Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние локуса чувствительности к экдистерону (esc) на функцию фертильности самок у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние локуса чувствительности к экдистерону (esc) на функцию фертильности самок у Drosophila melanogaster"

РГБ ОД

1 5 fP

На правах рукописи УДК 575.1: 595. Ш 4

Мазина Ольга Мансуровна

ВЛИЯНИЕ ЛОКУСА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ЭЩСТЕЮНУ (ees) НА ФУНКЦИЮ ФЕРТИЛЬНОСГИ САМОК У Drosophila melanogaster.

Генетика - 03. 00. 15.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1996

Работа выполнена в Институте СО РАН, г.Новосибирск

цитологии и генетики

Научный руководитель:

Официальное оппоненты:

Ведущее учереадени:

доктор биологических наук Е. С. Беляева

Институт цитологии и генетики 00 РАН, г.Новосибирск

доктор биологических наук Каракин Е. И.

Институт цитологии и генетики 00 РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Митрофанов В. Г. Институт биологии развития РАН, г. Москва

Санкт-Петербургский государственный университет г. Санкт-Петербург

Защита состоится

■ //

"V

йэтац

У

1996 Г.

заседании

на_

диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученое степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики 00 РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, Ю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики 00 РАН

Автореферат разослан

" 3~" /г & Л ¿у Л

1996

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д.Груздев

генов начнется одним и:» центральных вопросов в гавременной биологии. Без ответа на этот вопрос невозможно решить проблему дифферениировки тканей. Несмотря на гигантский потпхгг., который был сделан в понимании Э1их щюцесгов за последние десятилетия. изучение регуляции активности генов продолжает оставаться актуальней задачей.

Во многих г.чучаяя транскрипция специфичных генов эукариот ¡*»гу тируется гормонами, в том числе стероидными гормонами, пало показано, что стероидные гормоны очень важны для правильного развития позвоночных и их физиологии, поэтому гормональная регуляция на молекулярном, тканевом и организменном уровне стала фокусим как биологических, так и медицинских исследований.

Стероидные гормоны - экдистероиды играют большую роль в метаморфозе насекомых, а также они нужны для правильного развития и функционирования их репродуктивной системы. Drosophila melanogaster в период метаморфоза является хорошей моделью для детального изучения механизмов ткане-специфичной регуляции транскрипции генов под действием стероидного гормона экдистерона. а также для изучения таких фундаментальных процессов как рост и дифференцировка тканей и зап1Х)граммироланная клеточная смерть. В период метаморфоза, то есть превышения личинки в чуху, под действием гормона щх-детерминированные зачатки взрослых тканей (имагинальные диски) дифференцируются и растут, превращаясь во взрослые органы, а личиночные ткани полностью разрушаются В основе этих ткане-специфичных изменений лежит ткане-специфичный транскрипционный каскад, индуцируемый экдистероном. В начале пол действием гормона активируется набор факторов транскрипции ("ранние" гены;, которые, в свою очередь, активируют большое число ткане-специфичных "поздних" генов. Считается, что дифференциальная активность "поздних" генов отвечает за метаморфоз органов. Молекулярный механизм, который позволяет одному и тому же гормональному сигналу добиваться ткане-специфичного ответа, пока не полностью понят. Направленный поиск мутаций в области раннего экдистерон-индуцируемого пуфа 2ВЗ-5 привёл к открытию в 1980 году локуга ecs (ecdysterone sensitivity), который является типичным ранним геном и

играет ключевую роль в каскаде экдисгероновой регуляции развития (Belyaeva et al., 1980). Мутации в этом локуое приюдят к потере чувствительности клеток к экдистерону: регулируемые им гены не отвечают на гормон, хотя концентрация зкдистерона у мутантов не отличается от нормы. Нарушение правильного гормонального ответа вызывает остановку развития на разных стадиях метаморфоза и последующую гибель мутантов (Beiyaeva et al., 1980, 1981). Комплементационный анализ по признаку жизнеспособности выявил сложную генетичеосую организацию ecs локуса — четыре группы комплементации, перекрываемые серией частично или полностью некомллементирующих аллелей (Айзензон и др, 1980).

