Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние криоконсервирования на морфо-функциональные показатели культивированных клеток печени новорожденных поросят

ВАК РФ 03.00.22, Криобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние криоконсервирования на морфо-функциональные показатели культивированных клеток печени новорожденных поросят"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОЕІОЛОГІЇ І КРІОМЕДЙЦШЙ

РГБ од

„ 1%О,;-. ш правах рукопису

У * \ і і І !_• / V' > .

БЄЛОЧКІНА Ірина Владиславівна

ВПЛИВ КРІОКОШЕРВУБАННЯ НА МОРФО ФУНКЦІОНАЛЬНІ ПОКАЗНИКИ КУЛЬТИВОВАНИХ ПЕЧІНКОВИХ КЛІТИН . ЮЮНАРОДЕЕНИХ ПОРОСЯТ

03.00.22 - кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

Харків - 1894

Дисертація виконана е Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Б. її Сандомирський Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор 0. Я. Панков, доктор медичних наук, професор А. А. Дудаева

Ведуча установа: Харківський державний університет

Захист відбудеться "______" ________________ 1994 року о _____ г

на засіданні спеціалізованої ради Д 016.60.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (310015, Харків-15, вул. Переяслівська, 23)

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Автореферат розісланий *'______"__________________ 1994 року

Вчений секретар спеціалізованої ради, доктор медичних наук, професор А. М. Гольцев

Актуальність, Паренхіматозні клітини печінки, що виконують льшість органоспецифічних функцій, на протязі багатьох років є деллю для вивчення різних сторін метаболізму печінки, питань генерації і канцерогенезу цього органу, для токсикологічних і рмакологічних досліджень. В останнє десятиліття широко сліджуютьея можливості вастосування ізольованих гепатоцитів я тимчасового органозаміщення при захворюваннях печінки, вллється перспективним використання іх при вроджених енвимопа-ях.

Рішення названих експериментальних та клінічних задач е ре-ьним при наявності значних запасів гепатоцитів в відомими остями і високим функціональним потенціалом.

Низькотемпературне консервування є сьогодні майже безаль-рнативним засобом збереження значної кількості клітинного марі алу без великих витрат і більш тривалий час, ніж. це можливо , допомогою культивування або гіпотермічного зберігання клітин, соби оцінки цілості різних метаболічних функцій е суспензії патоцитів, др широко використовуються на протязі перших кіль-х годин після відігріЕу, не дають адекватного уявлення про жливсеті цих клітин до тривалого специфічного функціонування, нкціонування деконсервованих гепатоцитів після їх трансплан-ції в організм теоретично моя® вважатися найбільш переконливим кавником життєздатності цих клітин, проте на практиці об’єкти-а оцінка функціональних властивостей трансплантованих гепато-тів не може бути одержана через вплив на них в цих умовах чис-нних неконтрольованих факторів, в першу чергу, з боку імунної «теми реципієнта, і неможливості реєстрації кількості життє-дтних пересаджених клітин. На нинішній час абсолютним по-гником біологічної повноцінності ізольованих гепатоцитів може зжатися їх здатність до існування в умовах культивування з де-нстрацією елементарних та специфічних функцій. ■

Засоби кріоконсерЕування розроблялися головним чином для патоцитів гризунів і, в меншій мірі, людини. Розширення спект-1 експериментальних об'єктів, що досліджуються в-кріобіології, поможе виявити видові та вікові особливості кріочутлиЕоеті та-;х високо спеціалізованих клітин, якими є гепатоцити. Гепатоци-свині, шр є тваринокз, структура і функції печінки якої дібні до людських, не привернули до цього часу належної уваги боку кріобіологів; ¡де не вивчений вплив процесу низькотемпера-

турного консервування на ізольовані клітини печінки новонародлй них поросят. Крім того, доцільність такого вивчення є очевидне як 8 теоретичного, так і з практичного боків, оскільки.роамі поросячої печінки дозволяє вилучити значну кількість клітин.

Таким чином, метою дослідження було вивчення впливу уїж: низькотемпературного консервування на біологічну цілість гепатс цитів новонароджених поросят при культивуванні.

Для досягнення цієї мети мали бути вирішеними такі задачі:

- відробити умови виділення і культивування ізольованих Г6 патоцитів новонароджених поросят;

- оцінити адгезивні та проліферативні якості і здатність і синтезу сечовини свіжоівольованих гепатоцитів новонароджених пс росят в культурі;

- вивчити вплив кріопротекторів (ДОСО, ПЕО-400, ПЕ0-150С на морфо-функціональний стан деконсервованих гепатоцитів;

- вивчити вплив швидкостей заморожування на біологічи якості деконсервованих гепатоцитів новонароджених поросят.

