Влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование белка 14-3-3ζ, на его структуру и некоторые свойства

Случанко, Николай Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование белка 14-3-3ζ, на его структуру и некоторые свойства
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование белка 14-3-3ζ, на его структуру и некоторые свойства"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

4854931

На правах рукописи

СЛУЧАНКО Николай Николаевич

ВЛИЯНИЕ МУТАЦИИ, ИМИТИРУЮЩИХ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКА 14-З-ЗС, НА ЕГО СТРУКТУРУ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 СЕН 2011

Москва 2011

4854931

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор Н.Б. Гусев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор И.А. Гривенников

кандидат биологических наук в.н.с. A.B. Воротников

Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии

Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится 17 октября 2011 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119234, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 12 сентября 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук _ М.В. Медведева

ОВЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из наиболее распространенных и эффективных способов регуляции различных процессов жизнедеятельности клетки являются различные посттрансляционные модификации, среди которых особое значение имеет фосфорилирование. Этот процесс, катализируемый протеинкиназами, сопровождается переносом остатка фосфата от АТР на спиртовые группы аминокислот, что приводит к появлению дополнительного отрицательного заряда и зачастую приводит к изменению структуры и свойств белка, а также его способности взаимодействовать с другими белками. В настоящее время обнаружено несколько белков-адаптеров, узнающих и связывающих фосфорилированные белки-субстраты. Одним из таких белков является белок 14-3-3, способный узнавать участки фосфорилирования, расположенные в характерных последовательностях, и способный взаимодействовать более чем с 200 различными белками эукариотической клетки [1].

Белки семейства 14-3-3 широко распространены среди эукариот, причем, за редким исключением, у каждого организма найдено несколько изоформ 14-3-3. Семь изоформ 14-3-3 человека обозначаются греческими буквами от а до о [2, 3] и кодируются разными генами [4]. Будучи небольшими белками с массой около 30 кДа, представители семейства 14-3-3 формируют гомо- или гетеродимеры [5], каждая субъединица которых содержит по одному центру связывания фосфосерина/фосфотреонина в белках-партнерах [6]. Считается, что для нормального функционирования необходима именно димерная структура 14-3-3 [7]. Взаимодействуя с различными белками-субстратами, 14-3-3 принимают участие в регуляции апоптоза, клеточного деления, транскрипции, передаче внутриклеточного сигнала, контролируют функционирование ионных каналов и многие другие процессы. Благодаря распространению белков 14-3-3 практически во всех тканях человека [8] и вовлеченности в ключевые процессы жизнедеятельности клетки [9], это семейство белков является предметом пристального внимания и объектом постоянно расширяющихся исследований.

14-3-3 преимущественно взаимодействуют с фосфорилированными белками-партнерами. При этом связывание белков-мишеней может зависеть не только от их фосфорилирования, но может регулироваться путем фосфорилирования 14-3-3.

Список сокращений: цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; ДМС диметилсуберимидат; ДСН - додецилсульфат натрия; ДТТ - днтиотрейтол; МЭ - р-меркаптоэтанол; ПААГ - полиакриламидный гель; ПКА - цАМФ-зависимая • протеинкиназа; ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; тЗ - короткая изоформа may белка; ТФХК - Ы-тозил-Ь-фенилаланин хлормстилкетои; WT - белок дикого типа; ЗА - тройная мутантная форма may с заменами Serl56, Ser235, Ser267 на аланин; ЗЕ - тройная мутантная форма 14-3-3 с заменами Ser58, Serl84 и Thr232 на остатки глутаминовой кислоты, имитирующими фосфорилирование.

Фосфорилирование различных изоформ 14-3-3 изучено достаточно подробно, при этом установлено, что Ser58, Serl84 и Thr232 в структуре 14-3-3? могут фосфорилироваться как in vitro, так и in vivo [3, 10, 11]. В литературе есть разрозненные данные о влиянии фосфорилирования на взаимодействие 14-3-3 с различными белками, вовлеченными в регуляцию апоптоза, а также некоторыми протеинкиназами. В то же время, в литературе практически нет данных о влиянии фосфорилирования (или мутаций, имитирующих фосфорилирование) на структуру и физико-химические свойства 14-3-3. Кроме того, набор исследованных белков-мишеней, взаимодействие с которыми регулируется путем фосфорилирования 14-3-3, крайне ограничен и практически не включает в себя белки цитоскелета.

В этой связи представлялось целесообразным исследовать влияние фосфорилирования 14-3-3? на его физико-химические свойства и взаимодействие с белками-мишенями. К сожалению, детальный анализ влияния фосфорилирования на свойства белка затруднен (а зачастую технически не выполним) из-за того, что невозможно получить препаративные количества исследуемого белка с высокой степенью фосфорилирования по одному строго определенному участку. По этой причине исследование функциональной роли фосфорилирования зачастую проводят на мутантах исследуемого белка, имитирующих структурные изменения, происходящие при фосфорилировании. Для этой цели фосфорилируемые остатки серина/треонина заменяют на остатки аспарагиновой или глутаминовой кислоты [12-14].

Цель и задачи работы. Целью данной работы было определение влияния мутаций, имитирующих фосфорилирование, на структуру и физико-химические свойства 14-3-3?, а также на взаимодействие 14-3-3? с may белком человека. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Получить в гомогенном состоянии препараты рекомбинантного белка 14-3-3? дикого типа и его точечных мутантных форм S58E, S184E и Т232Е, а также тройного мутанта (S58E/S184Е/Т232Е), имитирующих структурные изменения, происходящие при фосфорилировании.

2. Исследовать влияние указанных мутаций на различные уровни структурной организации и некоторые физико-химические свойства 14-З-ЗС.

3. Определить влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование, на взаимодействие 14-3-3? с may белком, играющим важную роль в формировании цитоскелета нервных клеток.

4. Установить, как фосфорилирование may белка влияет на его взаимодействие с 143-3?, и определить участки may белка, обеспечивающие его взаимодействие с 14-3-3?.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Мутации, имитирующие структурные изменения, происходящие при фосфорилировании (S58E, S184E, Т232Е и ЗЕ (S58E/S184E/T232E)), не изменяют вторичной структуры 14-З-ЗС, однако влияют на его третичную и четвертичную структуру. Мутация S58E изменяет гидрофобные свойства 14-3-3, провоцирует диссоциацию димеров 14-3-3, (особенно при низкой концентрации белка), а также снижает термостабилыюсть и устойчивость 14-3-3 к ограниченному трипсинолизу. Мутации S184E и Т232Е практически не влияют на третичную структуру 14-3-35 и его олигомерное состояние, лишь незначительно изменяя гидродинамические свойства белка. При этом мутация S184E заметно увеличивает термостабильность 14-3-352. Фосфорилирование под действием протеинкиназы А (ПКА) резко увеличивает способность may белка человека взаимодействовать с 14-3-35- Точечный мутагенез остатков серина, фосфорилируемых ПКА [15, 16], позволил установить, что участки вблизи остатков Serl56, Ser235 и/или Ser267 короткой изоформы may белка вовлечены в образование комплексов с 14-3-353. Мутации S184E и Т232Е практически не влияют на способность 14-3-35 взаимодействовать с may белком, в то время как мутация S58E снижает способность 14-3-35 взаимодействовать с may белком, что, вероятно, связано с дестабилизацией димерной структуры 14-3-3.

Научная новизна и практическая значимость. Проведен систематический анализ влияния мутаций, имитирующих фосфорилирование, на структуру и физико-химические свойства 14-3-3. Установлено, что мутация S58E способствует диссоциации димеров 14-3-35-Этот эффект особенно выражен при низкой концентрации белка, и может быть уменьшен при добавлении ионов магния. Мутация S58E уменьшает термостабильность и увеличивает скорость трипсинолиза 14-3-35- Эти результаты свидетельствуют о том, что фосфорилирование Ser58 дестабилизирует структуру 14-3-35 и может увеличивать скорость его деградации в клетке. Проведенные исследования позволяют разрешить ряд противоречий, накопившихся в литературе и касающихся влияния фосфорилирования Ser58 на структуру 14-3-35 [И, 12, 17], а также охарактеризовать изменения структуры, происходящие при введении точечных мутаций, имитирующих фосфорилирование двух других остатков 14-3-35 - Serl 84 и Thr232.

Проведен систематический анализ влияния мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3, на его взаимодействие с may белком, играющим важную роль в развитии многих нейродегенеративных заболеваний [18]. Tay белок является одним из очень немногих цитоскелетных белков, взаимодействие которых с 14-3-3 было постулировано, но

лишь поверхностно описано в литературе [19]. Установлено, что фосфорилирование под действием ПКА значительно усиливает взаимодействие may с 14-3-3. Показано, что фосфорилирование трех остатков серина (Serl56, Ser235 и Ser267) обеспечивает прочное взаимодействие may с 14-3-3С Обнаружено, что мутация S58E, дестабилизирующая структуру димеров 14-3-3?, значительно ослабляет его взаимодействие с may белком.

Оптимизированы методы выделения и очистки рекомбинантных 14-3-3? и may белка, что позволило получать ~100 мг 14-3-3 и 2-5 мг may с 1 литра бактериальной культуры. Разработанные методы могут быть использованы в исследованиях как белков дикого типа, так и их точечных мутантов.

Обнаруженное в работе влияние фосфорилирования на взаимодействие 14-3-3 с may белком может оказаться полезным при разработке новых подходов к лечению различных нейродегенеративных заболеваний.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2008, 2009 и 2010 гг. (Москва), на Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» в 2010 г. (Пущино), на 34-м и 35-м Международных Конгрессах Федерации Европейских Биохимических Обществ (FEBS) в 2009 г. (Прага, Чешская республика) и 2010 г. (Гётеборг, Швеция), на Форуме Молодых Ученых и 12-й конференции Международного Союза Биохимиков и Молекулярных Биологов (IUBMB) в 2010 г. (Мельбурн, Австралия).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, включая 6 статей в рецензируемых журналах и 7 тезисов сообщений.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 144 страницах печатного текста, иллюстрирована 55 рисунками и 10 таблицами. Список цитированной литературы содержит 234 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы подробно описаны некоторые свойства белков семейства 14-3-3, включая номенклатуру, историю исследования, распространение, изоформенный состав, особенности структурной организации, механизм связывания белков-партнеров и основные принципы функционирования. Детально рассмотрена регуляция функционирования белков 14-3-3 путем фосфорилирования. Особое внимание уделено тому, как фосфорилирование 143-3 по различным остаткам влияет на его взаимодействие с известными белками-партнерами.

Проанализированы имеющиеся в литературе данные по взаимодействию 14-3-3 с may белком человека.