Позднее локус ecs, переименованный в Broad-Complex, стал предметом исследований во многих лабораториях мира. Ген ecs был клонирован, он оказался очень большим — около 115 тпо (Chao, Guild, 1986; Belyaeva et al., 1987). Изучение локуса ecs на молекулярном уровне выявило его сложную организацию. Он содержит 10 экзонов и кодирует более 12 факторов транскрипции, необходимых для своевременного и полного ответа на гормон как других "ранних", так и большого числа "поздних" экдисгерон-зависимых генов (diBello et al., 1991).

После получения мутаций по ecs локусу вое усилия исследователей были направлены на изучение влияния этих мутаций на транскрипционную активность генов в разных тканях. Влияние ecs локуса на функцию фертильносги самок не изучалось, хотя было известно, что эта функция также регулируется экдистероном. В ходе генетической работы в лаборатории молекулярной цитогенетики было замечено, что некоторые аллели и комбинации аллелей по локусу ecs вызывают стерильность самок. Однако ситуация осложнялась тем, что стерильность возникала и под действием мутации T(1;3)sta, не относящейся к локусу ecs на основании критерия жизнеспособности, и расположенной, возможно, за его пределама Кроме того, в цитологическом интервале локализации ecs был картирован ген минорного структурного белка хориона s70 (Yannoni, Petri, 1984; Peterson, Petri, 1986), повреждения которого также могли вызывать стерильность.

В связи со воем вышесказанным основной мелью настоящей работы было выяснение функциональной значимости локуса ecs в развитии репродуктивной

системы самок. Для решения этого вопроса необходимо было выполнить следующие конкретные эксперимент le

1. Метотом комплеглентационногъ анализа выявить комбинации мутаций в районе 2ВЗ-5, вызывающие стерильность самок.

2. Провес, ги точную шггогагетическук) локализацию хорионового гена S70 с лочошко электрофор'ггтссхот варианта по по^зижкосш белка s70.

3. Выясните свя:ина ли стерильность. вызываемая мутациями в локусе ecj, с нарушениями синтеза хорионового белк-ч а70.

4-. Определить уровень синтеза желточных белков у стерильных самок. 5. Методом межлинейной трансплантации гонад выявить фокус действия мутаций сгершй)!ьх.ти, т. о. ьылонить, какие ткани дефектны — оима гич«.кие или генеративный

Научная новизна. Впервые показано, что продукт локуса ees, ключевого гена метаморфоза дрозофилы, необходим для нормальной фертильности самок. Локализация на молекулярной карте ees повреждений, влияющих на жизнеспособность и фертильноегь, позволила сделать заключение о наличии в области гена ees, как минимум, двух участков, необходимых для фертильности: один в самой лисгалыюй части (цис.-дгйсгвуюмий алемеы Í, которая не важна ун: выживания, другой — внутри жизненно ¡их.-кл"! части ."хул. Слернлыкхль мутонгных самок ¿ошикает рслсмтгййп труангид oí кладки яиц, что происходит из-л дефектом в а .'.магических ткннях, л иг гегуративны*.

Усшктлсаю» что хориоиошй ген' S7Q r-c им<\~,т oiwuew«« к изучаемому феномену стсрилшости, г. к. он каштцкизч за пределами локализации гена ees.

развише, дифферекциропку и функциоиир-ж.ние ¡.е^юдуктивной (.истечы. Клонирование большою числа генов рецепторов стероидных гормонов у широкого набора видов выявило большую консервативность их ДНК- и гормон-связывающих доменов (Laudet et al., 1992). Исследование молекулярных механизмов гормональной рефляции показало, что они Солее универсальны, чем это представлялось ранее. Изучение таких генов, как ees, которые вовлечены в гормональную регуляцию дифферени|Х>вки и функционирования половой системы дрозофилы, поможет найти аналогичные -гены у человека и решить

Половые стероидные гормоны человека регулируют

практические медицинские проблемы, связанные с лечением его гормональных болезней. Полученные результаты позволяют вести целенаправленный поиск регуляторкого ткане-специфичного элемента в локуое еса

по дрозофиле в Одессе (сентябрь 1988г.); на Критской конференции по молекулярной генетике дрозофилы (Греция, 1990, 1994, 1996 г.); на 21-ом рабочем совещании по экдизону в Чехии (июнь - июль 1994 г.). Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 5 статьях и получены автором самостоятельна Трансплантация гонад проводилась совместно с С Е. Корочкиной, за что автор выражает ей признательность. Объём и структура лиогертяпии- Диссертация изложена на 107 страницах, содержит 1 таблицу, 22 рисунка, список литературы из 154 наименований. Работа содержит следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы.