Наукова новизна. Клітини печінки новонароджених поросят новим об’єктом для кріобіології. Вперше досліджено вплив різни режимів низькотемпературного консервування з використанням дво швидкостей заморожування і трьох кріопротекторів екстра- і ендо целюлярного типів дії на структурну і функціональну цілість ге патоцитів новонароджених поросят; як тест на біологічну пов ноцінність клітин буг використаний такий інтегральний показник як їх здатність до існування в умовах культивування. Впери виявлено специфічність впливу ДМСО, ПЕ0-4Ш і ПЕ0-1500 середовищі заморожування на адгезивні якості гепатоцитів. Уста новлено. можливість реалізації високого проліферативного по тенціалу деконсервованих гепатоцитів новонароджених поросят культурі при відсутності в середовищі гормонів і факторів росту

Теоретичне і. практичне значення.

Печінка новонароджених поросят дозволяє одержувати значну кількість клітин, які по функціональним якостям вельми подібн до людських, ар становить їх цінність з точки зору клінічног застосування, оскільки в цьому випадку зменшується небезпек вірусних заражень і не постає певних етичних проблем, шр існует при роботі з ліодським матеріалом. Розробка заходів низькотемпе ратурного зберігання ізольованих гепатоцитів поросят дозволит задовольнити потреби експериментальної і клінічної медицини

великій кількості цих клітин. Для кріоконсервування гепатоцитів новонароджених поросят є встановленою більш висока ефективність застосування ДМСО в концентрації 10% в порівнянні з ПЕ0-400 та ПЕ01500. Установлено оборотність зниження активності проліферації і синтезу сечовини в культурі деконсервованих гепатоцитіЕ новонароджених поросят.

До захисту еиносяться такі положення:

1. Гепатоцити поросят, натиєні і після низькотемпературного консервування, здатні до активної проліферації в культурі без збагачення середовища ростовими і гормональними факторами.

2. Існує різниця у еплиеі кріопротекгсріЕ ДМСО, ПЕО-400, ПЕ0-1500 на адгезивні якості деконсервованих гепатоцитів новонароджених поросят. Здатність клітин до прикріплення та розпластування найбільш висока після заморожування їх з ДМСО; найменш ефективний - ПЕО-400.

3. Низькотемпературне консервування в присутності 10% ДМСО і 10% ПЕО-1500 викликає оборотне зниження активності проліферації та сечовиноутЕОрення в культурі гепатоцитіЕ новонароджених поросят. Потрібний певний латентний період (1-2 доби) для відновлення досліджуваних функцій до рівня контролю.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи докладалися і обговорювалися на конференціях молодих вчених ІШіК АН України (м. Харків, 1991 р., 1992 р., 1993 р.); на III

Всесоюзній нараді по культивуванню клітин і тканин (м. Пущино, 1990 р.), на науково-практичній конференції "Структур-

но-функціональні одиниці та їх компоненти в органах вісцеральних систем в нормі і патології" (м. Харків, 1991 р.)

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковані 4 друковані роботи.

Обсяг і. структура роботи. Дисертація викладена на 108 сторінках машинописного тексту, складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і мєтодіе дослідження, двох глав результатів власних досліджень та їх обговорення, заключения і висновків. Містить 3 таблиці і 19 малюнків. Список використаної літератури має 179 найменувань.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Як об’єкт дослідження використовували печінку новонародже-

З

них поросят. Маса печінки складає 23±4 г.

До основи методики одержання гепатоцетів покладено спосіб двохступінчастої перфузії печінки (Seglen, 1976) з використанням суміші препаратів бактеріальної (Streptomyces sp.) колагенази з різним ступенем очждекня: 0,05% менш очищеної колагенази ГЗХ та

0,01% - Г10Х, більш очищеної (маркіровка виробника, НВО "Фермент", м. Вільнюс).

