Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние мебендазола, циклоспорина А и их сочетания на морфо-физиологические и биохимические показатели при экспериментальном трихинеллезе

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние мебендазола, циклоспорина А и их сочетания на морфо-физиологические и биохимические показатели при экспериментальном трихинеллезе"

БЕЛОРУССКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им. С. Н. ВЫШЕЛЕССКОГО

ГГБ ОД ТЗШпт

УДК 616.995.132.6.08-02.615.281

Давыдов Владимир Витольдович

ВЛИЯНИЕ МЕБЕНДАЗОЛА, ЦИКЛОСПОРИНА А И ИХ СОЧЕТАНИЯ

НА МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ

/

ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТРИХИНЕЛЛЕЗЕ

03.00.19 - паразитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск 2000

Работа выполнена на кафедре биологии Минского государственного медицинского института

кандидат медицинских наук, профессор Заяц Р. Г. заслуженный деятель науки Республики Беларусь, доктор медицинских наук, профессор Кухта В. К.

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Мишаева Н. П. доктор медицинских наук, профессор Чистенко Г. Н.

Оппонирующая организация: Институт зоологии НАН

Республики Беларусь

Защита диссертации состоится "21" июня 2000 г. в 14.00 на заседании совета [Д 05. 16. 01] по защите диссертаций при Белорусском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. С. Н. Вышелесского (223020, Минский р-он, п/о Кунцевщина, БелНИИЭВ, т. 508-81-38)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БелНИИЭВ. Автореферат разослан" ^ " 2000г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, доктор ветеринарных наук, профессор

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Красочко П. А.

-Ь 3., 9

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Трихинеллез является природно-очаговым заболеванием и занимает доминирующее положение в структуре биогельминтозов на территории Республики Беларусь, где имеются стационарные природные (А. А. Богуш, 1988) и природно-синактропные (Ю. С. Клейн, А. А. Веденьков, 1992) очаги инвазии, обеспечивающие высокую заболеваемость - 0,72±0,13 на 100 ООО населения (Г. Н. Чистенко, 1994). За период с 1981 по 1998 г. г. (В. П. Филонов и соавт., 1999) в Беларуси было зарегистрировано 102 вспышки трихинеллеза, во время которых заболело 1161 человек.

Медицинская и социальная значимость трихинеллеза обусловлена тяжелым течением заболевания (Н. Н. Озерецковская, 1985) и наносимым им экономическим ущербом (Т. М. Одинцова, 1992).

Большое значение проблема трихинеллеза имеет для ветеринарии и народного хозяйства, так как данное заболевание резко снижает продуктивность сельскохозяйственных животных (В. П. Нелюбин и соавт.,1981).

Создание моделей экспериментального трихинеллеза (О. -Я. Л. Бе-киш и соавт., 1980; 1982) помогает изучать вопросы патогенеза заболевания, разрабатывать и совершенствовать методы его лечения и диагностики.

Для лечения трихинеллеза широко используется мебендазол (О. -Я. Л. Бекиш и соавт., 1979; Н. Н. Озерецковская, 1990; 1994). Паразитоцидный эффект мебендазола связывают с прямым воздействием на трихинелл (Э. В. Переверзева, 1981), а также с действием препарата на иммунную систему (Ю. А. Сакалускайте, 1979). Действие мебендазола часто сопровождается побочными реакциями, связанными с сенсибилизацией антигенами, высвобождающимися из погибших паразитов, и зависящими от фазы инвазии, на которой применялся препарат (Н. Н. Озерецковская, 1990). Присутствие целого ряда побочных эффектов мебендазола - одного из наиболее важных этиотропных антигельминтных средств, которые зачастую опаснее самого заболевания (Н. Н. Озерецковская и соавт., 1978), обусловило необходимость формирования комплексного подхода в лечении трихинеллеза: сочетание антигельминтных и иммуномодулирующих средств (H.H. Озерецковская, В.П. Сергиев, 1994).

В доступной нам литературе есть единичные сообщения об использовании циклоспорина А для лечения трихинеллезной инвазии (F. Bolas-» Fernandes и соавт., 1988; L. М. Boulos и соавт. 1991), в которых было показано наличие антигельминтного действия препарата при трихинеллезе, выражающееся в уменьшении числа взрослых особей в кишечнике, длины тела самок, личиночного индекса и индекса репродуктивной способности.

Наряду с этим остается не изученным целый ряд важных вопросов изменений взаимоотношений з системе «паразит-хозяин», обусловленных влиянием этиотропной и патогенетической терапии трихинеллезной инва-

зии. Не выяснена целесообразность использования иммунодепрессанта циклоспорина А для лечения трихинеллеза, а также эффективность его применения в сочетании с мебендазолом. Не изучено влияние указанной терапии на ряд важных показателей организма хозяина: изменение структуры паразитарного комплекса в мышечной ткани, состояние осморези-стентности мембран, активность такого важного фермента энергообеспечения мышечной ткани, как креатинкиназа, и активность лактатдегидрогеназы - фермента терминальной стадии гликолиза.

Изучение влияния различных вариантов терапии на организм хозяина при экспериментальном трихинеллезе позволит оценить эффективность проводимого лечения и разработать теоретические предпосылки использования полученных данных для лечения трихинеллеза человека.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертация является частью научно-исследовательской работы Минского государственного медицинского института по теме: «Действие иммуносу-прессантов при трихинеллезе», запланированной на 1996-1999 гг. (Гос. per. № 1996262)

Цель исследования: провести сравнительный анализ эффективности различных схем лечения экспериментального трихинеллеза средней степени тяжести мебендазолом и циклоспорином А по данным клинических (проявления инвазии и выживаемость крыс), паразитологических (инвази-рованность мышечной ткани хозяина), физиологических (осморезистент-ность мембран эритроцитов), морфологических (структура паразитарной гранулемы, площадь ядер «питающей клетки» и площадь сечения личинок) и биохимических (активность КК и ЛДГ) показателей организма хозяина для углубления представлений о взаимоотношениях между паразитом и хозяином и патогенезе возникающих при лечении трихинеллеза осложнений.