(Belyaeva et al., 1980, 1982, 1987) и справочнике (Linsley, Zimrrí, 1992). Кпмплвмвнташонний анализ проводили по стандартной схеме при 25°С. Стерильными считали самок, которые не давали потомства, частично фертильными — самок, численность потомства которых была снижена на 75% по сравнению с контролем. Электрофорез белкой в денатурирующем ПААГ проводили, как описано в статье Laemmli (1970). Транш пянтаиию гоналм проводили по методу, описанному в статье Kambysellis (1968). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Комплементапионный анализ мутаций покуса ees по признаку ферггильности.

Карта комплементации мутаций локусов sta и ees, использованных в работе, приведена на рис L Она составлена по признаку жизнеспособности, и на ней показана аллелъность перестроек с соответствующими группами мутаций. Всего в анализе на стерильность самок использовали 47 аллелей локусов sta и ees. Из всех теоретически возможных сочетаний этих аллелей 643 комбинации доживают до стадии имаго. Все они были проанализированы на стерильность.

Результаты работы докладывались на Всесоюзном совещании

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

использованные в работе, описаны подробно в сообщениях

Df(1)sta

DfmSt490

t435_

t324

l( 1 )d.norm.-1¡

npr-1

П£Г-2

A T( 1 ;3)sta Df(1 )JTA1

РНППН

T(V,3UTA3

Df (1 )pn7b

1(1 >32/ 10B

Hw'

49c

.T(t;g)br"

bra br

tt 3 Ip3* 11 0 t252

It36 t4 t76 p1 4"

Ip41 * 1143 t197 p69*

Ip87 * l( 1 )d.norm. -24 1149 p5'

Ip94* It 35 t99

Ip99* 1р1 57* .ln(1)brlt103 It336 1132 t358

Ip62* It366 t376

It476 Ip13*

sta

b r

rbp l(1)PP1

Рис. I. Карта комплементации мутаций, и перестроек локусов ees и sta : в прямоугольнике расположены гипоморфные мутации, снижающие жизнеспособность только в гетерозиготах с делениями и длинными иекомплементирующими мутациями. Локализация br и rbp относительно лруг друга условна. Звёздочками отмечены мутации, полученные в системе Р-М гибридного дисгенеза, тёмными треугольниками — перестройки. Толстыми линиями обозначены мутации и перестройки, влияющие на фертильность самок.

Выявлено 47 комбинаций аллелей с нарушенной фертильностью. I! 35 сочетаниях проявлялась полная стерильность, при ттом наблюдалось отсутствие кладки яиц. В остальных 12 случаях самки были частично фертильные. Как стерильные, так и частично фертильные самки .имели сильно раздутые брюшки.

наполненные большим количеством неотложенных яиц, не обнаруживающих каких-либо видимых дефектов. На рис. 2 приведены результаты комплементационного анализа фертильносги для всех аллелей, нарушающих эту функцию (данные для остальных мутаций, которые ни в одном сочетании не снижали фертильность, на этом графике отсутствуют).

Рис 2 Сочетания мутаций локусов ees и sta, вызывающие стерильность самок. 1- летальность, 2- стерильность, 3- фертильность, 4- частичная фертильность.