Для постановки культури суспензію, шр містила не .менш, ніж 30% стійких до зажиттєвих барвників клітин, доеодили до концентрації 150 тис клітин/мл і Еисівали в пластикові чашки Петрі ("Ленмедполімер") діаметром 35 мм, які були покриті плівкою колагену з сухожиль хвоста щуріЕ, посівна доза - 450 тис клітин/чашку. Прикріплення гепатоцитів відбувалося в середовищі 199 при 3?°С на протязі 1 год в умовах абсолютної вологості. Потім рідину з клітинами, що не прикріпилися, видаляли, до чашок приливали 3 мл середовищ Лейбовича L-15 ("Serva") з глюггамином, доповненого 10% ембріональної телячої сироватки (ETC), пеніциліном и стрептоміцином з розрахунку 100 од/мл і 100 мг/мл відповідно. Культивування відбувалось на протязі 3-5 діб.

КріоконсерЕуЕання гепатоцитіЕ здійснювали в сахарозному середовищі, яке додатково містило 20% ETC. Як кріопротектор використовували ДМСО, ПЕО-400 або ПЕ0-1500. Кожний досліджуваний кріопротектор брали в концентраціях 52, 10%, 20%. Зразки

охолоджували лінійно з швидкістю 1°С/хв і 10 ° С/хв до -70° С, потім переносили для збереження при -196° С е рідкий азот. Відігрівання проводили на водяній бані при +37° С, після чого клітини ступенево відмивали від кріопротектора.

Життєздатність одержаної суспензії визначали через забарвлення їх вітальним барвником трипаноним синім. Спостерігали також зажиттєву флуоресценцію клітин після подеійного забарвлення їх ФДА і бромідом етідія.

Ефективність посіву гепатоцитіЕ визначали як еідношєння числа клітин, що прикріпились на протязі 1 години, до числа інокульованих життєздатних клітин, і виражали у відсотках. Активність прикріплення гепатоцитіЕ оцінювали через відношення кількості клітин, шр виявлялись на підложці за 1 добу культивування, до числа клітин, що прикріпилися за 1 годину після посіву. В добовій культурі нативних і деконсервованих гепатоцитів визначали частку розпластаних клітин щодо загальної кількості

:рикрішіених клітин.

Проліферативний потенціал культури гепатоцитів Еизначали :а методом гістоавторадіографії по рівню включення міченого три-■ієм тимідшу до ДБК гепатоцитів після імпульсного введення юпередника.

Утворення сечовини •гепатоцитами в культурі визначали за іопомогою стандартного набору реактивів ("1_асЬета", Чехосло-¡аччина). .

Локалізацію альфафетопротеіну в нативних гепатоцитах на 3-ю 5-у добу культивування виявляли непрямим імунопероксидазним ¡етодом. Ця частина дослідження здійснювалась на базі Інституту анцєрогенеза БОНЦ РАН (м. Москва) в лабораторії імунохімії, де іуло люб'язно надано усі необхідні матеріали і методичну ’опомогу.

Одержані результати вивчення адгезигних якостей гепатоцитів радіоавтографічного аналізу обробляли статистично ва методом [астотного аналізу на ЕОМ-4. Для обробки даних щодо рівня жит-'єздатноеті і активності синтезу сечовини застосовували метод !т>юдента-Фішера. Різницю вважали дос-гоЕірною, якщо рігень зна-іущрсті складав 0,05,

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Нативні гепатоцити новонароджених поросят тримали на протя-;і 5 діб в традиційних умовах монетарної культури. Еиттєздатність свіжо ізольованих гепатоцитів складала 78+6Х. !ісля їх посіву через 1 годину інкубації при 37 С на підложш іИЯЕЛЯЛОСЬ близько 68% гепатоцитів, уведених до культури. Мік-юскопічне спостереження культури нативних гепатоцитів на протя-■і п'яти діб .показало, що ця система динамічно розвивається і ¡роходить стадії становлення або .адаптації, тимчасової стабілі-;ації ґ, нарешті, стадію регресивних’змінювань. Фаза адаптаці і :арактеризується етапом прикріплення, розпластування клітин : ермування монетарних ділянок е культурі. На протязі 1-3 доби ілітини підтримують полігональну форму і мають морфологічну здібність до гепатоцитів в структурі тканини печінки. На 5-ту ;обу культиЕуЕання мокошар клітин морфологічно змінюється. Його кремі менш щільні ділянки набувають вид потоків, ідо складаються трохи Еитянутих клітин, орієнтованих удовж осі потоку, хоч

значна частина клітин ше зберігає полігональну форму. В це період е культурі виявляються клітини, шр синтезують альфафетоп ротеін. Модифікація моношару гепатоцитіЕ на 5-ту добу може бут ознакою інеолюційних змінювань е культурі, шр підтверджується щ й експресією -синтезу альфафетопротеіна. В нормі синтез альфафе топротеіва в клітинах сеинячої печінки припиняється на етап Енутрізньоугробного розвитку. Отак, НЗЯЕНІСТЬ в культурі клітин шр синтезують альфафетопроте ів, є ознакою ембріоналізації культу ри. Такий розвиток гепатоцитіЕ неонатальних поросят в умова традиційної культури є закономірним і узгоджується з результата ми, що були одержані при культивуванні гепатоцитів інших еиді тварин.