Материалы н методы исследования

Рекомбинантные белки 14-3-3^ и его точечные мутантные формы с заменами, имитирующими фосфорилирование (S58E, S184E, Т232Е и ЗЕ), а также короткую изоформу may белка и его точечные мутанты, блокирующие фосфорилирование (S156A, S156A/S235A, S156A/S267A и ЗА), экспрессировали в клетках E.coli штамм BL21(DE3). Плазмиды, содержащие кДНК всех форм 14-3-3, а также плазмида с кДНК may белка дикого типа, были любезно предоставлены к.б.н. А.С. Сеит-Неби. Все мутантные формы may белка были получены на основе кДНК белка дикого типа методом мегапраймера [20]. Все молекулярно-биологические конструкции, полученные при выполнении работы, были проверены секвенированием. Процедура очистки белков включала фракционирование лизата бактериальных клеток сульфатом аммония и стадии хроматографической очистки. 14-3-3 очищали методом ионообменной хроматографии на колонке High Trap Q с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex 200. Препарат may белка очищали с помощью ионообменной хроматографии на колонке High Trap S и последующей гель-фильтрации на Superdex 200. Такая процедура выделения позволила получить большие количества исследуемых белков в высокоочищенном состоянии.

Измерения спектров кругового дихроизма проводили при 22'С на дихрографе Chirascan (Applied Photophysics Inc.) в диапазоне длин волн 190-260 нм в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 150 мМ NaCl и 0,2 мМ ДТТ, в кювете с длиной оптического пути 0,2 мм при концентрации 14-3-3, равной 0,9 мг/мл. Спектры регистрировали пять раз, а затем из усредненного спектра вычитали спектр буфера. Оценку содержания вторичных структур проводили согласно методам, описанным в литературе [21, 22]. Автор благодарен к.б.н. А.В. Пивоваровой за помощь в проведении опытов по спектроскопии кругового дихроизма.

Исследование олигомерного состояния 14-3-3 проводили при различных концентрациях белка методами гель-фильтрации на колонке Superdex 200 как это было описано ранее [23], а также методом электрофореза в нативных условиях в системах Шауба-Перри (при рН 8,5) [24] и/или Шагера-фон Ягова (при рН 7,0) [25]. Для предотвращения диссоциации димеров при проведении электрофореза в системе Шагера-фон Ягова в дополнительных экспериментах 14-3-3 обрабатывали «сшивающим» агентом диметилсуберимидатом (ДМС) в конечной концентрации 0,6 мМ.

Ограниченный трипсинолиз 14-3-3 и его мутантов проводили в буфере В (20 мМ Трис-ацетат, рН 7,6, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА и 15 мМ МЭ) или буфере В' (буфер В,

содержащий дополнительно 140 мМ NaCl и 5 мМ MgCl2) при 37°С и весовом соотношении 14-3-3:трипсин - от 50:1 до 100:1. Реакцию начинали добавлением трипсина (ТФХК-трипсин, Sigma), и останавливали через различные промежутки времени добавлением ФМСФ до конечной концентрации 5 мМ. Состав полученных проб анализировали методом электрофореза в 15% ПААГ в присутствии ДСН [26].

Термостабильность 14-3-3 и его мутантных форм определяли с помощью двух подходов. В первом случае конформационные изменения белка отслеживали, измеряя зависимость интенсивности триптофановой флуоресценции (¡з4о) (?-„0зб 295 нм, >.ф,уор 340 нм) от температуры. Все измерения проводили на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían Inc.), оснащенном автоматическим термостатируемым иоветодержателем и термодатчиком. Образец белка нагревали со скоростью ГС/мин и измеряли флуоресценцию 14-3-3 дикого типа и его мутантов при ширине щелей 5 нм. Кривые зависимости от температуры преобразовывали в зависимости завершенности теплового перехода от температуры (зависимость а от температуры) по методу, предложенному Бушуевой с соавторами [27], и таким образом определяли температуру полуперехода для 14-3-3 дикого типа и его мутантов.

Во втором случае измеряли зависимости теплопоглощения от температуры Ср{t, °С) на дифференциальном сканирующем калориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения, г. Пущино). Измерения проводили при скорости нагрева ГС/мин, затем образец охлаждали, после чего проводили повторный нагрев. Такие манипуляции были необходимы для того, чтобы убедиться в необратимости тепловых переходов 14-3-3. Полученные зависимости Ср(t, °С) обрабатывали, как это было описано ранее [28], и определяли температуру теплового перехода по положению максимума на термограмме. Автор благодарен д.б.н., профессору Д.И. Левицкому за помощь в проведении калориметрических измерений.

ФосФорилирование короткой изоформы may белка и его мутантов (в которых определенные остатки серина были заменены на аланин) под действием каталитической субъединицы протеинкиназы А проводили в течение 4 часов при температуре 37°С в буфере Ф (20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ глицерол-1-фосфат, 1 мМ MgCl2, 0,1 мМ ФМСФ, 15 мМ МЭ, 150-250 мкМ АТР) в присутствии следовых количеств [у-32Р]АТР. Реакцию останавливали, инкубируя пробы в течение 5 мин при 90°С, а затем центрифугировали их 10 мин при 14000g для удаления инактивированной и денатурированной ПКА. Высокая термостабильность may белка делает возможным проведение кратковременной термической обработки. Включение радиоактивного фосфата в белок определяли по ранее описанному методу [29]. В выбранных условиях ПКА переносила около 2 моль фосфата на моль may белка дикого типа, что согласуется с данными литературы. Замена фосфорилируемых

остатков серина на аланин, применявшаяся при создании т.н. «аланиновых мутантов», сопровождалась уменьшением степени фосфорилирования may белка. Препараты фосфорилированного may белка и его «аланиновых мутантов» использовали для исследования взаимодействия с 14-3-3 непосредственно после фосфорилирования.

Взаимодействие may белка с 14-3-3 исследовали несколькими способами. В первом случае пробы, содержащие 14-3-3 и may (или их мутантные формы) в различных концентрациях, преинкубировали в присутствии 5% глицерина в течение 40 мин при 37°С, а затем подвергали электрофорезу в нативных условиях в системе Шауба-Перри [24] в 15% ПААГ, содержащем 15% глицерина. Полученные гели окрашивали Кумасси R250, сканировали, и проводили обсчет интенсивности полос свободных белков и их комплексов в среде MatLabR2008b с помощью алгоритма, разработанного к.б.н. Д.И. Марковым. Во втором случае проводили химическое «сшивание» 14-3-3? и may белка с помощью глутарового альдегида в концентрации 0,04-0,06% в течение 15 мин при 30°С. Реакцию останавливали, смешивая полученные пробы с 4-х кратным ДСН-буфером для образцов, а затем анализировали их состав методом ДСН-электрофореза [26] в градиентном (5-20%) ПААГ. Гели окрашивали и высушивали, а затем подвергали авторадиографии. Обсчет белковых полос на гелях и авторадиограммах проводили в среде MatLab, как это описано выше. При изучении взаимодействия 14-3-3 с may белком дикого типа и его «аланиновыми мутантами», после их фосфорилирования под действием ПКА, использовали также метод аналитической гель-фильтрации на колонке Superdex 200, откалиброванной по белкам-стандартам с известными молекулярными массами.

Результаты и их обсуждение Получение мутантпых форм 14-3-3С с заменами, имитирующими структурные изменения, происходящие при фосфорилировании. Влияние этих мутаций на структуру

и некоторые свойства 14-З-ЗС Различные протеинкиназы способны фосфорилировать остатки Ser58, Serl84 и Thr232 в составе 14-3-3? как in vitro, так и in vivo [3, 10, 11]. На рис. 1А показано положение этих остатков в структуре 14-3-3. Для того чтобы проанализировать влияние фосфорилирования по каждому из указанных остатков на структуру 14-3-3? и его способность взаимодействовать с may белком, мы провели точечный мутагенез кДНК 14-3-3? дикого типа, заменив остатки серина на глутаминовую кислоту (мутанты S58E, S184E и Т232Е), а также создали тройной мутант 14-3-3? с заменой сразу всех трех фосфорилируемых остатков серина (S58E/S184E/T232E, или ЗЕ). Белок дикого типа и его мутантные формы были экспрессированы в бактериальных клетках и очищены с помощью разработанных нами

методов (см. раздел «Материалы и методы исследования»). Использованная нами процедура выделения позволила получить высокоочищенные препараты 14-3-3 (рис. 1Б).

Рис. 1. Трехмерная структура 14-3-3? (PDB ID 1QJB), на которой сферами отмечено положение остатков Ser58, Serl 84 и Thr232, фосфорилируемых в составе 14-3-3? (А) и ДСН-электрофорез используемых в работе препаратов 14-3-3? дикого типа (WT) и его точечных мутантов с заменами фосфорилируемых остатков серина и треонина на остатки глутаминовой кислоты. На гель нанесено по 2 мкг белка. Стрелкой отмечено положение маркера с молекулярной массой 30 кДа,

Одним из наиболее широко используемых методов исследования вторичной структуры белка является метод спектроскопии кругового дихроизма (КД). Спектры КД как 14-3-3 дикого типа, так и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, имеют отрицательные максимумы при 208 и 222 нм, что свидетельствует о том, что значительная часть структуры исслсдусмых белков представлена в виде a-спиралей. По полученным нами данным спектроскопии КД на долю a-спиралей приходится около 65% структуры белка, что хорошо согласуется с данными рентгеноструктурного анализа (PDB ID 1QJB), при этом точечные мутации, имитирующие фосфорилирование, не оказывают существенного влияния на вторичную структуру 14-3-3 (данные не представлены).

По данным рентгеноструктурного анализа (см. рис. 1А) 14-3-3 представляет собой димер, мономеры которого взаимодействуют своими N-концами, образуя структуру напоминающую по своей форме подкову. Считается, что остаток Ser58, который располагается в зоне контакта субъединиц, может фосфорилироваться под действием нескольких протеинкиназ и играет важную роль в регуляции димерной структуры 14-3-3? [30]. Данные, накопленные в литературе до начала наших исследований, свидетельствовали о том, что фосфорилирование Ser58 может приводить либо к усилению [11], либо к ослаблению [12, 17] межсубъединичных контактов в составе димера 14-3-3. Хотя остатки Serl 84 и Thr232 удалены от зоны контакта мономеров 14-3-3, нельзя a priori исключить и их участия в регуляции димерного состояния 14-3-3?. В этой связи, мы проанализировали влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование Ser58, Serl 84 и Thr232, на олигомерную структуру 14-3-3?.