С помощью комплементационного теста выявлено 13 мутаций локуса ees, влияющих на функцию фертильносги самок. Семь мутаций — перестройки, пять из которых генетически проявляются как аллели фуппы br, а две другие — как полностью некомплементарные аллели ees. Остальные шесть мутаций не обнаруживают цитологически видимых перестроек и генетически ведут себя как полностью или частично некомплементарные аллели ees. Все жизнеспособные комбинации между указанными 13 мутациями обнаруживают

нарушение фертильносги самок. Стерильными оказываются также вое полностью жизнеспособные компаунды, содержащие любую из этих мутащш и перестройки Df(1)sta, T(1;3)sta, Df(1)St490, локализованные ранее дисгальнее лок><л ees, поскольку они не взаимодействуют с мутациями ees по признаку жизнеспособности. Остальные легальные аллели sta, не имеющие видимых хромосомных полреждений. в («терозиготах с любой мутацией локуса ees фертильносги не нарушают. Нормальная фертилыюегь была также и у гетерозигот, сочетавших аллели ees и sta (в том числе Df(1)sta и Df(1)St490) с Df(1)St472, ограничивающей локус ees справа. Локализация перестроек на физической карте района 2ВЗ-5 бьга определена ранее и приведена на рис. Я.

Анализ раглоложения гювреждений, нарушающих функцию фертильносги, показывает, что она связана с протяжённой последовательностью ДНК, которая слева выходит за границы последовательности локуса ees, влияющей на функцию жизнеспособности за счёт нарушения чувствительности к экдистерону. Возникает вопрос, связана ли выявленная нами функция фертильносги самок только с локуоом ees, или же она определяется двумя соседними локусами ees и sta?

Фенотип sta (утолщенные основания арист, укороченные щетинки на теле, стерильность гомозиготных самок) ассоциирован г. T(1;3)sta (Lindsley, Zimm, 1992), перемещающей участок 1Е1-4 - 283-4 п ри'юи 89D21-C4 третьей хромосомы, и вызван разрывом в 2ВЗ-4 (Aizenzon, Belyaeva, 1982). Вся другие мутации, аллельные T(1;3)sta, являются легальными. Одна из них (It3) картирована на генетической карте слева от ees на расгоянии 0,021 морганиды (Aizenzon, Belyaeva, 1982). Положение летальных мутаций локуса sta на молекулярной карте неизвестна Самки, гетерозиготные по T(1;3)sta и летальным мутациям sta жизнеспособны. Они имеют мутантный фенотип sta, но являются фертильными. Это свидетельствует о том, что локус sta не имеет отношения к выявленной функции фертильносги. Возникает вопрос, почему T(1;3)sta и Df(1)sta нарушают фертильность? Ранее мы считали, что проксимальный конец T(1;3)sta определяет положение локуса, поскольку именно этот разрыв приводит к фенотипу sta Однако мутантное прояаление всех без исключения аллелей sta, в том числе и Df(1)sta, полностью перекрыто Dp(1)yJYSz280, дистальный конец которой локализован на молекулярной

""ПI 11 I

P167

R 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 T[]n

Ь ' —J_I_|_|-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1—

В

1 23456789 10

■ тя шва mm an m m

BRcore Z1 24 72 23

ma ln(1)brIHM ■ T(t;3)JTA3

D

mm T(1 ;2)br» ^ <~ш Df(l)S39

Df(1)St469 Df(1)JTM ylp3,lp13

YbP«

■ ln(1)Hw**° ■» ln(1)br"~ ■ T(1;3)JTA3

- m T(1;3)sta <^Df(1)pn7bT Ip3

Д 4____■ИТ(1;2)ЬГ' Df(l)Pl54

^ и Df(1)sta, Df(1)St490

< вв Df(1)JTAl T de12

Рис. 3. Молекулярная карта ees гена. А — расположение регуляторных элементов, предсказанных на основе анализа всех молекулярнотенетических и цитологических данных; I — элемент, контролирующий транскрипцию ees гена и формирование 2ВЗ-5 пуфа в слюнных железах дрозофилы; II — элемент, необходимый для жизнеспособности и нормальной морфологии мух (Belyaeva et al., 1987); III — атемент, контролирующий функцию фертильносги самок (по данным настоящей работы), Р120, Р165, Р167 — старты транскрипции (diBello et al., 1991); Б — физическая карта в тго (Chao, Guild, 1986; Belyaeva et al., 1987); В — расположение экзонов, BRcore — бой экзои, входящий в состав всех транскриптов, Z1-Z4 — цинковые пальцы (diBello et al., 1991); Г — локализация повреждений, нарушающих функцию жизнеспособности (Belyaeva et al., 1987; Sampedro et al., 1989; Protopopov et al., 1991; Соловьёва, 1992); Д — локализация повреждений, нарушающих функцию фертильносги самок (по данным настоящей работы): локализация del 2 мутации (по Huang, Огг, 1992). Незаштрихованные области в Df(1)P154. соответствуют границам точности картирования.

