Р<0.001 ). Полученные данные дают возможность предположить, что влияние материнских аллелей локуса ингибитора протеиназ на уровень АФП опосредуется через белковый продукт данного локуса - альфа-1 -антитрипсин, который на 80% определяет уровень ТИСС.

Ранее было показано, что новорожденные с разным генотипом АСР1 имеют достоверные отличия по уровню билирубина (Bottini Е., Scacehi R., Gloria-Bottini F., 1976). В нашей работе были получены значения концентрации общего билирубина в двух группах беременных с разными генотипами АСР1. При сравнении уровня билирубина применяли критерий медианы. Различия по уровню билирубина между группой с генотипами А+АС и группой с генотипами АВ+В+ВС оказались достоверными (Р<0.05), Обнаруженные корреляции уровня ХГЧ и уровня общего билирубина с генотипом АСР1 позволили проверить возможность взаимной корреляции уровня ХГЧ и концентрации общего билирубина. Расчитанный коэффициент корреляции (г = - 0.370) показал с достоверностью Р<0.001 наличие обратной зависимости между уровнем ХГЧ и общим билирубином сыворотки. Боттини с соавторами (Bottini Е., Lucarelii P., Bastianon V., Gloria F., 1972) было высказано предположение, что определенный генотип АСР1 снижает устойчивость эритроцитов к гемолизу, что и определяет повышенный уровень общего билирубина у индивидов с данным генотипом. Причина корреляции снижения устойчивости эритроцитов к гемолизу с пониженым уровнем ХГЧ остается неизвестной.

Однако, с большой достоверностью можно предположить, что воздействие на уровень ХГЧ опосредуется белковыми продуктами генов локуса АСР1.

Таблица 1.

Частоты аллелей в контрольной группе и в групапах беременных с разными уровнями АФП и ХГЧ.

Система, контроль Уровень АФП (МоМ)__Уровень ХГЧ (МоМ)

