Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние NaCl на образование связанного пролина и оксипролина у солеустойчивых и несолеустойчивых клеток Nicotiana sylvestris

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние NaCl на образование связанного пролина и оксипролина у солеустойчивых и несолеустойчивых клеток Nicotiana sylvestris"

РГб од

1 и 5 > \ ГНАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН I ^ ¡,¡¡111

ИНСТИТУТ БОТАНИКИ

На правах рукописи УДК 581.133.12

АХЖГОВА ДАНШПАН ШАКИРБАЕВНА

ВЛИЯНИЕ УаС1 НА ОБРАЗОВАНИЕ СВЯЗАННОГО ПРОЛИНА И ОКСИ1РОЛИНА У СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ И НЕСОЛЕУСТОЙЧИВЫХ КЛЕТОК blicoila.no.

(03.00.12 - физиология растений)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алматы, 1993

Работа выполнена в Институте физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН.

Научные руководители:

- доктор биологических наук, профессор Н.Й.Шевякова,

- доктор биологических наук Л.К.Мамонов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук К.Н.Сарсенбаев,

- кандидат биологических наук З.А.Аликулов.

Ведущая организация: НПО "Биолог" АН Республики Узбекистан.

Защита диссертации состоится: на заседании специализированного совета К 008.12.02 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Главном ботаническом сапе HAH Республики Казахстан по адресу: 480070, Алмагы, Главный ботанический сад HAH Республики Казахстан.. " I/ " иШхЛ 1993г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Главного ботанического сада<НАН РК.

Автореферат разослан: "Л? " ила Л_1993г.

Ученый секретарь , j>

специализированного совета — Г.А.Нурмуханбетова

Актуальность проблемы. Опасность засоления сельскохозяйственных угодий с каждым годом возрастает. В ряде регионов экологического бедствия (Аральский регион и др.) засоление почв и дефляция солей стали главным фактором не только снижения сельскохозяйственной продукции, но и угрозой здоровью человека. Отсюда получение солеустойчивых форм растений, способных осваивать вновь образуемые засоленные почвы и давать экономически значимый урожай, становится все более актуальной задачей. Однако большим тормозом для получения таких форм равно как традиционными, так и нетрадиционными методами физиологии и генетики растений стала недостаточная изученность механизмов адаптации и выживания растительных клеток в условиях засоления, знание которых необходимо для создания надежных физиолого-биохимических параметров отбора (Шевякова,1989).

В последние годы многочисленные исследования направлены на изучение одной из универсальных ответных реакций растений на стресс, в том числе и солевой - аккумуляцию пролина (Шевякова, 1983; Кирьян, Шевякова, 1984; Кирьян, 1985; Калинкина, 1985; Ка-линкина, Наумова, 1992). В то же время практически отсутствуют исследования по изучению изменений в содержании связанного пролина и его производного - оксипролина у растений при действии повышенных концентраций солей.

Как 'лзвестно, эластичность клеточных стенок, в том числе и растительных, в большей степени зависит от содержания в них окси-пролинбогатых белков (экстенсинов). При засолении клеточн~;т стенка растительных клеток является вместилищем избыточных ионов, что является одним из механизмов устойчивости к солям (Строганов, Лапина, 1979; Лапина, 1981). Однако в литературе по солеустойчивос-ти отсутствуют данные о том, какие изменения претерпевает при этом сама клеточная стенка. Кроме того, остается неясным, образуются ли в- растительной клетке и тканях повышенные количества связанного пролина подобно тому, как это наблюдается с накоплением свободного пролина в условиях засоления.

Первой работой, в которой был поставлен вопрос об адаптивном значении пролинбогатых пептидов пля растений в экстремальных условиях засоления, была публикация Л.С.Приходько с соавторами (1979). Имеются исследования, в которых установлено участие уникальных оксипролин-богатых гликопротеинов (экстенсинов) клеточных стенок в их растяжимости в процессе жизнедеятельности раститель-

- lt-

ной клетки ( 2am/i0ii' 198S; Coofiei ei ctl 198?; Зга.£с ¿¿cd 1383).

Оксипролинзависимая эластичность клеточных стенок - одно из свойств, которое может обуславливать выживаемость клеток в условиях солевого стресса. Более того, в литературе отсутствуют сведения о том, в какой мере процесс гидролиза белков с освобождением свободного пролина может быть отнесен к адаптационным механизмам .

В связи с этим важное значение приобретает изучение закономерностей изменения в содержании свободного и связанного пролина, оксипролина у растений в период адаптации к солевому стрессу и . проявления повреждающего действия солей.