S184

WT S58E S184E Т232Е ЗЕ

При электрофорезе в отсутствие денатурирующих агентов в градиентном ПААГ при

рН 7,0 [25] белок дикого типа и его Б184Е и Т232Е мутанты мигрируют в виде узких зон с

кажущейся молекулярной массой около 60 кДа, соответствующей димеру. В то же время

Б58Е и ЗЕ мутанты 14-3-35 обладают значительно более высокой электрофоретической

подвижностью, чем белок дикого типа, и мигрируют в виде достаточно диффузных зон с

кажущимися молекулярными массами 30-40 кДа (рис. 2, дорожки «-ДМС»), Сходные

результаты были получены при проведении нативного электрофореза в гомогенном 15%

ПААГ при рН 8,5 [24]. Мы предположили, что зоны с высокой электрофоретической

подвижностью соответствуют мономерам 14-3-3. Для проверки этого предположения

исследуемые препараты белков сначала

обрабатывали «сшивающим» реагентом, а затем

подвергали электрофорезу в нативных условиях

(рис. 2, дорожки «+ДМС»). Оказалось, что

«сшивание» мутантов Э58Е и ЗЕ приводит к

появлению на электрофореграмме полосы с

кажущейся молекулярной массой 60 кДа,

соответствующей димеру, и одновременному

уменьшению интенсивности полосы с

кажущейся молекулярной массой 30-40 кДа, по-

видимому, соответствующей мономеру 14-3-3 Рис. 2. Нативный электрофорез 14-3-35

дикого типа и его мутантов, имитирующих (рис. 2). В то же время, ДМС практически не

фосфорилирование, до (-ДМС) или после мшш вд электрофоретическую подвижность 14-обработки 0,6 мМ диметилсуберимидатом

(+ДМС) в системе Шагера-фон Ягова при рН 3-35 дикого типа или его в 184Е и Т232Е 7,0. Концентрация 14-3-3 - 0,27 мг/мл.

Положение белков-стандартов в кДа указано мутантов, которые как до, так и после

стрелками. На гель нанесено по 2 мкг белка. <<СШИвания» ДМС («-ДМС» и «+ДМС» на рис. 2)

мигрировали с подвижностью, соответствующей димерам 14-3-3. Представленные данные свидетельствуют о том, что мутация Б58Е, имитирующая фосфорилирование 14-3-35, приводит к дестабилизации его димерной структуры.

Мы предположили, что снижение концентрации белка может влиять на степень диссоциации 14-3-3, и проверили это предположение с помощью метода гель-фильтрации. На колонку Зирегёех 200, предварительно откалиброванную белками-стандартами с известными радиусами Стокса, наносили различные количества 14-3-3 дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, и определяли зависимость радиуса Стокса различных образцов 14-3-3 от количества белка, нанесенного на колонку. Радиус Стокса белка дикого типа (около 37 А) или его 8184Е и Т232Е мутантов (37,5-38 А) практически не

-ДМС +ДМС

136-*-

68-»-

<—* ¡и Ы и ии

43 -*■ У у

зависел от количества белка, наносимого на колонку. Небольшое увеличение радиусов Стокса 8184Е и Т232Е мутантов по сравнению с белком дикого типа может означать, что указанные мутации оказывают лишь очень слабое влияние либо на форму, либо на размер димеров 14-3-3. В то же время, радиус Стокса 858Е и ЗЕ мутантов заметно уменьшался с уменьшением количества белка, наносимого на колонку. Это означает, что олигомерное состояние указанных мутантов сильно зависит от концентрации белка, и свидетельствует о том, что в исследуемом диапазоне концентраций (-0,01-1 мг/мл) мутанты в58Е и ЗЕ представлены в виде равновесной смеси мономеров и димеров.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что мутация Б58Е (и, вероятно, фосфорилирование 14-3-3 по этому остатку), действительно, дестабилизирует димерную структуру 14-3-3^, и этот эффект сильно зависит от концентрации белка.

Для дальнейшего анализа структурных изменений, индуцированных мутациями, имитирующими фосфорилирование 14-3-3, мы обратились к методу ограниченного протеолиза. Этот метод широко используется для сравнения структуры различных глобулярных белков и зачастую применяется для выявления структурных перестроек, являющихся следствием различных модификаций или мутаций в белке, поскольку положение участков расщепления в этом случае также может изменяться.

Пробы белка инкубировали с трипсином при низкой ионной силе различное время, останавливали реакцию добавлением ФМСФ и анализировали белковый состав полученных проб методом ДСН-электрофореза. Как видно из рис. 3, в выбранных условиях трипсинолиз сопровождается довольно медленной деградацией белка дикого типа, и за 30 мин инкубации интенсивность полосы нерасщепленного 14-3-3 уменьшалась чуть больше, чем в два раза. Аналогичные закономерности были выявлены и в случае 8184Е и Т232Е мутантов 14-3-3 (данные не представлены). В то же время в случае 858Е и, особенно, ЗЕ мутанта скорость трмпсинолиза была значительно выше, и уже на четвертой минуте инкубации интенсивность полосы нерасщепленного 14-3-3 составляла менее трети от исходного значения, а к 30

минуте происходило полное исчезновение полосы, соответствующей негидролизованному белку (рис. \УТ 30-> 3). Следует отметить, что добавление в среду

инкубации 5 мМ 1У^С12 и/или повышение

12 16 20 30

Б58Е

Рис. 3. Ограниченный трипсинолиз 14-3-3^ дикого типа (\¥Т) и его Б58Е мутанта. Концентрация белка 0,5 мг/мл. Соотношение 14-3-3:трипсин равно 100:1. Над каждой дорожкой указано время инкубации с трипсином (мин). Положение белков-маркеров (в кДа) отмечено стрелками.

концентрации NaCl до 150 мМ приводило к существенному снижению скорости расщепления как белка дикого типа, так и всех его мутантных форм. Особенно сильно этот эффект проявлялся в случае S5BE и ЗЕ мутантов.

Таким образом, мутация S58E дестабилизирует димеры 14-3-3£ и существенно снижает устойчивость \4-3-3C, к протеолизу. Это может означать, что фосфорилирование Ser58 может влиять на скорость расщепления 14-3-3 в клетке. Любопытно отметить, что регулируемый протеолиз рассматривается в литературе в качестве одного из способов

Для того чтобы подтвердить дестабилизирующий характер мутации S58E и более детально исследовать влияние других мутаций на структуру 14-3-3, мы провели анализ термостабильности 14-3-3? и его мутантных форм. В составе молекулы 14-3-3? присутствуют 2 остатка триптофана, Тгр59 и Тгр228, расположенные в первичной структуре в непосредственной близости от исследуемых остатков Ser58 и Thr232. При этом следует заметить, что в трехмерной структуре все исследуемые остатки - Ser58, Serl84 и Thr232 (а, значит, и остатки Тгр59 и Тгр228) располагаются недалеко друг от друга (см. рис. 1А). В этой связи мы

Рис. 4. Изменения Тгр флуоресценции 14-3-3? в предположили, что исследуемые в работе

зависимости от температуры. А. Температурная MyTailIiHj имитирующие фосфорилирование, зависимость флуоресценции 14-3-3? дикого типа.

Стрелки показывают направление нагревания и могут так или иначе влиять на собственную охлаждения. Б. Зависимости завершенности

перехода (а) от температуры для 14-3-3? WT (1), триптофановую флуоресценцию 14-3-3 и его

S58E (2), S184E (3), Т232Е (4) и ЗЕ (5). термостабильность. Процесс тепловой

денатурации и сопровождающие его структурные изменения можно легко регистрировать, измеряя зависимость интенсивности триптофановой флуоресценции белка (при фиксированной длине волны) от температуры. Раствор белка помещали в кювету с термодатчиком, нагревали с постоянной скоростью 1°С/мин и записывали зависимость интенсивности флуоресценции при 340 нм (¡но) от температуры для белка дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование. Нагревание растворов 14-3-3 от 35 до 55°С сопровождалось монотонным уменьшением интенсивности флуоресценции (рис. 4А), что

регуляции активности 14-3-3 в клетке [31].

Ё.

-§• 30.

30 40 50 60 70 80

t,°C

54 56 58 60 62 64 66

может объясняться простым тушением флуоресценции при столкновении хромофорных групп с молекулами воды и другими тушителями. В интервале от 55 до 65°С мы наблюдали тепловой переход, проявляющийся в резком увеличении интенсивности флуоресценции 143-3 (рис. 4А), который, вероятно, был связан с изменением структуры белка и увеличением расстояния между внутримолекулярными тушителями и хромофорами белка. Последующее нагревание до 80°С сопровождалось постепенным тушением флуоресценции, аналогично тому, что происходило при повышении температуры на начальном участке рассматриваемой кривой. Тепловой переход 14-3-3 был необратимым, и охлаждение раствора белка не приводило к возвращению интенсивности флуоресценции к исходному уровню.

Зависимость интенсивности флуоресценции от температуры была преобразована в зависимость завершенности теплового перехода от температуры [27] (рис. 4Б). Используя такой способ представления экспериментальных данных, мы смогли определить значения температуры полуперехода (\.\п, °С), характеризующие термостабильность белка. Температура теплового полуперехода для белка дикого типа составила 60,4 ± 0,1 °С. Аналогичное значение было получено и для мутанта Т232Е. В то же время мутация 8184Е повышала (11/2 = 61,7 ± 0,2 °С), а мутация Б58Е понижала {Кю = 59,3 ± 0,1 °С) термическую устойчивость 14-З-ЗС Любопытно отметить, что термостабильность тройной мутантной формы (ЗЕ) и белка дикого типа оказались примерно равными, вероятно, из-за компенсации эффектов, вызываемых точечными мутациями Б58Е и 8184Е. Данные, полученные методом дифференциальной сканирующей калориметрии (не представлены), полностью согласуются с результатами, полученными методом флуоресцентной спектроскопии, и свидетельствуют о том, что мутация 858Е понижает, а мутация 8184Е, напротив, повышает термическую стабильность 14-3-3^.

Снижение термостабильности 14-3-3 под действием мутации, имитирующей фосфорилирование 8ег58, согласуется с ранее описанными результатами и подтверждает дестабилизирующий характер указанной мутации. Повышение термостабильности 14-3-3 под действием мутации 8184Е может быть объяснено расположением остатка 8ег184 в «шарнирном» участке молекулы 14-З-ЗС, посередине между ее № и С-концевыми областями (см. рис. 1А). Вероятно, такая замена делает структуру 14-3-3 более «жесткой», что отражается в замедлении структурных перестроек белка, вызванных нагреванием, и приводит к повышению температуры теплового перехода 14-3-3^.

Таким образом, некоторые исследуемые нами мутации, имитирующие фосфорилирование, оказывают существенное влияние на структуру и физико-химические свойства белка 14-З-ЗС. Вероятно, такие структурные изменения, происходящие при фосфорилировании, могут существенно сказываться на взаимодействии 14-3-3 с различными

белками-партнерами. Белки семейства 14-3-3 экспрессируются в особенно больших количествах в нейронах, при этом на долю 14-3-3 приходится до 1% растворимых белков мозга [8]. По этой причине представлялось целесообразным исследовать взаимодействие 143-3 с белком may, играющим важную роль в регуляции цитоскелета нервных клеток, а также проанализировать влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3?, на это взаимодействие.

Влияние фосфорилирования may белка на его взаимодействие с 14-З-ЗС

Tay белок человека принадлежит к группе белков, ассоциированных с микротрубочками, определяет морфологию отростков нейронов, регулирует рост аксона и аксональный транспорт. Описано много способов регуляции функционирования may, одним из которых является фосфорилирование под действием различных протеинкиназ [19, 32]. Tay белок содержит около двадцати участков фосфорилирования, при этом гиперфосфорилирование увеличивает вероятность образования агрегатов, формирование которых коррелирует с развитием ряда нейродегенеративных заболеваний, получивших собирательное обозначение таупатии [32].