аллели <0.5 0.49- >2.0 <0.5 0.49- >2.0

1.99 1.99

АВ0 П=1339 п=214 11=1150 п=144 п=127 п=867 п=377

*0 0.6095 0.6330 0.6057 0.5869 0.5933 0.6019 0.6275

*А 0.2339 0.2252 0.2404 0.2329 0.2209 0.2392 0.2302

•в 0.1566 0.1418 0.1539 0.1802 0.1858 0.1589 0.1424

RH п=1591 п=86 П=1168 П=81 п=82 п=923 п=586

D 0.577 0.530 0.589 0.570 0.459 0.584 0.585

d 0.423 0.470 0.411 0.430 0.541 0.416 0.415

TF п=464 п=136 п=611 п=105 п=93 п=435 п=318

*С1 0.7478 0.7904 0.7553 0.7524 0.7419 0.7621 0.7657

*С2 0.1638 0.1324 0.1555 0.1667 0.1452 0.1448 0.1651

*СЗ 0.0830 0.0735 0.0843 0.0810 0.1075 0.0908 0.0645

*D 0.0032 0.0037 0.0033 0.0054 0.0011 0.0031

*В 0.0022 0.0016 0.0011 0.0016

GC п=365 п=125 п=507 П=69 п=82 п=351 п=226

MF 0.1301 0.1680 0.1174 0.1522 0.1402 0.1225 0.1327

*1S 0.5644 0.5320 0.5483 0.5290 0.5549 0.5442 0.5354

*2 0.3055 0.3000 0.3343 0.3118 0.3049 0.3333 0.3319

PI П=681 п=143 п=772 П=100 п=106 п=568 11=314

*М1 0.7379 0.7568 0.7416 0.7000 0.7689 0.7324 0.7516

*М2 0.1652 0.1588 0.1665 0.2100 0.1557 0.1761 0.1576

*МЗ 0.0910 0.0811 0.0874 0.0550 0.0613 0.0871 0.0828

♦Var 0.0058 0.0034 0.0040 0.0350 0.0141 0.0045 0.0080

HP п=322 п=97 п=460 п=61 П=80 11=305 п=228

*1 0.3882 0.2784 0.3685 0.4016 0.4000 0.3393 0.3684

*2 0.6118 0.7216 0.6315 0.5984 0.6000 0.6607 0.6318

АСР1 п=466 п=58 п=351 п=61

*А 0.3637 0.4483 0.3490 0.4344

*В 0.5773 0.4741 0.5912 0.5082

*С 0.0590 0.0776 0.0598 0.0574

AMY2 П=160 п=97 п=317 П=46 п=66 п=228 П=159

*1 0.9625 0.9588 0.9637 0.9891 0.9773 0.9539 0.9780

*2 0.0375 0.0361 0.0347 0.0109 0.0227 0.0439 0.0222

*3 0.0052 0.0016 0.0022

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ МЕЖДУ ГРУППАМИ ПО КОМПЛЕКСУ ИЗУЧЕННЫХ ЛОКУСОВ,

Для выявления степени различий между изучемыми группами по всему комплексу изученных локусов были исследованы генетические расстояния по совокупности 7-ми изученных локусов. Для наглядного представления величины генетических расстояний и направленности различий между исследуемыми группами в пространстве двух измерений мы воспользовались методом многомерного шкалирования (Дейвисон М„ 1988). Многомерное шкалирование полученных нами генетических расстояний было проведено с финальным стрессом, равным 0.00026 (многомерное шкалирование считается успешным, если стресс меньше 0.1), что показывает высокую точность приближения наглядного двумерного изображения к реальным значениям генетических расстояний.

Диаграмма, выражающая результаты многомерного шкалирования генетических расстояний между изучаемыми группами представлена на рисунке 1. Из диаграммы видно, что контрольная группа, группы с нормальным уровнем АФП и ХГЧ, а также группа с повышенным уровнем ХГЧ образуют совокупность из близко расположенных групп. Группы с низким уровнем АФП и ХГЧ оказываются наиболее отдаленными в генетическом отношении от контрольной группы и групп с нормальным уровнем СМ. Из диаграммы видно также, что группы с пониженным уровнем АФП и ХГЧ удалены от основного кластера в различных направлениях, что отражает их отличия от остальных по различным генетическим локусам. Таким образом результаты исследования по совокупности 7 локусов показывают, что к наиболее отклоняющимся в генетической структуре группам принадлежат группы с пониженным ХГЧ и с пониженным АФП. Из рисунка 1 также следует, что группа с повышенным уровнем АФП также дифференцируется от комплекса когорт с нормальным

уровнем СМ. Ранее была отмечена возможная, наследственная предрасположенность к определенному уровню СМ в последующие беременности. Однако такая тенденция была отмечена для отклонений СМ в сторону их повышения (Dar H., Merksamer R„ Berdichevsky D., David M., 1996). Этот факт можно объяснить тем обстоятельством, что совокупность исследованных нами полиморфных локусов не в полной мере отражает существо воздействия генотипа беременных на уровень АФП и ХГЧ. Можно предположить существование еще некоторого числа неисследованных в данной работе полиморфных локусов, коррелирующих с уровнями АФП и ХГЧ у беременных женщин.

Была изучена степень гетерозиготности в исследуемых группах и оценено отношение этого параметра с генетико-биохимическими факторами. Были определены значения наблюдаемой (Н0) и ожидаемой (Нв) гетерозиготности в группах с разными уровнями АФП и ХГЧ по совокупности всех изученных локусов. Наблюдаемая гетерозиготность в группе беременных с высоким уровнем АФП оказалась ниже чем таковая в контрольной группе по целому ряду локусов (PI, HP, TF). Оценка средней наблюдаемой гетерозиготности в этой группе (0.33) также показывает существенное понижение ее значения по сравнению с контролем (0.41). Существуют также значительные различия между наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностью в этой группе (0.33 и 0.39). Индекс фиксации Райта, определяемый отношением между наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготностью, в группе женщин с повышенным уровнем АФП (0.16) в 17 раз превышает таковое для контрольной группы (0.009), что указывает на выраженную тенденцию к снижению гетерозиготности в этой группе. Ранее изучение уровня гетерозиготности у женщин с привычным невынашиванием беременности показало достоверное снижение среднего уровня наблюдаемой гетерозиготности по сравнению с ожидаемой (Дуброва Ю.Е., Кучер А.Н., Алтухов Ю.П., 1987), что позволяет предполагать, что снижение эмпирической гетерозиготности является одним из

факторов риска этого состояния. Тот факт, что в группе с повышенным уровнем АФП уровень гетерозиготности оказался сниженным хорошо согласуется с известными данными о повышении частоты выкидышей и прерывания беременности среди беременных с повышенным уровнем АФП.

.5-

0-

1 □

г

4 П □

-.5

-1 -

-1.5

-2

-1.5 -1

-.5

Рис. 1. Диаграмма генетических расстояний между изученными группами, приведенных в пространство двух измерений методом многомерного шкалирования (по данным о генных частотах систем: ABO, RH, НР, TF, GC, AMY2, PI). Обозначения на диаграмме: по оси абсцис и по оси ординат -видимые расстояния, выраженные в условных единицах. Изученные группы: 1-контроль, 2 - группа с нормальным уровнем АФП, 3 - группа с нормальным уровнем ХГЧ, 4 - группа с повышенным уровнем ХГЧ, 5 - группа с повышенным уровнем АФП, 6 - фуппа с пониженным уровнем АФП, 7 - группа с пониженным уровнем ХГЧ.

