Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние металлов на вторичный рост мицелиальных микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние металлов на вторичный рост мицелиальных микроорганизмов"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН Институт микробиологии и вирусологии

На ирап-кс рукописи

&АЙН (Ларина Эмильевиа

шш ¡^ГАЛЛОВ НА вторичный РОСС И^ШЛЪНЛХ м11КР00Р1'А1ша-юи

03.00.07 - г.щкроОИШШПШ

Ашо р -з ф е р а т

Диссертации на соискание ученой етенени кандидата биологических наук

Алма-Ата-- 1992

Работа выполнена v Института микробиологии и вирусологии АН Республики Казахстан. Отдельные этапы работы проверены в Институте биохимии им.Саха АН СССР и в Институте биохимии физиологии микроорганизмов АН СССР.

Ihiyчныз руководители:

Доктор биологических наук, профессор - Е.Т.Никитина

кандидат биологических наук - Н.А.АЙтхоглша

О^шшаилме оппонент:;:

доктор биологических наук, профессор - В.Н.Дондленко

доктор биологических наук - М.Г.Саубенова

Недушая организация - Московский госуцарствешхый угогаорси-тет им.М.Н.Ломоносова.

Защита диссертации состоится " " .

в " /У " часов на заседании специализированного Ученого совета к v0ti.0i.0i Института микробиологии и вирусологии АН Республики Казахстан по адресу : 480100, Алма-Ата, ул.Кирова 103.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии н вирусологии АН Республики Казахстан.

» /f»

Автореферат разослан " а&ерд, 992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук , . М.С.Мухамедиева

ВВЕЛ 15 1! ¡1 Е

Актуальность темы. Изучению биологической роя; металлов посвящено много исследований, результата которых нмепт как Фундаментальное , так и прикладное значение. Определены концентрации металлов, оптимальные для процессов роста, рагшлтия и ференцирозки ]шеток микроорганизмов. Но почти нет чшшых о значении металлов для вторичного роста микроорпшизмов, при котором возможно действие конкурентного механизм» т/'озду ди^ьереш и-ровкой и делением клеток: нарушения дкфференцирошш коррелируют с усиленным делением клеток, формирукаотх вторичные колонии. Вторичный рост закономерно возникает у культур разного систематического положения на средах определенного состава и свидетельствует об ограниченности действия факторов, лимитируюимх и ингиби-рующих рост микроорганизмов.

Культуры, изолированные из вторичных колоний.характеризуются множественными структурными и метаболическими особешюстши. Практическое значение имеет показанное ранее (Никитина, 1975; 1!икитина и соавт., 1982, 1988, 1989; Шагаев, 1004; Айтхожина, 1365; Игина, 1963; Никитина, Айтхожина ,1309; Рншганова,1УЭ1) усиление у культур из вторичных колоний ферментативной и антибиотической активности, образование антибиотиков с измененным компонентным составом и локализацией. В связи с этим в исследованиях вторичного роста получил развитие селекционный аспект.

На некоторых мицелиалышх микроорганизмах показано повышение частоты образования вторичных колоний под влиянием УФ, рентгеновских лучей, химических мутагенов ( ЬовсЬалрв ,1974; Си-верцева, 1932; Шакиев, 13Я4;). Но сопсршешю не изучено влияние на вторичный рост микроорганизмов металлов, обладающих мутагенной и канцерогенной активностью.

Целью работы по теме было изучение влияния металлов на вторичный рост мицелиалышх микроорганизмов (про- и эукариот) и выявлений особенностей их метаболизма.

Задачи исследования включали:

1. Изучвше вторичного роста про- и зукариотических мице-лиальшос микроорганизмов при наличии в средах солей металлов.

2. Сравнительное исследование металлосорбции клеток первичного и вторичного роста.

3. Изучение биохимических особенностей мембран и энергетического обмена клеток вторичных колоний микроорганизмов.

и

'1. Идентификация и выявление роли пигментов-'ищу киди вторичного роста.

Нгу.'чная новичка. Вдервие выявлено избирательное (стимулирующее к иигибирумуэс) действие солей металлов на втор!щшй рост актшгоуицетов ( ИЗ родов ^горгоиусег, /¡еипсшщйига, Косагй1а (

М1СГС1ПОПСВрОГР., !НГ в р г О 40 Г^ 1С 1111иШ ) И ГрИбОВ ( ИЗ родов 1Чша-г!ип, 1'еп1с1111ит, АорегйШиа, Кг.Ы^орЬуПит, Т1-1сНо№ес1ия ( ссрЬн1оарог1 ¡ал ). Стимуляторами вторичного роста у иольшшетва кеолецовашшх актшюмицетоз и грибов являются соли тяжелых металлов, в том число са, Нк, /,п, ръ , облагающих канцерогенной акпилк стьп. Показана возможность индукции диморфизма у грибов сублетальними концентрациями солей тяжелых металлов, 'Лнгибирова-нке вторичного роста и нормализация развития у грибов достигается внесением в среды солий Мо, 'П, По , для когорта известен противоопухолевый аффект.

Ьпервие получены дашше об усилении в 2-3 раза сорбции ме-дл.!, цинка, марганца клетками вторичных колоний по сравнению с тукч-шди »схемного роста. Клетки вторичных колоний х\ЬиШ.яепш1

, в отличие от исходных, болю 350 часов сохра-.'¡•,:',!>: чд высоком уровне дыхание, содержание ЛТ1> и аценилатныЛ ^..'•¡'^ле'^дч.есш.и! заряд. Они также значительно отличаются от исходных 5° активности альдолазы, пируваткинази и малатдегвдро-

ГУпВДЗм,.

Предполагается, что механизм ингибирукщего действия Па^Мос^

вдорлчном росте Ь'.Ьи1с^епит уаг.Ь1аэ1.1со1а связан с его щсокрц буферной емкостью. Не выявлено стимулирующего влияния 1^>зеофунгина и пигмента, идентифицированного как бикаверин Сго!!14°8 )» на индукцию вторичного роста.