Согласно работе Хашигучи с соавт. [19], 14-3-3 является эффектором фосфорилирования may белка. При этом постулировалось, что 14-3-3 обеспечивает одновременное связывание протеинкиназы NCLK (Neuronal Cdc2-Like Kinase) и may белка, что способствует сближению субстрата и фермента и обеспечивает эффективное фосфорилирование may. В то же время результаты Хашигучи и соавт. [19], свидетельствовали о том, что фосфорилирование may не влияет на его взаимодействие с 143-3. Этот вывод вызывал определенное сомнение, потому что в большинстве случаев для прочного связывания партнеры 14-3-3 должны находиться в фосфорилированном состоянии.

Согласно данным литературы, цАМФ-зависимая протеинкиназа способна фосфорилировать пять участков в структуре may белка [16]. Первичная структура вблизи некоторых из этих участков фосфорилирования имеет определенное сходство с консенсусным мотивом (R/K)XX(pS/pT)X(P/G) [33], узнаваемым 14-3-3 в других белках-субстратах. В этой связи мы предположили, что фосфорилирование may под действием ПКА может влиять на его взаимодействие с 14-3-3?. Для проверки этого предположения мы проанализировали способность 14-3-3 взаимодействовать с нефосфорилированной и фосфорилированной короткой (зародышевой) изоформой may белка.

Короткую изоформу may белка человека, содержащую три повтора в тубулин-связывающем домене и обозначаемую как тЗ (352 аминокислотных остатка), получали

согласно разработанной нами модифицированной методике. Рекомбинантный белок экспрессировали в клетках E.coli и очищали методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации (см. раздел «Материалы и методы исследования»). Наша методика выделения may исключала жесткую термическую обработку, широко использовавшуюся при выделении may в ранее опубликованных работах, и в то же время обеспечивала получение препаративных количеств высокоочищенного белка.

Как уже отмечалось, may белок является хорошим субстратом для цАМФ-зависимой протеинкиназы, и в выбранных нами условиях при не слишком длительной инкубации протеинкиназа переносила около двух моль фосфата на моль тЗ, что хорошо согласуется с ранее опубликованными данными [16].

Для исследования взаимодействия нефосфорилированного и фосфорилированного тЗ с 14-3-3 мы использовали несколько методов. Смесь белков в различном молярном соотношении преинкубировали в течение получаса при температуре 37°С, а затем подвергали нативному гель-электрофорезу, гель-фильтрации или химическому «сшиванию» глутаровым альдегидом.

При проведении электрофореза в отсутствие денатурирующих агентов при рН 8,5 [24] may белок, имеющий изоэлектрическую точку (pi) около 9,5, обладал положительным зарядом, и не входил в гель (рис. 5А и Б, последняя дорожка). В то же время 14-3-3,

имеющий pi порядка 4,5-5,0, обладал высокой электрофоретической подвижностью (рис. 5). Титрование 14-З-Зц увеличивающимися количествами нефосфорилированного тЗ приводило к появлению очень слабой зоны с промежуточной электрофоретической

подвижностью и параллельному слабому уменьшению интенсивности зоны свободного 14-3-3. Этот факт свидетельствовал в пользу

Рис. 5. Исследование взаимодействия нефосфорилированного (А) и фосфорилированного (Б) may белка (тЗ и ртЗ, соответственно) с 14-3-3 Стрелками указано положение 14-3-3 и комплексов 14-3-3 с may, внизу под каждой дорожкой указано молярное соотношение may к 14-3-3. Концентрация 14-3-3 равна 2,7 мкМ. На последнюю дорожку в А и Б нанесены изолированные тЗ и ртЗ, соответственно. В. Зависимость интенсивности полосы свободного 14-3-3 при титровании тЗ (1) или ртЗ (2) и зависимость интенсивности комплекса 14-З-З-ртЗ (3) от концентрации may.

14-3-3-1)13^.

камшекс

1H.V14-3-3 0 0.2 0.3 0.7 1.0 1.35 2.0 pt3

3 у » 2

0 1 2 3 4 5 6

Концентрация добавленного тпу, мкМ

образования очень неустойчивого комплекса 14-3-3 с нефосфорилированным тЗ. В том случае, когда 14-3-3 титровали may белком, фосфорилированным ПКА, наблюдалось практически полное исчезновение полосы свободного 14-3-3 и параллельное с этим образование новой интенсивной и четкой полосы с электрофоретической подвижностью, промежуточной между подвижностями may белка и свободного 14-3-3 (рис. 5Б). Мы предположили, что эта полоса соответствует комплексу, образованному фосфорилированным may белком и 14-3-3. Для проверки этого предположения указанную полосу вырезали из геля, экстрагировали содержащиеся в ней белки и подвергли электрофорезу в присутствии ДСН. Оказалось, что указанная полоса, действительно, содержит в своем составе как may белок, так и 14-3-3 (данные не представлены).

Таким образом, фосфорилирование may белка способствует его связыванию с 14-3-3?. Действительно, как видно из рис. 5В, полумаксимапыюе увеличение интенсивности полосы, соответствующей комплексу или полумаксимальное уменьшение интенсивности остающегося несвязанным 14-3-3 происходит при концентрации фосфорилированного may, равной ~2 мкМ. В случае нефосфорилированного may мы не могли точно определить концентрацию белка, при которой происходило бы полумаксимальное изменение интенсивности анализируемых полос, однако очевидно, что это могло произойти только при концентрациях, как минимум на порядок больших, чем аналогичные концентрации фосфорилированного белка.

Продолжая свое исследование, мы подвергли гель-фильтрации преинкубированные образцы изолированного 14-3-3, изолированного may белка, а также смеси 14-3-3 с фосфорилированным или нефосфорилированным may белком при молярном соотношении 14-3-3:тау, равном 3:1 и 1:3. На профиле элюции смеси 14-3-3 с нефосфорилированным may удается выявить только два пика, объемы элюции которых точно соответствуют объемам элюции изолированного may белка и изолированного 14-3-3, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия (или об очень слабом взаимодействии) между нефосфорилированным may с 14-3-3. В то же время при гель-фильтрации смеси фосфорилированного may белка с 14-3-3 на профиле элюции был выявлен только один очень широкий пик, при этом профиль элюции смеси фосфорилированного may и 14-3-3 существенно отличался от алгебраической суммы профилей элюции двух изолированных белков (данные не представлены). Этот факт, а также то, что большинство фракций, элюируемых в составе указанного большого пика, содержала как may, так и 14-3-3, вновь свидетельствует о том, что фосфорилирование may значительно усиливает его взаимодействие с 14-3-3.

Обработка смеси нефосфорилированного may белка и 14-3-3 глутаровым альдегидом не приводила к накоплению «сшитых» белковых комплексов. В то же время обработка глутаровым альдегидом смеси фосфорилированного ПКА may белка и 14-3-3 сопровождалась накоплением «сшитых» белковых комплексов с кажущимися молекулярными массами 80-90 и 110-150 кДа (данные не представлены). Меньший по размеру комплекс (80-90 кДа) может соответствовать «сшитым» между собой мономеру 143-3 (30 кДа) и мономеру may (50 кДа), а больший по размеру комплекс может соответствовать «сшитым» между собой димеру 14-3-3 (60 кДа) и мономеру may (50 кДа) или димеру 14-3-3 (60 кДа) и димеру may (100 кДа) (см. рис. 8).

Таким образом, используя методы нативного электрофореза, гель-фильтрации и химического «сшивания» мы установили, что фосфорилирование значительно усиливает взаимодействие may белка с 14-3-3. Следующей задачей, к решению которой мы обратились, была идентификация фосфорилируемых участков may белка, вовлеченных в его взаимодействие с 14-3-3.

Определение участков, фосфорилируемых протеинкиназой А и участвующих во взаимодействии may белка с 14-3-3(

Протеинкиназа А (ПКА) способна фосфорилировать остатки Ser/Thr в консенсусной последовательности (R/K)X|.2(S/T), первичная структура которой с N-конца от фосфорилируемого остатка практически полностью совпадает с мотивом (R/K)XX(pS/pT)X(P/G) [33], узнаваемым белками 14-3-3. Кроме того, известно, что многие белки-партнеры, взаимодействующие с 14-3-3, содержат в своем составе остатки, фосфорилируемые ПКА. В литературе высказывалось предположение [34], что индуцируемое фосфорилированием усиление взаимодействия may белка с 14-3-3 обусловлено фосфорилированием серина в составе последовательности RTPSLP. Указанный остаток соответствует Ser214 длинной или, соответственно, Serl56 короткой изоформы may белка. Окружение указанного остатка Serl56 (Ser214), действительно, идеально совпадает с мотивами, узнаваемыми 14-3-3. В то же время проведенный нами анализ первичной структуры короткой изоформы may белка свидетельствовал о том, что еще как минимум два других участка, фосфорилируемых ПКА, а именно остатки Ser235 и Ser267, могут тем или иным способом участвовать во взаимодействии may белка с 14-3-3 (рис. 6А). Для определения роли указанных остатков был создан набор мутантных форм тЗ с точечными заменами Ser—»Ala, блокирующими фосфорилирование под действием ПКА (рис. 6Б). Как и предполагалось, при создании одиночного, двойного и тройного мутантов последовательная замена остатков Serl56, Ser235 и Ser267 на аланин приводит к ступенчатому снижению

Kcrs".<Lr -KÍGS LD-LO- \

-RTPS I.F

TyóyIMH-cwi 1Ыв;|к)Шн11 домен

2,0-

скорости и степени фосфорилирования may белка. Эти результаты хорошо дополняют данные литературы [15, 16]. Введение тройной мутации S156A/S235A/S267A приводит к

~70% уменьшению степени фосфорилирования короткой изоформы may белка. В полном соответствии с данными литературы [15, 16], это означает, что остатки Ser320 и Ser327 короткой изоформы may белка фосфорилируются с гораздо меньшей скоростью и эффективностью, чем

упомянутые ранее остатки Serl56, Ser235 и Ser267.

Далее, мы перешли к

о *

с. ~

г ->

í °

Г -Э

с. =:

с о

1.5-

1,0

о б

0,5-

0,0-

-' t3wt

____» SI56A

—*

S156A/S267A S156A/S235A S156A/S235A/S267A

100 150 200 Время, МИН

250

Рис. 6. Схема расположения остатков серина, фосфорилируемых исследованию взаимодействия ПКА в составе короткой изоформы may белка тЗ (А), и эффект чных мутш1тных форм т3

замен Serl56, Ser235 и Ser267 на Ala на кинетику г

фосфорилирования тЗ под действием ПКА (Б). Потенциальные с 14-3-3^. Тау белок дикого типа участки, фосфорилирование которых может влиять на

взаимодействие тЗ с 14-3-3, выделены жирным текстом. и его «апаниновые» мутантные

формы фосфорилировали ПКА в одинаковых условиях, преинкубировали с белком 14-3-3С, в различных молярных соотношениях, и анализировали взаимодействие фосфорилированного may белка с 14-3-3 с помощью различных методов.