Печінкові клітини новонароджених поросят як експерименталь на модель приЕертагоь тим, шр еони достатньо диференційовані дл виконання специфічних печінкових функцій, наприклад, можуть ак тивно акумулювати жовчні кислоти, до того ж триваліше, ніжгепа тоцити щурів чи людини, або метаболізугати ксенобіотики. Разом тим гепатоцити новонароджених поросят еияеляють еисокі резерЕ проліферації, які забезпечують нормальне протікання процесі поетнаталыюго розвитку органу е цілому.

Динаміку участі клітин в синтезі ДНК під час культивуЕанн гепатоцитіЕ показано на мал. 1. Аналіз радіоавтографів клітинни культур- показав, шр нативні гепатоцити зберігають здатність д синтезу ДНК на протязі усього строку спостереження - 5 діб. Ре алізація здатності клітин печінки поросят проліферувати в умова культивування відбувається поступово. На протязі перших трьо діб культивування кількість клітин, щр синтезують ДНК збільшується більше, ніж у 6 разів, досягаючи на третю доб 13,0±1,5 %. На 5-у добу 5Н-тимідин включало близько 10% ядер-ге патоцитів. Особливо помітно появлення в 3-добовій культур гепатоцитів неонатальних поросят клітин у стані мітотичног ділення, оскільки мітоги в культурі гепатоцитів дорослих твари зустрічаються дуже рідко. . _

Уявлення про ступінь проліферативної активності гепатоциті новонароджених поросят дає порівняння, досить умовне,, резульга тів наших експериментів з даними радіоавтографічного аналізу ак тиеності включення ^Н-тимідину в ДНК гепатоцитів щурів in viv після дії на тканину печінки різних пошкоджуючих факторів, які сильними стимуляторами регенерації печінки. Індекс мічення яде

б

ДОБА КУЛЬТИВУВАННЯ

Мал.1. Динаміка проліферації в культурі свіжоізольованих гепатоцитів. * - різнивд з попереднім строком спостереження є достовірною (Р<0,05).

гепатоцитів після хроничної інтоксикації чотирьоххлористим вуглецем, часткової гепатектомії, локальних кріовпливань на дві частки печінки не перевищував 8,14% (Сандомирський, 1992). Клітини в культурі е ізольованими від неконтрольованої регуляції регенерації з боку ендокрінної, імунної та нервової систем, тому індекс мічення ядер гепатоцитів поросят близько 13 %, шр реєструється на 3-ю добу культивування, свідчить про реалізацію високих внутрішніх резервів проліферації саме гепатоцитів. Таким чином, в умовах нашого експерименту, свіжоізольовані гепатоцити новонароджених поросят після періоду адаптації вступають у фазу активної' проліферації, яка досягає піку на 3 добу культивування. Вона триває принаймні до 5 доби і стає фоном для інволюційних змінювань в культурі, щр відзначаються на цей строк спостереження морфологічно і, як буде показано нижче, біохімічно. Наведені результати підтверджують наявність високого проліферативного потенціалу в гепатоцитах поросят, який може проявлятися в середовищі, яке не містить стимуляторів росту.

Оцінка специфічної для гепатоцитів функції сечовиноутворен-ня, щр є проявом знешкоджувальної фун:сці ї печінки, показала", що

робота цикла синтезу сечовини е нативних гепатоцитах найбільше ефективна в першу добу культивування (мал. 2). Кількість сечовини складала близько 10,5 мкмоль/доб 106клітин. При подальшому перебуванні культури до другої доби швидкість синтезу сечовини знижується у два рази, залишатись проте достатньо високою і незмінною до третьої доби (близько 5,5 мкмоль/доб 10 клітин). З урахуванням того, ЕР на 1 г мокрої ваги печінки стає близько 10 клітин, і порівнюючи одержані в наших експериментах значення з активністю сечовиноутворення в організмі людини (близько 20 г/доб, тобто 0,33 моль/доб), показано, шр це величини того самого роду. На 5-у добу в середовищі культивування нативних гепато-.цихів знайдено сдідоеі кількссгі сечовини. На протязі 5-І доби утворення сечовини складає близько 1 мкмоль/10 клітин.

Різке зниження синтезу сечовини нативними гепатоцитами під час 2-ї доби культивування, як еидно, обумовлюється метаболічними перебудовами у культивованих клітинах. Відомо, шр свіжоізо-льовані гепатоцити на протязі перших кількох годин після виділення перебувають у стані негативного азотистого балансу (Дук’яно-

ДОБА КУЛЬТИВУВАННЯ

Мал. 2. Динаміка швидкості синтезу сечовини в культурі свіжо ізольованих гепатоцитів. * - різниця 8 попереднім періодом спостереження є достовірною (Р<0,05).

;а, 1985). Його породжено зрушенням рівноваги між швидкістю ути-іігації і утворення амінокислот до катаболічного напряму білко-¡ого обміну. Посилення розпаду білка призводить до підвищення ібсягу вільних амінокислот в цитозолі клітини і, відповідно, убетратів для утворення сечовини, чим, можливо, пояснюється мсока активність синтезу сєчоеини в 1-у добу культивування ге-¡атоцитів. Лімітуючим моментом в процесі утвореная сечовини може іути нестача енергії в клітинах, оскільки енергетичні потреби интегу достатньо великі і теоретично складають 4 моля АТФ/моль «човини. Можна припустити, що гниження цієї функції в гепатоци-ах новонароджених поросят на 2-у добу культивування спричинене :естачею в клітинах АТФ. Проте швидкість синтезу сечовини іідтримується на постійному і високому фізіологічному рівні на ротязі другої-третьої доби, що свідчить про достатній енерге-ичний потенціал системи. Мздуляція активностей специфічних фер-іентіп, шр описана для культивованих гепатоцитів щурів, тосується і ферментів, щр каталізують реакції циклу сечоЕиноут-орення (Єигис п-ВиШоиго С., Биіііоиго А., 1983). Може бути, шр :изька швидкість утворення сєчоеини, і_ка реєструється у наших кспериментах на 5-у добу культивування гепатоцитів поросят, бумовлена збитком активності специфічних ферментів цього процесу і є однією з ознак регресивних змінювань в культурі.

Процес низькотемпературного консервування індуктує низку труктурно-метаболічних змін в ізольованих гепатоцитах, що поз-ачаеться і на здатності цих клітин до перебування е умовах ультивування. Результати оцінки життєздатності гепатоцитів за х стійкістю до забарвлення трипановим синім після усіх Еарі-нтів заморожування показані в таблиці. Після відігріЕання пере-ажну кількість незабарвлених клітин, в середньому близько 68% ід контролю, одержували у зразках, щр заморожували з 105! ДМСО ри швидкості охолодження 1°С/хе. Трохи нижче (05<Р<0,1) була иттєздатність гепатоцитів при використанні 10Х і 20% ПЕО-1БОО з вома швидкостями охолодження та 10% ДЬСО при швидкості заморо-ування 10°С/хв. У цих серіях експериментів кількість клітин, шр ули стійкими до забарвлення трипановим синім, складала близько ОХ. Малоефективним в наших дослідженнях виявився ПЕ0-4СЮ: за

сіма режимами гаморожуваня він забезпечував близько 20% від онтролю життєздатних гепатоцитів. Тривалість збереження на прояві від трьох діб до двох місяців не впливала нажіттєздатність

Таблиця.

Життєздатність* (X) гепатоцитів після кріоконсервування

Кріопротектор (КП) "і Концентра- 1 ція КП 1 (%) 1 Швидкість ■ 1 - — ~і заморожування |

1° С/хв і і 1 10°С/хв 1 і і

ДЫСО 5 1 58±4 І 1 1 52+4 1

10 і 68±5 1 60±4 і

20 1 54±А 1 45±3 1 і і

ПЕ0-400 5 1 25±4 1 1 1 28±5 1

10 і 29±5 1 29±3 1

20 1 31±3. 1 24±3 t і і

ПЕО-1500 5 і 48±б 1 42±4 1

10 і 61 ±4. 1 60±3 і

20 1 . . _ і 65±6 1 62±4 1 І 1

* - Життєздатність кріоконсервованих гепатоцитів визначали п відношенню частки живих клітин в суспензії після відігрів і відмивання від кріопротектора до частки живих клітин . суспензії після виділення (контролю).