Удобным молельным объектом для изучения этих вопросов являются клеточные линии растений, контрастные по солеустойчивости и способности аккумулировать свободный пролин, которые и были использованы в настоящей работе.

Цель и задачи исследования. Цель работы - установить содержание связанного пролина и оксипролина в различных фракциях белков, выделенных из солеустойчивых и несолеустойчивых суспензионных культур клеток hfUolla.no. syPv&slzis соответственно (Л^Е^-I) и дикий штамм, произраставших на солевой и безсолевой среде.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать рост отличающихся по солеустойчивости культур клеток в различных условиях засоления/VaCI.

2. Используя в качестве биохимических маркеров пероксидазу и свободный пролин, выявить характер ответной реакции клеток на солевой стресс.

3. Определить содержание связанного пролина и оксипролина в клеточной стенке солеустойчивых и несолеустойчивых клеток.

4. Изучить влияниеVaCI на интенсивность включения ^С-пролина в белки растворимой, ионосвязанной и ковалентноевязанной с клеточной. стенкой фракции и установить компонентный состав ионосвязанной фракции белков, меченных ^С-пролином.

5. Изучить состав специфичных для клеточных стенок изоперок-сидаз, которые могут принимать участие в образовании экстенсина.

Научная новизна. Используя в качестве маркера ответной реакции на солевой стресс изменения в активности пероксидазы, содержании свободного пролина и интенсивности роста сравниваемых клеточных линий А/иц>Шгм.a sytvealus, были выделены диапазоны концентрации >VaCI адаптивного и повреждающего воздействий. В соответствии с этим.клеточные линии были охарактеризованы по содержанию связан-

ного пролина и оксипролина. Впервые установлено присутст ~ окси-пролина в белковой фракции клеточных: стенок у //aCI-рези:: г.итной клеточной линии и несолеустойчивого дикого штамма

Показано, что содержание оксипролина возрастает в конце клеточного цикла у обоих клеточных линий: у дикого штамма на среде Цурасиге-Скуга безУаС1, у №г%-1 - на той же среде, но с внесением 1%л/аС1. В солеустойчивых клетках наблюдалось более плавное изменение в содержании оксипролина, что коррелировало с их более высокой солеустойчивостью. Снижению количества связанного оксипролина в клетках дикого штамма с возрастанием концентрации МаС1 в среде соответствовало отсутствие изменений в содержании связанного пролина. У//аС1-резистентных клеток на фоне снижения количества связанного оксипролина наблюдался хорошо выраженный максимум связанного пролина в диапазоне концентраций УаС!, оптимальных для роста (1,0 - 1,5^). Впервые установлено образование пролинбогатых белков в клеточной стенке, в растворимой и ионосвя-занной фракциях солеустойчивых клеток. Обсуждается возможная роль таких белков, как запасного пула свободного пролина, используемого в условиях засоления лля защиты структурных элементов клетки и осморегуляции. /

Практическая значимость. Изменения в метаболизме пролина к оксипролина и их связь с солеустойчивостью клеточных линий позволяет использовать выявленные в работе закономерности для поиска биохимических маркеров адаптивных реакций растений и при отборе клеток для получения растений-регенерантов с повышенной солеустой-чивостыо.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на: II, III; 1УВсесоюзных конференциях молодых ученых по физиологии растительной клетки (Москва, 1986; Петрозаводск, 1988; Минск, 1990), на расширенном семинаре лаборатории солевого обмена и солеустойчи-вости И$Р РАН (Москва, 1989), Международном симпозиуме по физиологическим, биохимическим и генетическим аспектам солеустойчи-вости растений (Ташкент, 1992), на заседании секции Ученого Совета по физиологии растений Института ботаники HAH PK (Алма-Ата, 1990).- ч -

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, "экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включает f3lf наименований, в том числе //9 иностранных. Диссертация изложена на страницах машинопис-

- б -

ного текста, содержит ^ таблицы, иллюстрирована рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектом исследования служили две клеточные линии Vicotiana üylveshis , полученные в лаборатории культуры тканей и морфогенеза ®Р РАН В.И.Ошмариной и З.Б.Шаминой (1982):

1) цикий штамм - исходная несолеустойчивая клеточная линия

2) клеточная линия №г%1, отобранная как. спонтанный солеустойчи-вый вариант на селективной среде (1%л/аС1) и как сверхпродуцент' метионина и пролина.

Суспензионные культуры клеток выращивали в темноте, при 25°С на среде Цурасиге-Скута с добавлением 2 мг/л 2,4 -Д и 0,1 мг/л кинетина (Ошмарина, Шамина, 1982). Длительность одного цикла выращивания (I пассаж) составляла 15 дней. Показателями роста суспензионных культур на основной и селективной средах были ростовой индекс и жизнеспособность.