Рассмотрим здесь только результаты, полученные методом нативного электрофореза. Как было показано ранее (см. предыдущий раздел), титрование фиксированного количества 14-3-3 фосфорилированным may сопровождается появлением на электрофореграмме новой зоны, соответствующей комплексу may-14-3-3, и убылью интенсивности зоны, соответствующей свободному 14-3-3. После электрофореза мы проводили количественную денситометрию зоны свободного 14-3-3 и по калибровочному графику определяли концентрацию 14-3-3, остающегося свободным в смесях, содержащих разные количества may белка. Строя зависимость остающегося свободным 14-3-3 от суммарной концентрации добавленного may дикого типа или его «аланиновых» мутантов (рис. 7), мы могли определить вклад различных участков may в его взаимодействие с 14-3-3.

В выбранных условиях титрование 14-3-3 увеличивающимися количествами фосфорилированного may дикого типа приводило к тому, что лишь около 5-10% 14-3-3 остается в несвязанном с may состоянии. Мутация S156A, исключающая фосфорилирование Serl56, приводила лишь к небольшому ингибированию связывания фосфорилированного may с 14-3-3. Двойные мутации S156A/S267A и, особенно, S156A/S235A приводили к значительному ослаблению взаимодействия фосфорилированного may белка с 14-3-3 (рис. 7).

Тройная мутация S156A/S235A/S267A (рЗА) приводила к практически полному ингибированию

взаимодействия фосфорилированного may белка с 14-3-3 (рис. 7), и фосфорилированный тройной мутант взаимодействовал с 14-3-3 практически так же, как и нефосфорилированный may белок. Представленные данные

свидетельствуют о том, что фосфорилирование как минимум трех остатков Serl56, Ser235 и/или Ser267

2,5-

2,0-

1,5-

1,0-

Ь. 0,5-

0,0-

t3wt - рЗА

P-S156A/S235A

01 234S67S9 10

Концентрация добавленного тау, мкМ

Рис. 7. Исследование роли различных остатков серина,

фосфорилируемых ПКА, во взаимодействии may белка с (нумерация короткой изоформы may,

14-З-ЗС методом нативного электрофореза. Приведены

ъпъ.и-,* тЗ) играет важную роль в прочном

кривые титрования 2,7 мкМ 14-3-3 увеличивающимися г

концентрациями may белка дикого типа, may белка взаимодействии may белка с 14-3-3.

дикого типа, фосфорилированного ПКА (ртЗ), и

мутантов S156A, S156A/S267A, S156A/S235A, Необходимо отметить, что по

S156A/S235A/S267A (ЗА), фосфорилированных ПКА в данным литературы среди белков. условиях, идентичных условиям фосфорилирования

белка дикого типа. партнеров 14-3-3 описано довольно

много белков, содержащих в своем составе более одного центра связывания 14-3-3. Каждый мономер 14-3-3 содержит один центр связывания белка-мишени, поэтому стабильные димеры 14-3-3 содержат два центра связывания субстратов. Наличие в структуре молекулы белка-партнера двух центров связывания, как правило, значительно повышает прочность комплексов, образуемых этим белком с 14-3-3, и иногда бывает просто необходимо для регуляции активности таких белков [35].

Влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3С, на его взаимодействие с фосфорилированным may белком Для исследования влияния мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3, на его способность взаимодействовать с фосфорилированным may белком были использованы методы химического «сшивания» и электрофореза в нативных условиях.

При инкубации изолированного 14-3-3 в присутствии 0,05% глутарового альдегида (ГА) при последующем ДСН-электрофорезе в градиентном ПААГ мы наблюдали появление полосы «сшитого» димера 14-3-3 с кажущейся молекулярной массой 60 кДа (рис. 8А, дорожки 1 и 2). В тех же условиях may белок, фосфорилированный ПКА (-1,6-1,8 моль фосфата на моль белка), практически не образовывал «сшитых» олигомеров и оставался в виде мономера с кажущейся молекулярной массой -50 кДа (рис. 8А и Б, дорожки 3 и 4). При

Б В

(14-3-3)?

1 2 3 4 5 6 7 8 9

123 + 5 6789

WT S5SE S184E Т232Е ЗЕ

Рис. 8. Химическое «сшивание» фосфорилированного may белка (ртЗ) с 14-3-3? дикого типа и его мутантами, имитирующими фосфорилирование А. Градиентный ДСН-электрофорез изолированного «несшитого» (1) и «сшитого» (2) 14-3-3, изолированного «несшитого» (3) и «сшитого» (4) ртЗ, а также «сшитых» образцов, содержащих смесь ртЗ и 14-3-3? WT (5) или его мутантов S58E (6), SI 84Е (7), Т232Е (8) и ЗЕ (9). Б. Авторадиограмма геля, представленного на панели А. Стрелками отмечены положения мономеров (14-3-3) и димеров (14-3-3)2 белка 14-3-3, мономеров may (ртЗ), «сшитые» комплексы 14-З-З-ртЗ и белки-маркеры (в кДа). В. Относительная интенсивность зоны с кажущейся молекулярной массой в районе 110-140 кДа, соответствующей комплексам ртЗ с 14-3-31^ дикого типа (WT) или его мутантами.

«сшивании» смесей 14-3-3 с may белком на электрофореграмме удается выявить несколько новых зон с кажущимися молекулярными массами около 80 кДа и 110-140 кДа, соответствующих комплексам 14-3-3 с may (рис. 8А и Б, дорожки 5-9). Как видно из рис. 8, интенсивность полосы комплексов 14-3-3 с may с кажущейся молекулярной массой около 110-140 кДа для 14-3-3? дикого типа и его мутантов убывает в ряду S184E ~ WT = Т232Е > S58E = ЗЕ. Таким образом, мутация S58E, имитирующая фосфорилирование Ser58, заметно уменьшает, в то время как остальные мутации практически не влияют на способность 14-3-3? образовывать «сшитые» комплексы с фосфорилированным may белком.

Молярное соотношение рсЗ/14-З-З

О 0,2 0,4 0,7 1,0 1,3 2,1 2,8

YVT

14-3-3 •*

858Е

14-3-3

S184E

Т232Е

ЗЕ

W- w— |

»( ».ц Гй

V *"* W iAi да»

.J-.

Wwv W* i

• ^ щ ,

\шт Wv <

г -71ГТ1

I- 14-3-3-тау комплекс

-14-3-3-lay комплекс

- 14-3-3-тау комплекс

«-14-3-3-тау комплекс

-14-3-3-тау комплекс

S58E ЗЕ

> S184E

Т232Е

Концентрация добавленного ртЗ. мкМ

Метод нативного электрофореза также использовался для анализа взаимодействия 14-3-3 дикого типа и его мутантов, имитирующих

фосфорилирование, с фосфорилированным may белком. Как уже отмечалось ранее, титрование фиксированного количества 143-3? (или его мутантов) нарастающими количествами ртЗ приводит к тому, что зона, соответствующая изолированному 14-3-3 постепенно убывает и одновременно с этим увеличивается интенсивность полосы, соответствующей комплексу, образованному двумя белками (рис. 9А). Измеряя интенсивность полосы остающегося свободным (не связанным с may белком) 14-3-3, можно построить зависимость убыли интенсивности указанной полосы от суммарного количества добавленного

фосфорилированного may белка и таким образом проанализировать, как мутации, имитирующие фосфорилирование 14-3-3?, влияют на его взаимодействие с may белком (рис. 9Б). Добавление 2,8-кратного молярного избытка фосфорилированного may белка к 14-3-3? дикого типа и его S184E и Т232Е мутантным формам сопровождалось практически полным исчезновением полосы свободного 14-3-3?

Рис.

9. Анализ взаимодействия 14-3-3 дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, с фосфорилированным may белком (ртЗ) методом нативного электрофореза. А. Титрование 2,7 мкМ 14-3-3? дикого типа (WT) и его мутантов фосфорилированным may белком. Стрелки показывают положение 14-3-3 и комплекса, образованного 14-3-3 и фосфорилированным may. Молярное соотношение двух белков указано сверху над каждой дорожкой. Б. Зависимость интенсивности полосы свободного 14-3-3 от концентрации добавленного may. Кривые получены в результате обсчета трех независимых экспериментов.

(рис. 9). В полном соответствии с рассмотренными ранее результатами, как 14-3-3 дикого типа, так и его мутанты S184E и Т232Е образуют стабильные димеры, мигрирующие в геле в виде узкой зоны (см. первый раздел главы «Основные результаты и их обсуждение»). В то же время мутанты S58E и ЗЕ образуют менее стабильные и легко диссоциирующие димеры и, наиболее вероятно, представлены в виде равновесной смеси мономеров и димеров. Если скорость установления равновесия между мономерными и димерными формами S58E и ЗЕ меньше скорости их электрофоретического разделения, то на геле можно ожидать появления двух разделенных зон (что на самом деле и выявляется на рис. 9А). При этом зона с меньшей подвижностью соответствует преимущественно димерам, а зона с большей подвижностью представлена в основном в виде мономеров 14-3-3. В ходе титрования фосфорилированным may белком зона мономеров убывает значительно медленнее, чем зона димеров (рис. 9А). Вероятно, это говорит о том, что мономеры 14-3-3 слабо взаимодействуют с фосфорилированным may белком. Вопрос функциональности мономерных форм 14-3-3 до настоящего времени остается достаточно спорным. В литературе есть сведения о том, что мономеры 14-3-3 все-таки способны взаимодействовать с некоторыми белками-партнерами [36], однако принято считать, что именно димерная форма 14-3-3 является функционально активной [7].

Любопытно отметить, что полумаксимальное уменьшение интенсивности полосы свободного димерного 14-3-3 происходило при концентрации фосфорилированного may белка в районе 2 мкМ вне зависимости от природы анализируемых мутантов 14-3-3. Этот факт может означать, что исследуемые мутации, имитирующие фосфорилирование, практически не влияют на сродство димеров 14-3-3 к фосфорилированному may белку, однако мутации S58E и ЗЕ сдвигают равновесие в сторону образования мономеров 14-3-3 и тем самым уменьшают эффективность взаимодействия 14-3-3 с фосфорилированным may белком.

Таким образом, фосфорилирование 14-3-3 может служить эффективным дополнительным механизмом, регулирующим взаимодействие 14-3-3 с may белком. По-видимому, такой уровень регуляции необходим для поддержания в нервных клетках постоянной концентрации фракции свободного may, способного связываться с микротрубочками. В противном случае, весь фосфорилированный may белок мог бы постепенно перейти в комплекс с 14-3-3 и перестал бы выполнять свои нормальные функции.