карте на 4-10 тин левее проксимального конца T(1;3)sta (Protopopov et al., 1991). Таким образом, последовательность гена sta, южная для выживания и нормальной морфологии, ограничена позицией дисгального разрыва Dp(1)y2YSz280. Недавно ген sta был клонирован и локализован на 50 тпо левее точки разрыва T(1;3)sta (Melnick et al., 1993). Следовательно, область важная для фертилыюсти (амок и, повреждаемая T(1;3)sta, Df(1)sta, Df(1)St490, принадлежит локусу ees, а не sta Эгот вывод подкрепляется и тем фактом, что ни один из летальных аллелей sta не даёт снижения фертильности в гхзтершиготах с теми мутациями ees, которые вызывают стерильность в гстерозиготах cT(1;3)sta и Df(1)St490.

Нарушение фертильности мутациями в районе 2ВЗ-5 могли быть связаны с повреждением гена хорионового белка s70, который был картирован в том же цитологическом интервале, что и ген ees (Yannonl, Petri, 1984; Peterson, Petri, 1986). Для проверки этого предположения было необходима 1) уточнить локализацию гена S70 относительно ees; 2) проверить влияние перестроек и мутаций локуса ees на синтез хорионового белка s70. Картирование гена. K4jji<j)yÄ!iiera ^^KOHOJiijiLGt-„iuK.._3ZCI

Американские исследователи локализовали хорионовый ген S70 в районе 2ВЗ-6 (рис. 4) м(ггодо\1 лекционного картирования с помощью "шектрофоретического варианта по подвижности в линии Staket (Yannoni, Petri, 1984; Peterson, Petri, 1986). Суть ггого метода заключается в том. что элекцюфоретически исследуется синтез хорионового белка в гетерозиготах между делецией, удаляющей часть исследуемого района, и линией Staket Если делеция удаляет хорионовый ген, то на электрофореграмме видна воего одна полоса вариантного белка, в противном случае видно две полосы, соответствующие стандартному и вариантному типам белка.

Мы имели более широкий набор делений района 1Е1-2 —2В11-12 и поэтому смогли более точно картировать хорионовый ген S70. В таблице 1 приведены результаты алияния различных делений на синтез белка s70. Ike эти делеции нарушают функцию фертильности самок в локусе ees. но только делеция Р-154 не удаляет S70 ген. Хорионовый ген удаляется Df(1)sta, следовательно, он расположен в районе 1Е1-2 — 2В3-4 (рис. 4L Чтобы сузить

1Е1-2 3-Д F 2AV23-4 B1-2 3-4

7-8 9-Ю 1112

InlUHw»*

DHDA94,

Of(1)RA13 □

Df(1)sta,Df(1)SW90,Df(1)pn7b, Df (1)JTA1

ln(1)brlt'03, T(1;2)br¿ Т(1;3)ЛДЭ T(1;3)sta

Рис. 4. Локализация концов хромосомных перестроек на цитологической карте района 1Е1-2 — 2ВЗ-4 Х-хромогомы. Незаиприхованные области соответвтвуют границам точности картирования. В районе 2ВЗ-5 точками обозначена зона остаточного пуфинта (Ве!уаеуа е{ а!., 1987).

интервал картирования, мы проанализировали делению Df(1)At127 (1Е1-2 — 2А1-2). Оказалось, что она не удаляет хорионовый ген. Это позволило нам локализовать хорионовый ген S70 в районе 2А1-2 — 2ВЗ-4, т. е. за пределами локуса ees. Чтобы подтвердить этот вывод, мы проверили влияние инверсий и транслокаций по локусу ees, нарушающих функцию фертильности самок, на синтез хорионового белка s70.

фергильногго самок. на гинтга хприпнппого ffanca S70.