Свободный пролин определяли спекгрофотометрически по методу Бейта ( ßaie ti cd , 1973), при длине волны 520 нм на спектрофотометре СФ-4А. Качественные реакции на лигнин проводили по методу Паламарчук (19§9).

Фракционирование белков осуществляли по методу Риджа и Осбор-на (Ridge, Üsiozne , 1974) с некоторыми модификациями.

Изофокусирование пероксидаз проводили по прописи, прилагаемой к прибору фирмы ЛКБ (Швеция). Активность пероксидазы во фракциях определяли общепринятым методом (Ярош, Ермаков, Арасимович, 1972).

Гидролиз фракции клеточных стенок проводили бн HCl при Ю7°С в течение 18 часов ( fioiottwsii, 1984).

Определение связанного пролина и оксипролина в гидролизате клеточных стенок осуществляли по методу Бергмана {ßei<]mant£oxteyf 1970) и Стигимана (iie^mon, Staiclez. , 1967).

Изучение включения ^С-пролина в различные фракции белков осуществляли с использованием равномерномеченного ^С-пролина (ЧССР). Клетки инкубировали в присутствии метки в течение 2,4 м 6 часов. Включение радиоактивной метки в белки учитывали по методу Лин и др. (Xintlal , 1984) с некоторыми модификациями. Концентрацию белка определяли по Бредфорд (Biadfoicl, 1976). Белки анализировали одномерным электрофорезом в градиентном 10-20%

- ?-

ПААГ с по метолу Леммли (¿йен-лт^с, 1970). Флюорграфию полученных гелей проводили по Боннеру и Ласки (Боппег ,1974).

Статистическую обработку результатов проводили по П.Ф.Рокиц-кому (1967).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Избранные для исследований клеточные линии (дикий штамм и со-леустойчивая линия А^,Е5-1) были детально охарактеризованы И.Г.Кирьян (1986) с нашим участием по ростовым параметрам и способности накапливать в присутствии Л/аС1 свободный пролин (рисЛ).

До начала и во время наших исследований суспензионные культуры клеток выращивались на среде Мурасиге-Скуга: дикий штамм на контрольной среде без внесения ¿/&С1, а солеустойчивая линия - в селективных условиях, т.е. в присутствии 1%//аС1. Цикл культивирования - 15 дней. Клеточные линии постоянно контролировались по ростовой активности и способности накапливать свободный пролин в присутствии УаС1 и не отличались пэ этим признакам от ранее исследованиих культур.

Особенностью солеустойчивоб".:. линии (Л^Е^-1) при культивировании в присутствии л/аС1 явилась способность аккумулировать большое количество пролина в клетках {рисЛА). В клетках дикого типа никаких изменений в содержании свободного пролина а условиях засоления не отмечалось (рисЛА).

Если исходить из развиваемого в работе И.Г.Кирьян (1986) положения, что накопление пролина в клетках играет защитную роль при солевом стрессе, то можно полагать, что в области максимального внутриклеточного содержания аминокислоты и при сохранении высокой ростовой активности (интервалУаС1 от 1.0 до 2.5%) солеустой-чивые клетки были способны адаптироваться к повышению солевой концентрации в среде. У дикого штамма способность к такой ответной реакции клеток на солевой стресс не проявилась, т.е. она была специфична только для клеток линии (рисЛ).

. В этой связи представляло интерес использовать для идентификации наличия в клетках метаболических изменений адаптивного характера при действии солевого стресса другой биохимический маркер пероксидазу - известный "аварийный" фермент.

Увеличение пероксидазной активности является весьма надежны;.? Маркером действия солевого стресса на растения (Белецкий, Шевяхо-ва, Карнаухова, 1990). Кроме того, известно, что ковалентносвя-

- В -

з

1 500

5

■зоо-

—I—

' %^асг

2,5 %УаС6

Рис Л. Дозовый эффект аС1 на рост (Б) и аккумуляцию пролина (А, Кирьян, 1985) в клетках дикого." штамма (I) и линии Л£Е5-1 (2)

занная-пероксидаза участвует в образовании перекрестных связей экстенсина в клеточной стенке, а некоторые изозимы фермента дейст- , вуют как пролилгидроксилаза ( У1ц, 1364). л ).