выводы

1. Разработан метод выделения рекомбинантного 14-3-3? человека и его мутантных форм с заменами S58E, S184E, Т232Е и S58E/S184Е/Т232Е, имитирующими структурные изменения, происходящие при фосфорилировании. Показано, что анализируемые мутации не влияют на вторичную структуру 14-3-3?.

2. Оптимизирован метод выделения короткой (зародышевой) изоформы may белка человека, а также ее мутантных форм с заменами некоторых остатков серина, фосфорилируемых цАМФ-зависимой протеинкиназой, на аланин.

3. Установлено, что катализируемое цАМФ-зависимой протеинкиназой фосфорилирование остатков Serl56, Ser235 и/или Ser267 may белка способствует его взаимодействию с 14-3-3?.

4. Обнаружено, что мутация S58E, имитирующая структурные изменения, происходящие при фосфорилировании 14-3-3? под действием нескольких протеинкиназ, дестабилизирует структуру 14-3-3, снижая его термостабильность и устойчивость к протеолизу, а также провоцирует диссоциацию димеров 14-3-3? при разведении, следствием чего является ослабление взаимодействия 14-3-3 с фосфорилированным may белком.

5. Мутации S184E и Т232Е, имитирующие структурные изменения, происходящие при фосфорилировании 14-3-3 под действием некоторых протеинкиназ, не оказывают существенного влияния не третичную структуру белка, его устойчивость к протеолизу и на взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным may белком.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. N.N. Sluchanko, I.S. Chernik, A.S. Seit-Nebi, A.V. Pivovarova, D.I. Levitsky, N.B. Gusev, Effect of mutations mimicking phosphorylation on the structure and properties of human 143-3$, Arch. Biochem. Biophys. 477 (2008) 305-374

2. N.N. Sluchanko, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev, Effect of phosphorylation on interaction of human tau protein with 14-3-3?, Biochem. Biophys. Res. Commun. 379 (2009) 990-994

3. N.N. Sluchanko, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev, Phosphorylation of more than one site is required for tight interaction of human tau protein with 14-3-3?, FEBS Lett. 583 (2009) 2739-2742

4. N.N. Sluchanko. M.V. Sudnitsyna, I.S. Chernik, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev, Phospbomimicking mutations of human 14-3-3? affect its interaction with tau protein and small heat shock protein HspB6, Arch. Biochem. Biophys. 506 (2011) 24-34

5. H.H. Случанко, Н.Б. Гусев, Белки семейства 14-3-3 и регуляция цитоскелета, Усп. Биол. Хим. 50 (2010) 69-116

6. N.N. Sluchanko. N.B. Gusev, Probable participation of 14-3-3 in tau protein oligomerization and aggregation, J. Alzheim. Dis., doi: 10.3233/jad-2011-110692

Тезисы докладов

1. H.H. Случанко. И.С. Черник (2008) Сравнение структуры и физико-химических свойств белка 14-3-3? и его точечных мутантов, имитирующих фосфорилирование. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», с. 45-46, Москва

2. N.N. Sluchanko. A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2009) Effect of phosphorylation on interaction of human tau protein with 14-3-3?, FEBS J., 276 (si), p. 166, Abstracts of the 34,h FEBS Congress, Prague

3. H.H. Случанко (2009) Фосфорилирование цАМФ-зависимой протеинкиназой влияет на взаимодействие may белка с белком 14-3-3<?. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», с. 62-63, Москва

4. Н.Н. Случанко (2010) Фосфорилирование may белка человека по трем остаткам серина влияет на его взаимодействие с белком 14-3-3?. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», с. 63-64, Москва

5. Н.Н. Случанко, Н.Б. Гусев (2010) Участие универсального адапторного белка 14-3-3 в регуляции мышечного сокращения, клеточной подвижности и цитоскелета. Тезисы докладов международного симпозиума «Биологическая подвижность», с. 261-262, Пущино

6. N.N. Sluchanko, I.S. Chernik, A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2010) Effect of pseudophosphorylations on the structure and properties of 14-3-3?, FEBS J., 277 (si), p. 179, Abstracts of the 35th FEBS Congress, Gothenburg

7. N.N. Sluchanko. A.S. Seit-Nebi, N.B. Gusev (2010) Three sites phosphorylated by protein kinase A in human tau protein affect its interaction with 14-3-3?. Proceedings of the Australian Society for Biochemistry and Molecular Biology, 42, p. 211, Melbourne

Данное исследование проводилось при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (проекты 07-04-00115-а и 10-04-00026-а).

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Pozuelo Rubio, M. et al., Biochem J, 379(2): 395-408,2004.

2. Ichimura, T. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 85(19): 7084-7088,1988.

3. Aitken, A. et al., J Biol Chem, 270(11): 5706-5709,1995.

4. Aitken, A., Plant Mol Biol, 50(6): 993-1010,2002.

5. Jones, D.H. et al., FEBS Lett, 368(1): 55-58,1995.

6. Liu, D. et al., Nature, 376(6536): 191-194,1995.

7. Shen, Y. et al., Mol Biol Cell, 14(11): 4721-4733, 2003.

8. Boston, P.F. etal., J Neurochem, 38(5): 1466-1474,1982.

9. Mackintosh, C., Biochem. J., 381(2): 329-342, 2004.

10. Dubois, T. et al., J Biol Chem, 272(46): 28882-28888,1997.

11. Megldish, T. et al., J Biol Chem, 273(34): 21834-21845,1998.

12. Gu, Y.-M. et al., FEBS Lett, 580(1): 305-310, 2006.

13. Powell, D. et al., Mol Cell Biol, 23(15): 5376-5387, 2003.

14. Zhou, J. et al., Mol Cell Biol, 29(15): 4167-4176, 2009.

15. Landrieu, I. et al., J Am ChemSoc, 128(11): 3575-3583, 2006.

16. Scott, C.W. et al., J Biol Chem, 268(2): 1166-1173,1993.

17. Woodcock, J.M. et al., J Biol Chem, 278(38): 36323-36327, 2003.

18. Layfield, R. et al., Neurosci Lett, 209(1): 57-60,1996.

19. Hashlguchi, M. et al., J Biol Chem, 275(33): 25247-25254, 2000.

20. Sarkar, G. et al., Biotechniques, 8(4): 404-407,1990.

21. Greenfield, N. et al., Biochemistry, 8(10): 4108-4116,1969.

22. Sreerama, N. et al., Anal Biochem, 287(2): 252-260, 2000.

23. Chernlk, I. et al., Mol Cell Biochem, 295(1-2): 9-17, 2007.

24. Schaub, M.C. et al., Biochem J, 115(5): 993-1004,1969.

25. Schagger, H. et al., Anal Biochem, 217(2): 220-230,1994.

26. Laemmli, U.K., Nature, 227(5259): 680-685,1970.

27. Bushueva, T.L. et al., Arch Biochem Biophys, 204(1): 161-166,1980.

28. Plvovarova, A.V. et al., Biochem Biophys Res Commun, 331(4): 1548-1553,2005.

29. Witt, J.J. et al., Anal Biochem, 66(1): 253-258,1975.

30. Aitken, A., Semin. Cane. Biol., 16(3): 162-172, 2006.

31. Won, J. et al., J Biol Chem, 278(21): 19347-19351, 2003.

32. Johnson, G.V. et al., J CellSci, 117(24): 5721-5729, 2004.

33. Rlttinger, K. et al., Mol. Cell, 4(2): 153-166,1999.

34. Sadik, G. et al., J Neurochem, 108(1): 33-43,2009.

35. Yaffe, M.B. et al., Cell, 91(7): 961-971,1997.

36. Zhou, Y. et al., J Biol Chem, 278(12): 10073-10080, 2003.

Заказ №274-1/09/2011 Подписано в печать 08.09.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

д ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

1, тт. с/г. ги; е-таИ: т/о@с/г. ги

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Случанко, Николай Николаевич, Москва

др.) (72, 103, 167, 183). Поскольку участки фосфорилирования разбросаны по всей длине полипептидной цепи тау (71, 72), фосфорилирование может оказывать влияние на различные свойства тау белков. Например, установлено, что фосфорилирование влияет на связывание тау с микротрубочками (161) и устойчивость тау к протеолизу (87, 111).

Однако особенно важно, что фосфорилирование влияет на способность тау белков к , формированию различных по форме и* размерам агрегатов. Более того, по данным литературы, некоторые участки тау специфически фосфорилируются при< развитии определенных заболеваний, что позволяет говорить о конкретных фосфо-эпитопах, присущих тому или иному заболеванию (12, 205). Стоит отметить, что чаще всего в структуре тау белка сразу несколько остатков могут находиться в фосфорилированном состоянии. Считается, что в физиологических условиях тау содержит обычно 2-3 моль фосфата на моль белка (82), однако при разбалансировании* процессов фосфорилирования и дефосфорилирования может происходить гиперфосфорилирование тау, что подразумевает включение в его состав более 6 моль фосфата (82). Фосфорилирование сразу нескольких остатков тау частично снижает катионные свойства тау белка и уменьшает его сродство к анионной поверхности микротрубочек, а также снижает взаимное отталкивание молекул свободного тау друг от друга (81). Все это приводит к тому, что гиперфосфорилированный тау белок диссоциирует от микротрубочек, теряет способность выполнять свои функции и приобретает склонность к олигомеризации и, в конечном счете, к агрегации. Неоспоримым доказательством этого является тот факт, что тау белок, обнаруженный в нейрофибриллярных сплетениях у больных таупатиями, является преимущественно гиперфосфорилированным (16, 18, 19).

Однако и без того сложная картина регуляции тау под действием фосфорилирования^ (88, 205) еще более осложняется тем, что помимо фосфорилирования тау белок может подвергаться множеству других посттрансляционных модификаций. По данным литературы, тау белок может быть субстратом для Ы- и О- гликозилирования, пикирования, дезаминирования, протеолитического расщепления, убиквитинилирования, окисления и др. (18, 178), при этом наибольшее число модификаций происходит, как правило, с гиперфосфорилированным тау белком, и, по-видимому, каким-то образом сопровождает развитие патологических процессов при таупатиях.

Взаимосвязь тау белков с представителями семейства 14-3-3

Несмотря на то, что белковые включения, обнаруживаемые при различных таупатиях, преимущественно содержат тау белок, в их составе были найдены также и другие белки.

78. Ichimura T, Isobe T, Okuyama T, Takahashi N, Araki K, Kuwano R, and^Takahashi

Y. Molecular cloning of cDNA coding for brain-specific 14-3-3 protein, a protein kinase-dependent activator of tyrosine and tryptophan hydroxylases. Proc Natl Acad Sci USA 85: 7084-7088, 1988.

79. Ichimura T, Isobe T, Okuyama T, Yamauchi T, and Fujisawa Hi Brain 14-3-3 protein is an activator protein that activates tryptophan 5-monooxygenase and tyrosine 3-monooxygenase in the presence of Ca2+,calmodulin-dependent protein kinase II. FEBS Lett 219: 79-82, 1987.