розморожених гепатоцитів за всіх умов експерименту.

Тестування клітин по трипановому синьому дозволяє виявит тяжкі пошкодження бар’єрних властивостей мембрани і часто да завищені показники біологічно! цілості клітин. Абсолютним лабо раторним показником біологічної цілості може вважатись здатніст клітин до існування в культурі. Яри одержанні первинної культур печінкових клітин важливим є етап прикріплення, до обумовлюєтьс як' збереженням адгезивних якостей власне гепатоцитів, тобто ї вдатністю до активного контакту з суміжними клітинами різноманітними субстратами біологічного і небіологічного по ходження, так і наявністю необхідних компонентів системи культи вуваннн. Гепатоцити, щр перенесли усі опробувані умови зам ролування-відігріву, по ефективності посіву значно поступаютьс свіжо ізольованим клітинам (мал.3), Із суспензії нативних гепатс цитів, шр вносяться до культури, на протязі години ПІСЛЯ ПОСІЕ

10. 1 ' •

¡S3 5 % Шк 10 X ЕЯ 20 %

Мал. 3. Ефективність посіву нативних і де консервованих гепатоцитіЕ поросят. Швидкість заморожування: А - 1 С/ХЕ;

Б - 10° С/хь.

осідає і прикріплюється до підложки близько 68% клітин. В дослідних групах здатність до прикріплення краще зберігають ге-патоцити після заморожування в середовищі з ДМСО без залежності від його концентрації і шеидкості охолодження суспензії, хоч еф-фективність посіву знижується майже до 40%. Клітини, шр були заморожені за усіма режимами з ПЕ0-1500, еияеляють ефгктиЕність посіву на рівні близько 30Z. Використання ПЕ0-400 забезпечує прикріплення менш ніж 20% експлантованих клітин. Привертає увагу факт зниження на 10-15% ефективності посіву гепатоцитів, шр були заморожені під захистом 10% и йО%-ПЕО-1БОО, ардо клітин, при за-'коронуванні яких використовували ДМСО в концентрації 10%. Слід позначити," шр показники життєздатності по трипановому синьому цих експериментальних груп ідентичні (табл.), але прямої кореляції між ефективністю посіву та стійкістю клітинної мембрани до зажиттєвого барвника не еияелєно.

В оптимальних умовах для повноцінних гепатоцитіЕ на протязі наступних кількох годин після посіву властиве розпластування на колагеновім матриксі, що є істотним для багатьох внутріклітинних процесів Ссинтез ДНН, РНК, проліферація та ін.). По здатності до

розпластування найбільш близькі до нативних клітин гепатоцити, шр були заморожені з Щ)0 незалежно від його концентрації і швидкості охолодження - 80% розпластаних гепатоцитів. Після всіх ! варіантів кріоконсервування з ПЕ0-400 і ПЕ0-1500 близько 402 клітин, що прикріпились, не здатні до розпластування. .

Одержані дані свідчать про те, що кріоконсерЕуЕання викликає в гепатоцитах ряд змін, що в умовах нашого експерименту проявляється у зниженні ефективності посіву і здатності до розпластування в культурі. Можна припустити, що це пов'язане з пошкодженням структур, що опосередковують взаємодію клітин з позаклітинним матриксом, або такими модіфікаціями плазматичної мембрани, коли неможливою є перебудова геометрії контактуючої поверхні клітини (Blanguet P. R. , 198S). В іншого боку, відомо, що енергетика і редокс-статус клітини, локалізація іонів і розподіл метаболітів в компартментах є факторами, що.контролюють організацію цитоскелета і, опосередковано, поиерхні клітини (Лук*янога,1985).

Найбільш примітною е знайдена специфічність впливу виду використаного кріпротектора на збереження адгезивних якостей розморожених гепатоцитів. За тим в межах кожної серії експериментів, де використовували один з трьох випробуваних кріопротекторів, не відзначено впливу концентраці ї кріопротектора і швидкості заморожування на ефективність посіву гепатоцитів та їх здатність до розпластування. Еайменш пошкоджуючим для реалізації адгезивних якостей гепатоцитів в культурі є кріоконсервування їх в присутності ДШО. Застосування при заморожуванні гепатоцитів поросят ПЕО-400 і ПЕО-1500 еєдє до більш драматичних наслідків.

