Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Влияние кастрации на параметры иммунного ответа у мышей B6D2F1

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Влияние кастрации на параметры иммунного ответа у мышей B6D2F1"

На правах рукописи

АРСЁНОВА Светлана Андреевна

ВЛИЯНИЕ КАСТРАЦИИ НА ПАРАМЕТРЫ ИММУННОГО ОТВЕТА У МЫШЕЙ В6Б2Р1 ,

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005011560

9 ОЕВ 20Т2

Новосибирск - 2012

005011560

На правах рукописи

АРСЁНОВА Светлана Андреевна

ВЛИЯНИЕ КАСТРАЦИИ НА ПАРАМЕТРЫ ИММУННОГО ОТВЕТА У МЫШЕЙ В6Б2Р1

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2012

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и микробиологии в ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Масычева Валентина Ивановна,

кандидат биологических наук Ефанова Нина Владимировна

Ведущая организация: Институт ветеринарной медицины ФГБОУ

ВПО «Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина»

Защита состоится « 29 » февраля 2012 г. в « 13-00 » часов на заседании диссертационного совета Д 006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Рос-сельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат диссертации разослан «_» января 2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.М. Стеблева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Кастрация — одна из самых распространенных операций в ветеринарной практике. Хирургическое удаление гонад также широко используется как метод в экспериментальных исследованиях для изучения им-мунофизиологических механизмов действия половых стероидных гормонов. Известно влияние гонадэктомии (GE) на некоторые параметры иммунной системы. Установлено, что возрастная инволюция тимуса ускоряется во время полового созревания - периода, когда резко возрастает уровень половых гормонов (А.А. Ярилин, 2003; С.С. Whitacre, 2001). В результате кастрации останавливается возрастная инволюция тимуса и наблюдается его гиперплазия (J.S. Sutherland, 2005; F.F. Safadi, 2000; F. Fitzpatrick, 1991). В литературе имеются данные, свидетельствующие о половом диморфизме в иммунном ответе, который обусловлен половыми стероидными гормонами (О.Т. Кудаева, 2005; М. Myers, 1972). Так женские половые гормоны - эстрогены - обладают стимулирующим влиянием на гуморальный иммунный ответ. Повышенное антителообразование может сопровождаться появлением антител против собственных тканей организма. Тестостерон, напротив, угнетает гуморальный иммунный ответ, а значит, снижается риск проявления аутоиммунных реакций (Ch.J. Grossman, 1984; N.J. Olsen, 2001). В литературе описано усиление антителообразования после кастрации у мышей, крыс (D. Edinger et al., 1972; В. Tartarcovsky et al., 1981; E. Ainbeder et al., 1968), хряков (H.B. Ефанова, 2006). При этом антителообразование у кастрированных самцов становится более интенсивным, чем у самок (D. Edinger et al., 1972). Показано, что спонтанный и стимулированный синтез IgM, IgG, IgA клетками селезенки in vitro кастрированных мышей не отличается от интактных, но клетки селезенки кастрированных животных синтезировали высокие уровни аутореактивных антител, антител против IgG (ревматоидный фактор) и тиреоглобулина (S.M. Viselli et al., 1995). Возникает вопрос -возрастает ли риск развития аутоиммунных реакций в организме при такой усиленной продукции антител и является ли этот «аутоиммунный компонент» одним из этиологических факторов, который приводит к увеличению частоты болезней нижних мочевыводящих путей вследствие орхидэктомии?

Известно, что хирургическое удаление гонад приводит к возникновению различных патологий, ухудшающих качество жизни животных, таких как ожирение (M.J. Fettman et al., 1997; M.L. Kanchuk et al., 2002; P.G. Nguyen et al., 2004), сахарный диабет (M. Hoeng et al., 2002; M.L. Kanchuk et al., 2002), гипо-тиреоидизм (K.L. Milne et al., 1981; D.L. Panciera, 1994) и др. Также показано, что у животных кастрация приводит к увеличению частоты болезней нижних мочевыводящих путей (W. Stubbs et al., 1996; С. Lekcharoensuk et al., 2001; C.V. Spain et al., 2002). Однако конкретные механизмы развития патологии почек у кастрированных самцов, участие в этом аутоиммунных компонентов, воспаления изучены мало.