80. Ichimura T, Uchiyama J, Kunihiro O; Ito M, Horigome T, Omata S, ShinkaiF, Kaji H, and Isobe T. Identification of the site of interaction of the 14-3-3 protein with phosphorylated tryptophan hydroxylase. J Biol Chem 270:28515-28518, 1995.

81. Iqbal K, Alonso Adel C, Chen S, Chohan MO, EI-Akkad E, Gong CX, Khatoon S, Li B, Liu F, Rahman A, Tanimukai H, and Grundke-IqbaM. Tau pathology in Alzheimer disease and other tauopathies. Biochim Biophys Acta 1739: 198-210,2005.

82. Iqbal K, Wang X, Blanchard J; Liu F, Gong CX, and Grundke-Iqbal L Alzheimer's disease neurofibrillary degeneration: pivotal and multifactorial. Biochem Soc Trans 38: 962-966, 2010.

83. Jang JS, Cho HY, Lee YJ, Ha WS, and Kim.HW. The differential proteome profile of stomach cancer: identification of the biomarker candidates. Oncol Res 14: 491-499,2004.

84. Jeganathan> S, von Bergen, M, Mandelkow EM; and^ Mandelkow E. The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments. Biochemistry 47: 10526-10539, 2008.

85. JeruTj; Papin S, L'Hoste S, Duquesnoy P, Cazeneuve G, Camonis J, andAmselem S«.

Interaction of pyrin with 14.3.3 in an isoform-specific and phosphorylation-dependent manner regulates its translocation to the nucleus. Arthritis and rheumatism 52: 1848-1857, 2005.

86. Jho YS, Zhulina EB, Kim MW, and Pincus PA. Monte carlo simulations of tau proteins: effect of phosphorylation. Biophys J99: 2387-2397,2010.

87. Johnson GV, and Foley VG. Calpain-mediated proteolysis of microtubule-associated protein 2 (MAP-2) is inhibited by phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase, but not by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. JNenrosci Res 34: 642-647, 1993.

88. Johnson. GV, and Stoothoff WH. Tau phosphorylation in neuronal cell function and dysfunction. J Cell Sci 117: 5721-5729,2004.

89. Jones DH, Ley S, and Aitken A. Isoforms of 14-3-3 protein can form homo- and heterodimers in vivo and in vitro: implications for function as adapter proteins. FEBS Lett 368: 5558, 1995.

90. Jones DH, Martin H; Madrazo J, Robinson KA, Nielsen P, Roseboom PH; Patel Y, Howell SA, and Aitken A. Expression and structural analysis of 14-3-3 proteins. Journal of molecular biology 245: 375-384, 1995.

91. Kampers, T, Friedhoff P, Biernat J, Mandelkow EM, and Mandelkow E. RNA

stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments. FEBS Lett 399: 344-349, 1996.

92. Kaneko K, and Hachiya N. The alternative role of 14-3-3 zeta as a sweeper of misfolded proteins in disease conditions. Medical hypotheses 67:169-171, 2006.

93. Kim TD, Choi E, Rhim H, Paik SR, and Yang CH. Alpha-synuclein has structural and functional similarities to small heat shock proteins. Biochem Biophys Res Comman 324: 1352-1359, 2004.

94. Klein DC, Ganguly S, Coon S, Weller JL, Obsil T, Hickman A, and Dyda F. 14-3-3 Proteins and photoneuroendocrine transduction: role in controlling the daily rhythm in melatonin. Biochem Soc Trans 30: 365-373,2002.

95. Kleppe R, Toska K, and Haavik J: Interaction of phosphorylated tyrosine hydroxylase with 14-3-3 proteins: evidence for a phosphoserine 40-dependent association. Journal of neurochemistry 77: 1097-1107, 2001.

135. Obsil T, Ghirlando R, Klein DC, Ganguly S, and Dyda F. Crystal structure of the 14-3-3zeta:serotonin N-acetyltransferase complex, a role for scaffolding in enzyme regulation. Cell 105: 257-267, 2001.

136. Obsilova V, Herman P, Vecer J, Sulc M, Teisinger J, and Obsil T. 14-3-3zeta C-terminal stretch changes its conformation upon ligand binding and phosphorylation at Thr232. The Journal of biological chemistry 279:4531 -4540,2004.

137. Obsilova V, Vecer J, HermanOPj Pabianova A, Sulc M; Teisinger J, Boura E, and Obsil T. 14-3-3 Protein interacts with nuclear localization sequence of forkhead transcription factor Fox04. Biochemistry 44: 11608-11617, 2005.

138. Ostrerova N, Petrucelli L, Farrer M, Mehta N, Choi P, Hardy J, and WoIozinB. alpha-Synuclein shares physical and functional homology with 14-3-3 proteins. The Journal of

\ neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 19: 5782-5791, 1999.

139. Paudel HK. Phosphorylation by neuronal cdc2-like protein kinase promotes dimerization of Tau protein in vitro. J Biol Chem 272: 28328-28334, 1997.

140. Paul A-L, Folta K, and Ferl R: 14-3-3 proteins, red light and photoperiodic flowering: A point of connection? Plant signaling & behavior 3:511-515, 2008.

141. Pennington G, Chohan G, Mackenzie J; Andrews WillR, Knight R; and Green A. The role of cerebrospinal fluid proteins as early diagnostic markers for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Neuroscience letters 455: 56-59,2009.

' 142. Peterson^ DW, Zhou H>, Dahlquist FW, and Lew J. A soluble oligomer of tau associated with fiber formation analyzed by NMR. Biochemistry 47: 7393-7404, 2008.

143. Petosa G, Masters SC, Bankston LA, Pohl J, Wang B, Fu H; and Liddington RC. 14-3-3zeta binds a phosphorylated Raf peptide and an unphosphorylated peptide via its conserved amphipathic groove. The Journal of biological chemistry 273: 16305-16310, 1998.

144. Pietromonaco SF, Seluja GA, Aitken-A, andElias L. Association of 14-3-3 proteins with centrosomes. Blood cells, molecules & diseases 22: 225-237, 1996.

145. Pivovarova AV, Mikhailova W, Chernik IS, Chebotareva NA', Levitsky DI', and Gusev

NB. Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation and aggregation of F-actin. Biochem Biophys Res Commun 331: 1548-1553, 2005.

146. Plesniak LA, Mahalakshmi R, Rypien^ C, Yang Y, Racic J, and Marassi- FM3. Expression, refolding, and initial structural characterization of the Y. pestis Ail outer membrane protein in lipids. Biochim Biophys Acta 1808: 482-489,2011.

147. PowellD, Rane M^ Chen Q; Singh S, and McLeish.K. Identification of 14-3-3zeta as a protein kinase B/Akt substrate. J Biol Chem 211: 21639-21642,2002.

148. Powell D, Rane M, Joughin B, Kalmukova R, Hong J-H, Tidor B, Dean W, Pierce W, Klein J, Yaffe M, and McLeish K. Proteomic identification of 14-3-3zeta as a mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2 substrate: role in dimer formation and ligand binding. Mol' Cell Biol 23: 5376-5387, 2003.

149. Pozuelo Rubio M; Geraghty KM, Wong BH, Wood NT, Campbell DG, Morrice N, and Mackintosh C. 14-3-3-affinity purification of over 200 human phosphoproteins reveals new links to regulation of cellular metabolism, proliferation and trafficking. Biochem J 379: 395-408,2004.

150. Qi W, Liu X, Chen W, Li Q, and1 Martinez JD. Overexpression of 14-3-3gamma causes polyploidization in H322 lung cancer cells. Mol Carcinog 46: 847-856, 2007.

151. Rajamani D, Thiel S, Vajda S, and Camacho CJ. Anchor residues in protein-protein interactions. Proc Natl Acad Sci USA 101: 11287-11292, 2004.

152. Rittinger K, Budnian J, Xu J, Volinia S, Cantley LC, SmerdonSJ, Gambling J, and Yaffe MB. Structural analysis of 14-3-3 phosphopeptide complexes identifies a dual role for the nuclear export signal of 14-3-3 in ligand binding. Mol Cell 4: 153-166, 1999.

153. Robinson K, Jones D, Patel Y, Martin H, Madrazo J, Martin S, Howell S, Elmore M, Finnen MJ, and Aitken A. Mechanism of inhibition of protein kinase C by 14-3-3 isoforms. 14-33 isoforms do not have phospholipase A2 activity. Biochem J299 (Pt 3): 853-861, 1994.

154. Rosenberg KJ, Ross JL, Feinstein HE, Feinstein SG,_ and Israelachvili J.

Complementary dimerlzation of microtubule-associated tau protein: Implications for microtubule bundling and tau-mediated pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 105: 7445-7450, 2008.

155. Ross DT, Scherf U, Eisen MB, Perou CM, Rees C, SpellmanP, Iyer V, Jeffrey SS, Van? de Rijn M, WalthamM, Pergamenschikov A, Lee JC, Lashkari D, Shalon D, Myers TG, Weinstein JN, Botstein D, and Brown PO. Systematic variation in gene expression patterns in human cancer cell lines. Nat Genet 24: 227-235,2000.

156. Sadik.G, Tanaka T, Kato K, Yamamori H, Nessa BN, Morihara T, and Takeda M. Phosphorylation of tau at Ser214 mediates its interaction with 14-3-3 protein: implications for the mechanism of tau aggregation. JNenrochem 108: 33-43, 2009.

157. Sadik G, Tanaka iT, Kato K, Yanagi K, Kudo T, andTakedaM. Differential interaction and aggregation of 3-repeat and 4-repeat tau isoforms with 14-3-3zeta protein. Biochemical and biophysical research communications 383:37-41,2009.

158. Sarkar G, and- Sommer SS: The "megaprimer" method of site-directed mutagenesis. Biotechniques 8: 404-407, 1990.

159. Schagger H, Cramer WA, andi von Jagow G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem 217:220-230, 1994.

160. Schaub MG, and'Perry SV. The relaxing protein system of striated muscle. Resolution of the troponin complex into inhibitory and calcium ion-sensitizing factors and their relationship to tropomyosin. Biochem J115: 993-1004, 1969.

161. Schneider A, Biernat J; von Bergen M; Mandelkow E, and Mandelkow EM.

Phosphorylation that detaches tau protein from microtubules (Ser262, Ser214) also protects it against aggregation into Alzheimer paired helical filaments. Biochemistry 38: 3549-3558, 1999.

162. Schneider A, and Mandelkow E. Tau-based treatment strategies in neurodegenerative diseases. Nearotherapeatics 5: 443-457,2008.

163. Schomerus G, andf Korf HW. Mechanisms regulating melatonin synthesis in the mammalian pineal organ. Ann NY Acad Sci 1057: 372-383,2005.

164. Schuck P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and lamm equation modeling. Biophys /78: 1606-1619, 2000.

165. Schweers O; Schonbrunn-Hanebeck E, Marx A, and^Mandelkow E. Structural studies of tau protein and Alzheimer paired helical filaments show no evidence for beta-structure. J Biol Chem 269:24290-24297,1994.