Гомозиготные самки noT(1;3)sta и In(1)Hw49c жизнеспособны, стерильны, синтезируют стандартный тип хорионового белка (табл. 11 Гомозиготы по другим перестройкам нежизнеспособны, поэтому мы их последовали в гетерозиштах с линией Staket Ни одна из перестроек не влияла на синтез хорионового белка. Точки разрывов воех этих перестроек могли бы нарушать его «кчлреогию за счёт изменения взаимного расположения гена и его ние1*туляти|*ш\ областей. Однако мы не обнаружили такого нарушения. Не

Таблица L Влияние делений, перестроек и точкой« мутаций, нарушающих

функцию фертилыюсги самок и районе локуса ees, на синтез Белка s70.

Генотип самок Цитологическая локализации повреждения Синтез хорионового белка стандартный/вариантный

Oregon RJOregon R контроль + + /-

Staket/Staket контполь -/ + +

Oregon R/Staket контроль + / +

Df(1)JTÄ1/Staket Df(T)S33 ..... 1D-E; 2В5 -1 +

1Е1-2; 2В5-6

Df(1)sta 1Е1-2; 2ВЗ-4 -/ +

Df(1 )St490 1Е1-2; 2ВЗ-4 -/ +

Df(1)pn7b 1Е1-2; 2В4-5 -/ +

Df(1)P154 2ВЗ-5 + /+ .

Df(1)At127 1Е1-2; 2А1-2 + / +

T(1;3)sta/T(1;3)sia 1Е1-2 -2ВЗ-4; 8SB21-C4 + + / -

!n(1)Hw^/ln(1)Hw4äc W; 2ВЗ-4 + + /.

HnHw^/Staket 1В; 2ВЗ-4 •«■ i *■

T(1:2)br7Stnket 1А-2ВЗ-5. 2SD5-6 + / +

ln(i;br,10Vstaket 2ВЗ-4; ЗС1 + / +

T(1;3)JTA3/Staket 2В5; 61F3-4 + / +

npr-1 /Staket + [ +

npr-2/Staket + / +

t324/Staket + / +

l(1)d.norm.-1a/Staket + / +

Ip3/Staket + / +

t143/Staket

Обозначены отсутствие (-), синтез ¡ он дози (+). синтез 2 \ лоз (+ +) белка s70.

оказывают влияния на синтез хорионового белка и точковые мутаци по локусу ees, вшивающие стерильность самок (табл. 11

Полученные результаты показывают, что мутации и перестройки, нарушающие функцию фертильности самок в локусе ees, не влияют на экспрессию хорионового гена. Следовательно, причина стерильности кроется не в повреждении хорионового гена, а в повреждении самого гена ees. Локализация функции фертильногги на физической карте SCS локуса.

Можно ли связать функцию фертильности самок с какими-либо определёнными участками ees? Один такой участок расположен в правой части ees. Df(1)P154 и T(1;3)JTA3 (рис. 3), нарушающие чувствительность к экдистсрону и жизнеспособность, нарушают также фертильноегь. Другая зона, необходимая для нормальной фертильности, лежит в левой части ees, так как все перестройки, затрагивающие эту зону локуса, также влияют на фертильность. Однако, кажется вполне вероятным, что для фертильности важен только небольшой район в зоне локализации разрыва T(1;3)sta или дистальнее нега Вое исследованные перестройки левой части ees либо удаляют этот район, либо нарушают его цис-положение по отгошению к остальной последовательности ees. Возможно, что этот циоалемент является ткане-специфичным промотором ees, функционирующим только в гениталыюм диске в период формирования половой системы самки. Таким образом, выявляются, как минимум, две зоны, целостность которых необходима для фертильности самок,— в левой и правой частях локуса ees. Не исключено, однако, что для этой функции южны и другие зоны ees, не обнаруженные нами из-за ограниченного числа, локализованных на молекулярной карте повреждений.

Для выяснения природы стерильности мутантных no ees локусу самок мы исследовали функциональную полноценность гонад стерильных самок методом трансплантации гонад.