Практическая значимость. Возможность усиления сорбционннх способностей клеток вторичных колоний мицелиальных микроорганизмов предлагается учитывать и использовать при .подборе культур для очистки окружающей среди от тяжелых мета:»лов.

С селекционной работе предлагается учитывать возможность повышения частота формирования вторичных колоний под влиянием солей металлов, а также использовать их для индукции диморфизма у мицелиаяышх г.цпфооргшшэмов.

На аа;улт.у наносятся положения:

об обвдх " '•:ие1!)1<\.ических реакциях- про- и эукариотннх

микрсорг шш:-.да» н« присутствие в средах солей-металлов;

о подобии действия металлов на процессы дифференциации к деления клеток у высших организмов и мицелиалышх зукдриот;

о различии металлссорбции у клеток первичных и пторичню: колоний мицелиальких клкроорганнсмоз;

об особенностях янергвтЕческого обмена и функций мембран клеток вторичных колоний мш-елиальинх ¡яп-рооргани эмов.

Апробация работа. Результаты исследования балй долоаонн из УП съезде Ш9 (Алма-Ата,1985), Всесоюзной конференции "Рег^.гч-Ш1Я микробного метаболизма" (Пугашо, 1589)? У конфсретда бпэ-лшпксв Средней Азии я Казахстана (Ттквнт,1991); 15 швядуна- ■ родном биохимическом конгрессе (Иерусалим, 1991).

Ijtoj«, По материалам диссертация опубликовано печзтжс: работ: у.

Структура и объем работа. Диссертация излогена на № страницах машинописного текста, включая 14 таблиц и I? рисунков, состоит из введения, 7 глав, заключения к выводов» КисЗлисгрифия составляет 358 наименований работ стечестзешшх к эарубемшк авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДН ИССЛВДОЙДШЛ

Объектами исследования служили мицелиальнае нрокариотные ( Streptomyceo roaooflaVua vnr.ioaeofungint ШТ* ИМиВ 1128} n.grisoorubsr шт.ИМиВ 1618} Я. roQQoflavua шт. IPV 1344; Mlcromonoapora во. шт.ИШВ 1723} Hocardia яр. шт.Ш4яВ 531; Streptoverticillium ар.шт.ИШВ 593} Astlnoobdura ар. ет.ИМйВ 65) и эукрряотиыз микроорганизмы'-1-Pusariujn buiMganun var. blasticola шт.ИМиВ 77; F.oxyaporun ют. ЕШ 2313 } Penlclllium ehrysogenau BKMF шт.239, ШИКА шт.194} Aspergillus kanngnwa-ensin щт.ВКШ332; ' frichotheclust roasun шт.БШ95Э} Cepha-looporium acremonlura шт«ВК№2033| GshizophylZum commune kit. BKMF7I5; Epyderreophyton rubrum BT.ffi&iiJ.

Растворы солей металлов ( MgS04, MgAo2« hl^O^, NaAn0s,MnS0^, MnCl2# СаНР04, CaCl2, CaSO^, CaJiO-j, CuSO^, NiClg, HßdiO^g, PoSO,,, FeCl3, ТЮг, BH4(70j)2, PhAcg, HagMoO^ CoCl2, CdCl2,

(bio)2cc>3 ) и соединения оеледа* бинтики

деканозого ряда добавляли в расплавленные питательные среди н методом двухкратных разведений получали концентрации от I до 0,001$. Для культивирования аятиномицетов использовали бинаризованную среду Првдхэма-Готтлиба, дж грибов - среди РцДор а Чапека,

Учет i¡ микроокопирошние (. на микроскопе Polyvar ) ьторич-' них колоний проводилось в течение месяца. Увеличение на 50/» и более и ускорение сроков их появления оценивалась как стимуляции

ВТОрИЧНОГО píC'1-i.

Содержать шталлов н сухой биомассе микроорганизмов определяя« митодо-: эмиссионного спектрального анализа на дифракционном СИСКТро! рафи ,!1Д"С-13.

Для получения фракции мембран s.roueoi"lfivu3 var, roo^ofunKini ffi'i. JI2Q дезинтеграцию клеток цостигали продавливанием их из замороженного (при - Ь0°С) состоянл^при давлении около 100 атм. Степень разрушения контролировали определением белка по Лоури и по способности поостанаштваи> краситель ;í,6 дихлорфенолиндофенол (Жукова и др., I'.K-j-i). Инфракрасные спектры препаратов снимали на спектрометре Hit -20 ( ^arl üeíoe ,ГДР).

Связивание розеофунгина (полученного по методу Л.А.Ветлуги-ной, 1ь'!\) с мембранами изучали, вводя радиактивную метку (3Н). Радиоактивность препаратов определяли на счетчике :;ь -4000 " intorchi-iu.: " (Франция) .Лкниди, экстрагированные смесью хлороформ нлетшюл по !лаы и ДаИиру ( »п^ь, пуег ,I95S), фракционировала на пластинках "Свдуфил? Пигмент Р. bulbigonum var.blaotl-cola извлекали из мицелия хлороформом, хроматографироьоли В системе хлороформ:метанол: ледяная уксусная кислота - 100:.';;!. Спектра поглощения измеряли ь видимой и "(¡-области на спектрофотометре uv -ICO ".Jhlwadau " (Япония), масс-спектр - на масс-спектрометре f'4:inigu.ii MATwodoi о430 (ФРГ), температуру плавленая - на плавильном столике " tiageaa " (ГДР).Кшшние бцкавершш на вторпчнш! рост t'.bu.Uiigonum var.bia«ttrola изучалось при концентрации от -l.ZB.Iü""'1 Идо 1,5 .I0"bí.1, розеофунгина на вторичный рост я .roüooí'iayua vur.roneofungi ni при концентрациях 6,5.мЧм - 1,3.IO"3!,!.

Экстракции адешшонь'х ну клеотидов проводили 4f¿ НСЮ(. при 0-4°С. Содержание адетшошх нуклеотвдов к активность ферментов углеводного обмена в постмикросомалыюй фракции измеряли на флюориметре "Hitachi" (Япония) при 3G0 им возбуждения и '165нм эмиссии. Энергетический заряд рассчитывали по формуле:

Y- - Ш t V2 АЛФ Ш>+АД$+ЛШ>

Спектрц цитохромов в суспензии клеток регистрировали на спектрофотометре " ohiraad?'U " (Япошш) ^качестве восстановителя

применяли дитионит Па , окислителя - перекись нодороча, для расчета количества использовали еле ;увдйе коэффициенты молярной око-тлнкцни МГ1 .см"*): цитохром с-2о,3; цитохром в цитох-

ром аа -14,0 (Ме^оиэМЛя , и-37). Результаты относили к гдг сухого веса биомассы.

Скорость потребления кислорода у изучаемых культур определяли на поллрографе ьр -у (ЧССР) с помоцьы закрытого платинового электрода типа Кларка. В качество разобщитолл дыхания и окислительного фосфорилировання использовали карбошицианнцхлорфенил-гддразон (КХФ), ингибиторов - I мМ кс;г и [> мГЛ салицилгицракса-мояой кислоты (СГК) в ацетоне .

РНЗУЛЬГШ! ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Вжк'ьяе солей ко галлов на вторичный рост грибов.

Реакций исследованных грибов на присутствие в срезах металлов не были однотипны. 0)ш выратлются: в полном ггодаплешш рос га,в избирательно;,5 ингиблровшши и стану „тиши вторич.чого роста, в нормализации дифферонцнровки исходных культур, в изначальном появлении дроякеиодобного роста. Эффект зависит от концентрации солей и видовой принадлежности грибов.

Ингабированис вторичного роста может солровсдааться вос-станоатением ди&еренцировки. Наиболее выраженным лойствиом этого типа обладает молибдат натрия. Исследован^ нами грибы растут яри высоких концентрациях (до 14 г/л) молибдена в среде, которые леталыш для многих других микроорганизмов (Кагнта1ко е - р-1. > 19У9). Ингабирование вторичного роста и нормализация исходного {г, опытах С Р.Ьи1Ыеепи.Т! шт.77, Р.сЬгуаокепил шт.230, А.капаз* -«авпп1я ит.1332) достигается также при введении в среды соединений титана и селена.

Среди соединений, нормализующих дифференцировку, почти не значатся соли метатлов, относящихся к группе "тяжелых". На основании известных данных о токсичности, мутагенности л канцероген-пасти тяжелых металлов ожидалось разнообразие их действия на исследуемые грибы. Предположение подтвердилось.

Стимуляция вторичного роста наблюдалась у грибов при наличии в средах рада солей" (Сачо4. СаНР04, Мп304, рвС13. г*<ЮА> с<ЮХ2,

:!5(?;о3)2, !1аАэ02, СилЧО^, ■Р^03)2, (В10)2С0у СоС ),

среди которых преобладают соли тяжелых металлов. Наиболее часто стимуляцию вторичного роста вызывают нитраты ртути и

G

свинца (гайл.1), относящиеся к основным загрязнителям окруааа-щсй среди, ü некоторых опытах набладалась индукцкя вторичного роста у грибов, у которых в контрольных условиях формировании вторичных колоний не било . Так вторичной рост у F.oxynporum возникает только пш: наличии в среде шпрата свинца, у с.acromo-nium ~ при наличии ь среде сульфата цинка.

Своеобразием отличались реакции грибов на добавление в срю~ ДИ хлоридов ахлс-за и кадмия. II присутствии P0CI3 проис-

ходило подавление исходного роста. Он бал представлен мелкими ('¿-'3 ш в диаметре) колониями, вторичные ко колонии превосходили иервичше в -'3—*J раза. При субдеталмшх концентрациях fee 13 и C(U:i2 наблвдалось формирование) пторп-íHux колоний, но рост исходных культур полностью отсутствовал.

При сублетальпых концентрациях ¡;ieM.2> CoClgi CufiO^/'.nSO.} t cdc.iz, Hk(¡;o;í>2< Ь'ЬАс2 выявлен тип роста, ха-

рактерный нля дро;иеподоСной фазы диморфных грибоь. Дроыепо-досни', • ос г обнаружен у всех исследованных грибов, по набор солеи их дейет1зуи4и1) концентрации различаются у разных вичоь. Полученные данные расширяют про оставления о факторах диморфизма у грибоь, киявлакпю условий, способствующих переходу от мицелиаль-ной формы развития х'рибов к развитию в виде одиночных дрожзхопо-добних клеток, посвящено мнох-о исследований (-Чап-гОа» ,1984; Matouahutt:, Kobayuobi и др.), выполненных с патоген-

ными грибами, вирулентноеть которых связана с дрожжеподобиым ростом. Имеются данные о повышенной способности к оиосинтезу ысигохичесм! активных веществ у драшшодобных клеток в сравнении о мицелиалышш (Кондратьева, 1981} Шбпкова, 1990; Bartoo-hevich at al. ,1990). В связи с этим предлагается учитывать и использовать нши дашше о факторах, индуцирующих дрожконо-добный рсот у грибовj

Ингибироадшо вторичного роста у грибоз. при внесении в среды содей Mo, 54, fíe t для которых известен противоопухолевый эффект, и стимуляция солями Zn, Pb с известной кан-

церогенной активностью (Аццрощисашили, 197?, 1983; Габешсо, 1933; Ваоильейа, 1983, Быкоред , Рубенчик 1987, Гоцман ,195)9} указывают на подобие в характере действия металлов на вторичный рост грибов и новообразования высших оукариот и поддерживают представлешхе о сходстве действующих в' зтих биологических системах мехшшзмов (Никитина, Айтхоамна, 1989). '

Таблица I

Концентрация {%) солей металлов, стимулирующих вторичный рост грибов

Соединения 81йа?£со1а Р.оху зро-гит ["Р^сНгу зоге-пт шт.239 Р.сЪгуао-Ввпиш шт. 194 С «асгешо-п!ип Т.гозеит А. кааазаетаеп-з!а

СаЗОд 0,03-0,015 - _

СаНГ04 - - 0,125-0,015 - I 0,125-0,06

МпБО^ 1-0,5 - - - - - -

г*еС13 - - - - 0,03 -

1-0,003 - - - 0,25-0, 125 - -

сасх2 - - 1-001 1-0,5 - - —

нг(ыо3)2 НЙАБО, 0,004-0,002— 0,004-0,005 - - 0,0015 ...

- - - - - 0,0-3-0 ,005 -

СгйО^ - - 0,06-0,007 0,03-0,001 - - -

ръсыо3)2 (В10)2С03 СоС12 - 0,06 1-0,001 1-0,25 - 1-0,сз -

- - 0,25 - 0,25 - -

— - 0,125-0,003 - - -

примечание: в табл. 1,2,3 ( -) отсутствие действия

/

о

2. Действие содой металлов на вторичный рост актшог.ище^ов

Изменения -ч характере роста актиномицетов при добавлении в. среду солей г:"холлов били менее разнообразны, чем у грибов. Они выражах/гся: в полном отсутствии роста актиномицетов, в ингиби-ровашш и стимуляции вторичного роста. Эффект зависит от систематического положения культур. Испытанные соли металлов, в том числе соли металлов с канцерогенной активностью,не стимулируют вторичный рост у представителей рода Р^герЬогоусеа , а вызывают его полное или частичное ингибирование (табл.2). У культур родов АсИпотш1ига, К1с гоао поаро га, ¡1осагс11а иной характер реакций на введение в среды солей металлов: при их концентрациях, не подавляющих рост исходных культур, выявлена избирательная стимуляция вторичного роста (табл.3). Этот эффект возможен при введении в среды На^МоО^ - универсального ингибитора вторичного роста у грибов.

Таким образом било показано, что влияние солей металлов на рост и про- и эукариотичешшх мицелиалъных микроорганизмов имеет кшс общ«, так и специфические черты.

3. Сравнительное иеследов;.шие сорбции металлов клетками первичного и вторичного роста мнкрооргашгзмов

Наиболее выраженное (ингибирукхцее и стимулирущее) влияние на вторичный рост оказывают соли Мо, Са, мп, Ре, Си, см, 2п , Било изучено содержание этих элементов в биомассе походных и вторичных колоний.

Результаты анализов показали, что металлы, соли которых до- ■ бавляли в питательные среды в избыточных концентрациях, поглощаются клетками в больших количествах. Так, при 0,03% концентрациях солей молибдена и железа в среде их содержание в золе биомассы Р,Ьи1Ыаепит уаг.Ыао1;1со1а достигает макроколичеств, составляя

Были выявлены значительные различия в содержании молибдена, меди, цинка в биомассе клеток исходного и вторичного роста В'.Ъи1М^епиш v3r.blaati.c0la " . Как видно из табл.4 , биомасса клеток вторичных колоний содержала в 2,8; 3,5 раза больше Мп, Си, гп соответственно и в 2,0 раза меньше молибдена, чем. биомасса клеток исходных колоний. Было та-еже показано, что биомасса меток исходного роста содержит повышенное количество

zl W

ctf

o

M <y

tf n

M

o f1 tj

Ci

o

w o r,

a; it

n «

O

f>

a r-4 o o

CI, E-i

Ei

M

o g

c! /-J

<t-< o

n

l~J

X

a) d

I <i>

K ffl • Gbqi te o . s a, w

a) 3

CD

a S=3 O 0» M

aj ro E-i R wo o o o K ^ p.

o H

<r> C!

s>i ; s o

J. £

u «

>j" Q

!

fl) ti o eg

u-' o o o o s o e e x c,

s*

¡as

o!?

1 1 I I I t I I I I t t t 1

m m 1/2 tx>

? 9 ?

I M >-) Hi I I I I I I I I

in

cj la M o

o

0

1

t t \ \ M M .1 t~4 f t I

o

I

%

o

I t o"

o

0

1

C!

I o

! ! I

in

C 3

I.O t~l n i"

C\; o » CJ

► - O -

O O O

I !, I I

n v-i hi

in

i.Q *

' > o

- I I o

lilt

I I I I I I I t I I I I I I I I

in m m n to

CM M CM o CM

in n o m o >—1 in

o 1 o 1 c.. « o 1 o t o o * . o 1

^ 1 1 1 M 1 n I 1-1 t M 1 M 1 li

<n M

n o

o o

o

I—I fw

<0 o

o I

I (-< I

s s

o c5

o CJ

t I I f I !

m cv i—i

m i

o i

1-4 1 1 t-1

CO <p

o o o

o o o

lA u^ J,

C-? c; CM

M l-l 1—1

c" o o*

o

A

C\!

I I I I t I I I I O I I I I I I

t I I

m

in C-J CO

m CM h-1 8 n IC o o

o 1 o 0 1 o 1 9 ? M

1 I KH n 1—1 i i—i

OJ CM <M<f-e\ cvi w

OOH r-tOHHftOO

tc o O w; o o o cc rc

fiHR a o>' a> «4 OPB

M rs M U En h SOON

in

in in

in o OJ C\!

o 9 o t o 1

1 (-1 4 I n 1 1 1-1

*

N cm

m n CJ

CM o o CM o

r-t o a

8 t

o

11

Концентрации (%) солеи металлов, подашшцкз первична?, к рост представителей редко встречашггся родов актин®.ище!

Таблица 3

стцмулдрушдв вторичный :ов

Соединения Характер действия гз-сИциа АсЬхпсгвааига ар. т. 65 К1СГОПОПО вро-га ср. КТ. 1723 КосаГ'И?. яр. £Т. 531

НБ2М0О4 нет роста - Х—0, 1^5 - 1-05

стшулягя в.р. - 0,06-0,03 0,5-0,25 0,25-0,06

Си304 нет роста 0,1-0,05 0,1-0,001 0,1-0,007 0,1-0,025

стимуляция в. р. - 0,0005-0,0002 - 0.., 01-0,005

СаНР04 нет роста - 1-0,125 1-0,05 25

стимуляция в.р. — - 0,03-0,0015 -

нет роста 1-0,5 1-0,007 1-0,03 1-0,125

я С'^-муЛЕЦЕЯ в.р. - - 0,015-0,007 -

РвЯ о4 нет роста 1-С',03 1-0,00? Т-0,25 1-0,5

симуляция в.р. - - - С

МпЯ04 кет роста г 1-0,06 1-0,003 1-0,125

стимуляция в.р. - - 0,125-0,03

РЪ(110з>2 нет роста 1-0,5 1-0,25 1-0,03 1-0,25

стимуляция в.р. - 0,125-0,03

>—I

о

хелеза и пониженное-кадчия.

Аналогичный характер раопредедешш этих ж металлов бил выявлен ДЛЯ клеток P.chrysogemim, C.acremoniuai .

Таблица 4

GopöipiH металлов метками P.bulbigenun var. Masticóla (% от сухой биомассы)

Культуры Zn Cu Мп. ■ Mo

Исходная • 0,007 0,06 0,17 0,07

Вторичная 0,024 0,17 0,3 0,03

При увеличении накопления железа в биомассе, как правило, отмечается уменьшешю поглощения иед'Л, магния п некоторых других ионов. Вероятно, при новниошюм соцоржашш селоза в среде для дополнительного поглощения ионов аелеза imötbi> начинает использовать транспортные канала других ионов (Сеэдова,Максимов, is:;5; IVhite, Gadd I9G9).

При изучении содержания металлов ( Fe, Мп, Си ) в биомассе клеток исходных и вторичных колоний стрептсмицетов ( Я.го-seoílavua var.roseofungini ШТ. 1123 и а

i rooaotlavna

шт.1344) различия были выявлены только в содержании меди у шт. 1344, В биомассе вторичных меток содер:халось в 2 (при культивировании в жидкой среде)~4 (при культивировании на твердой среде) раза больше меди, чем в биомассе клеток исходных колоний.

Разлитая в сорбциотшх способностях клеток исходного и вторичного роста представляют не только научный, по и практически"! интерес: показана возможность увеличения сорбции металлов при вторичном росте микроорганизмов. Предлагается учитывать это при работе с микробными культурами, используемыми для концентрирования и очистки окружающей среды от тяжелых металлов.

4.Сравнительное исследование метаболизма исходных культур и культур из вторичных колоний млцелиальных микроорганизмов.

сраженное влияние солей металлов на вторичный рост микроорганизмов свидетельствует об их активном участии в метаболических процессах, обеспечивающих дарференцлроьку и целение клеток.

Процессы, ответственные за дофферонцкацкю клеток спицкТкчнц. Но оии обеспечивается однотипными метаболическими реакциями, вклю-чэладими образование макроэргнческих соединений, необходим!« ддя ионной регуляции, образования промежуточных продуктов для биосинтеза нуклеиновых кислот, белков, липкие у. углеводов я .др. (Хочач-ка, Соморо, 1Э77; Бродский, Урываева, 1РЯ). В связи с этим исследовались некоторые особенности ме-а-Зол :зма мицелиачьнше микроорганизмов ( ;!,roseoflavua var.roK; ofungini 1128 - из прокариот И F.bulbigonura var.blaRticola - КЗ эукаркот) НрИ наличии В культурах вторичного роста и его кнгибкрованкп. В качестве ингибитора использовался молкбдат натряя, подавляюикй вторичный рост .у всех исследованных грибов.

Результаты определения рН показали (рис.16), что рост р-ьи1-bigenusn var.blasticola на с])еде Ркдер, на которой регулярно возникают вторичные колонии, сопровождается ее заккслонкем ( с 6,8 до 2,8). Это совпадает с началом стационарной фазы у исходной культуры. На среде Чапека, где исходная культура растет без нарушения диф^еренцировот и фордаронания вторичных колоний, концентрация водородных ионов остается на постоянном уровне (рН 6) (рис.1а). Однако нельзя говорить о рН как об единственном индуцирующем факторе, так как при низком его значении и достаточном количестве источника углерода в среде формирование вторичных колоний наблюдается не всегда.

Снижение рН среды культивирования ы процессе роста гриба на среде Рвдер коррелирует с быстрым падением активности днха-нкя с 26-16 нлшей сухих клеток (36-48 часов) до О,Б

цмолвй О^мин мг {72 часа). Затем наступает 'стадия покоя" ( до 120-160 часов культивирования - начало формирования вторичных колоний), когда многие энергетические показатели (интенсивность днхания, уровень адеиялатный энергетический заряд) близки по значению нулю. Через 24-36 часов после появления вторичных колоний, в последних вновь регкетргру ^тся активное (32 имоль/мин/ мг) потребление кислорода, значительно не отличающееся от дкханяя исходных клеток,высокое содержание АТФ и высокое значение аденилатного заряда (рис.2). 3 отлкчие от исходного мицелия интенсивность дыхания клеток из вторг.чних колоний .хотя к падает в 5-6 раз, остается на относительно вноокоы уровне (3-8 {¡колей 02 тя/мг) 350 часов, а содер.-'гпг? УК', жйокое значение йденклаткого заряда держится почти на ;:ос ::наног, уровне.

РисЛ. Изменение рН, интенсивности : поглощения кислорода ,

чувствительности к ингибиторам (КСН , СГЮ и разобщителю дыхания 1КХФ) клеток Р.Ъи1Ыеепит уаг.Ыав^соЫ : а)исходные,среда Чапека; б) исходные, среда Ридер ; в)вторичные, среда Ридер; г)белые, изолированные из л.к., среда Ридер; д; исходные, среда Ридер с Единицы измерения для названных показателей

дан!! в ймолях о /шпу'мг сухого в'эоя

Рис 2. Интенсивность ) поглощения 0-, , содержание АТФ

(--л-л) клеток исходных (1,2)» вторичных (3,4) колоний и изолированных из вторичных колоний (5,6)Р»Ъи1М§епит

Уаг.Маа-ЫсоХа

У культуры, изолированной из белых вторичных колоний, все перечисленные выше энергетические показатели были по значению близки к таковым вторичных колоний (рисЛг, 2).

Было показано, что все исследуемые клетки высоко чувствительны к цианиду-ингибитору основной цитохромной транспортной цеди, действие СГК-ингнбитора альтернативного пути только немного потенцирует действие цианида. Эти результаты показывает, что и в исходных, и во вторичных клетках действуют только цито-хромная электронотранспортная система. Последнее подтверждают и результаты цптохрошого анализа, показавшие высокое содержание цитохромов: аар в, с.

Было показано (рисЛг), что интенсивность дыхания мицелиаль них клеток (клетки исходной культуры и белого варианта, выделенного из вторичной после 40-96 часов культивирования) не изменяется под действием КХФ. Интенсивность дыхания полиморфных клеток (клетки вторичных колоний и белого варианта, выделенного из вторичной культуры посла 96 часов культивирован:^) значительно уси-

лииается при введении разобщителя. Разница в чувствительности мкцелиальных и полиморфных клеток к разобщителю дыхания и окислительного ¿Еоофорилкродания, с одной стороны, может свидетельство вать о несбалансированности процессов образования энергии и ее потребления в процессе роста клеток вторичных колоний. С другой стороны, наличие актишрупцего действия разобщителя мокот указы -кать на различие в составе и проницаемости цхтоплазыатических мембран.

Limo показано, что при добавлении 0,5$ IÍÍ12M0O4 рН среды сохраняется в течении всего периода наблвденая (до 400 часов) на уровне 5-6. Кило установлено, что НагМоО^ обладает высокой буферной емкостью.

Интенсивность дихания клеток F.bulblgeinun var.blanticola и с-е чувствительность к ингибиторам кардинально не изменяется при выращивании культур с молибдатом натрия (рисДд),

Таким образом, проведенные опыты доказали, что изменения, приводящие к ингибировани» вторичного роста или восстановлению дифференцировки, не вызываются качественными изменения"^ основных звеньях дыхательной цепи. Однако была выявлена другая суще -стпенная особенность в метаболизме клеток вторичных культур. У них и варианта, выделенного из вторичных колоний, в отличие от клеток исходного роста, при снижении интенсивности дыхания на протяжении всего периода наблвдений йо изменяется уровень АТФ (рис.2) и аденилатного заряда. Это дает основание предположить существование дополнительных ггутей регенерации адешшовых нук-леотидов через запасные субстраты, полкфосфатц в частности,о гиперсинтезе которых при вторичном росте получены вполне определенные данные (Айтхожина, 1985; Айтхожина, Никитина, 1УЭ1).

Известна (Никитина, ГУ/9 ) значимость Сахаров для индукции вторичного роста, поэтому не исключена вероятность изменения энергетического потенциала клетки за счет реакций гликолиза и ЦТК, о чем может свидетельствовать активность ряда Ферментов углеводного обмен.-].

Бита выявлены супиотвешше различия: клетки ьторичннх колоний отлит-грся от v-. V:■.-.;< исходного роста 4-х кратным снижение« альдолазжи: ша-й.-и v¡ с, иониаешшм содержанием пяру&атккназы, изоцитр/'т - ДР II •!:.! .. • гЫЧА СОДврУЯИИеМ гллнюзо—6—■)осХ«т ДГ к »vía* Д.' ! •"чл.-'.;. . ауль-гати указывают на то, что при кс-

Таблица 5

Активность некоторых ферментов в клетках F^bulbigenum var.blanticola (нмоль/мии/мг бРЛкг.)

Тип клеток, вре;.-л культивирования (час)

- -i—

Ферменты Исхо.щше в.к. субкультуры КЗ в.к.

40 12 0 40 160

Гексокиназа 0,02 0,02 0,02 0,01

Альдолаза 0,9 0,21 0,21 0,43

Пируваткиназа ' 0,92 0,23 0,96 1,05

Глюкоза-б-фос^ат

-дегидрогеназа(ДГ) 0,22 0,69 0,23 0,1

6~фосфоглкконат ДГ 0,24 - 1,2

Изоцктрат ДГ С,15 0,036 0,14 0,13

Малат ДГ 6,4 10,6 10,4 5,9

следуемой аномалии развития в реакциях гликолиза и ЦТК ироисхо-

дят значительные изменения, возможно, меняющие энергетический потенциал клетки.

При изучении интенсивности дыхания ««raoéoflavua var.roeeo-funginl в стационарной фазе показано, что исходная культура поглощает 0,8± 0,1 н/атом 0 на I от сырой биомассы, а вторичная культура - 0,44±0,05 н/агом O/mm/i.O'. Введение в среду измерения протонофорного разобдателя дыхания и окислительного фосфорилирований - КХФ до 10"^ М стимулирует эндогенное дыхание в 2 раза, а введение КСп да 3.10-!эМ в присутствии КХФ т-гибирует дыхание на 50%, что j-ксзывает на то, что в клетках продуцента розеофунгииа веется дканидчувствктельная цитохро- • мокскдаза, а также дыхательный контроль, несмотря на накопление большого количества антибиотиков. Значительной разницы в этих показателях между клетками первичного к вторичного роста нет.