ОЦЕНКА РИСКА ДЛЯ ЖЕНЩИНЫ С ОПРЕДЕЛЕННЫМ ГЕНОТИПОМ ИМЕТЬ ОТКЛОНЕНИЯ В ЗНАЧЕНИИ СЫВОРОТОЧНЫХ МАРКЕРОВ.

Чтобы оценить степень риска иметь отклонение в уровне АФП и ХГЧ во время беременности по методу Вульфа (Woolf В. 1955) мы посчитали относительный риск для тех генетических систем, для которых были получены статистически значимые величины связи между уровнем маркера и генетическим фактором. Величина относительного риска означает, во сколько раз больше риск иметь отклонение в уровне маркеров у женщин с определенным фенотипом по отношению к женщинам без этого фенотипа. Статистическую достоверность относительного риска определили при помощи критерия %2 (таблица 2). В результате этого исследования показано, что женщины с изученными фенотипами имеют достоверно больший риск отклонения уровней одного из сывороточных маркеров.

Величина относительного риска отклонения уровня сывороточных маркеров СД для женщины с определенным фенотипом генетического маркера.

Таблица 2.

Фенотип

Отклонение маркера

Величина xJ(d-f-=0 р риска_

RH-

Понижение уровня 1.90 ХГЧ

6.52 <0.025

АСР АА+АСР АС Понижение уровня

ХГЧ

1.96

4.81 < 0.05

HP 2-2

Понижение уровня 1.90 9.21 <0.005

АФП

Редкие факторы PI Повышение уровня 6.33 12.23 <0.001

АФП

Однако, с клинической точки зрения недостаточно знание величин относительного риска, т.к. эти значения не говорят о том, какая доля беременных с сигнальным фенотипом будут иметь отклонение в уровне АФП или ХГЧ. Поэтому, используя теорему Байеса мы провели расчет абсолютного риска иметь отклонение маркера у женщины с сигнальным фенотипом. Результаты исследования показали, что популяционный риск иметь отклонение в уровне маркера колеблется от 5.3% до 6.4% (таблица 3). Определение у женщины одного из сигнальных RH, HP и АСР1 фенотипов дает лишь незначительное повышение абсолютного риска иметь отклонение уровня маркера во время беременности. Однако при определении у женщины одного из редких аллелей PI риск иметь повышенный АФП увеличивается более чем в 4 раза.

Величина абсолютного риска отклонения уровней сывороточных маркеров СД для женщины до и после определения сигнального фенотипа генетического маркера.

Таблица 3.

Отклонение Сигнальный маркера на СД фенотип

Общепопупяционны й риск отклонения уровня СМ

Риск отклонения уровня СМ у женщины с сигнальным фенотипом

Понижение уровня ХГЧ

Rh-

5.3%

6.5%

Понижение АСР АА + уровня ХГЧ АСР АС

5.3%

8.5%

Понижение уровня АФП

HP 2-2

6.1%

8.8%

Повышение Редкие

уровня АФП факторы PI

6.4%

28.5%

ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ БЕРЕМЕННОЙ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЗНАЧЕНИЙ АФП И ХГ ПРИ СКРИНИНГЕ НА СИНДРОМ ДАУНА.

Вклад различных факторов в вариабельность значений АФП и ХГЧ.

Выше были продемонстрированы зависимости уровней АФП и ХГЧ от некоторых генетических маркеров и корреляции с зависимыми от них биохимическими показателями. Исходя из предположения, что факторы определяющие уровень этих биохимических показателей оказывают воздействие на уровень АФП и ХГЧ в крови матери был оценен вклад значений ТИСС и общего билирубина крови беременной в вариабельность значений АФП и ХГЧ при скрининге на синдром Дауна. Для этого воспользовались методом многофакторного дисперсионного анализа. Результаты дисперсионного анализа подтвердили хорошо известный факт о влиянии срока беременности на уровень АФП в крови матери (Р<0.001) и показали существование достоверного влияния уровня ТИСС матери на уровень АФП в ее крови (Р<0.001). Однако влияние веса беременной на уровень АФП оказалось недостоверным, по видимому, из-за малой величины оказываемого влияния (Р< 0.3). Доля участия факторов в варьировании уровня АФП показана в таблице 4. Из таблицы видно, что степень влияния уровня ТИСС матери на вариабельность уровня АФП является величиной такого же масштаба, что и влияние на уровень АФП такого мощного фактора, как срок беременности, составляя 25% из сумарного вклада различных факторов.