Оцінка адгезивних якостей гепатоцитів після кріоконсервування дає інтегральне уяелєння про збереження клітин, бо Еідбивае стан комплексу внутріклітинних подій, які необхідні для реалізації таких первинних реакцій клітини, як прикріплення і розпластування на субстраті. При цьому немає абсолютної кореляції між життєздатністю печінкових клітин, що визначається за тршановим синім, і їх здатністю до прояву адгезивних якостей in vitro: -стійкість плазматичної мембрани до барвника не гарантує

збереження здатності до прикріплювання і розпластування. Більш того, клітини демонструють різний ступінь збереження адгезивних якостей при однаковій життєздатності суспензії гепатоцитів, що в наших експериментах спостерігали-після заморожування клітин з 10% і 202 ПЕО-1500 за двома режимами охолодження та з 10% ДМСО -

із швидкістю 10° С/хв. Шс видно, в доповнення до методу забарвлення трипановим синім є сенс використовувати як простий і поступний експрес-тест оцінку ефективності посіву гепатоцитів на колагеновий матрикс, що дозволяє характеризувати більш бисокий рівень збереження клітин.

Комплексне урахування життєздатност і (табл.) і ступеня збереження адгезивних якостей (мал. 3) показало перевагу використання 10% ДМЗО і швидкості охолодження 1°С/хв. Б серіях, це застосовували ПЕО, по сукупності даних тесту трипанового синього і оцінки ефективності посіву та здатності клітин до розпластування більш високі і рівнозначні результати одержували з 10% і 20% ІЗЕ0-1500 і двома швидкостями охолодження. Виявилось цікавим порівняти, як в процесі культивування реалізуються 6і-осинтетичні функції гепатоцитів поросят після низькотемпературного консервування з кріопротекторами різної природи. Для спостереження на протязі трьох діб культивування взяли клітини після заморожування із швидкістю 1°С/хв в присутності 10% ЛМСО або 10% ПЕО-1500.

В цілому динаміка еключєння міченого тимідину до ДНК гепатоцитів, що були кріоконсервовані з ДОСО і ПЕО-1500, аналогічна до тієї, що спостерігається в культурі свіжоізольованих гепато-цитів. Тимчасове зниження синтезу ДНК відносно контролю спостерігається на протязі першої-другеі доби культивування розморожених клітин. ІМЯ за 1-у добу складає менш, ніж 0,5% в обох серіях експериментів, шр достовірно нижче контролю (мазі. 4). За 2-у добу спостереження в культурі гепатоцитів, що були кріоконсервовані з ДМСО і ПЕО-1500,3Н-тимідин включають 1,5+0,6% і 0,9+0,8% (Р>0,05) клітин відповідно, що приблизно в 3,5 рази менше, ніж в культурі нативних клітин. На протязі третьої доби спостерігається висока, на рівні контролю^ активність синтезу ДНК в культурі розморожених гепатоцитів незалежно від виду використаного кріопротектора.

Вивчення функції сечовиноутворення деконсервованих клітин показало, що на протязі 1-ї доби культивування гепатоцити, які були заморожені з 10% ДМСО і 10% ПЕО-1500, виробляють близько 60% від рівня синтезу сечовини нативними клітинами (мал.5). Потім спостерігається тенденція до незначного зниження активності сечовиноутворення деконсервованих гепатоцитів, проте показники цієї функції залишаються досить високими і стабільними на протязі

ІЗ

17

16

1ЄГ

14

13

12

11

10

ДОБА КУЛЬТИЄУОАИНЯ

Мал. 4. Динаміка проліферації в культурі свіжоізольованих і кріоконсервованих в 10% ДОЗО або 10% ПЕ0-1500 гепатоцитіЕ.

ЄЗ £23 Е22

Мал.5/ Синтез сечовини в культурі свімоівольованих 1 кріоконсервованих з 10% ДМСО або 10% ПЕО-1500 гепатоцитів.

14 . ■

другої-третьої доби культивування. Зважаючи на те, що реакції процесу сечовиноутворення протікають, у різних компартментах клітини, е мітохондріях і в цитоплазмі, через ЙОГО ВІДНОЕЛЄННЯ в розморожених клітинах до рівня контролю до 2-ї доби культивування можна побічно зробити висновок про збереження системи енергозабезпечення, мембрано-транспортних процесів в мітохондріях, активності ферментної системи циклу сечовиноутворення. Вид кріоп-ротектора не спричиняє достовірної різниці в активності синтезу сечовини між експериментальними групами.