Задачи исследования:

1. Изучить клинические проявления, выживаемость животных и ин-вазированность мышечной ткани личинками трихинелл как показатели эффективности лечения экспериментального трихинеллеза средней степени тяжести мебендазолом, циклоспорином А и их сочетанием на миграционной и мышечной стадиях инвазии.

2. Оценить влияние мебендазола, циклоспорина А и их сочетания на морфометрические показатели паразитарного комплекса в мышечной ткани при экспериментальном трихинеллезе средней степени тяжести в зависимости от сроков введения препаратов.

3. Исследовать действие изучаемых препаратов на осморезистент-ность эритроцитарных мембран при различных схемах антигельминтной терапии экспериментального трихинеллеза средней степени тяжести.

4. Изучить динамику активности креатинкиназы и лактатдегидроге-

назы в сыворотке крови и различных скелетных мышцах при экспериментальном трихинеллезе средней степени тяжести в зависимости от сроков введения и сочетания антигельминтного препарата мебендазола и иммуно-супрессанта циклоспорина А.

5. Оценить значимость изученных показателей для выяснения компенсаторных возможностей организма хозяина и эффективности различных схем лечения инвазии и углубить представления о взаимоотношениях между паразитом и хозяином при лечении экспериментального трихинеллеза.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования служили образцы диафрагмы, икроножной и четырехглавой мышц, сыворотка крови и эритроциты белых крыс-самцов линии "Wistar", инвазированных личинками Т. spiralis, антигельминтик мебендазол и иммунодепрессант циклоспорин А.

Предметом исследования являлась совокупность клинических, пара-зитологических, физиологических и биохимических показателей организма хозяина при воздействии трихинелл и их метаболитов на фоне специфической и патогенетической терапии.

Гипотеза. Использование иммунодепрессанта циклоспорина А в сочетании с антигельминтиком мебендазолом является эффективным вариантом терапии экспериментального трихинеллеза.

Научная новизна и значимость полученных результатов. Впервые в Республике Беларусь проведено морфометрическое исследование структуры паразитарной гранулемы в мышечной ткани хозяина с использованием компьютерной технологии получения и анализа изображений при экспериментальном трихинеллезе и его лечении.

Изучено влияние не используемого ранее сочетания антигельминти-ка мебендазола и иммунодепрессанта циклоспорина А на течение экспериментального трихинеллеза при их введении на различных стадиях инвазии.

Проведена ранее не используемая комплексная оценка морфо-физиологических и биохимических показателей развития взаимоотношений в системе «паразит-хозяин», формирующихся на фоне этиотропной и патогенетической терапии.

Проведенные исследования динамики активности КК и ЛДГ (молеку-лярно-генетический уровень), изменения структуры «питающей клетки», интенсивности клеточно-воспапительной инфильтрации вокруг паразита и ин-вазированности мышц личинками трихинеллы, осморезистентности мембран эритроцитов (клеточный и тканевой уровень), выживаемость хозяина и интенсивность клинических проявлений инвазии (организменный уровень) позволяют углубить представления об изменениях во взаимоотношении между паразитом и хозяином при лечении экспериментального трихинеллеза.

Комплексная оценка результатов проводимой терапии позволила

сделать выводы об эффективности используемых средств и их сочетаний и дать заключение о целесообразности применения таких схем лечения.

Практическая значимость полученных результатов определяется эффективностью использования циклоспорина А в сочетании с мебендазо-лом для лечения экспериментального трихинеллеза, что позволяет рассматривать возможность клинической апробации разработанной схемы лечения.

Предложена методика использования системы компьютерной обработки и анализа изображений "Вюзсап - N1 2,0", разработанной лабораторией морфологических методов ЦНИЛ МГМИ, для морфометрического исследования паразитарного комплекса личинок трихинелл в мышцах.

Данные диссертационной работы используются в преподавании раздела "Паразитология" на кафедрах биологии Минского и Гомельского медицинских институтов и Гродненского медицинского университета, кафедре паразитологии Витебской академии ветеринарной медицины и раздела "Паразитарные болезни" на кафедрах инфекционных болезней и эпидемиологии Минского государственного медицинского института.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Изменение осморезистентности мембран эритроцитов отражает интенсивность мембраноповреждающего действия метаболитов и продуктов распада трихинеллы и позволяет оценить состояние компенсаторных возможностей организма хозяина при действии трихинеллоцидных препаратов мебендазола и циклоспорина А.

2. Скелетные мышцы (диафрагма, четырехглавая и икроножная) по-разному реагируют на лечение трихинеллезной инвазии, что обусловлено различной пораженностью и неодинаковым соотношением в них красных и белых мышечных волокон.

3. Изменения площади «питающей клетки» и клеточно-воспалительной инфильтрации в структуре гранулемы, площади ядер инкапсулированной саркоплазмы и площади сечения личинки паразита свидетельствуют об эффективности трихинеллоцидного действия мебендазола и циклоспорина А и их сочетания и позволяют оценить возможность адаптации паразита в условиях проводимого лечения.

4. Комплексное лечение экспериментального трихинеллеза мебен-дазолом и циклоспорином А приводит к положительной динамике активности креатинкиназы и лактатдегидрогеназы в мышечной ткани и сыворотке крови хозяина, что свидетельствует о снижении патогенного действия продуктов распада паразита и уменьшении интенсивности дистрофических процессов в организме хозяина.

5. Циклоспорин А обладает умеренным трихинеллоцидным действием, нарушая процесс формирования "питающей клетки" личинки паразита, способствует формированию адекватного иммунного ответа хозяина на

продукты распада паразита вследствие иммуносупрессивного действия.