Для фракционирования пероксидаз мы воспользовались в основном метолом Риджа и Осборна (Ridge , 1971). Используя та-

кой подход, стало возможным охарактеризовать активность растворимой, ионосвязанной и ковалентносвязанной форм пероксидазы у клеточных линий при культивировании их в присутствии различных доз УаС1 в культуральной "среде.

Как видно из рисунка 2 в суспензии клеток дикого штамма на среде с VaCI активность растворимой и ионосвязаннойл пероксидазы возрастала, достигнув максимума Ьри действии сублетальной дозы (0,5%), которая ранее была выявлена в опытах с определением ростовой активности" клеток (рис.I Б).-Активность" обоих форм пероксида- -зы практически'не изменялась по сравнению с контролем CVaCI в среде отсутствует) при действии летальной для дикого штамма дозы Л"аС1 il %).

. УУаС1-резистенгной клеточной линии постоянно культивируемой в селективных условиях (I % //аСГ), увеличение активности свободной и ионос вязанной пероксидазы наблюдалось только в присутствии сублетальной для этого штамма дозыУаСГ (2-2,5%).

Полученные результаты показывают, что различные фракции пероксидазы функционируют у солеустойчивой клеточной линии аналогично дикому, штамму, но с расширенной нормой реакции на\ солевой стресс, т.е. изменение активности пероксидазы неспецифично

Таким, образом, на дозовых кривых изменения активности растворимой и- ионосвязанной пероксидаз у обеих клеточных линий четко оп-. ределились два "типа действия УаС1: стимуляция и ингибирование. ■ Стимуляция активности фермента наблюдается при действии сублетальных концентраций, характерных для каждой клеточной линии, т.е. тогда, когда еще возможны приспособительные перестройки метаболизма.- Ингибирование фермента было явно приурочено ос необратимому торможению ростовой активности и повреждению структурных элементов клеток. - ,

Вместе с тем, у обоих клеточных линий не были найдены изменения в активности ковалентносвязанных с клеточной стенкой пероксидаз, хотя-по компонентному составу они значительно различались (рис.З). Наряду с. сохранением в условиях солевого., стресса стабильности пероксидаз, иммобилизованных на клеточной, стенке, было показано отсутствие заметши изменений в содержании в клеточных

• И 05 10 2,0

-ЗД5

-53

а

г««"

•Ш

-{0.05

Рис.3. Изофокусирование пероксилаз ковалентно-свяэанной фракции белков клеточных стенок.

1 - дикий штамм

2 - линия

-1-1-1-!---Т—* Г"

0 05" - 10 {5" № 15

Рис.2. Влияние УаС1 на кг.уеиенке активнс-ти П'.-гскгпла:*!-в ликом ктакке (А) солеустоКчш'кх клетках (Г)

-- растворимая фоакцкя

---- ионосвязанная фракция

стенках лигнина, в образовании которого участвуют кислые компоненты ковалентносвязанных изопероксилаз (Соььаб апЖУагпет()988).

Отсутствие изменений в активности пероксилаз в клеточной стенке и содержании в них лигнина при действии солевого стресса на клетки обоих типов не лает возможности объяснить' прямо противоположные различия в ростовой активности у клеток /\/Е5-1 и дикого штамма (стимуляция и торможение соответственно).

В то же время солеустойчивость клеток во многом может зависеть от способности регулировать эластичность клеточных оболочек при изменении тургорного давления избытком солей в среде.

Как показал электроноскопический контроль у дикого штамма в контроле и у еолеустойчивой линии в селективных условиях ( т.е. на среде с 1%//&С1) хорошо выражена клеточная стенка (Рощупкин, 1990).

Объем солеустойчивых клеток оказался приблизительно в три

раза меньше, чем у клеток дикого штамма. Дня первых он равен 3,03,4 млх Ю , а для вторых 1,0-1,5 мл х Ю-7.

Как известно, именно для первичной клеточной стенки характерно присутствие белков, обогащенных производным пролина - оксипро-лином, т.н. экстенсинов, от которых в большой степени зависит эластичность. Таким образом, в клеточных стенках изучаемых линий можно окидать наличие повышенного содержания пролина и оксипроли-на в этом компартменте. Причем значительное уменьшение объеме . солеустойчивых клеток по сравнению с диким штаммом вероятно сопровождается существенными изменениями в составе этих аминокислот.

Фракция клеточных стенок, содержащая не изменяющуюся по компонентному составу ковалентносвязанную пероксидазу была использо--вана нами для определения в ней содержания связанного пролина и оксипролина. Однако в этом случае фракцию анализировали без предварительной обработки гидролитическими ферм.ентами.