166. Scott GW, Blowers DP, Barth PT, Lo MM, Salama AI, and Gaputo CBl Differences in the abilities of human tau isoforms to promote microtubule assembly. J Neurosci Res 30: 154-162, 1991.

167. Scott GW, Spreen RC, Herman JL, Chow FP, Davison MD, Young J, and Gaputo CB.

Phosphorylation of recombinant tau by cAMP-dependent protein kinase. Identification of phosphorylation sites and effect on microtubule assembly. J Biol Chem 268: 1166-1173, 1993.

168. Seimiya H, Sawada H, Muramatsu Y, Shimizu M, Ohko K, Yamane K, and.Tsuruo T. Involvement of 14-3-3 proteins in nuclear localization of telomerase. The EMBO journal 19: 26522661,2000.

169. Serrano L, Montejo de Garcini E, Hernandez MA, and Avila J: Localization of the tubulin binding site for tau protein. Eur J Biochem 153: 595-600, 1985.

170. Shankardas J, Senchyna M, and Dimitrijevich S. Presence and distribution of 14-3-3 proteins in human ocular surface tissues. Molecular vision 14: 2604-2615, 2008.

171. Shen Y, Godlewski J, Bronisz A, Zhu J, Comb M, Avruch J, and Tzivion G.

Significance of 14-3-3 self-dimerization for phosphorylation-dependent target binding. Mol Biol Cell 14: 4721-4733, 2003.

172. Sheth PR; Ramanathan L, Ranchod A, Basso AD, Barrett D, Zhao J, Gray K, Liu YH; Zhang R, and Le HV. Expression, purification, stability optimization and characterization of human Aurora B kinase domain from E. coli. Arch Biochem Biophys 503: 191-201, 2010.

173. Silhan J, Obsilova V, Vecer J, Herman P, Sulc M, Teisinger J, and Obsil T. 14-3-3 protein C-terminal stretch occupies ligand binding groove and is displaced by phosphopeptide binding. The Journal of biological chemistry 279:49113-49119, 2004.

174. Skoulakis EM; and Mudher A. Two days of tau: a meeting focused on its biology and pathology. Biochem Soc Trans 38: 953-954,2010.

175. Skrabana R, Sevcik J, and Novak M. Intrinsically disordered proteins in the neurodegenerative processes: formation of tau protein paired helical filaments and their analysis. Cell Mol Neurobiol 26: 1085-1097, 2006.

176. Sluchanko N, Seit-Nebi A, and Gusev N. Effect of phosphorylation on interaction of 1 human tau protein with 14-3-3zeta. Biochem Biophys Res Commnn 379: 990-994, 2009.

s 177. Sluchanko NN, Ghernik IS, Seit-Nebi AS, Pivovarova AV, Levitsky DI, and Gusev NB!

( Effect of mutations mimicking phosphorylation on the structure and properties of human 14-3-

3zeta. Arch Biochem Biophys All: 305-312, 2008. i 178. Spires-Jones TL, Stoothoff WH, de Calignom A, Jones PB, and* Hyman < BT. Tau

l pathophysiology in neurodegeneration: a tangled issue. Trends Neurosci 32: 150-159,2009.

» 179. Sreerama N, and* Woody RW. Estimation of protein secondary structure from circular

I dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with an expanded

reference set. Anal Biochem 287: 252-260,2000. 5 180. Sugimori K, Kobayashi K, Kitamura T, Sudo S, and Koshino Y. 14-3-3 protein beta

it isoform is associated with 3-repeat tau neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease. Psychiatry

i and clinical neurosciences 61: 159-167, 2007.

I 181. Sunayama J, Tsuruta F, Masuyama N, and Gotoh Y. JNK antagonizes Akt-mediated

! survival signals by phosphorylating 14-3-3 .J Cell Biol 170: 295-304,2005.

182. Sweadner KJ. Size, shape, and solubility of a class of releasable cell surface proteins of i sympathetic neurons. J Neurosci 3: 2518-2524, 1983.

183. Timm T, Marx A, Panneerselvam S, Mandelkow E, and Mandelkow EM. Structure and regulation of MARK, a kinase involved in abnormal phosphorylation of Tau protein. BMC Neurosci 9 Suppl 2: S9,2008.

184. Toker A, Sellers LA, Amess B, Patel Y, Harris A, and Aitken A. Multiple isoforms of a protein kinase C inhibitor (KCIP-1/14-3-3) from sheep brain. Amino acid sequence of phosphorylated forms. European journal of biochemistry / FEBS 206: 453-461, 1992.

185. Tommerup N, and Leffers H. Assignment of the human genes encoding 14,3-3 Eta (YWHAH) to 22ql2, 14-3-3 zeta (YWHAZ) to 2p25.1-p25.2, and 14-3-3 beta (YWHAB) to 20ql3.1 by in situ hybridization. Genomics 33: 149-150, 1996.

186. Tsuruta F, Sunayama J; Mori Y, Hattori S, Shimizu S, Tsujimoto Y, Yoshioka K, Masuyama N, and Gotoh Y. JNK promotes Bax translocation to mitochondria through phosphorylation of 14-3-3 proteins. The EMBO journal 23:1889-1899, 2004.

187. Tzivion G, Gupta VS, Kaplun L, andBalan V. 14-3-3 proteins as potential oncogenes. Semin Cancer Biol 16:203-213,2006.

188. Tzivion G, Luo Z, and Avruch J. A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature 394: 88-92, 1998.

189. Tzivion G, Luo ZJ, and Avruch J. Calyculin A-induced vimentin phosphorylation sequesters 14-3-3 and displaces other 14-3-3 partners in vivo. J Biol Chem 275: 29772-29778, 2000.

190. Tzivion G, Shen YH, and Zhu J. 14-3-3 proteins; bringing new definitions to scaffolding. Oncogene 20: 6331-6338,2001.

191. Uhart M, Iglesias AA, and Bustos DM. Structurally constrained residues outside the binding motif are essential in the interaction of 14-3-3 and phosphorylated partner. J Mol Biol 406: 552-557,2011.

192. Umahara T, Uchihara T, Tsuchiya K, Nakamura A, Iwamoto T, Ikeda K, and Takasaki M. 14-3-3 proteins and zeta isoform containing neurofibrillary tangles in patients with Alzheimer's disease. Acta neuropathology 108:279-286,2004.

193. Uversky VN, Oldfield CJ, and Dunker AK. Showing your ID: intrinsic disorder as an ID for recognition, regulation and cell signaling. JMol Recognit 18: 343-384,2005.

194. Van Der Hoeven PC, Van Der Wal JC, Ruurs P, and Van Blitterswijk WJ. Protein kinase C activation by acidic proteins including 14-3-3. Biochem J 347 Pt 3: 781-785, 2000.

195. Van Der Hoeven PC, Van Der Wal JC, Ruurs P, Van Dijk MC, and Van Blitterswijk J. 14-3-3 isotypes facilitate coupling of protein kinase C-zeta to Raf-1: negative regulation by 14-3-3 phosphorylation. Biochem J 345 Pt 2: 297-306,2000.

196. van Hemert MJ, Steensma HY, andvan Heusden GPI 14-3-3 proteins: key regulators of cell division, signalling and apoptosis. Bioessays 23: 936-946,2001.

197. van Heusden GP, WenzelTJ, Lagendijk EL, de Steensma HY, and^van. den Berg JA.

Characterization of the yeast BMH1 gene encoding a putative protein homologous to mammalian protein kinase II activators and protein kinase C inhibitors. FEBS Lett 302: 145-150, 1992.

198. Vera JC, Rivas CI, andvMaccioni>RB. Heat-stable microtubule protein MAP-1 binds to microtubules and induces microtubule assembly. FEBS Lett 232: 159-162, 1988.

199. Verdoodt B, Benzinger A, Popowicz GM1, Holak TA, and Hermeking H. Characterization of 14-3-3sigma dimerization determinants: requirement of homodimerization for inhibition of cell proliferation. Cell Cycle 5: 2920-2926,2006.

200. Vincenz C, and Dixit VM. 14-3-3 proteins associate with A20 in an isoform-specific manner and function both as chaperone and adapter molecules. J Biol Chem 271: 20029-20034, 1996.

201. Volke D, and Hoffmann R. Purification of bovine Tau versions by affinity chromatography. Protein Expr Purif50: 37-42, 2006.

202. von Bergen M, Barghorn S, Biernat J, Mandelkow EM, and Mandelkow E. Tau

aggregation is driven by a transition from random coil to beta sheet structure. Biochim Biophys Acta 1739: 158-166,2005.

203. Walker JM. The Protein Protocols Handbook. 2002.

204. Wang H, Zhang L, Liddington R, and Fu H. Mutations in the hydrophobic surface of an amphipathic groove of 14-3-3zeta disrupt its interaction with Raf-1 kinase. The Journal of biological chemistiy 273: 16297-16304, 1998.

205. Wang JZ, Grundke-Iqbal I, and Iqbal K. Kinases and phosphatases and tau sites involved in Alzheimer neurofibrillary degeneration. Eur JNenrosci 25: 59-68,2007.

206. Wang Y, Garg S, Mandelkow EM, and» Mandelkow E. Proteolytic processing of tau. Biochem Soc Trans 38: 955-961, 2010.

207. Wang Y, Jacobs C, Hook KE, DuantH, Booher RN, and Sun Y. Binding of 14-3-3beta to the carboxyl terminus of Weel increases Weel stability, kinase activity, and G2-M cell population. Cell Growth Differ 11:211-219, 2000.

208. Waterman MJ, Stavridi ES, Waterman JL, and Halazonetis TD. ATM-dependent activation of p53 involves dephosphorylation and association with 14-3-3 proteins. Nat Genet 19: 175-178, 1998.

209. Weast R. Handbook of chemistry and physics. Cleveland: CRC Press, 1976-1977.

210. Wheeler JM, Guthrie CR, and Kraemer BC. The role of MSUT-2 in tau neurotoxicity: a target for neuroprotection in tauopathy? Biochem Soc Trans 38: 973-976, 2010.

211. Wilker E, Grant R, Artim S, and Yaffe M. A structural basis for 14-3-3sigma functional specificity. The Journal of biological chemistiy 280: 18891-18898,2005.

212. Wilson DM, and Binder LI. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease. Am J Pathol 150: 2181-2195, 1997.

213. Winge I, McKinney J, Ying M, D'Santos C, Kleppe R, Knappskog P, and Haavik J.

Activation and stabilization of human tryptophan hydroxylase 2 by phosphorylation and 14-3-3 binding. The Biochemical journal 410: 195-204, 2008.

214. Witt JJ, and Roskoski R, Jr. Rapid protein kinase assay using phosphocellulose-paper absorption. Anal Biochem 66: 253-258, 1975.

Информация о работе

Случанко, Николай Николаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование белка 14-3-3ζ, на его структуру и некоторые свойства - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы