Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние колхамина на сегмантацию параксиальной мезодермы куриного эмбриона

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние колхамина на сегмантацию параксиальной мезодермы куриного эмбриона"

0™1

РГо ии

САНКТ41ЕТЕРЕУРПЗШЛ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЭЛЬ АЛИ Мохэддин Шабан

ВЛИЯНИЕ КОЛХАШША НА СЕШАНТАЩ® ПАРАКСИАЛЬНОЙ

МЕЗОДЕРМЫ КУРИНОГО ЭМШЮНА

Специальность 03.00.11 - Эмбриология,гистология

и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени вацдадага биологических наук

Сеж?-Петербург 1593

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной цитологии Биологического научно-исследовательского института Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель - кандидат биологических наук,

доцент В.И.ЕЗШЮВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

В.4ЛУЧЮВ,

кандидат биологических наук Н.СЛШИГШ

Ведущее научное учреждение - Институт цитологии

Академии наук России

Защита диссертации состоится " % * 1993г.

в 1^3*^асов на заседании специализированного совета Д 063.57.22 по защиге диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических науп в Санкт-Петербургском государственной университете по адресу: 199034.С-Петербург. Университетская наб^.7/9.Еиолого-почвенныа факультет, ауд.133.

С диссертацизй шзтао ознакомиться в Научной библиотеке им. А. Ы.Горько го С-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан » )Ъ ■ 9 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Д Л .ОБУХОВ

О Бдел ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш,В ТО-о гг.,в особенности посла работ ДЛфза & Ceotos» 1973» 1975) .продемонетрпроваппа принципиаль-вуо ~оз:гошость изрфогекеттгасгюс двиганий в раннем эмбрио-гсиоов ок^кбия при снатпггельном подавлении клеточных деле-insft,постепенно утвзрдилось представление,согласно поторому слотосная репродукция либо вообще не принимает участие в морфогенезе, либо ээ участие сводится в вспомогательной роли ЕГостаг-г~а клетотаого материала (Ефетз,1958; Белоусов,1990).

ЕЬезсте с тем при рассмотрении причинно-следственных от-ксгсгптЛ гзгщу про.ттг&редпея.дифференциацией и шрфогеневом в последяез премя вез большее внаташе приобретает систекныя {надеяетотгша) аспект. Отрагением втой тенденция стало фор:„<у-лпроззягэ ряда полопгяий о тон,что в развертывании слогной прогргагя шрфэгенезоэ и экбрйоналшоп дифференциаций боль-сгсз слатапгэ газет физиологическая гетерогенность штотсчнпг. спсгет, обусловленная состодтеи ккнегиап пролиферации к ергг^э ссзго Еогяоспцлез гяеточнгпг поауледта (Дондуа, 1983; Лщгрозпа,1950). Iba стон предполагается»*^ спецпфжа ямяо-епцгп кого? бить огЕСТ'сггениоЯ па дк$5зрсяцпальяуп лузстз:?-^егшоегь пгсгоспз созохфшосгея п расносбргсшга г.*орйэгг:-тэ-^птезези йзггерга (ЩрекгаДЭТо); в ряда езу^эв нлеготагз цппл Ltorrr? плтуазть в ролл сЕОЗсбраспота гайара.гэдаггрж» p:r?;j nararecsrs пгрподпосгп повгорггг^Еся газоэ кзрфогсясга { Stora ard Во11о±гз ,IgS5; Prints» ей ol. ,1?еЭ) Л стелу гезяз Егргэдзчзсззг гзрфспрсцэссоз, сйсспзсггт^: ста-ггоглхлегэ nrerm стросия paatnsss^sroen eprenncin, стпосгг?сл cMtxsmcra пграгсйяьпоЯ езгедер^а у сгродгг^гЯ позпепгггпг: (сс-гггогезез).

"ЗЕГПГЖси СС'Г^О^СПЗСй fTJZiO I 1Г1ХТ?.ТГЛ*ТЭ ПССЛФ-

дсггя?злзЗ*1>о ссс5"~:о сстсзеппзо г-ст прсцесс пзтал раергбэ-гн^гьез в 70-Ш-о г?. Пзутег-тэ сс^пюгс^сга у позпкготнк: г ггасго.трэ ездстсп спрсзгм Гзггггез п гтэсахгггпз

лсклпз» п егдглгяш ггэ frns дссгзгщтп ¿сзс-пз.

па газ кяггэ сгерог-и сгэгэ сткетя сз ююжага cpoiwsi-ггоэкгпз nss?c2 до сс±згл гсЗсзгет® сгкядагсп п rrca-e-j'-кгза стэггзгрггсл гс^жзгл ечггпгоз ссэ ОГЗ еггеезел «тежо»

ценными .К числу таких интегрирующих аспектов сошгеогеноеа можно отнести вопросы: как и чей определяется удивительное видовое постоянство числа соиитов в гародизе; что запускает, хронометрирует и терминирует сегментацию; в каком отношении находятся скорость сегментации и размеры сомитов,и наконец, каковы регуляционные потенции параксиальной мезодермы и с чем они связаны.

Выполнено достаточное количество исследования клетоедоя репродукции и особенностей митотических циклов мезодермы при сомитогенезе (Дондуа и Федорова,I964;I967; Priaaet et al. 1989), но все они,как правило,носят описательный характер. До сих пор только на зародьаах амфибий были предприняты попытки экспериментально оценить роль клетовдого разшохгния в этом процессе ( Сооке ,1975; Slsdalo and Davidson ,1986). Как выяснилось, продолжительное ингибирование нитотпчвста циклов и делений клеток не влияло на процесс сомитогенеза. Однако автоматическое перенесение сделанного заключения на другие группы позвоночных вряд ли оправдано .поскольку хорошо известив принципиальные различия в характере и длительности протекания некоторых собьаий раннего эмбриогенеза (в т.ч. и в способах гаструлпщга) у амфибий и ашяот. Более того,показано, что осевая кззодерш зеродазей птвд я илекопктащвх при сегментации отличается от таковой у аифибнй Еначительыо более высокий пролифератпвнш статусом.

В представленной работе предпринята попытка восполнить существующий пробел в окспериыентальноы анализе участия s роли пролиферации в сомитогенезе,проведя такое исследование на зародышах цыпленка и уделив особое вникание очгнь вашой количественной характеристике процесса - скорости сагыгнтацдп.

Был использован традиционный подход,состоящий в выключении на разные сроки клеточной репродукции с помощью ингибитора мятоза-нолхамина. Выбор этого штостатиза в хамстве ев— гибктора клеточного цикла был сделан не случайно. Прежде всего хотелось по возможности избежать проявления несбалансировап-ного синтеаа РНК и белка, вызывающего неконтролируемую гибель клеток. Применение ингибиторов митоза в этом случае предпочтительнее ( *Uler-?aurèa et al. , 1981 ). В то яе время известно, ио колцемид (колхамин) отличается от колхицина менее вы-

раягтошы питотоксическим аффектом .Наконец,как обнаружилось уже в ходе вмзсинения данной работы,длительность митостати-даской активности колхамина в тканях эародьша зависит от ис-польэуеиой концентрации; после полного связывания его с тубу-лкнами в аародыве блок снимается и клетки оказываются в состоянии продол кит ь ыитотический цикл .Эти результаты показали,что с поиоцыэ колхамина при определенных условиях можно получить временный блок митозов и,следовательно,вызвать контролируемую синхронизацию клеток эм5риона ia ото . При зтом возникла воэмогность расширить круг изучаемых аспектов, включив сюда вопрос о влиянии композиционных перестроек популяции сегментируют® клеток.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла во всестороннем анализе участия и роли клеточной пролиферации, ее организации в процессе сомитогенеза эмбрионов цыпленка на стадиях детерминации сонитогенных свойств клеток иезодерш и в период ее вкщшой сегментации .В связи с этим были поставлены следующие задачи;

I.Отработать технические условия продолжительных (до 2-х суток) экспозиций эмбрионов in ovo с инъецированным под бластодерму интостагиком и,преаде всего,решить проблему фиэиоло-ипэского растворителя активной субстанции (см ее контрольная среда).

2 .Дать подробную и по возмошости более паяную характеристику иорфо-фтологичесхкх в хкнетггческкх изменений в изученных популяциях клеток зародышей в момент и после снятия блока кятоаов; оценить уровень и длительность сохранения синхронного состояния. •

3.Провести дифференцированный анализ ыорфоэффекта колхамина (через юверогрубочки цитоскелета или через блок пролиферации) на сокнтогенез и другие иорфогенетические процесса,уделив особое шикание скорости сегшкгащт*

4 .Оценить регуляцяошше возиогносгп клеток вэзодеркы после распой степени пораташа»вызсггашх длительным блоком пролиферации.

Научная ношена. ШерЕа? просаден детаяышЯ корфоцэто- : логический я аоторадио1ра<|д'пский анализ кпиетшта клемчнкз популяций в еачакюх вуряшг е?,;бр:!Сиов о ходе продол гатеяь-

ной обработки митостатическиыи агентами - колхоасшои и колхицином . Обнаружен феномен спонтанного прекращения блока като-

—'— i—^ -— — .а..яяы hmhhijfnjmk »» ппл 11лп flrtlltíft гчмитйш t ti*!' fvp it ít?^ v

¡fUofВаоЫВасм^Ги пиллоиппим^л dwuuuiWimimdiw — ------ —..«vats —

кого цикла. Описаны последовательные этапы восстановления веретена деления и превращения к-метафаз в нормальные ыетафазы, анафазы и т.д. Установлена прямая линеяная зависимость длительности блока от концентрации колхаынна. Обнаружение факта спонтанного деблокирования и способа произвольно изменять продолжительность блока предоставило возможность вызывать контролируемую синхронизацию клеточного цикла в тканях зародила ia evo .

Установлена критическая продолжительность пребывания клеток в состоянии к-ыетафазы; клетки,находящиеся в этой состоянии свыше 6-8 часов .претерпевают пикнотическое перерождение и гибнут .Сделана•попытка обосновать предположение,согласно которому наблвдаемая пикнотичаская деградация обусловлена непрерывающейся в к-матафазе суперконденсацией хроматина.

В работе впервые описаны и проанализированы зависящие от концентрации ыитостатика нарушения скорости новообразования сомитов,степень которых коррелирует с продолжительностью блока штозов.

Научная и практическая значимость. Теоретический интерес представляет главный вывод диссертанта,состоящий в установлении большой зависимости "распространяющихся" морфогенезов,таких как образование и рост первичной полоски.формирование трубчатого сердца и соыитогенеза от количества клеток в местах развертывания этих событий .Ваяны полученные доказательства того,что источником (поставщиком) клеток для этих морфопроцессов у зародышей птиц и .по-видимому, млекопитающих служит клеточная пролиферация,что,несошенно,является важной особенностью эмбрионального развития амниот .Дефицит клеток,вызванный временным прекращением митотических делений или гибелью клеток,преиде всего отражается на темпах протекания указанных морфопроцессов и неизбежно приводит к дисгармонии раз вития. В этом автор видит значение таких количественных характеристик,кал скорость сегментации.

Открытие спонтанной обратимости ыитоетатического эффекта колхамина и основанный на ней относительно простой способ

синхронизации митотических циклов клеток вародышвй цыпленка в яте, делает ягу систему перспективной в исследованиях некоторых современных вопросов цитологии .эмбриологии и молекулярной биологии. Возмодаость вызывания с помощью варьирующих до» колхамина регулируемой гибели клеток несомненно моют быть использована при изучении явлений регуляции типа "реставрационного роста" Сноу, а также механизмов возникновения »мбриопатия в тератологических исследованиях.

Учитывая,что колхамин как противоопухолевый препарат применяется в клинической практике,полученные в работе данные, дополняющие сведения о фармакологических свойствах этого агента,могут быть использованы в медицине.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсувдены на научных семинарах кафедры эмбриологии С-Пе-тербургского университета и лаборатории экспериментальной цитологии Биологического научно-исследовательского института (3161У в 1991-92 гг.

Отруктура и объем диссертации. Работа состоит ив введения,4 глав, содержащих обзор литературы,кетодичесаую часть, результаты я обсуждение; выводов и списка литературы,кигача-вщего 136 источников, из которых 91 - кно странных .Объем рукописи 160 е.,в т.ч. 8 таблиц, 41 - рисунков и фотографий.

КРАТКОЕ ООдаШИЕ РАБОТЫ

Объект и методика исследования. Объектом исследования сдували вибрионы курс кросса High sex taute ш ранних (до 3,5 суток инкубации) стадиях развития .Для обеспечения относительно синхронного развития зародапей яйца в течение сутсз вздергивали при тешературе 12-13° С п 60% пгашости .Инкубация производилась при 38° С 50-60? урогае относительной влажности .Работа выполнялась с вародгаени на стадиях 2,4,5, 6 и 10 (по НавЬогсег aed И anllt са ,1951).

В качгэствэ ингибиторов кяозов нспольсовалп два родст-венньш соединения - яолхкцпн и волхакгн (лозсрстсшиая форка яолцекида). Ннтостатлкп вводила в яйца растюренньэи в разных физиологичзских средах в концентрации ст 2,5 я 10" до 1,0 х I0"6 г/мя. При плпшгрогании денного псслодопгняя учитывались т.гзЕз:0ся в литература увагсипя на ?o,tr?o э уело-

зиях долгосрочных экспериментов с в ведет и ем под бластодерму физиологических растворов может вызывать различные

структурные уродства. Была проведена проверка на нейтральность 9 различных физиологических растворителей; был сделан выбор в польау раствора Howard. , забуференного HEPES, £ ЕЙ - "М-

Физиологическим контролем служили зародыши .которым вводили раствор лгаиколхина - вещества инертного в отношении сборки микротрубочек. Дпмиколхин получали с помощью облучения раствора колхамина ультрафиолетом с длиной волны 346 нм в кварцевых кюветах в течение 1,5 час.

Митостатики и контрольный раствор вводили в яйца через окошечно в скорлупе в объеме 0,1 мл с помощью инъекций под бластодерму зародыша .Окошечки заклеивали ыедпластырем,затеи лаца помещали на реинкубацию. Содержание экспериментов состояло в однократном введении датостатияа с дальнейшей фиксацией зародышей через последовательные интервалы времени .3 зависимости от конкретной задачи максимальная экспозиция варьировала от 12 до 52 час. Для исследования кинетики клеточных популяций а условиях блока митозов за полчаса до фиксации производилась дополнительная инъекция 0,1 ил спаси (лшикол-хин + ^-тамидин) с активностью 92,5 MSi. Снятые с кзлтка с помощью бумажных колец бластодерма промывали в растворе " Howard .ватем фиксировали* в «леей (этанол: уксусная кислота-3:1). Материал тотально окрашивали триоксигеыатеином и гематоксилином Майера с докраскоя эозином или эритрозиноы. После-дущее изучение зародышей проводили как на тотальных препаратах, заключенных в бальзам,так и на срезах и автографах. На тотальных препаратах производили морфологическую оценку характера развития; регистрировали наличие или отсутствие пер-~ вичной полоски,хорды, головной склада, зачатка мозга .количество сомитов,степень развития сосудистой системы и сердца, а также различные отклонения от нормального развития Лри высоких увеличениях микроскопа отмечали присутствие к-митозов, нормальных ыетафаз,анафаз; телофаз.профаз и др. состояний ядерного аппарата,имеющих отношение к митозу. Особо учитывали пикнотические превращения в клетках Да автографах .помимо указанных характеристик .регистрировали относительную долю метеных и немеченых ядер. На поперечных срезах через презуштив-

ную область параксиальной иеэодермы (ранние стадии) или область сегментарной пластинки,где формируется очередной спида,производили подсчет относительного количества упомянута* форы, выражая его в й к общей суше клеток Л од счеты выполняли в неяральной эктодерме и осевой мезодерме в зоне, занивапвеЯ 3 поля зрения микроскопа и имеющей центром зачаток хсрда.На автографах,помимо указанных характеристик в этой области »регистрировали такта относительную долю меченых и немеченых ядер.результаты количественного анализа обрабатывались с помощью методов вариационной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ К ОБСУГ^ШИЕ

I.МорДюпитологические и кинетические особенности мкто-тичеекого эмбриона, вызванного продолжительным воздействием колхамина Доказано.что колхамин в широком диапазоне концентраций, будучи введенным под бластодерму, вызывает у куриных эмбрионов остановку митозов по крайней мере через 10 мик. после инъекция .Как я в экспериментах с колхицином,в опытаг с волхаминоы количество к-ыетафаз нарастает по мере прсхов-деншг клеток по ютотическому циклу .Причем до определенного иокента наблюдается устойчивое блокирование,о чем говорит отсутствие снафзз и теяофаз. Блокированные когхамЕноы ми-?озн не отличаются от еолхициноеых к-«етафазЛлотшй комок ароыосоя,отсутствле ядерной оболочки, ?щ>ьнег и никаких признаков веретена деления - таковы шеанпз проявления этой анокалшой фзрны ютоза у куриного зародыша.

• Однако в отлптаге от действия колхицина блскирукзий эф-фест кодггосна не продолгается бесконе^зго: по истечении оп-ргдегеккого гремела га згшстатировали снятие блока и рестав-ргипв агзттоза»так и других гшкятсескнх процессов в клетке . Дэкагетельстэсм зидогенного деблокирования колет слугсть ггоогресетшое снигегше в ходе гкспернкекта доли зародызеЕ г тяппчтва а-катафазта гдаоть до патаого пг тевзиовешниеь.. рнеЛ па

•■Д|ругеэ аодтпгрЕдссте снятия блоха етпет шдеть в ггде-ннп процента я-ютозов у йфмулзей.пгжиая .о оярвдшгеянагэ спета посео введения пикб£сс?а,в слагая с Спт8.2) '.(^ймгоскапв постоянно отиэчахоеь кассовое пздаг-нке нстагаяшиг {с взрзгевоа) 'кагафаз и анафаз в огагазг

териале. Это явление напоминает картины,описанные в культурах клеток после отмывки от ингибитора ( »г1акХлу ев «1, 1967; ВяхЬш Ьг1Ыс1ву1376).

Рис. "П.

Рис.1. Изменения доли зародышей,содержащих к-ыитозы

(сплошная линия) и фигуры восстановления(точеч-ная линия).после инъекции колхаыина в концентрации I х Ю-о в/мл и 5 х 10-' г/мл зародышам 38 часов инкубации

В отличие от описанной последовательности событий при наблюдаемом эндогенном деблокировании у куриных зародышей преобразования начинается с одного промежуточного этапа,состоящего в появлении т.н. "рыхлых" метафаз.Это округлые клетки без ящерной мембраны и едратка.но конденсированные хромосомы в них располагается рыхло в центральной зоне клетки,на некотором расстоянии друг от друга,так что можно установить

- 9 -

z количество; при этом веретено не просматривается^ одних тех гэ зародьшей в разных областях мошо видеть"р1шше"ме-афазы с хромосомами .рассеянными в разной степени.Рыхлые ме-афазы переходят затем в типичные метафазыЛри изучении на то-альных препаратах таких типичных,нормальных метафаз,видим, то их хромосомные пластинки имеют веретено и почти всегда располагаются ортогонально к поверхности бластодермы в виде ¡-югочисленных палочек .На смену этим фигурам скоро появляются ормальные анафазы,затем переходящие в интерфазы,что вырагает-я в почти полном исчезновении митозов.

В работе показано,что продолжительность метафазного бло-а митотического цикла клеток эмбрионов находится в прямой явисимости от концентраций вводимого мит о статика и обратной-г возраста зародыша.Это позволяет предположить,что наступ-ение момента деблокирования в конечном счете определяется оличеством молекул свободного (несвязанного) колхамина в уббластодермальном пространстве,откуда ингибитор поступает клетке зародыша. Пока нет данных »позволяющих дать удовле-ворительное толкование спонтанного снятия ютостатическогс лоза,равно как ъ- причин,лежащих в основе отличий дейст-ия колхицина и колхамина.Высказано предположение,что колха-ин,отличающийся по общему признанию менее токсичным действи-м,не подавляет в клетке синтез белков, в т.ч. а тубулшов. о мере образования новых тубуляновых димеров, создается насы-ение,ко1\ца все молекулы ингибитора уяэ связаны .При этом сбора микротрубочек более не встречает препятствий и течение ормального митоза возобновляется. Колхицин яэ .помимо с вязы-ания с тубулинами,блокирует и синтез белков,пока лрисутству-т в клетке .Основания для такого предположения мошо обнару-ить в работах,где показано,что для восстановления нормально-о митотического аппарата после воздействия колхицином совер-енно необходим дополнительный синтез белка .тогда как при ействии кольцемида восстановление происходит в результате епояимеривации пред существующих тубулшов boucfc «ad В гота 970;Асрлз и Старосветская,197?)•

При использовании нолхамияа в концентрациях 4 х 10" к ыше, вызывающего длительную остановку митозов,в большинстве аших экспериментов черев 7-8 час.наблвдазш рвзков прохрео-

- 10 -

сивное нарастание числа гибнущих клеток, находящихся на разных стадиях пикнотической дегенерации. Процесс пикнотизации был особо выражен при обработке колхамином в концентрации I х очаги пикнозов обнаруживались, как правило,в непо-

средственном соседстве с зонами к-митозов. Это явление не отличается от некротизации, наблвдаемой на поздних сроках обработки колхицином. Чаще причину гибели клеток при воздействии антитубулинами усматривает в повреждениях митотическо-го аппарата и связывает с высокими дозами агента. Значительно меньше внимания уделяется времени пребывания клетки в блокированном состоянии. Подтверждением важной роли, которую играет в переводе клетки на путь пикнотической гибели длительность ее нахождения в блокированном к-митозе, может служить наблюдаемое нами наличие в одаом и том же зародыпе после 3-часового блока как фигур восстановления и нормальных митозов, так и пикнозов, одновременно. Можно думать,что в подобных случаях пикнозы - это клетки .которые, находясь в начале эксперимента в G>>, первыми входят в митоз и,следовательно, пребывает в состоянии к-метафазы максимальное время, тогда как для клеток, вошедших в митоз позднее, это время оказывается короче критического, в они после снятия блока возобновляет течение нормального митоза и клетошого цикла. Т.о., окончательная судьба клетки вависнт от времени ее нахождения в блокированном состоянии-Если длительность блока не превышает б часов, то клетки оказывается способными в кратчайший срок (около I часа) нормально завершить митоз и перейти в интерфазу . В случае,если блок растягивается до 8 часов и более, наступают необратимые изменения,возмошо вызванные гиперконденсацией хроматина, и клетки так же,как и при обработке колхицином, вступают на путь пикнотической дегенфации.

При обработке колхамином в умеренных концентрациях наблюдается существенное преобразование кошозиции изученных популяций клеток (распределение клеток по -фазам митотическо-го цикла) .выражающееся в значительном повышении их синхронности без заметных изменений характеристик клеточного цикла. Эта наведенная синхронность достигается за счет относительно высокого уровня (до 35%) митозов после снятия блока и сохраняется на высоком уровне в течение следующего за деблоки-

рованием китотячесвого цикла {см.рис.2). Обнаруженные кинетические различия «евду мезодермоЯ и эктодермой обусловлены

«к

за

:о

»9

/1

г ' '• 2

' ( : / 3 О

I -

. п....

3

90 75 60 45 30 15 О

\

V /и

V /

V

в 10 12 14 16 ч.

г 1 в в ю ц и 16 ■!.

60-г»

«5

га

■о 2 -О_э

2 4 6 в 10 12 14 1В РВв. и)

Рис.2. Динамика изменения процента к-метафаз (1).митоз(2),

пикнозов (3), меченых (4) и немеченных (5) ядер параксиальной мезодермы 18-часовых куриных эмбрионов,меченых зН-тимидином.после различной экспозиции с холха-ыином з дозе 4 х 10"' г/мл а и б - опыт; в -контроль. Абсциса - время после инъекции митостатика; ордината - гтсцен? клеток.

1

-•iz -

прещпе всего исходно равной вариабельностью некоторых параметров клеточных циклов в вгкх вачатках. Показано,что меньшая дисперсия характерна для параксиальной мезодермы, чтг связано с изначально более высокой степенью синхронности ее клеток. В этом отношении наши наблюдения хорошо согласуются с результатами работ других авторов. Так,экспериментами на куриных зародышах (Ефремов,1976; Ефремов и Сер-говская,1Э79; Ефремов и др.,1980; Stera and B«ll&ira , 1984; Priaaet et al , 1989) и эмбрионах мьией { Snow, 1977) был установлен параеннхрогашй характер пролиферации клетож-мезодермы в период гаструляпии и во время сомитогенеза .Описанная кинетика клеточных популяций наблюдается при коротком (не более 5-6 часов,т .е .короче одного митотического цикла) блоке. В этих случаях,как установлено, подавляющее большинство клеток сохраняет способность к возобновлению нормального цикла.

Вызванные высокими (5 х 10"' т/т и вше) концентрациями колхамина условия длительного блока, значительно превышающего клеточный цикл в зачатках куриного зародыша, несмотря иа более высокий уровень к-метафаз, тем не менее не приводят к соответственно более значительной синхронизации после деблокирования. Это несоответствие обусловлено гибелью большей части (до 80%) синхрониэкрованной фракции клеток,о чем свидетельствует прохрессишо нарастающее количество пик-нозое, особенно в мезодерме сегментарной пластинки и первичной полоски. .

2.Морфогеяетяческий эффект колхамина на развитие куриного эмбриона на стадиях гаструляции и раннего сомитогенеза.

Обработка колхамином яяродшей в начале 1<асгруляции, на стадии ранней полоски вызывает отчетливый морфоэффект, проявляющийся в двух формах .Это, во-первых, непрерывное во время блока митозов замедление развития у всех эмбрионов,вы-раненное в виде торможения разрастания бластодермы по взятку, снижения темпов роста az*a p*llaeida .первичной полос- . ки и самого зародыша, с последующим ускорением основных мор-фопропессов у половины зародышей. И,во-вторых, полное прекращение развития осевого «омплекса зачатков после снятия блока у другой половины эмбрионов с дальнейшей их деграда-

щгеЯ. Столь выраженные различия з судьбе зародимЯ, испытавших влияние метостатяка,могут бить объяснены некоторой разницей я их возрасте к моменту введения антитубулина.Зародыши, досгигаяе к моменту снятия блока стадии дефшитивноя полоски,продолжает развитие в ускоренном теше.

Таким образ ом,полученные данные а определенном смысле подтверждает результаты известных опытов Кука (соок»»1973), выполненных на эмбрионах амфибий.3 аналогиодых экспериментах Кук показал принципиальную возможность морфо генетических процессов,включая гаструлясию.неяруляпию и ранний органогенез,с со ответ стнутзсея гистодифференпиапиея зачатков, несмотря на длительную блокаду клето^иых делений и существенное недопроизводство клеток зародыаа. При этом он такав констатировал значительное тормовение развития. Вместе с тем результаты нате го исследования обнаруживает вашое отличие от полученных Куком. В над ем случае продол еать развитие оказывается способными не все эмбрионы,а лишь проведшие стадию средней зародшевой полоски.Уогно думать,что такая разная реакция зародьнеа аыфнбий и птиц, находящихся в начале га-струляпии, на действие ингибиторов клеточных делений связана с разнны значением фаатора количества клеток в успешном протекании большинства шрфогенетичзегах процессов у представителей этих классов позвоночные. Именно в силу большей зависимости процесса гаструляцни от количества клеток у куриного экбриона (да и у зародыша шля) просматривается определенная связь этого процесса с клеточной пролиферацией и митотическим циклом.

Что касается влияния колхамнна на начало п ход сегментации, то на основании полученных данных моето заключить, что на детерминации сомитогенных потенций и начальной разметке презумптивных сомитов, которая происходит как раз на стадии средней полоски (11хр1е« аМ Па'цат ,1982; ^еоЪзоа , Т9В8),блоя клеточного цикла и наведенная парасинхронность пролиферации не сказывается; сомитогенез начинается своевременно и протекает с нормальной скоростью.

Для того,чтобы опенить влияние колхаминового блока клеточных делений на - инициацию сомитогенеза у куриного эмбриона,был поставлен опьгг,в котором зародышей на стадиях голов-

- 14 -

но$ отросток - головная складка, параксиальная мезодерма г. торш ут организована в виде блока сомитомеров ¡juj«r ,1979), инъецировали актктубулкном в дозе 2,5 * 10"' г/ил. Выбранная концентрация обеспечивала короткий, 3-часовоя блок митозов,который снимался непосредственна перед или в момент начала видимой сегментации ti не вызывал появления пиенозоб.

Анализ хода развития а опытной и контрольной партиях лиц показал отчетливее аадариу развития в первые 4 часа после инъекции кшгхашна и приблизительно 6-часовое аапаадыва-ние появления сомитов 3 пасл едущие 8 часов экспозиции темп марфогенетичесхнх процессов существенно возрастает,т.ч. по уровне развития и по появление сомитов экспериментальный материал в массе своей догоняет контроль.Расчеты средней скорости прироста числа сегментов,начиная со времени их появления,у обработанных зародышей показывает тем не менее,что темпы сегментации в опытном к контрольном материале в последние 36 часов в*спазкции абсолютно одинаковы, «ото думать,что наблюдаемое 6-часовое-запаздывание начала сомитогенеза является сладетвкем общей аадершеи развития зародыва в целок и его отдельных систем .Длительность отреака. мевду стадией головного отростка и стадией 7,когда возникает первая видимая граница между сегмент прущейся в несегаштированнс?. порциями меаодер-столь коротка,а события,совершающиеся га aro время, столь значительны, что, оожэдуй. моюо говорить о сшаротноа» sos-ншеновения 12 сомитомеров. Естественно покатать,тао vasos энергичный мерфогеаетттаекмй акт возмошг *ольао при максимальной готовности всех звеньев системы септнташш к, npes- . де всего,при достагодаои количестве детерминированных кхеток. Система пополняется влегкамн аостепгкно в хсще рехреесии первичной полоски,начиная со стада» 4 в 5. Поэтову весьма вероятно, что дяке крахковреишшаа бдокБда штозов, аадервнва?; развитие »неизбешо нбруаает готовность системы сеиязя-ассс дефицит клеток,вызванный кг недопроиввадством в результате блока, будет ощушаться в течение с «sacos, гсоада баньте часть восстановившихся от блока елвтсе,разделигззгеь,перейдет в % t см .рис .2}. Наведенная <жнш»шосгь ке сказывается ка возмое-нссти возобновления развития к на скорости соиятогодеза с :;:срмкг, овакия сердца.

- Г5 -

Дня изучения злияния яолхамина на сегментацию мезодермы з период активно протекающего сомитогенеза были поставлены несколько экспериментов,а которых объектом служили эмбрионы на стадии 9+, содержащие в среднем 9 пар сомитов.3 этой части работы нас првяде всего интересовали принципиальная возможность соыитогенеза и тедаы сегментации при вы-раяенном исяаяеяии пролиферативного статуса систем,участвующих в этом процессе со всеми сопутствующим* явлениями, з т.ч. и дефицитом клеток. С этой «елью были подобраны условия, вызывающие раздоя длительности блокирование клеточного цикла. Результаты этих экспериментов свидетельствуют, что »начиная с дозы 4 х I0"7 г/ил, митостатик вызывает разнообразные клрушения развития. Наиболее чувствительными оказываются производаые мезодермы; задерживается развитие сердца,замедляется,а при концентрации I х Ю"6 практически превращается новообразование сомитов,возникают аномалии уже сформировавшихся сегментов. Этот эффект икзэт выраженный дозоза-висимый характер (рис.£).

В исследованиях влияния шяоста»иаов на морфогенез при интерпретации получаемых результатов необходимо учитывать двойственную природу вызываемого эффекта (через ыикротру-бочки ютотичесаого перетона или ьгатротрубочки цитоскеле-та). Достоверно известно,что последние чувствительны к ан-титубулинаы в широком диапазоне концентраций»вплоть до очень низких (5 х 10. г/мл) ( Harri<iet ai ,1978).'После удаления ингибитора их сборка начинается тотчас и заканчивается очень быстро,так что те морфопротесса, которые совершаются при прямом участии цптоплазкатических микротрубочек, например, эпиболия или разрастание гипобласта ранних куриных эмбрионов, восстанавливаются также в течение очень короткого проиеяутка времени (до 2 часов) ( Пате el et al , 1984). После удаления тем или иным способом свободного колпеыида из окружающей среды очень быстро возобновляется процесс сборки мянротрубочек и веретена,и цитоскелета. Поэтому восстановление нормальных митозов мояет слуаить показателем сборки скелета клетки. Восстановление нормальной скорости сомитогенеэа после снятия блоков в наютх экспериментах указывало бы на участие микротрубочек цитоскелета в процессе

40 1 парк с цмч и»

0 I , ,, —.—.—-------—

3 6 9 12 15 1821 24ч

Рис.5. Прирост числа сомитов в опытах с кодхамином (исходная стадия 38 часов инкубации). Ордината - число пап сомитов; абсцисса - время экспозиции с мито-статиком (в часах) .1 - биологический контроль (не-инъецированные яйца); 2 -физиологический контроль (инъекция люмиколхина): £ -колхамин (5 х 10""' т/ мл): 4, — колхамин Г) х 10-° г/мл); 5 - колхамин (4 х ТО-7 г/мл).Тонкими сплошными линиями обозначены соответствующие линии регрессии.

*ср«5трованяя новых сомитов.Однако з данных экспериментах этого но происходит (рис.2). а"ро:«э того,нами не обнпругкно нарушение скорости сегментации при использовании шгтостати-ка з доза к 1С"' г/мл, хотя эта доза несомненно вполне дсстатс^а, чгсби вызывать дезорганизацию цнтоплазматичэско-го комплекса «икрс-трубочек. Учитывая эти обстоятельства,мы полагаем,что влияние колхаыина на сегментацию совершается ко через разрушение питоскедета.

3 отличие от экспериментов с применением 5-Зром-дезо-ксиуркдина,аьпывчгг,его стабильные модификации биохимического фенотипа тканей н органов,не изменяя пролифератипную активность и жизнеспособность клеток { аи«ег , 1975; Ьоо ао!

£а1ааа 19781,а напих опытах спектр поражаемых зачатков не меняется от стадии к стадии. Поэтому етгно думать,что колха-кип не влияет на дотерминециз клеток в направлении образования соштоэ.

Проведенный анализ показал,что появление большинства описанных нарупений развития обусловлено нехваткой клеток, участвуг-зос в норфспрсцессах. Дефтг? возникает во время т-тостатнчзского блока в связи с недопроизводством клеток в результате остановки деления Лосле превращения действия кол-хамика нехватка клеток вызывается гибельэ части блокированной фракции Лри этом дефицит на всех этапах эксперимента сказывается тем значительнее,чем продолгительнее блок и чэм пыле пролиферативная активность ткани. Именно поэтому от подобного воздействия болызе всего "страдает" зачатки, морфогенез которых совершается на фоне активной прояеферации. В частности, наиболее ощутимые нарушения наблюдается при сегментации параксиальной кезодерш.

Таким образом, цитокснческий эффект высота доз полбайта у зародьаеа птиц изначально обусловлен выключением звена клеточной пролиферации з общей цепи собыгий морфогенеза йомитов .Аналогичные результаты, полученные с друтагл ингибиторами клеточного цикла (например, с ыитстящином - С) у ргш-них эмбрионов мыля (Эпоэ , 1983), наводят на мысль, что здесь мы имеем дело с общей,свойственной всем а»,киотам особенностью. У зародапея ашиот в отличие от амфибий очень велико значение непрерывного производства клеточного мате-

- 18 -

риала,в следовательно к клеточной оратфератт,обеспечивавшей в?о производство »для ссузеетвЕгявя кзрфагенеаов.

£ Ы Б 0 ¿, £

I Латают (фвриакологеческая форма колаемкда) вызыгв-ет остановку мктоаа в клетках куриного эмбриона,переводя гг в состояние книетайазы. Б отлкчке от когхетвна, действие которого в аародыве необратимо ,колхамин создает лить временник блок характерных событие матова. Длительность етого блоке зависит от количества несвязанного ингибитора,т .е. определяется исходной коипентрапией.Исчерпывание запаса свободного колхамкна в тканях зародила возобновляет пршесс сборки кил-ротрубочек (в теш числе и веретена деления).

2.Окончательная судьба клетки зависит от времен* ее пребывания в блокированном состоянии .Если длительность блоке не превышает 6 чассв.то клетки способны в кратчаягкй срок завершить митоз и переяти в янтерфазу. (Описана морфология последовательных: этапов восстановления нормального течения митоза). Если блок растягивается до 8 пасов и более .наступают необратимые изменения, и клетка, так же,как орт! обработке кптицином,пкреходяг на путь пиквотической дегенерации.

ЗЛрн обработке зародшея кояхамвном в умеренных дозах достигается отчетливое преобразование композншп? изученных популяций клеток,выражающееся в существенном повышении степени их синхронности без заметных изменений мятотеческого тягла Заведенная синхронность сохраняется на высоком уродае в течение,по крайней мере, одного цикла. Обнаруженные кинетические различия меиду эктодермой и мезодермой обусловлены исходно разной вариабельностью некоторых параметров клеточных циклов в этих зачатках.

4-Условия длительного блока,вызванные высокими концентрациями (5 х 10"' г/ж и вше) кслхамика, несмотря на повышение процента к-мвтоаов, тем не менее не обеспечивают по-вышннуе синхронизацию популяций после снятия блока .Это объясняется габелыо значительной доли синхронизированной фракции клеток., о чем- свидетельствуют кассовые пикноаы, в особенности в мезодерме сегкентраной пластинки и в первичной

:э

полоска.

о. .-{олхзмян вызывает разнообразна нарушения развития, гключагаие тормояемие эпиЛолия,роста полоска и отдельных облаете Я эыбрисиа.задервху образования сердца и сомитов,за-игдление.а при высоких дозах ыятостатяка,и прекращение сег-»ягнтатга параксиальной мезодермы.

5. 5 большинстве случаев отмеченные наруоения не связаны с изменением свойств ялетса, обусловленных состоянием ттгоскелета,но сопрягены с недостатком количества клетоя,яо-торое необходимо для нормального протекания морфопрсцессов, э условиях длительного подавления клеточных делений и гибели клеток после снятия блока. Нарушен;« сегментация являются ярким примером подобных отношений.

7.Изменения композиции алето«8шх популяций в результате продолзительногэ блока ютозоо нэ злиятгг на детерминацию сомитообразующнх свояста 1гззодер1£а,незавасям> от того, на хакоя стадии развития эта изуэненил вызызаются.

8. Сопоставление представленных результатов с данными литературы позволяют заагшчять,что у аитаот в отличие от амфибий процесс сомзгеогенеза (н,по-тщ1вгоиу,другая морфопро-цессы) существенно зависит от пролиферации - гаашого поставщика клеточного материала.Шжнно состопнпеа процесса клеточной репродукции у высших позесночных определяется степень и выражение регуляционных возмошостея при сегиэн-

тапии