Как видно из дозовой нривой (рис.4А), у дикого штамма с увеличением концентрации УаС1 резко уменьшалось содержание связанного оксипролина. В солеустойчивых клетках наблюдалось более плавное изменение, что коррелировало с их более высокой солеустойчивостью по сравнению с диким штаммом. Как видно из дозовой кривой (рис.4Б) снижению количества связанного оксипролина соответствовало отсутствие изменений связанного пролина у дикого штамма.

Поскольку оксипролин образуется в результате постмодификации пролиловых остатков в белках при реакции гидроксилирования, то из этих данных следует, что реакция гидроксилирования тормозилась при увеличении концентрации соли в среде.

В солеустойчивых клетках при торможении реакции гидроксилирования, напротив, наблюдалось увеличение пула пролинсодержащих белков (рис.4Б). Это можно объяснить, с одной стороны, тем, что про-линовые остатки в белках сохраняются в неизменном виде,и, с другой стороны - увеличением синтеза белков, содержащих пролин. Максимум накопления связанного пролина в клеточной стенке отмечается у со-леустойчивой линии для селективных условий, -т.е. тех условий, в которых и был выделен солеустойчивый штамм. Таким образом, клетки с повышенным содержанием пролина во фракции клеточных стенок оказались солеустойчивыми и для оптимального роста и развития им требовалось присутствие УаС1. В отсутствие соли у них снижался рост и количество связанного пролина. Собственно кривая роста и накопления связанного пролина были аналогичны, хотя кривая оксипролина имела другой характер. Повышенное содержание пролина в клеточных

Рис.4. Влияние-.УаС! на содержание связанного оксипролина (А) и пролина (В) во франции клеточных стенок: ' I - дикий штаммч 2 - линия

- и-

стенках может быть связано с увеличением синтеза этого белка или торможением реакции гипроксилированиг.

Для выяснения еопроса, связано ли повышенное содержание пролива в клеточных стенках с увеличением синтеза этого белка или торможением реакции гидроксчлирования мы изучили интенсивность включения ^С-пролина в белки клеточных стенок. В опытах сравнивались два контроля: зикий штамм на среде без засоления и солеус-тойчивый - в присутствии 1%А/а.С1. Эти условия соответствовали оптимальным -для роста клеток. В то ке время в этих условиях в соле-устойчивых ¡: несолеустойчивых клетках существовало большое различу • ■ ""•'¡••гжании свободного и связанного пролита, а ростовые ха-рак:г:р;;стикя был:: однотипными, т.е. соответствовали 100> росту.

В качестве метки мы использовал;: равномерномеченный "С-пролин с пктивносгм* 75 мкккг,? на опкт. Б;-.г.: з???ы следующие экспозиции: 2, ••, 6 чнео? в присутптзяй уетк;*. Время экспозиции было отработан.- ь г;рг:цпр;:тольнк:< опытах, ^тдкциокярозение меченых аминокислот ь гидролиза*:-- клеточных сгон^к проводил:: пг;: "омот,;: разделе-

их на пластинках с ДДУЭКСок в опреполеншх условиях, а затек п:',аст;;нка сканировалась. На рисунке пекпэзнг. присутствие метки в с ••ноьксм в пролине. Меныае активности наблюдалось в ексипролине и ^сновке изменения в других аминокислотах (рис.5>. ^"С-пролнн и •1",С-скеипрсдин элювровались со .'смолы и активность определялась на стшнтиляционном счетчике.

На рисунке б представлены данные по солеустойчивой линии и дикому штамму. Как видно из рисунка, общий уровень включения метки в белки клеточных стенок у дикого птамма ниже, чем у л4Е£-1.

Была также вычислена удельная скорость включения ^С-пролина в ковалентносвязанные белки с учетом конечной и начальной радиоактивности пролина и оксипролина. Как следует из рисунка 7 удельная скорость включения метки в клеточные стенки клеток дикого штамма приблизительно в 2-3 раза ниже, чем у Л^Еу-1.

Эти данные подтверждают, что у солеустойчивых клеток повышен еппгез пролинсопержащих белков клеточных стенок.

Представляло интерес исследовать, является ли обнаруженная нами закономерность специфичной для белков клеточных стенок, или же она проявляется и в других фракциях белков.

Для этой цели мы в одном и том ке опыте учитывали включение С-пролина во фракцию растворимых и ионосвязанных белков из солеустойчивой линии (среда с 1% ЫаС1) и из дикого штамма (среда без А'аС!).