6. Сочетанное действие циклоспорина А и мебендазола на стадии инкапсулирующихся личинок является высокоэффективным вариантом лечения экспериментального трихинеллеза, сопровождающимся практически полной дегельминтизацией организма хозяина, преобладанием репаратив-ных процессов, нормализацией энергообеспечения мышечной ткани и увеличением компенсаторных возможностей организма хозяина.

Личный вклад соискателя. Соискателем разработана методика морфометрического исследования паразитарной гранулемы в мышцах, выполнена экспериментальная часть, проведена статистическая и графическая обработка полученных результатов с использованием электронных таблиц. Научным руководителем и консультантом была предложена тема диссертации и ее методическое решение.

Апробация результатов диссертации. Результаты исследований доложены на 111 конгрессе ассоциации морфологов (АГЭ) (Тверь, 1996), седьмой научной конференции по трихинеллезу человека и животных (Москва, 1996), республиканской научной конференции молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной медицины» (Минск, 1997), конференции «Современная паразитология: проблемы и перспективы» (Витебск, 1999), учредительной конференции ассоциации паразитоценологов СНГ (Витебск, 1999), научных сессиях Минского государственного медицинского института (1999, 2000), VIII зоологической научной конференции «Структурно-функциональное состояние биологического разнообразия животного мира Беларуси» (Минск, 2000).

Опубликованность результатов. По материалам исследований опубликовано 5 статей (из них 2 в журналах и 3 в сборниках и материалах конференций), 7 тезисов докладов. Материалы диссертации опубликованы на 32 страницах печатного текста.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 128 страницах машинописного текста, иллюстрированы 40 рисунками и содержат 25 таблиц в приложениях.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Библиографический указатель содержит 98 работ на русском и 131 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальная часть работы выполнена на 672-х белых крысах самцах линии Wistar средней массой 200 грамм, которые были разделены

на 3 серии.

В первой серии изучали влияние мебендазола на течение инвазии экспериментальных животных в зависимости от срока введения препарата при трихинеллезе средней степени тяжести, который моделировали перо-ральным введением личинок Trichinella spiralis лабораторного штамма 45-60-суточного возраста, в течение 25 лет пассированного на белых крысах сотрудниками кафедры биологии Минского медицинского института, в дозе 20 личинок на грамм массы тела животного (О. -Я. Л. Бекиш и соавт., 1982). Опытных животных лечили пероральным введением суспензии мебендазола в дозе 50 мг/кг массы тела животных 1 раз в сутки, полученного путем измельчения таблеток "Вермокс" производства Гедеон Рихтер, Будапешт, Венгрия.

Во второй серии изучали воздействие циклоспорина А на течение трихинеллезной инвазии при лечении в различные сроки. Циклоспорин А вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг массы тела животных 1 раз в сутки, используя препарат "Sandimun ®" производства Sandoz Pharma Ltd., Швейцария.

В третьей серии эксперимента изучали комплексное влияние мебендазола и циклоспорина А на течение экспериментального трихинеллеза средней степени тяжести при лечении на стадии мигрирующих и инкапсулирующихся личинок. Лечение проводили одновременным введением двух препаратов: пероральным введением суспензии мебендазола в дозе 50 мг/кг массы тела животных 1 раз в сутки и внутрибрюшинным введением циклоспорина А в дозе 50 мг/кг массы тела животных 1 раз в сутки.

Животные каждой серии были разделены на четыре группы.

В первой группе, состоящей из 84 животных (две подгруппы по 42 крысы), изучали влияние препаратов при их введении на 7-10-е сутки инвазии (стадия мигрирующих личинок). Крысы 1-й подгруппы, инвазированные личинками Т. spiralis, - опытные животные. Незараженные крысы 11-й подгруппы являлись контролем к 1-й, и получали препарат в такой же дозе и в такие же сроки, как и животные 1-й подгруппы (контроль препарата). Животных умерщвляли декапитацией на 14-е, 21-е, 30-е, 45-е, 60-е и 90-е сутки инвазии.

Во второй группе, состоящей из 56 крыс (две подгруппы по 28 животных), изучали влияние препаратов при лечении ивазированных крыс на 25-28-е сутки после заражения Т. spiralis (стадия инкапсулирующихся личинок). У крыс 1-й подгруппы моделировали экспериментальный трихинеллез средней степени тяжести. Незараженные крысы 11-й подгруппы являлись контролем к 1-й и получали препарат в такой же дозе и в такие же сроки, как и животные 1-й подгруппы (контроль препарата). Забой животных производили на 30-е, 45-е, 60-е и 90-е сутки после заражения.

Животные третьей группы (42 крысы) - зараженные трихинеллами,

служили контролем к 1-й и 11-й группам. Им вместо препарата вводили соответствующий объем физиологического раствора. Забой производили на 14-е, 21-е, 30-е, 45-е, 60-е и 90-е сутки инвазии.

Крысы четвертой группы (42 крысы) не были заражены трихинеллами и не получали лечения (интактный контроль). Забой производили на 14-е, 21-е, 30-е, 45-е, 60-е и 90-е сутки инвазии.

Все животные содержались в одинаковых условиях экспериментально-биологической клиники МГМИ и получали стандартный рацион. В процессе проведения эксперимента проводили ежедневные наблюдения за внешними проявлениями инвазии у зараженных крыс (отек глаз, кровянистые выделения из носа, диарея, ломкость и взъерошенность шерсти, затруднение передвижения).

Контрольные и опытные группы составляли по 7 крыс на каждый срок инвазии. Цельную кровь использовали для получения эритроцитарной массы и сыворотки. Эритроциты использовали для определения осморези-стентности клеточных мембран экспериментальных животных. В сыворотке крови определяли активность лактатдегидрогеназы и креатинкиназы.

После вскрытия животных отсепаровывапи диафрагму, икроножную и бедренную мышцы и отмывали их от крови физиологическим раствором. Образцы мышечной ткани помещали в 10 % нейтральный формалин для последующих морфологических исследований, а также готовили навески тканей для гомогенизации и определения их инвазированности. В надмито-хондриальных супернатантах гомогенатов мышечной ткани определяли активность лактатдегидрогеназы и креатинкиназы.

Инвазированность мышечной ткани определяли по стандартной методике переваривания мышц в искусственном желудочном соке (О.-Я. Л. Бе-киш и соавт., 1982). Исследовано 294 образца мышечной ткани.

Определение осморезистентности эритроцитарных мембран проводили по методу В. Н. Колмакова и соавт. (1982), в модификации В. С. Камышникова и соавт. (1985). Проведено 4704 исследования.

Определение содержания общего белка проводили колориметрическим методом по Лоури (1951).

Определение активности креатинкиназы проводили кинетическим спектрофотометрическим методом Oliver-Rosalki (1967) в модификации G. Szacz и соавт. (1976) на автоматическом фотометре Cormay Plus с использованием стандартных наборов Cormay CK (Польша).

Определение активности лактатдегидрогеназы проводили на автоматическом фотометре Cormay Plus ("Cormay" Польша) с использованием диагностических наборов Cormay LDH. Метод основан на регистрации убыли НАДН при его окислении в ходе прямой лактатдегидрогеназной реакции (Д. Вилкинсон, 1981). Проведено 8064 биохимических исследований.

Морфометрические исследования проводили при помощи компьютерной системы "Вюэсап - N1 2,0", разработанной лабораторией морфологических методов исследований ЦНИЛ МГМИ. Использовали метод контурных измерений и кластерное сжатие цветов. Измеряли:

• контур клеточно-воспалительной инфильтрации;

• контур капсулы, окружающей участок видоизмененной саркоплазмы и личинку трихинеллы;

• контур личинки;

• контур ядер внутрикапсулярной саркоплазмы;

• контур поперечного сечения личинки (рис. 1).

Рис. 1. Схема обведения контуров паразитарного комплекса личинки

Trichinella spiralis в мышечной ткани.

В процессе морфологических исследований изучено 588 препаратов, которые были изготовлены группой световой микроскопии лаборатории морфологических методов исследований ЦНИЛ МГМИ, получено 700 изображений, обведено около 5600 компонентов гранулемы.

РАЗВИТИЕ ИНВАЗИИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ТЕРАПИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТРИХИНЕЛЛЕЗА ЦИКЛОСПОРИНОМ А И МЕБЕНДАЗОЛОМ

В ходе проведенных исследований установлено, что лечение трихинеллеза циклоспорином А вне зависимости от сроков введения препарата значительно снижает клинические проявления болезни. На 30-е сутки эксперимента кровянистые выделения из носа наблюдались только у 12, 2%

животных, отек глаз у 5,6%, диарея у 5,3%. Уменьшение массы тела, взъе-рошенность и ломкость шерсти не наблюдались. К концу эксперимента выживаемость составляла не менее 95 %.

Однотипные изменения клинической картины наблюдались при со-четанном введении мебендазола и циклоспорина А на стадии инкапсулирующихся личинок. Выживаемость составила 93%.

Наиболее тяжелое течение инвазии сохранялось при лечении мебен-дазолом на стадии инкапсулирующихся личинок. Типичные симптомы инвазии наблюдались у большинства животных, что обусловило высокую летальность. Выживаемость составила 55%.

Введение мебендазола на стадии мигрирующих личинок снижало интенсивность инвазии (рис. 2) в диафрагме до 14,8%, в икроножной и четырехглавой мышцах - соответственно 7,1% и 7,6% от показателей нелеченных животных (р<0,001).

Лечение мебендазолом на стадии инкапсулирующихся личинок снижало интенсивность инвазии в диафрагме до 19,6%, в икроножной до 10,9% и в четырехглавой мышце до 11,7% от значений контрольной группы (р<0,001).

Влияние циклоспорина А на стадии мигрирующих личинок было менее выражено. Инвазированность диафрагмы снижалась до 56,1%, икроножной и четырехглавой мышц до 12,6% и 21,4% при сравнении с группой контроля (р<0,001).

Рис. 2. Интенсивность мышечной инвазии при различных вариантах лечения экспериментального трихинеллеза мебендазолом и циклоспорином А.

При введении циклоспорина А на стадии инкапсулирующихся личинок интенсивность инвазии в диафрагме снижалась до 30,4%, в икроножной мышце - до 17,0%, а в четырехглавой - 18,8% по сравнению с нелечен-

ными животными (р<0,001).

Установлено, что наибольшим трихинеллоцидным эффектом обладает мебендазол в сочетании с циклоспорином А вне зависимости от сроков введения. Остаточное количество личинок трихинелл в диафрагме, икроножной и четырехглавой мышцах составляло соответственно 2,6%, 2,5%, и 2,2% от показателя контрольных животных (р<0,001).

ВЛИЯНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

ТРИХИНЕЛЛЕЗА НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ОЧАГА В МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ХОЗЯИНА

Лечение мебендазолом вне зависимости от срока введения приводило к существенным нарушениям взаимоотношений между паразитом и хозяином. Вокруг личиночно-саркоплазменного комплекса возникала массированная клеточно-воспапительная инфильтрация, относительная площадь которой достигала на 45-е сутки инвазии в диафрагме 65,9% (р<0,001). Доля площади инкапсулированной саркоплазмы ("питающей клетки") в структуре паразитарной гранулемы в этот период значительно уменьшалась (до 19%) (р<0,001). Изменение структуры гранулемы коррелировало с уменьшением площади ядер инкапсулированной саркоплазмы и площади поперечного сечения личинки паразита.

Изменения морфометрических показателей патологического очага при лечении циклоспорином А не зависят от сроков введения препарата. Доля площади клеточно-воспалительного инфильтрата увеличивалась (максимально в четырехглавой мышце на 30-е сутки инвазии - до 30,8% (р<0,01) от размеров всего паразитарного комплекса). Относительная площадь "питающей клетки" уменьшалась, и была в четырехглавой мышце на 60-е сутки инвазии на 32% меньше значений контроля (р<0,001). Эти изменения сопровождались уменьшением размера ядер инкапсулированной саркоплазмы, особенно при введении препарата на стадии инкапсулирующихся личинок.

Необходимо отметить особую реакцию икроножной мышцы на циклоспорин А. Относительная площадь трансформированной саркоплазмы в ней увеличивалась, превышая на 90-е сутки показатель контроля на 19% (р<0,001). При этом введение препарата на стадии инкапсулирующихся личинок приводило к увеличению площади ядер инкапсулированной саркоплазмы на 45-е сутки до 135% (р<0,01), а введение циклоспорина А на стадии мигрирующих личинок увеличивало площадь поперечного сечения личинки до 140% на 45-е сутки (р<0,001).

Комплексное влияние мебендазола и циклоспорина А на стадии мигрирующих личинок оказывало такое же действие, как и один мебендазол. Действие препаратов на стадии инкапсулирующихся личинок приводило к

умеренной доле клеточно-воспалительной инфильтрации в структуре паразитарной гранулемы, однако эта реакция была менее выражена, чем при введении только одного мебендазола (рис. 3). В то же время доля площади "питающей клетки" была меньше, чем в гранулеме, не подверженной влиянию препаратов.

Таким образом, совместное введение препаратов наиболее эффективно, что подтверждается уменьшением площади ядер инкапсулированной саркоплазмы и площади сечения личинки паразита, особенно на 30-45-е сутки.

Лечение мебендазолом Лечение мебендазолом и циклоспорином А

Рис. 3. Структура паразитарной гранулемы в диафрагме при лечении экспериментального трихинеллеза на стадии инкапсулирующихся личинок.

ОСМОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТРИХИНЕЛЛЕЗА МЕБЕНДАЗОЛОМ, ЦИКЛОСПОРИНОМ А И ИХ СОЧЕТАННОМ ДЕЙСТВИИ

При изучении осмотической резистентности мембран эритроцитов (ОМЭ) установлено, что введение мебендазола на миграционной стадии инвазии (рис. 4) приводило к снижению показателя на 14-е сутки инвазии на 23% при действии низких концентраций мочевины (р<0,05) и дальнейшему его увеличению на 45-е сутки на 40% при действии средних концентраций повреждающего фактора по сравнению с показателем группы нелеченного трихинеллеза (р<0,05). Введение циклоспорина А на этой же стадии инвазии сопровождалось увеличением ос-морезистентности мембран эритроцитов для мочевины средних концентраций на 14-е сутки инвазии на 34% (р<0,001).

Циклоспорин А в сочетании с мебендазолом повышали устойчивость мембран эритроцитов на 21-е сутки на 42% только к низким концентрациям мебраноповреждающего фактора (р<0,001).

Введение мебендазола на стадии инкапсулирующихся личинок снижало ОМЭ к действию низких доз мочевины на 45-60-е сутки инвазии на 17-25% по

сравнению с группой нелеченного трихинеллеза (р<0,05).

20 10

Разведения мочевины (М)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Разведения мочевины (М)

Рис. 4. Кривые гемолиза эритроцитов белых крыс при лечения экспериментального трихинеллеза на стадии мигрирующих личинок (в % к полному гемолизу). А - 14-е сутки

инвазии, Б -21-е сутки инвазии.--чистый трихинеллез,..........-интактный контроль.

~тк— - мебендазол,--циклоспоринА,- - мебендазол + циклоспорин А.

Введение циклоспорина А на этой же стадии инвазии приводило к увельме-нию ОМЭ к действию низких доз мочевины на 45-е сутки инвазии на 28% по сравнению с группой нелеченного трихинеллеза (р<0,001). Комплексная терапия циклоспорином А и мебендазолом приводила к значительному увеличению ОМЭ на 30-е сутки до 66% по сравнению с группой интактного контроля и нормализации показателя на 45-90-е сутки инвазии (р<0,01).

ВЛИЯНИЕ МЕБЕНДАЗОЛА, ЦИКЛОСПОРИНА А И ИХ СОЧЕТАННОГО ДЕЙСТВИЯ НА АКТИВНОСТЬ КРЕАТИНКИНАЗЫ И ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ КРЫС, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ИНВАЗИРОВАННЫХ Т. SPIRALIS

Установлено, что введение мебендазола на стадии мигрирующих личинок приводило к уменьшению активности КК и ЛДГ в диафрагме до 40% и 22% соответственно от показателя у незараженных крыс (р<0,05). Активность ферментов в сыворотке крови резко возрастала (166% для КК и 173% для ДЦГ по сравнению с группой нелеченного трихинеллеза (р<0,001)).

Активность ферментов в различных мышцах при введении мебенда-

зола на стадии инкапсулирующихся личинок имела тенденцию к росту на 30-е сутки эксперимента и к снижению на 60-90-е сутки инвазии (р<0,001) (до 34% от показателя интактного контроля для КК в икроножной мышце, до 28% для ЛДГ в диафрагме). Активность ферментов в сыворотке крови увеличивалась и достигала на 45-е сутки для КК 166% (р<0,01), а для ЛДГ 179% по отношению к интактным животным (р<0,001).

Динамика активности КК и ЛДГ при лечении циклоспорином А имела сходную реакцию с показателями группы нелеченного трихинеллеза. Введение препарата на стадии мигрирующих личинок приводило к преимущественному уменьшению активности КК и увеличению активности ЛДГ в мышечной ткани хозяина. Действие циклоспорина А на мышечной стадии инвазии сопровождалось выраженным уменьшением активности КК и ЛДГ в мышечной ткани во все сроки инвазии, достигающем в диафрагме 40% и 42% соответственно от значений интактных животных (р<0,05) и в сыворотке крови на поздних стадиях, а также значительным увеличением активности ферментов в сыворотке крови сразу после введения препарата до 133% и 145% соответственно (р<0,05).

Сочетанное введение мебендазола и циклоспорина А на стадии мигрирующих личинок приводило к увеличению активности КК и ЛДГ в мышечной ткани на 45-60-е сутки (в диафрагме до 267% и 240% соответственно (р<0,001)). Необходимо отметить особую реакцию икроножной мышцы, заключающуюся в достоверном уменьшении активности ЛДГ (за исключением 45-х суток), что, вероятно, связано с увеличением функциональной активности регенерирующих пораженных красных мышечных волокон, для которых характерен аэробный путь метаболизма, и некоторым угнетением физиологической активности непораженных (белых) волокон с анаэробным путем энергообеспечения.

Активность КК и ЛДГ в сыворотке крови при сочетанном действии препаратов на миграционной стадии инвазии уменьшалась на 14-30-е сутки до 28% и 57% соответственно (р<0,001). Активность ЛДГ увеличивалась на 4560-е сутки до 199% (р<0,001) по сравнению с группой интактного контроля.

Динамика активности ферментов в сыворотке крови при комплексном лечении на стадии инкапсулирующихся личинок (рис. 5) имела противоположную тенденцию: на 30-е сутки наблюдался рост, а в более поздние сроки (4590-е сутки эксперимента) - уменьшение активности, что, возможно, является результатом преобладания репаративных процессов в изучаемых группах мышц после проведенного лечения (активность ферментов в мышцах уменьшалась на 30-45-е сутки инвазии и приближалась к контрольным величинам на 60-90-е сутки).

Таким образом, наиболее эффективным вариантом лечения из всех изученных нами схем является комплексная терапия трихинеллеза мебен-

дазолом в сочетании с циклоспорином А на стадии инкапсулирующихся личинок. Об этом свидетельствует высокоэффективная дегельминтизация, отсутствие резких физиологических нарушений, увеличение функционально-адаптационных возможностей организма хозяина в процессе проводимого лечения.

Диафрагма Икроножная Четырехглавая Сыворотка

Рис. 5. Активность КК и ЛДГ в мышечной ткани и сыворотке крови при соче-танном действии мебендазола и циклоспорина А на стадии инкапсулирующихся личинок.

Комплексная терапия экспериментального трихинеллеза мебенда-золом и циклоспорином А сочетает в себе выраженное антипаразитарное действие и иммуномодулирующий эффект. Совместное влияние препаратов характеризуется кумулятивным трихинеяпоцидным действием. Циклоспорин А является ингибитором фактора транскрипции (Копо Т. и соавт., 1995), необходимого для дифференцировки клеток, и вследствие этого в "питающей клетке" нарушается синтез веществ, необходимых для формирования коллагеновой капсулы вокруг личинок трихинелл. Это позволяет мебендазолу легко проникать внутрь капсулы и эффективно влиять на жизнедеятельность паразита.

ВЫВОДЫ:

1. Морфометрические показатели патологического очага (относительная площадь "питающей клетки" и абсолютное значение площади ядер этого участка саркоплазмы) достоверно отражают состояние взаимоотношений в системе "паразит-хозяин" при трихинеллезе и могут использоваться для оценки эффективности трихинеллоцидного действия антигельминт-ных препаратов [1, 5, 8].

2. Икроножная мышца имеет особый тип реакции на проводимое ле-

чение экспериментального трихинеллеза мебендазолом и циклоспорином А, что обусловлено более низкой пораженностью ее личинками паразита вследствие более высокого содержания белых мышечных волокон [4, 5, 12].

3. Активность креатинкиназы и лактатдегидрогеназы в скелетных мышцах и сыворотке крови, а также осморезистентность мембран эритроцитов являются достоверными критериями для оценки эффективности различных вариантов лечения экспериментального трихинеллеза антигель-минтиком мебендазолом и иммунодепрессантом циклоспорином А [2, 3, 4, 6, 7, 9,10, 11].

4. Антигельминтик мебендазол обладает выраженным трихинеллоцид-ным действием, проявляющимся в значительном уменьшении инвазирован-ности мышечной ткани. Однако действие мебендазола сопровождается тяжелыми клиническими проявлениями, приводит к высокой смертности инвазиро-ванных животных, усилением воспалительной инфильтрации мышечной ткани и глубоким нарушениям процессов энергообеспечения мышц хозяина, особенно при его применении на стадии инкапсулирующихся личинок [2, 3, 4, 5, 11, 12].

5. Циклоспорин А оказывает двойственное действие: нарушает процесс формирования "питающей клетки" личинки паразита и способствует формированию адекватного иммунного ответа хозяина на продукты деструкции паразита, предупреждая развитие осложнений, возникающих при лечении трихинеллеза [2, 3, 4, 5,11,12].

6. Наиболее эффективной из изученных нами схем лечения экспериментального трихинеллеза средней степени тяжести является сочетан-ное введение мебендазола и циклоспорина А на стадии инкапсулирующихся личинок, что подтверждается более легким течением инвазии, низкой инвазированностью мышечной ткани, уменьшением площади "питающей клетки" паразитарной гранулемы, нормализацией осморезистентности мембран эритроцитов и активности креатинкиназы и лактатдегидрогеназы в мышечной ткани и сыворотке крови [2, 3, 4, 5, 11, 12].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бутвиловский В. Э., Давыдов В. В., Жигунова И. И., Заяц Р. Г. Морфометрические изменения ядер мышечной ткани белых крыс при экспериментальном трихинеллезе II Здравоохранение - 1998. - № 9. - С.19-23.

2. Давыдов В. В. Проницаемость эритроцитарных мембран при лечении экспериментального трихинеллеза // Труды молодых ученых. Минск, МГМИ, 1998-С. 244-248.

3. Давыдов В. В., Заяц Р. Г., Бутвиловский В. Э. Активность креатинкиназы в диафрагме и сыворотке крови при лечении экспериментального

трихинеллеза мебендазолом и циклоспорином А //Труды научной конференции, посвященной 65-летию кафедры медицинской биологии и общей генетики ВГМУ «Современная паразитология: проблемы и перспективы» -Витебск: ВГМУ, 1999 - с 63-70.

4. Давыдов В. В. Активность лакгатдегидрогеназы в диафрагме и сыворотке крови при лечении экспериментального трихинеллеза мебендазолом и циклоспорином А //Труды молодых ученых. Минск, МГМИ, 1998 - С. 244-248.

5. Давыдов В. В. Изучение личиночно-саркоплазменного комплекса исчерченной мышцы при лечении экспериментального трихинеллеза мебендазолом и циклоспорином А II Здравоохранение. - 2000. - № 5. - С. 15-17.

6. Бутвиловский В. Э., Давыдов В. В. Изменение активности креа-тинфосфокиназы в сыворотке крови и мышечной ткани при экспериментальном трихинеллезе // Актуальные вопросы медицины. Тез. докл. конф. -Витебск, 1994.-с. 5.

7. Бутвиловский В. Э., Давыдов В. В. Динамика проницаемости эрит-роцитарных мембран при экспериментальном трихинеллезе различной степени тяжести // Актуальные вопросы биологии и медицины. Тез. докл. конф. -Минск, 1996.-с. 44-45.

8. Бутвиловский В.Э., Давыдов В.В. Кариометрические показатели изменений диафрагмы в динамике экспериментального трихинеллеза II III Ко пресс Международной Ассоциации морфологов. Морфология -1996. - № 2. -с. 39.

9. Бутвиловский В. Э., Давыдов В. В. Проницаемость эритроцитар-ных мембран белых крыс при экспериментальном трихинеллезе // Материалы докл. седьмой науч. конф. по трихинеллезу человека и животных. -Москва, 1996. - С. 17-19.

10. Бутвиловский В. Э., Давыдов В. В. Активность креатинкиназы в мышечной ткани при экспериментальном трихинеллезе средней степени тяжести // Актуальные вопросы современной медицины. Тез. докл. Республиканской науч. конф. молодых ученых и студентов. - Минск, МГМИ, 1997. - С. 14-16.

11. Бутвиловский В. Э., Давыдов В. В. Влияние антигельминтной терапии на активность креатинкиназы при экспериментальном трихинеллезе II Структурно-функциональное состояние биологического разнообразия животного мира Беларуси: Тез. докл. VIII зоол. научн. конф. Минск. «Право и экономика», 1999. - С. 370-372.

12. Давыдов В. В., Заяц Р. Г., Бутвиловский В. Э. Антигельминтное действие циклоспорина А и мебендазола при экспериментальном трихинеллезе // Материалы учредительной конференции ассоциации паразито-ценологов СНГ. - Витебск, ВГАВМ, 1999. -С. 23-24.

РЕЗЮМЕ

Давыдов Владимир Витольдович

ВЛИЯНИЕ МЕБЕНДАЗОЛА, ЦИКЛОСПОРИНА А И ИХ СОЧЕТАНИЯ НА МОРФО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТРИХИНЕЛЛЕЗЕ

Ключевые слова: трихинеллез, мебендазол, циклоспорин А, мышечная ткань, паразитарная гранулема, осморезистентность мембран эритроцитов, креатинкиназа, лактатдеплдрогеназа.

Объекты исследования: образцы диафрагмы, икроножной и четырехглавой мышц, сыворотка крови и эритроциты белых крыс-самцов линии "Wistar", инвазированных личинками Trichinella spiralis, антигельминтик мебендазол и иммунодепрессант циклоспорин А. Цель исследования: провести сравнительный анализ различных схем лечения экспериментального трихинеллеза мебендазолом и циклоспорином А по данным клинических, паразитологических, физиологических, морфологических и биохимических показателей организма хозяина, в зависимости от сроков введения и сочетания препаратов. Методы исследования и аппаратура: морфометриче-ские исследования проводились при помощи компьютерной системы "Bioscan - NT 2,0", биохимические - на автоматическом моноканальном фотометре "Cormay Plus" и спектрофотометре СФ- 46. Научная новизна исследования: с использованием компьютерной технологии проведено мор-фометрическое исследование структуры паразитарной гранулемы при экспериментальном трихинеллезе и его лечении. Изучено влияние не используемого ранее сочетания мебендазола и циклоспорина А на течение экспериментального трихинеллеза. Полученные результаты. Морфометриче-ские показатели патологического очага достоверно отражают состояние взаимоотношений в системе "паразит-хозяин" при трихинеллезе и могут использоваться для оценки эффективности трихинеллоцидного действия ан-тигельминтных препаратов. Активность креатинкиназы и лакгатдегидроге-назы в скелетных мышцах и сыворотке крови, а также осморезистентность мембран эритроцитов - достоверные критерии оценки эффективности различных вариантов лечения экспериментального трихинеллеза антигель-минтиком мебендазолом и иммунодепрессантом циклоспорином А. Наиболее эффективной из изученных нами схем лечения экспериментального трихинеллеза является сочетанное введение мебендазола и циклоспорина А на стадии инкапсулирующихся личинок, что подтверждается более легким течением инвазии, низкой инвазированностьга мышечной ткани, уменьшением площади "питающей клетки" паразитарной гранулемы, нормализацией осморезистентности мембран эритроцитов и активности креатинкиназы и лактатдегидрогеназы в мышечной ткани и сыворотке крови. Полученные результаты используются в преподавании разделов «Паразитология» и «Паразитарные болезни» в медицинских институтах Республики Беларусь.

18

РЭЗЮМЕ

Давыдау Уладзшр В1тольдав1ч

УПЛЫУ МЕБЕНДАЗОЛУ, ЦЫКЛАСПАРЫНУ A IIX СПАЛУЧЭННЯ НА

МОРФА-Ф131ЯЛАГ1ЧНЫЯ I Б1ЯХ1М1ЧНЫЯ ПАКАЗЧЫК1 ПРЫ ЭКСПЕРЫМЕНТАЛЬНЫМ ТРЫХ1НЕЛЕЗЕ

Ключавыя словы: трыхжелез, мебендазол, цыкласпарын А, мышачная тканка, параз1тарная гранулема, осмарэзютэнтнасць мембран эрытрацытау, крэацжюназа, лактатдэпдрагеназа.

Аб'екты даследавання: узоры дыяфрагмы, ¡краножнай i чатырох-галоукавай мышцау, сываратка крыв1 i эрытрацыты белых пацукоу-самцуоу лши "Wistar", ¡нваз1раваных л1чынкам! Trichinella spiralis, антыгельм1нтык мебендазол i ¡мунадэпрэсат цыкласпарын А. Мэта даследавання: правесц1 параунальны анал1з розных схем лячэння зксперыментальнага трыхшэлезу мебендазолам i цыкласпарынам А па даным клш!чных, параз1тапапчных, фгаялапчных, марфалапчных i 61ях1м1чных паказчыкау арган1зма гаспадара, у запежнасц1 ад тэрмшау увядзення i спалучэння прэларатау. Метады даследавання i апаратура: морфаметрычныя даследаваны праводзтюя пры дапамозе камп'ютэрнай астэмы "Bioscan — NT 2,0", б1ях1м1чныя - на аутаматычнам монаканальным фатометры "Cormay Plus" i спектрафато-метры СФ-46. Навуковая навЬна даследавання: з выкарастаннем камп'ютэрнай тэхналогн праведзена марфаметрычнае даследаванне структуры параз1тарнай гранулемы пры эксперыментальным трыхжелезе i яго лячэнш. Вывучаны уплыу спалучэння мебендазолу i цыкласпарыну А, якое раней не выкарыстоувалася, на цячэнне зксперыментальнага трыхжэлезу. Атрыманыя рэзультаты. Марфалапчныя паказчык1 паталапчнага ачага дакладна адлюстроуваюць стан узаемаадноанау у сютэме "параз1т-гаспа-дар" пры трыхжэлезе i могуць выкарыстоувацца для ацэню эфектыунасц! трых1нэлацыднага дзеяння антыгельмжтных прэпаратау. Актыунасць крэатынкжазы i лактатдэпдрагеназы у скелетных мышцах i сываратцы крыв1, а таксама осмарэзютэнтнасць мембран эрытрацытау - дакладныя крытэрьн ацэню эфектыунасц/ розных варыянтау лячэння зксперыментальнага трыхшэлезу антыгельмштыкам мебендазолам i ¡мунадэпрэсантам цыкласпарынам А. НаЮольш эфектыунай з вывучаных нам1 схем лячэння з'яуляецца спалучальнае увядзенне мебендазолу i цыкласпарыну А на стадьм жкапсуляцьн га'чынак, што пацвярджаецца больш легюм цячэннем ¡нвазм, н1зкай ¡нваз1раванасцю мышачнай тканю, памяншэннем плошчы "жывячай клети" паразтарнай гранулемы, нармал1зацыяй осмарэзи стэнтнасц1 мембран эрытрацытау i актыунасц1 крэацжкжазы i лактатдэпдрагеназы у мышачнай тканцы i сываратцы крыв!. Атрыманыя рэзультаты выкарыстоуваюцца у выкладанш разделау "Параз1талопя" i "Параз1тарныя хваробы" у медыцынсюх ¡нстытутах Рэспублт Беларусь.

19

SUMMARY

Vladimir V. Davydov MEBENDAZOLE, CYCLOSPORINE A AND THEIR COMBINATION INFLUENCE ON MORPHO-PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL DATA IN EXPERIMENTAL TRICHINOSIS

Key words: trichinosis, mebendazole, cyclosporine A, muscular tissue, parasitic granuloma, erythrocytes, membranes osmoresistance, creatine kinase, lactate dehydrogenase.

Objects of the study: specimen of the diaphragm, calf and quadriceps muscles, blood serum and erythrocytes of white male rats of "Wistar" line, invaded by Trichinella spirals larvae, anthelmintic mebendazole and immunodepressant cyclosporine A.Objective of the study: to carry on comparative analysis of different treatment plans of experimental trichinosis with mebendazole and cyclosporine A according to clinical, parasitologic, physiologic, morphologic and biochemical data of the host body, depending on the dates of introduction and combination of prepara-tions.Methods of the study and equipment: morphometric studies were carried on with the use of "Bioscan-NT 2,0" computer system, biochemical studies were carried on by automatic monoclonal photometer "Cormay Plus" and spectrophotometer CF-46.Sclentific novelty of the study: Using computer technology we have carried on morphometric studies of parasitic granuloma and its treatment. We have studied the effect of non-used before combination of mebendazole and cyclosporine A on the course of experimental trichinosis.Obtained results:Morphometric data of pathologic locus show for certain the state of "parasite-host" relationship in trichinosis and may be used for evaluation of trichinellicide effect of anthelmintic preparations. Creatin kinase and lactate dehydrogenase activity in skeletal muscles and blood serum as well as erythrocytes membranes osmoresistance are reliable criteria in effectiveness evaluation of different treatment plans of experimental trichinosis with anthelmintic mebendazole and immunosupressant cyclosporine A. The most effective of the studied treatment plans of experimental trichinosis is a combined introduction of mebendazole and cyclosporine A in the stage of encapsulation larvae which is proved by a milder invasion course, low invasiveness of muscular tissue, parasitic granuloma "nurse-cell" area diminution, normalization of erythrocytes membranes osmoresistance and activity of creatin kinase and lactate dehydrogenase in muscle tissue and blood serum. Obtained results are used in teaching units "Parasitology" and "Parasitic Diseases" in medical institutes of Republic of Belarus.