В первой серии экспериментов в качестве донора использовали личинок III возраста стерильных гетерозиготных самок с генотипом yl(1)npr-1w/y+ln(1)Hv/*w. Взрослые самки с таким генотипом частично жизнеспособны, но имеют ряд морфологических нарушений, характерных для ees локуса

12

(фенотип br и rbp). В качестве реципиента использовали личинок III возраста

стерильных гетерозиготных самок, несущих доминантную м>ташда стерильности самок Fs(1)K1237v24 на Х-хромосоме. Гетерозиготные самки ++/Fs(1)K1237v24 имеют атрофи|хтанный яичник, в котором оогенез блокирован до стадии вителлогенеза, и яйца никогда не формируются.

Было осуществлено +7 трансплантаций. Выжило и развилось до стадии имаго 20 мух. Дало потомство И мух. Результаты вскрытия выживших мух-{¡еципиентов показали, что у 11 мух, которые дали потомство, гопала донора развилась нормально и приросла к протоку, заместив гонаду реципиента. Легальные 9 мух имели нормальнее разиггас яшпихоз дсплрп, "о о"" свободно плавали в брюшной полости, чем и была обусловлена их стерильность.

Во второй серии экспериментов в качестве донора использовали личинок самок с генотипом yl(1)npr-1w/ln(1)br"103. Самки с таким генотипом имеют более серьёзные нарушения ees локуса, поэтому они развиваются до стадии формирования пупарнума и погибают. По этой причине они не могли быть проверены на фертилыюсть. Поскольку и аллель 1(1)прг-1, и аллель нарушают функцию фертилыюсти, то, теоретически, их сочетание должно приводить к стерильности самок. Используя личинок этих гетерозигот, мы могли проверить функциональную полноценность гонад самок с летальными нарушениями по ees локусу. В качестве [«епипиента использовали личинок ++/Fs(1)K1237v24.

Было осуществлено <12 трансплантации. Выжило и развилось ю стадии имаю 14 мух. Дало потомство 4 мухи. У этих четы[)ёх мух гонада донора развилась нормально и приросла к протоку, заместив гонаду реципиента. У остальных 10 мух гонада донора либо отсутствовала (7 сачок), либо развилась нормально, но присоединения яичника к протокам реципиента не произошло (3 самки), и они остались стерильными. Это обычное явление в экспериментах по трансплантации, обусловленное конкуренцией за проток гонады донора с гонадой реципиента (Ксцючкина, Савватеепа, 1985).

Всех развившихся до стадии имаго самок отбирали виргинными и скрещивали с самцами дикой линии Кантон С Генетический анализ подтвердил, что потомство оперированных мух имело генотип донора и

развилось только из гонады донора, как и должно быть вследствие полной стерильности реципиента.

Результаты показали функциональную полноценность гонад стерильных по ees локусу мутантов. Значит, стерильность самок возникает из-за дефекта соматических, а не стволовых клеток. Можно думать, что стерильность обусловлена нарушением чувствительности к экдистерону соматических клеток, участвующих в формировании репродуктивной системы самок.

Желточные белки синтезируются жировым телом и фолликулярными клетками яичника самок дрозофилы. Экдистерон регулирует синтез желточных белков жировым телом, ь то время как синтез в фолликулярных клетках не является экдистерон-зависимым (Bownes, 1989). Недопродукция желточных белков приводит к стерильности самок (Komitopopoulou et al., 1983). Мы предположили, что нарушение регуляции синтеза желточных белков экдистероном в жировом теле самок, мутантных по ees, может быть одной из причин стерильности. Чтобы проверить эту гипотезу, мы последовали накопление желточных белков в гемолимфе и ооцитах у диких и стерильных самок с генотипом lri(1)Hw4a=/ln(1)Hw'l8c и T(1;3)sta/T(1;3)sta. Было показано, что количество желточных белков и в гемолимфе, и в ооцотах сгерилшых самок не отличается от нормы в контрольном, образце Следовательно, мутации стерильности проявляются в других соматических тканях.

откладки .яиц

Чтобы убедиться в том, что яйца стерильных мух не только полноценны, но и нормально оплодотворяются в половых путях самки, был поставлен дополнительный эксперимент. 250 половозрелых стерильных по ees локусу самок с генотипом ln(1)br,103/ln(1)Hw48c и 250 фергильных FM6,yswsc8dm/Y самцов 2-3 дня держали вместе в большой банке с кормом, а затем переносили в специальный иилиндр, в основании которого помещали чашку Петри с агаром на виноградном соке для сбора яиц. Мы наблюдали мух, которые медленно передвигались под тяжестью брюшек, набитых большим количеством яиц. В редких случаях происходила "утечка" яиц. Так за сутки удалось собрать 16 яиц, из которых вылупилось 13 личинок, остальные 3 яйца были оплодотворены,

ко погибли по неизвестным причинам. Результата показали, что стерильность

глчок ы,¡звана тем, что они не могут откладывать лица.