Исследование свойств поверхности клеток проводили, вводя тритий в живые клетки и определяя связывание 3Н-розеофунгина с метками и мембранами. Выявлено существенное связывание антибиотика, причем клетки исходной культуры связывают его больше, чем клетки вторичной культуры (табл.6). Мембраны, ьзятые в аналогичном эксперименте, также сорбируют 3Н-розо-укг1н в-разном количестве.

X?

'íaojiiiiiu о

Сорбция 311-роиеорунгина целыми клетками и мембранными препаратами л.roaooflavua vax-.ropeofungini {% от рал.иак-тивности суспензии),

i летки

Мембраны

Культуры через 15 мин

через 150 мин через 15 мни

Исходная

Бторичная

Иода(коитроль)

С 5 45 О

72 50 Ü

50 31

О

При изучении поверхности мембраны методами инфракрасной спектроскопии било показано, что область валентных колебаний 0=0 группы в пептидной связи ($=1650 см~^) и исходных клетках не меняется при обезжиривании мембран и имеет существенные различия у мембран клеток вторичной культуры, что говорит об измененной конфоршции бзжов клеток вторичных колоний продуцента розеофунгина.

Полученные данные документируй связь вторичного роста исследованных «тцсшшлышх микроорганизмов с особенностями их метаболизма. Эти особенности ибесиочивам действие конкурентного механизма менад дифререкццроакой и иелониш клеток и выражаются как в интенсификации определенных звеньев метаболической цени, так и ослаблении. Нарушения дифференцировал клеток, вероятно, связаны с падением активности ряда ключей]/ ifefiHjjyroB углеводного обмена. Размножение ¡слеток, форшрущнх ьторлчнне w-vrvts, на характерное для нормального >:;изпениого цикла, гкчет осиоьннк<; предполагать наличие дополштелышх воооиноотей для конструктивных процессов, пошшшдихся на поздних стадиям онтои;пеза вопреки общеизвестным концепция;'! об их затухании при cmpomuw Пседидо-вания в атом направлении долхнн бить прсдолг.епи.

а. Псслецовшшо роли пигментов и индукции вторично! о

ООШЯОПаШЮ вторичных !-СЛОНЯЙ ,У P.blliMgenuM vnr.bliisfclcola сопровождается ншсоил'лкпкл в культуре miruviiT« шлшготго цвета (ранее im нмонтифишгро^ашюго), которкР по спитезлду лтд ¡¡¡л; нормальном ¡хнл'ПТ'.ш rpinía. Una вюри'иы: рог/п- п.гоиооп/г/цп иг.

роста у мицнлиялвин/ микрооргашкгоп

мента - розеофунпша, иденфпцированного Л.А.Ветлугиной (1977). При ингабиросатш вторичного роста синтез пигментов подавляется. Это указывает на вероятную связь образования пигментов с нарушениями дифференциации и делешш клетск нсслвдуеюх микроорганизмов. Пошипел* необходимость проведештя опытов с очшценшми препаратами пиментов.

При гдентифпкацин грибного пигмента бшю показано, что он имеет максимума поглощения в УФ ( в этаноле) при 252, 273 и 503,5 нм . Масс-спектр показал следующие интенсивные пики:382 (Мь~С20Н1408),367 ai1" - CH3CI9 HjjOg), 354 (lí*- -СО), 339 (367-CO,CIgf{IJ07), 311 (ЗЗд-СО, CI? Hjj а,). Температура плавления пигмента 320-323°. На основании подученных данных исследованный пигмент бнл идентифицирован как бикаверкн ( соединение хиноново: природа), ранее наделенный из P.oxysporua и F.nonilifonse ( Balan ot al.,I970f3oruforth et al. ,1971; Kjaer et al.,1971). Бикавер'лн описан, как фактор, вызывающий вакуолизацию мицелия, характерную для старещгэс культур.

Тыло наказало, что добавление розеофунгана в испытанных ко центрациях не оказывает выраженного влияния на вторичный рост собственного продуцента, ко заметно подавляет рост исходной ку.г туры. Ешсаверин видимых изменений в исходного н вторичном росте buibigenum var.blasticola не вызывает. Учитывая обилие вакуолей и лапицов в клетка?: вторичных колоний гриба, можно предположить, что бикаверин, как и другие яйгмйнты хиноновой природы (Феофилова, 1974), участвует в детоксикацяи продуктов обмен; и металлов, а также в аккумуляции резервных компонентов на поз; них стадиях онтогенеза.

В U В О Д Ы

I; Показано, что соли металлов могут оказывать избиратель ное стимулирующее и икгибирукздее действие, на вторичный рост ак ТИН0ШЩ9Т0В ( из родов Straptorayces.Streptoverticilllum, Aoti-noamdura, Micromonoepora, ïïocardia ) И грибов ( ИЗ родов Риаг un, Pénicillium, Cephalosporiuiii, Aspergillim, ñchizophillua,

Spydermophyton, Trichothecium) . Действие солей металлов m карлоты более выражено, чем на прокариота.