Оценка сравнительного вклада общего билирубина в вариабельность уровня ХГЧ многофакторным дисперсионным анализом (таблица 4) подтвердила достоверное влияние срока беременности и уровня билирубина в крови у матери на уровень ХГЧ в ее крови (Р<0.001 для обеих факторов). Однако влияние веса женщины оказалось недостоверным, как и в случае с АФП, по видимому, из-за малой величины вклада данного фактора (Р< 0.2).

Доля участия факторов в варьировании уровня ХГЧ показана в таблице 4. Видно, что степень влияния уровня билирубина сыворотки матери на вариабельность ХГЧ составляет 22% и сопоставима с суммарным влиянием таких факторов как вес матери и срок беременности (1% + 16%).

Полученные данные показывают, что проведение коррекции значений АФП - по уровню ТИСС и ХГЧ - по уровню общего билирубина должно оказать на эффективность биохимического скрининга синдрома Дауна у плода не меньшее влияние, чем учет таких факторов как срок беременности и вес при расчете относительных концентраций АФП и ХГЧ.

Таблица 4.

Доля участия независимых факторов в варьировании уровней АФП и ХГЧ.

Факторы Вклад в варьирование уровня АФП, % Вклад в варьирование уровня ХГЧ,%

Срок беременности 15 16

Вес беременной 1 1

Уровень ТИСС 25 -

Концентрация общего - 22

билирубина

Другие факторы 59 61

Коррекция значений АФП и ХГЧ.

Чтобы продемонстрировать влияние коррекции по ТИСС на уменьшение вариабельности значений АФП в сыворотке женщин, проходящих скрининг на СД в образцах сыворотки беременных измеряли ТИСС. Результаты были использованы для коррекции значений АФП в группе женщин с здоровым плодом и в группе беременных с СД. Процедура коррекции привела к достоверному уменьшению коэффициента вариации для значений АФП в группе женщин с здоровым плодом по сравнению с его значением в той же группе без использования процедуры коррекции (таблица 5). В группе

беременных плодом с СД процедура коррекции не привела к сколько нибудь значимому изменению коэффициента вариации, что может быть объяснено малочисленностью выборки. Среднее значение АФП в группе женщин с здоровым плодом достоверно снижается после коррекции, тогда как в группе беременных плодом с СД наблюдаемое снижение недостоверно, что также может быть следствием малочисленности выборки. Снижение вариабельности АФП измерением дополнительного параметра крови матери, в данном случае ТИСС, дает возможность увеличить эффективность скрининга на СД.

Чтобы продемонстрировать влияние коррекции по уровню билирубина на уменьшение дисперсии значений ХГЧ был проведен регрессионный анализ наших данных по уровню ХГЧ и концентрации билирубина. Результаты были использованы для коррекции значений ХГЧ в контрольной группе. Процедура коррекции привела к достоверному уменьшению коэффициента вариации для значений ХГЧ в группе женщин с здоровым плодом по сравнению с его значением в той же группе, но без использования процедуры коррекции (таблица 6). В группе беременных плодом с СД процедура коррекции также привела к достоверному уменьшению коэффициента вариации с 69% до 21.1%. Различия между средними значениями, вычисленными до и после коррекции в обеих группах являются достоверными. Однако при значительном снижении вариабельности разница между средними значениями после коррекции в двух исследуемых группах не уменьшается (до коррекции А = 3.28; после А = 3.23). Снижение вариабельности ХГЧ измерением дополнительного параметра крови матери, в данном случае билирубина, дает возможность увеличить эффективность скрининга на СД. Таким образом полученные результаты показывают перспективность использования таких параметров крови матери как уровень билирубина и ТИСС для возможного увеличения эффективности скрининга на СД.

Таблица 5.

Вариабельность значений АФП в группе женщин с здоровым плодом и в группе

беременных с СД до и после коррекции на ТИСС.

Изученные N Характеристики значений Характеристики значений

группы АФП в группе без коррекции АФП в группе после

на ТИСС коррекции на ТИСС

Среднее Коэфф. арифметическое вариации (МоМ) (%) Среднее арифметическое (МоМ) Коэфф. вариации (%)

Женщины с здоровым плодом 50 1.298 45.7% 0.864 11.1%*

Беременные плодом с СД 8 0.87 8.6% 0.73 9.7%

Таблица 6.

Вариабельность значений ХГЧ в группе женщин с здоровым плодом

и в группе беременных с СД до и после коррекции на уровень билирубина.

Изученные N Характеристики значений Характеристики значений ХГЧ

группы ХГЧ в группе без коррекции на уровень билирубина в группе после коррекции на уровень билирубина

Среднее Коэфф. арифметическое вариации (МоМ) (%) Среднее арифметическое (МоМ) Коэфф. вариации (%)

Женщины с здоровым плодом 52 2.14 65.0% 1.097 21.1%*

Беременные плодом с СД 9 5.42 266% 4.33 169%

ВЫВОДЫ:

1. Выявлено наличие корреляции между определенным генотипом матери уровнями экспрессируемых плодом АФП и ХГЧ в материнской крови. Генотип

1атери HP 2-2 коррелирует с понижением уровня АФП, наличие редкох аллелей 'I коррелирует с повышением уровня АФП, фенотипы RH-, АСР1 АА и АСР1 АС оррелируют с понижением уровня ХГЧ.

2. Беременные с пониженным уровнем ХГЧ характеризуются наибольшим 'Тличием генотипов от контрольной группы и от групп с нормальным уровнем СМ.

3. Повышение уровня АФП у беременных коррелирует со снижением рипсинингибирующей способности сыворотки.

4. Понижение уровня ХГЧ у беременных коррелирует с повышением уровня >бщего билирубина в сыворотке.

5. Выделены группы беременных с определенными генотипами, при оторых повышена вероятность ошибочного теста при скрининге на синдром (ауна: вероятность ложноотрицательного теста повышена у беременных с енотипами АСР АА, АСР АС и редкими факторами PI; вероятность южноположительного теста повышена у беременных с генотипом HP 2-2.

6. Показана возможность увеличения эффективности биохимического жрининга на синдром Дауна при помощи коррекции значений АФП с ^пользованием значений трипсинингибирующей способности сыворотки и юррекции значений ХГЧ с использованием значений общего билирубина ;ыворотки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Золотухина Т.В., Чивилев И.В., Юдина Е.В. Использование материнского ;ывороточного скрининга в профилактике врожденных и наследственных заболе-ааний. Педиатрия, 1996, № 4, с. 26—30.

2. Золотухина Т.В., Чивилев И.В. Диагностические аспекты массовых ис-:ледований АФП и ХГЧ в сыворотке беременных женщин. Сборник "Новые набавления ИФА-диагносгики", Москва-Вороново, 1996, с. 4—11.

3. Золотухина Т.В.,Чивилев И.В., Юдина Е.В., Евдокименков В.Н. Профилактика синдрома Дауна. Сборник материалов семинара "Диагностические аспекты применения ИФА тест-систем "Roche". Москва, май 1997, с. 4 — 12.

4. Чивилев И.В.,Рослый И.М.,Золотухина Т.В., Спицин В.А. Наследственная предрасположенность к определенным уровням АФП и ХГЧ у женщин, проходящих скрининг на синдром Дауна. Сборник материалов семинара "Диагностические аспекты применения ИФА тест-систем "Roche". Москва, май 1997, с. 13 —

5. Чивилев И.В., Золотухина Т.В., Спицын В.А., Башлай А.Г. Зависимость концентрации хорионического гонадотропина от фенотипа системы резус. Вестник РАМН, 1997, № 2, с. 24—26.

6. Чивилев И.В., Золотухина Т.В., Спицын В.А., Нурбаев С.Д., Грибкова Л.Г. Зависимость концентрации материнских сывороточных маркеров от гена гапто-глобина. Генетика, 1997, т. 33, № 3, с. 399—404.

7. Tchivilev I.V., Zolotukhina T.V., Spitsyn V.A. Heredutary predisposition for different AFP levels among the pregnant women screened for Down's syndrome. Abstracts of 2nd PECO-EUCROMIC Congress, Budapest, June 1—4,1997., p. 53.

8. Zolotukhina T, Tchivilev I, Yudina E. Biochemical and ultrasound screening for prenatal detection of Down's syndrome. Abstracts of 2nd PECO-EUCROMIC Congress, Budapest, June 1—4,1997, p. 54.

9. Золотухина T.B., Чивилев И.В., Маркова Ж.Г. Использование материнского сывороточного скрининга в пренатальной профилактике синдрома Дауна. Методические рекомендации. Москва: Правительство Москвы, Комитет здравоохранения. 1997,12 с.

10. Золотухина Т.В., Чивилев И.В., Шилова Н.В., Юдина Е.В., Евдокименков В.Н. Роль скрининговых исследований в пренатальной профилактике врожденной и наследственной патологии. Тезисы доклада. Сб. трудов российской научно-практической конференции "Медико-генетическое консультирование в профилактике наследственных болезней". Москва, 12-13 ноября 1997 г.

22.