Американские исследователи, изучавшие причины стерильности у самок, гамозшотных по InfliMw^ (одному m аллелей ec.s), также сделали щшод о тг>ч. что мутация Inf^Hw490 вызывает уникальный тип стерильности, связанный г. нарушенном откладки яид и возникающий из-за дисфункции общет яйцевода п сбдасги его соелинрния с маткой (Holzworth et ai., 1974а, 1974b).

Таким ображч, мы пришли к яшоду, чго егчриййксп- 'амок. обусловленная муташшми по локусу ees, вызвана неспособностью откладывать "Г:цг\ я что ^кус "ригтгрич -лих мутации находится а сеглатпчсс-пг. тгмвгч. Наиболее вероятным кажется предположение, что одной из гакил тканей являются имагинальные генитальные диски. Дифференцировка имагинальных дисков находится под контролем экдистерона и нарушена у мутантов по локусу ees. Кз генитального диска формируется вся система полобых протоков самки Нарушение этого процесса у мутантов приводит к дефекту в области соединения общего яйцевода с маткой, что делает невозможным откладку яиц ■л яцллегсд причиной стерильности сачок.

ВЫВОДЫ.

S. Ппервме уа*нпктч, чю продукт лохуса ees необходим дли 'аномального Функционировании ¡^продуктивной системы самок D. rnelanogasíer. Вывод основан на следующих результатах:

а) выявлено 13 мутаций локуса ees, нарушающие функцию фертильности самок;

б) стерильность самок у ряда мулатов ко локусу ees не связана с нарушением экспрессии гена хориоиовош Г,елка s70. т. к. этот ген картирован за пределами локуса ees в районе 2А1-2 — 2ВЗ-4.

2. С помощью метода трансплантации гонад показано, что стерильность самок, мутантных по лек>су ees, возникает вследствие дефектов соматических, а не генеративных тканей.

3. Стерильность мутантных самок возникает в результате нарушения откладки полноценных яиц, которое вызывается, по-видимому. дефектами в развитии

гениталыюго имагинального диска из-за потери чувствительности его клеток к экдистерону.

4. Стерильные самки, мутантные по ees локусу, имеют нормальный уровень синтеза желточных белкоа

5. На основании данных о локализации на молекулярной карте повреждений, влияющих на жизнеспособность и фертильность, предполагается, что имеется, как минимум, две последовательности в локусе ees, необходимые для фертильности самок цисэлемент в самой дисгальной зоне локуса, которая не важна для выживания, и последовательность внутри жизненно важной части локуса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1 Мазина О. М, Беляева Е. С, Графодатская В. Е, Жимулёв И. Ф. Влияние локуса ees Drosophila melanogaster на фертильность самок // Генетика. 1990. т. 26. С 1038-1045.

2 Мазина О. М^ Дубровский Э. Б. О связи функции фертильности самок локуса ees с геном минорного хорионового белка s70 Drosophila melanogaster //Генетика. 1990. т. 26. С 2156-2165.

3. Мазина О. М, Корочкина С Е. Исследование природы стерильности самок у мутантов по локусу ees, контролирующему чувствительность к экдистерону у Drosophila melanogaster// Генетика. 199L т. 27. С 19201927.

4. Mazina О. М., Belyaeva Е. S„ Zhimulev I. F. Cytogenetic analysis of the 2B1-2 - 2B9-10 region of the X chromosome of Drosophila melanogaster. VII. Influence of the ees locus on the female fertility II Mol. Gen. Genet. 1991. V. 225. P. 99-105.

5. Zhimulev I. F., Belyaeva E. S., Mazina O. M., Balasov M. L. Structure and expression of the br-c locus in Drosophila melanogaster // Eur. J. Entomol. 1995. V. 92. P. 263-270.