2. Соли тяжелым металлов (CuX5Q4, РЬ(К0з)2, Hg( 1103)2. ZnS CdClg, ^03)2, (BiO)2C03 ) ч стимулируют вторичный рос у-всех исследованных грибов и актшомщетов ( кроме streptoay

а гци сублетальннх кощеитрадешх «ог^-г óatb Заетором диморфизма грибов. Соля мо,ТдакгаСждею? вгорвлшй рее» и восстанавливают дифферетщрев.ку у храбодн

3. Устдаоздеза разлагай в кедадасмаофйда клеток исходных и вторачшх холодай рздез Fuaarima, Penl-ciliira, r>tr'íptc5^c<sa .Клетки в,тсрилшгх ксдокв! в. 2-3 раза больше поглощав? цеди, цинка, марганца. излибдан а яалезо более интенсивно цогдегрютоя клеткша погодках кулиур y.bvübigemm var. blaatioola » а составляэт 8-10$ аеж» биомассы гриба, устойчивого к шаокта (до 14 г/л), концрнтригдалколибдена в среде.

4. Еадакеш йкхдажчйсквв особенное« измйран клеток вторична* колощгаа«гс,з'заПа№л ta^.rorsofuagltti esJJ28. Меченый тритием розео$?вгаи <$одзг ск&шгаа евдза&ктга с изолированными кембрашЕа и цытя кггзжзш исхздгхаа кд^од», чем с клетками вторичной культура» какашс» кодабаний- группы 0=0 в пептидной сзазя i $ «ЗбЩ-ЗТСРй» но- мезкявшвя при обезжиривании мембран» укатают на разждаа коа^орикзЕ® белков в препаратах из исходной к вторичной культур « •

о.» Б&чзлени особенности эиергз.тачеакого обмена клеток вторичных ксйШЗЙ P.butbigenum var.blasttcala . К 5-7 суткам У исходной жз^угурн отмечено розксо окиязанао интенсивности дыхашя, ypoBW а адештлатного энергетического заряда. У клеток вторичная ко.пегд'й названные показатели поддерживаются на относительно шооад» уровне (дыхание - 5 шлолей О^/отн/мг, АТФ -2,5 нмолей/ мг клеток,, энергетический заряд - 0,56 ) более 350 часов.

6. Проведено сравнительное исследование активности ферментов углеводного обмена (альдолаза, ппруваткиназа, глюкоза - 6-

фосф.;ч1дегадрогеназа . G-фюсфоглюконат-ЦГ, изоцитрат-ДГ, манат-ДГ )в клетках первичного и вторичного роста P.bulbigenua var.bl&stiicola . Наиболее значительные различия выявлены в активности альдолазы, пируваткиназы, тлатдегидрогеназы.

7. Одним из факторов, инцударувдих образование вторичных колоний, является высокая концентрация ионов И*' в сред« (гЛЬЗ). Предполагается, что механизм пнгабипукэдего вторичный рост действия На2МоС>4 у p.bulbigenum var.blaaticola связан с его высокой буферной емкостью и поддержанием рН субстрата на уровне 5-6.

0. Исследован пигмент, образование которого сонрововда^т вторичный рост у p.bulbigenum . По данным УФ и масс-спектромпт-

рии, пигмент идентифицирован как биКаверин (С^Н^Оц). Доказано,

что он,также,как розеофунгин, не имеет значения для индукции

.вторичного роста собственного продуцента.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Избирательное отношение клеток первичного а вторичного роста F.buibigenum var.biaaticola к шшроалементам, содержащимся в среде// Физиология, биохимия и организация микроорганизмов. Тез,докл.УН съезда ШО.-Алма-Ата,1985.-Т.2.-С. 152 (Совместно с Е.Т.Никитиной).

2. Сравнительное исследование различных вариантовR.roseoflavua var.roseofungini '»образующих полаеновый антибиотик розеофунгин // Микробиология.-1988.-T.57.-Ji 4.-С.642-647 ( Совместно с Н.Г.куковой, Т.П. Коротковой, Е.Т.Никитиной, Д.Н.Островским, Т.В.Шейко).

3. Особенности усвоения микроэлементов при наличии вторичного роста в культурах микроорганизмов // Труды Института микробиологи! и вирусологии АН КазССР.-Алма-Атал1988.-Т.ЗЗ.-С.93-Ю1 { Совместно с Б.Т.Никитиной).

4. Влияние солей металлов на вторичный рост мвделаальных микроорганизмов // Регуляция микробного метаоолизма.-Тез.докл.Всес. конференции.-Пущино, 1989.-С.Ш-112 С Совместно с Н.А.Айтхо-ждной, Е.Т.Никитиной).

5. Влияние солей различных металлов на рост первичного мицелия и вторичных колоний F.buibigenum var.blasticola // Труда Института микробиологии и'вирусологии АН КазССР,- Алма- -Ата,

1989.-Т.36.-С.71-73. '

6» Выделение и изучение пигмента,образуемого при аномалии развития F.buibigenum var.biaaticola // ВвСТНИК АН КазССР.-

1990,-Н12.-С.70-73 ( Совместно с Н.А.Айтхожиной, А.Г.Меден-цевым, Е.Т.Никитиной).

7. Активность .ферментов машптольного цикла F.buibigenum var. blasticola при вторичном росте // У конференция биохши-ков Средней Азии и Казахстана.Тез .докл.-Ташкент,1991.-С.388 ( Соместно с Н.А.Айтхожиной, А.Г. Меденцевда, Е.Т.Никитиной).

Й. Comparison of glycolytic enzyraea'activitiea during F.bulbi-gsnura primary and secondary growth // Abntr.15 Int.Congress of-Siochemietry. - Jerusalem, 1ЭЭ1.- Р.Э9 ■ ССовмес-но с Н.А.Айтхожиной, А.Г.Ыеденцевда,, Е.Т,Ну;китйной).

•AI

9. Энергетический обмен белого варианта F.buibigenum var.biаа ticola, изолированного при вторичном росте // Вобйик Ali КазССР,-1991.-Ш.-С.50-о1 ( Совместно с Н.А.Айтхожиной, А.Г.Меденцевил, ЦЛ\Никитиной),

Подписано к печати . II.01.92 г.

Тираж 100, зак.-'i аи2

О

тп-гъата-Но иа. f>oranjn.UHrе. P//Mlf