В цілому, гепатоцити, що були заморожені з ДМСО і ПЕ0-1500 і зберегли спроможність до перебування в культурі, ідентичні за показниками синтезу ДНК і сєчоенни. Цри'культивуванні на протязі трьох діб і свіжоізольовані, і кріоконсерЕовані гепатоцити зазнають періоди адаптації до інших умов середовища і тимчасової стабілізації функцій. Зниження функцій в гепатоцитах після процесу кріоконсервування оборотне. Потрібний певний латентний період , в наших експериментах одна-дві доби, для еідновлєння функцій, ар спостерігаються, до контрольного рівня. Аналогічну тривалість латентного періода спостерігали в культурі деконсер-вованих гепатоцитів людини (Dou et al., 1992). Такий самий вплив кріоконсервування є виявленим і для інших біологічних об’єктів. Відновлення низки ферментативних реакцій і фізіологічних функцій не відбувається одночасно з розмерзанням, отже, потрібний додатковий час до періоду природної адаптації для репарації нелеталь-них пошкоджень клітин.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, щр ізольовані гепатоцити новонароджених по-

росят спроможні після низькотемпературного консервування до існування в культурі із збереженням ряда елементарних і специфічних функцій. ..

2. Виявлено різницю у впливі кріопротекторіЕ ДМСО, ПЕ0400, ПЕО-1500 на адгезивні якості деконсервованих гепатоцитів новонароджених поросят. Здатність клітин до прикріплення та розпластування, найбільш висока після заморожування їх в присутності ДМСО; найменш ефективний - ПЕО-400.

3. Показано відсутність впливу використаних швидкостей заморожування (1°С/хв і 10°С/хе) і концентрацій кріопротекторіЕ (52, 1QX, ZOZ) на збереження здатності гепатоцитів до прикріплення і розпластування на колагеновій лідложці.

4. Виявлена ідентичність показників динаміки синтезу ДНК і сечовини е культурі гепатоцитів новонароджених поросят після крюконсервування а Юй ДМЗО або 10/ҐПЕ0-1500.

5. Низькотемпературне консервування в 10% ДШО і 10% ПЕ0-1500 індуктує оборотне-зниження активності проліферації та сечовиноутворення в культурі гепатоцитіЕ новонароджених поросят. Потрібний пєений латентний період (1-2 доби) для Еідновлення досліджуваних функцій до рівня контролю.

6. За оцінкою стійкості плазматичної мембрани до трипано-вого синього і по збереженню здатності клітин до прикріплення і розпластування на субстраті показано’ найбільшу ефективність ДМСО е концентрації 10% для кріоконсервування гепатоцитів новонароджених поросят.

?. Виявлено, ідо гепатоцити новонароджених поросят, натиЕйі і деконсервовані, мають високий проліферативний потенціал і здатні до вступу е Б-фазу клітинного циклу при відсутності додаткових ростоеих і гормональних факторіЕ в середовищі культивування. Проліферуюча культура гепатоцитів новонароджених поросят може бути зручною моделлю для випробовування гепатотропних факторів, як стимуляторІЕ, так і інгибіторіЕ.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІї РОБІТ.

1. Волкова Н. А., Бедочкина И. В. Культивирование печеночных клеток новорожденных поросят // Культивирование клеток животных и человека. Тез. докл. III Всесоюзного совещания 13-15 февраля 1990 г. , г. Цущино. - М., 1990. - С. 81-82.

2. Волкова К А., Бе дочкина И. В. , Сигал К С. Способность гепатоци-тое поросят к пролиферации в культуре // Структурно-функциональные единицы и их компоненты в органах висцеральных систем в норме и патологии. Тез. докл. научна-практич. конференции, 1-3 октября 1991. - Харьков, 1991. - С. 45.

3. Бе дочкина И. В. , Волкова Н. А. Культивирование гепатоцитов новорожденных поросят // Фундаментальные и прикладные проблемы криобиологии / Под ред. Г. А. Бабийчука. - Харьков, 1993. - С. 13-16.

4. Бадочкина И. В. , Волкова Е А. Адгезивные способности изолиро-

ванных гепатоцитоЕ новорожденных поросят после низкотемпературного консервирования // Проблемы криобиологии . - 1994. - N

2. - С. 52-54. ■ '