01

!Л

тз ч и

I

<г

I-

и> ш

н-1

. ш

ой

с

ш

S trt

m о

w о п

3

j. ш 01 е

Ш V

IA Ш ЗЕ § о:

Ш

LILI

М М Г»

■■(■■, I —>■>«•• I

о о о о о о — с* о

--1-1

Рис. 5. Профиль распределения меченных аминокислот гидродизата клеточных стенок, линии (результат сканирования

пластинки)

Г* 2 - 14С-пролиц М - ^С-оксипролин

су ,800_- • а и

. и

' е| 7504

о •

ш ч

• и

Р 700

X £

6504

ш я

г

-тг

2.

—г А

6-.

, время экспозиции (час)

Рис. 6. Включение ^С-пролина в белки клеточных

стенок дикого штамма (I) и линии УхЕ4-1 (2).

- 1Т-

30

го -

л 6«

о о

о-

О -10

X

о

II

-щ-

Г----*'?

1 1 2 * ' ■ '

время экспозиции (час)

Рис.7; Удельная скорость включения ^С-пролина в белки ковалентносвязанной фракции клеток дикого штамма (I) и линии //гЕ5-1 (II)

• I - общая активность 2 - по "^С-пролмну

6

Как следует из рисунка 8 у солеустойчивых клеток интенсивность включения метки в растворимые и ионосвязандае белки намного выше, чем у дикого штамма. Повышенный уровень включения "^С-проли-на выявлялся также и для белков клеточных стенок солеустойчивой линии.

В литературе давно дискутируется вопрос о том, являются ли ионосвязанные белки предшественниками коваленгносвязанных или их нужно рассматривать как автономные образования. Существует гипотеза (5m.lt Ыо^1984) о том, что имеются цитоплазматические предшественники экстенсина, которые до того, как перейдут в связанное состояние в клеточной стенке, можно экстрагировать растворами солей.

Поскольку клеточные стенки солеустойчивых клеток отличались высоким сопержанием пролинбсгатых белков, то, исходя из гипотезы Смита ^тНЬе^а!, 1984), повышенная интенсивность включения ^С-про-лина в растворимые и ионосвязанные фракции может быть объяснена существованием в этих фракциях белков, выполняющих роль цитоплаз-матических предшественников экстенсина.

Обнаруженный нами повышенный уровень включения ^С-пролина в белки клеточных стенок оказался неспецифичным и проявился также и б других фракциях белков. Исходя из этого, было необходимо знать процентное распределение метки между различными фракциями белков. Были получены следующие результаты, отраженные в таблице I.

Таблица I

Включение "^С-пролина в различные фракции белков и в клеточные стенки клеток дикого штамма и линии • (в % от поглощения метки)

В^ ! фРакЧии

экспози- ! растворимая ? ионосвязанная ! клеточная стенка "

(часы) '_Клеточная линуя_

_! Д.шт. 1 Е -I ! Д.шт. ! Е -I! Д.шт. ! Е -I

2 1,5+0,2 36,5+1,3 14,9+0,4 27,0+1,2 30,0+1,3 39,7+2,0

4 1,9+0,4 29,0+1,7 12,0+2,6 31,8+0,6 31,0+1,7 37,9+4,5

6 4,0+0,9 20,1+1,2 12,0+2,4 31,0+1,3 41,6+3,7 26,7+1,3

Картина распределения метки между различными фракциями белков у двух исследуемых типов клеток резко различалась. В солеустойчивых клетках основная часть метки обнаруживалась в растворимой и ионосвязанной фракциях белков. На долю этих белков приходилось' от 50 до 63$ радиоактивной метки от общего включения. В то же время

.....

Т

о

1б;о --

140--

120

х . '. 100-

и ч а> чэ

2 80

X я К

> 6-0

2 8

5.0 --

40: --

■за --

20. --

Рис. 8.

Л(ЕГ1

2 4

время экспозиции (час)

Г4л

Включение С-пролина в растворимые (I) и ионосвязанные (2) белки клеток линии л/гЕ^-1 и дикого штамма

для белков этих же фракций у дикого штамма эта величина составляла лишь 14-16%.

Процент включения метки в ионосвязанную и растворимую фракции клеток линии почти в 3-4 раза выше по сравнению с диким

штаммом. Это свидетельствует^о наличии в этих фракциях значительного пула белков, обогащенных пролином. Способность же солеустой-чивых клеток аккумулировать свободный пролин в ответ на засоление говорит о том, что эти белки, помимо их функции как предшественников экстенсина, могут играть пролинзапасающую роль. Вполне возможно, что такие белки составляют некий запасной пул связанного пррлина, изменение скорости гидролиза которого, регулирует содержание свободного прелина в клетках при действии соли.

Таблица 2

Распределение ^С-пролина между различными фракциями белков и клеточных стенок Л' Е£-1

(1,5£//аС1)(в % от поглощения метки)

Воемя экспо- ;_Фракция_

?и'"ии (час ) ' 1 ' I

' , растворимая | ионоезязанная ¡клеточная стенка

2 2,4 + 0,5 7,1 + 0,3 4,6 + 0,7

4 4,1 + 0,7 12,0 + 0,5 9,5 + 0,4

6 11,0 + 0,7 31,0 + 0,7 24,2 + 1,1 .

Если растворимые белки составляют запасной пул связанного пролина, то из этого следует, что при увеличении концентрации соли в среде культивирования процент включения метки в эту фракцию должен снижаться, поскольку пролин будет переходить в свободную фракцию.

Для выяснения этого предположения мы провели'' эксперимент по включению ^С-пролина в солеустойчивые клетки, выращенные на среде с I,5% д/аС1. Как обсуждалось ранее, при 1,5^д/аС1 ростовая активность клеток снижалась на 10%, но при этом сохранялась высокая активность пероксипазы, а внутриклеточный пул свободного пролина был максимальным. Условия эксперимента были те же, что и в предыдущих опытах.

Результаты опыта представлены в таблице 2. С увеличением времени экспозиции в присутствии *4С-пролина и д/аС1 в клетках происходит постепенное увеличение процента включенной метки во всех фракциях белков. Сравнение данных аналогичного эксперимента с 6-ти часовой экспозицией на *4С-пролине клеток в присутствии 1$//аС1 с

i 2

= EEi' - — Ц1

• == — 20,1

-* — — 30 I<

lililí! ■ í f = — — 43

—- — — — 67 — 54

Рис. 9. Электрофлюорограмма полипептидов ионосвязанной

фракции, синтезированных в присутствии ^С-пролина в клетках линии A£ES-I (I) и дикого штамма (2).

полученными данными выявило следующее.

В первые 2 и 4 часа экспозиции в клетках, растущих на 1$УаС1, процент включения метки в 15 и 8 раз был выше, чем у клеток, растущих на I,5$VaCI. К б часам экспозиции, когда устанавливалось стабильное^ распределение метки в клетках, культивируемых на Г,5% УаС1, интенсивность включения ^С-пролина в белки ионосвязанной фракции и фракции клеточных стенок выравнивалась с тем, которое наблюдалось в присутствии I$/VaCI. Для белков клеточной стенки она составляла 26,7 и 24,2$ в опыте с 1$ и I,5$/VaCI соответственно, а для белков ионосвязанной фракции она практически не изменялась и составляла 31$ в обоих опытах. В этих услозиях в растворимую фракцию клеток,- культивируемых на I,5$/VaCI, включалось лишь 11,0$ метки от общего включения. В то же время для клеток, растущих на среде с 1$УаС1 интенсивность включения составила 20,1$.

Итак, .в присутствии в среде 1,5$//аС1 в растворимую фракцию белков поступает почти в два раза меньше ^С-лролина, чем при 1%

- гг -

л/aCI (данные на 6 часов экспозиции)»

Резкое торможение поступления метки в белки растворимой фракч ции свидетельствует о том, что именно эти белки в первую очередь ответственны за аккумуляцию свободного пролина в клетке, хотя не исключено участие в этом процессе белков ионосвязанной фракции.

По-видимому, увеличение концентрации свободного пролина в клетках происходит не за счет гидролиза тотального белка, а лишь специфических гликопептидов, обогащенных пролином. Они могут быть предшественниками оксигтролин- и пролинбогат-ых белков клеточной стенки. Не исключено, что при гидролизе таких гликопептидов освобождаются также углеводы, которые могут наряду с пролином увеличивать пул осмопротекторов у солеустойчивых клеток.

Для проверки предположения о наличии специфических полипептидов фракция ионосвязанных меченных ^С-пролином белков разделялась при помощи одномерного электрофореза в градиентном (10-20$) ПААГ с SOS . Затем получали флюорограммы готовых гелей (рис. 9 ). Было установлено, что у солеустойчивой линии не только идут количественные изменения в синтезе "^С-пролинсвязывающих белков, но имеются качественные различия в спектре таких белков по сравнению с диким штаммом: появляются три новых полипептида с молекулярными массами 27, 36, 51-53 Кд. Повышается также синтез ряда белков с молекулярными массами 12, 13, 29, 31-32, 47, 53-55 Кд.

Таким образом, в солеустойчивых клетках, наряду со сверхпродукцией свободного пролина идет образование обогащенных пролином белков в клеточной стенке п во фракции растворимых и ионосвязанных белков.

3 клеточной стенке пролиновые и оксипролиновые белки могут играть структурную роль, поддерживая необходиыую'.для условий засоления конформацгао. Пролиновые белки растворимой фракции, благо-паря своей лабильности, могут участвовать также в регуляции содержания свободного пролина в клетке.

.Имеется ряд работ, в которых основной причиной накопления пролина, индуцируемого стрессом, считалась активация гидролиза белков ( yasuo,yoskio , 1981; Ven&iarnji f Kool , 1988). В этих исследованиях повышение уровня свободного пролина в молодых листьях при засухе сопровождалось снижением содержания растворимых и связанных с мембранами белков. Авторы пришли к выводу, что источником пролина в первый лень засухи служил фонд свободных и связанных аминокислот, на второй лень засухи - белки.

Известно» что основной путь деградации белка осуществляется

через протеолиз, который в растительных клетках происходит в основном в вакуолях. При определенных условиях (чаще всего стрессор-ных) в клетках изменяются свойства вакуолярной мембраны таким образом, что становится доступным контакт цитоплазматических белков и протеаз вакуоли.

Вакуоль при засолении становится местом компартментации избыточных ионов ( Ыпг^ &1 , /988 ), что конечно может отразиться на состоянии вакуолярной мембраны и действия указанного выше механизма. Вполне вероятно, что для расщепления пролиновой связи в белках используются специфичные протеазы так называемые пролида-зы. Пролидазы способны гидролизовать амидные связи рядом с остатком пролина в белках.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано образование обогащенных пролином белков клеточных стенок в 'условиях засоления. Максимум накопления связанного пролина наблюдается лишь в селективных условиях (1%//аС1), которые являются нормой существования солеустойчивой линии.

2. Выявлены особенности связи содержания обогащенных пролином белков с солеустойчивостью клеток и получены биохимические пара-' метры клеточных стенок устойчивых и неустойчивых к засолению клеточных линий //ио11апа. sljlv&s[гis^

3. Установлено повышенное включение ^С-пролина во фракцию ионосвязанных, растворимых и ковалентноевязанных белков у солеустойчивой линии МгЕ$-1 по-сравнению с включением метки в аналогичные фракции белков дикого штамма.

4. Показано, что у солеустойчивой лиши происходят качественные изменения в составе .ионосвязанных белков, выражающиеся в появлении трех новых полипептидов с молекулярными массами 27, 31, 5153 Кд.

5. Установлено различие в компонентном составе ковалентносвя-занной с клеточной стенкой пероксидазы у солеустойчивых и несоле-устойчивых клеток, что свидетельствует о наличии в них различной степени перекрестного связывания с ббразованием оксипролинбогато-го белка - экстенсина.

6. Выявленные закономерности в содержании связанного пролина и оксипролина могут служить тестом для оценки солеустойчивости

растений и для получения регенерантов с повышенной солеустойчи-востью.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Ахметова Д.Ш. "Изменение активности различных фракций пероксилазы в суспензии клеток0 Afitdiuria. sijivestiis в условиях засоления". II Всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растительной клетки: Тез.докл. - Москва, 1986.

2. Ахметова Д.Ш. "Изменения в содержании оксипролина и про-лина б солеустойчивых и несолеустойчивых клетках M syivtsiùs

Ш Всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растительной клетки: Тез.докл. - Петрозаводск, 1988.

3. Ахметова Д.Ш., Шевякова H.H. "Роль оксипролина в усгойчи вости растительных клеток к засолению". Межвузовский сборник научных трудов. - Москва, 1989.

4. Ахметова Д.Ш. "Образование белков, обогащенных пролином и их возможная роль в солеустойчивых клетках ffi.coLa.na s¡j(vtúti¿ "

- 4 Всесоюзая конференция молодых ученых по физиологии растительной клетки: Тез.локл. - Минск, 1990.

5. Jckmeiova V. M. Skt irjcckova. А/. J. Thz ¿ou.nd /zic^ùne. and hdclio-xuhioàne con-lení ¿n cCiffeienè fciûéein 4zacét'pns о/сг££ unes of Micoéiana ¡цРгге ship : J?C-iíiac¿$ cfJife inalio/iaJ1 t^mfupsium on /ikgiióCpay, ¿iocfamíshg cuicfgenetics о//г-fkné Salí legijíance.- Taskíeni, J932.

6. Ахметова Д.Ш., Шевякова H.И. "Повышенная продукция про-линбогатых белков в солеустойчивых клетках fficoüana sufvcsites 11 -Тез.локл.III съезда В0#Р,'Санкт-Петербург,1993.(в печйти)