Одной из моделей аутоиммунных нарушений, активно используемых в экспериментальных работах, является модель на основе хронической реакции

трансплантант против хозяина (РТПХ) в полуаллогенной системе DBA/2->(C57BL/6 х DBA/2)F1 (когда клетки селезенки одного из родителей, самок линии DBA/2, вводят внутривенно гибридам первого поколения) (C.S. Via et al., 1991). Несмотря на генетическую однородность реципиентов, при индукции хронической РПТХ в системе DBA/2-> (DBA/2 х C57B1/6)F1 было обнаружено, что реакция может идти по двум направлениям: у 50-60 % самок мышей развивается аутоиммунный гломерулонефрит на фоне супрессии клеточного и гуморального иммунитета, а у остальных мышей отсутствуют выраженные проявления поражения почек, и к тому же резко выраженная супрессия гуморального иммунного ответа не сочетается с супрессией клеточного ответа (О.Т. Кудаева, 1993). Развитие иммунного ответа по клеточному или гуморальному типу связано с преимущественной активацией клонов Т-хелперов 1-го (Thl) или 2-го (Th2) типа, которые различаются по своей функции и по спектру экспрессируемых цитокинов. Тип аутоиммунного заболевания, обусловленный аутоантителами или аутореактивными Т-лимфоцитами, определяется преобладанием соответственно либо Th2-, либо Thl- клеток (В.А. Козлов, 1997).

Течение хронической РТПХ у самок может быть направлено по двум разным путям: с преобладающим влиянием ТЬ2-клеток (группа lupus, в которой развивается иммунокомплексный гломерулонефрит) или Thl-клеток (группа nonlupus без развития нефрита) (О.Т. Кудаева, 1993). Иммунопатологическое состояние, возникающие в результате индукции РТПХ, хорошо изучено и описано на самках и практически нет данных о возможности индукции этого состояния на самцах. Индукция РТПХ, а также исследование некоторых параметров иммунного ответа у кастрированных самцов позволит выяснить некоторые особенности функционирования иммунной системы у животных после проведения кастрации.

Цель исследования. Изучить влияние кастрации па параметры гуморального и клеточного иммунного ответа в динамике у интактных мышей гибридов F1 и частоту развития аутоиммунного расстройства в экспериментальной модели.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние кастрации на массу и количество ядросодержаших клеток тимуса и селезенки у самцов гибридов B6D2F1.

2. Исследовать влияние кастрации на гуморальный и клеточный иммунный ответ у самцов мышей B6D2F1.

3. Изучить особенности течения реакции «трансплантат против хозяина» у кастрированных самцов гибридов B6D2F1.

Научная новизна работы. Получены данные по усилению интенсивности гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у кастрированных самцов B6D2F1. Отмечено повышение ГЗТ у мышей в разные сроки после проведения кастрации.

Выявлено повышение иммуноглобулина класса Е в сыворотке крови интактных кастрированных самцов B6D2F1 через 5 и 12 недель после проведения

операции и кастрированных самцов B6D2F1 с ТЬ2-вариантом течения хронической РТПХ.

Впервые установлены различия в содержании тестостерона в сыворотке крови у самцов с Thl- и Th2- вариантами течения хронической РТПХ в системе DBA/2->(C57BL/6 х DBA/2)F1. Выявлено, что развитие иммунокомплексного гломерулонефрита у интактных самцов после индукции РТПХ приводит к резкому снижению тестостерона в сыворотке крови.

Показано, что кастрация самцов приводит к уменьшению числа животных lupus в экспериментальной модели, и баланс Thl/Th2 клеток у оперированных самцов сдвигается в сторону Thl, т.е. преобладания числа животных nonlupus. Установлена возможность модуляции течения хронической РТПХ у кастрированных животных под действием препарата, изменяющего соотношение Thl/Th2 в момент индукции реакции у самцов B6D2F1. Введение MDP приводит к увеличению числа мышей lupus с аутоиммунным гломерулонефритом.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные представляют дополнительные сведения о механизме иммунореактивности у кастрированных самцов. Показано, что кастрация приводит к усилению интенсивности специфического первичного и вторичного гуморального и клеточного иммунного ответа у интактных самцов гибридов B6D2F1. Кастрация самцов B6D2F1 до или после индукции аутоиммунного расстройства снижает риск развития аутоиммунных реакций в организме, обусловленных аутоантителами. Однако введение кастрированным самцам B6D2F1 бактериального антигена (мурамилдипептида), который вызывает поликлональную активацию В-клеток и усиливает стимулирующее влияние ИЛ-4 на активированные В-лимфоциты, в момент индукции аутоиммунного заболевания увеличивает риск развития аутоиммунных реакций - число случаев иммунокомплексного гломерулонефрита возрастает. На основании полученных данных рекомендуется проводить профилактику бактериальных инфекций мочевыводящих путей и ограничение использования иммуностимуляторов поликлонального действия у кастрированных самцов, как факторов провоцирующих поражение почек.

Апробация полученных результатов. Основные результаты работы представлены на трех этапах Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (Новосибирск, Омск, Москва, 2008, 2009), на VII Межрегиональной конференции молодых ученых и специалистов аграных вузов Сибирского федерального округа (Новосибирск, 2009).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Уральский вестник медицинской академической науки», «Вестник НГАУ»).

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 128 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения результатов исследования, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложения. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 9 таблицами. Библиографический

5

список включает 240 источников, из них 29 отечественных авторов и 211 - зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изменение массы и количества ядросодержащих клеток тимуса и селезенки у самцов мышей B6D2F1 в посткастрационном периоде.

2. Показатели гуморального и клеточного иммунного ответа у самцов гибридов B6D2F1 после кастрации.

3. Влияние кастрации на течение хронической РТПХ у самцов гибридов B6D2F1 в системе полуаллогенного переноса.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Материалы и методы исследования

Работа выполнена в 2006-2009 гг. на кафедре эпизоотологии и микробиологии Новосибирского государственного аграрного университета, часть исследований проведены на базе Научно-исследовательского института клинической иммунологии СО РАМН.

Животные. Экспериментальные исследования проводились на самцах мышей - гибридах первого поколения (C57Bl/6xDBA/2)Fi B6D2F1, самки DBA/2 9-16 - недельного возраста.

Культуральные среды и реагенты. Питательная среда — RPMI-1640 (НПО «Вектор»); физиологический раствор, забуференный фосфатным буфером рН 7,4 (ЗФР); краситель - Kumsai brilliant blue (Loba Feinchemie); уксусная кислота (РеаХим); соляная кислота (РеаХим); комплемент морской свинки (НПО «Биомед», г. Пермь); Tween 20 («Sigma»); этиловый спирт; мурамилди-пептид («Sigma»), эритроциты барана (НПО «Вектор»),

Кастрация. Опытным мышам проводили кастрацию открытым способом с использованием Zooletil™ в качестве наркоза в дозе 5 мг/кг. Ложноопериро-ванных животных (ЛО) погружали в наркоз и делали разрез на мошонке.

Подсчет количества лейкоцитов и лимфоцитов. Подсчет абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови проводили в камере Горяева (разведение 1:20), подсчет относительного количества лимфоцитов проводили по Романовскому - Гимза.

Определение массы и количества ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке. Массу тимуса и селезенки определяли путем взвешивания. Количество ядросодержащих клеток тимуса и селезенки подсчитывали в камере Горяева и рассчитывали по формуле

^ Ах20 . , тг /1x200 „ ,

Kt =-х4,5; К2=-х4,5,

1600x1/4000 1600x1/4000

где Kj — количество ядросодержащих клеток тимуса; Кг- количество ядросодержащих клеток селезенки; А - количество клеток, подсчитанное в 100 больших квадратах; 1600 - количество маленьких квадратиков в 100 больших квадратах (100x16=1600); 1/4000 - объем счетной камеры (1/4000мкл); 20 -

б

степень разведения клеток тимуса; 200 - степень разведения клеток селезенки; 4,5 - объем (мл) суспензии тимуса (селезенки).

Определение первичного и вторичного гуморального ответа на Т-зависимый антиген (эритроциты барана ЭБ). Количество антителообра-зующих клеток, синтезирующих антитела класса М, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 5-е сутки после внутривенной иммунизации эритроцитами барана в дозе 107/мышь по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом (A.J. Cunningham, 1968). Расчет абсолютного количества АОК проводили по формуле

A6c.AOK = kAOKxVhxR Vk

где Абс. АОК - абсолютное количество антителообразующих клеток; кАОК - количество антителообразующих клеток на камеру;Ук - объем камеры; Vks - объем клеточной суспензии; R- разведение.

Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса G, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 9-е сутки после внутривенной иммунизации 2%-ным раствором эритроцитов барана (A.J. Cunningham, 1968). Для определения вторичного гуморального иммунного ответа проводили внутривенную иммунизацию 2%-ным раствором ЭБ в дозе 0,5 мл двукратно с интервалом 30 дней. Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса G, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 4-е сутки после повторной иммунизации по методу J. Sterzl, I. Riha, 1965.

Оценка клеточного ответа на Т-зависимый антиген. Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа по методу A.J. Crowle, 1975.

Хроническую РТПХ осуществляли путём переноса самцам B6D2F1 лимфоидных клеток родительской линии - клеток селезенки самок DBA/2. Вводили клетки селезёнки, выделенные ex tempore, в стерильной среде RPMI-1640. Каждая мышь-реципиент получала по 150x10б клеток путём внутривенной инъекции в хвостовую вену в объёме 0,5 мл среды двукратно с интервалом в пять дней.

Содержание белка в моче определяли колориметрически с красителем Kumsai brilliant blue (Loba Feinchemie) с помощью Titertec Multiskan, длина волны 570 nm; калибровочную кривую строили по BSA 100-1000 мкг/мл.

Мурамилдипептид (MDP) водили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг массы тела в первый день переноса полуаллогенных лимфоидных клеток и через 10 дней.

Иммуноглобулин Е в сыворотке определяли иммуноферментным методом ELISA (BD OptElA™) с помощью Titertec Multiskan, длина волны 450 nm.

Тестостерон в сыворотке определяли иммуноферментным методом EL1SA (ИФА-БЕСТ™) с помощью Titertec Multiskan, длина волны 450 nm.

Морфологический анализ органов мышей-гибридов В6Б2Р1 как ин-тактных, так и с РТПХ, индуцированной иммунопатологией проводили методом обзорной микроскопии и общегистологическими полуколичественными методами совместно с сотрудниками Института клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, канд. мед. наук В.А. Логиновым и канд.мед.наук Л.А. Обуховой.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась в соответствии с общепринятыми методами статистики, с использованием прикладного рабочего пакета статистического анализа «8ш1зйса у.6.0». Для представления количественных данных, не подчиняющихся нормальному закону распределения, применялся непараметрический критерий Шее! Манна-Уитни (Е.В. Гублер, 1978).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Влияние кастрации на количество лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови, на массу и количество клеток в тимусе и селезенке

Как известно, семенники являются основным органом, продуцирующим тестостерон. Нами для контроля кастрации проведено определение уровня тестостерона. Часть опытов была проведена с использованием ложнооперирован-ных животных. В результате определения массы тимуса и селезенки, а также количество ^М антителообразующих клеток на Т-зависимый антиген при первичном гуморальном иммунном ответе у интактных, ложнооперированных и гонадэктомированных самцов получены сходные данные между интактным контролем и ложнооперированными животными. Отсутствие существенных различий в показателях массы тимуса и селезенки, а также первичного (^М -АОК) иммунного ответа между оперированными и ложнооперированными мышами (таб.1., рис. 3). позволило в дальнейших опытах отказаться от группы ложнооперированных самцов.

Как видно из данных, представленных на рисунке 1, после гонадэктомии мышей происходило достоверное снижение концентрации тестостерона в сыворотке крови - в среднем в 4,8 раза через 5 недель после операции. В эти сроки значение тестостерона в среднем составляло 11,2 нмоль/л, тогда как у контрольных мышей 54 нмоль/л. Через 12 недель после кастрации концентрация тестостерона оставалась сниженной в среднем в 4 раза и составляла 13,5 нмоль/л.

Далее исследовали содержание лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови в сроки через 5 и 12 недель после орхидэктомии.

Установлена тенденция к увеличению абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови. Как видно из данных, представленных в таблице 1, относительное количество лимфоцитов в периферической крови достоверно повышалось через 5 и 12 недель после кастрации. Относительное количество лимфоцитов в крови гонадэктомированных животных было в среднем вы-8

ше в 1,3 раза, чем у интактного контроля. Разница в показателях абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови у кастрированных и интакт-ных животных не являлась достоверной, тем не менее, отмечалась тенденция к повышению абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови у кастрированных животных.

54, п=20

11,2*, п=16

13,5*, п=8

Контроль 5 недель после 12 недель после ОЕ СЕ

*Р<0,001

Рисунок 1- Концентрация тестостерона в сыворотке крови у кастрированных мышеи

В(>П2П

Результаты исследования массы и абсолютного количества ядросодер-жащих клеток тимуса у самцов В602Р1 через 5 и 12 недель после кастрации представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Количество лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови, масса тимуса и селезенки, количество клеток в тимусе и селезенке в динамике посткастрациониого периода

5 недель 12 недель

Показатели Контроль ЛО после после

кастрации кастрации

Количество лейкоцитов, 19,3 25,9 22,0

х 109/п п=11 п=10 п=10

Количество лимфоцитов, 61,5 80,5** 81,2**

%, п=10 п=10 п=10

Количество лимфоцитов, 11,9 20,8 17,8

Ю'/л п=10 п=10 п=10

Масса тимуса, мг 30,9 34,8 76,1*** 7***

п=21 El—11 п=19 п=8

Количество клеток тимуса, 47,9 50,6 157*** 65,2***

л 106 п=10 п=11 п=8 п=8

Масса селезенки, мг 103 118 108 104

п=12 п=6 п=13 п=10

Количество клеток селе- 121,3 114,5 130 125,2

зенки, х 10б п=10 п=6 п=8 п=10

**Р<0,01; ***Р<0,05.

Как видно из приведенных данных, масса тимуса у мышей В602Р1 через 5 недель после кастрации составила в среднем 77,1 мг, через 12 недель - 37,7, у интактного контроля и ложнооперированных животных в среднем 30,9 и 34,8 мг. Масса тимуса через 5 недель после кастрации была в среднем в 2,5 раза больше, чем у контрольных мышей, через 12 недель - в 1,2 раза.

Общее количество ядросодержащих клеток тимуса у кастрированных мышей в среднем было в 3,2 раза больше, чем у контрольных животных, через 5 недель после кастрации (157 х 106 в опытной группе, 47,9 х 106 в контрольной и 50,6 х 106 у ложнооперированных животных) и в 1,3 раза выше через 12 недель (65,2 х 10 в опытной группе). Таким образом, во все исследуемые сроки установлено достоверное увеличение массы и клеточности тимуса у го-иадэктомированных самцов В602Р1 (Р<0,001; Р<0,05)

Во все сроки наблюдения у кастрированных самцов В602Р1 не установлено каких-либо отличий по массе и количеству ядросодержащих клеток в селезенке по сравнению с интактными мышами.

2.2.2. Развитие гиперчувствительности замедленного типа при кастрации

Клеточный иммунный ответ у кастрированных самцов оценивался с помощью измерения ГЗТ. Степень гиперчувствительности замедленного типа у мышей определяли через 5 и 12 недель после проведения кастрации.

Как видно из данных, представленных на рисунке 2, после кастрации происходило изменение выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа. Через 5 недель после кастрации у опытных мышей гиперчувствительность замедленного типа достоверно увеличивалась - в среднем в 1,6 раза по сравнению с контролем. Через 12 недель после кастрации гиперчувствительность замедленного типа у опытных мышей была в среднем в 1,7 раза выше, чем в контроле.

71.3**. п=13 79.1***. п=8

ляшаа -

80 п- § ^¡шшяш

70

№

/

40

1П

?0

10 у у У У

0 —I---—--,-(

Контроль .ч недель после 12 недель СЕ после СЕ

**Р<0,01; ***Р<0,05

Рисунок 2 - Влияние кастрации на гиперчувствитепыюсть замедленного типа в динамике посткастрационного периода, %

Таким образом, кастрация приводит к достоверному увеличению клеточного иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ГЗТ) у самцов B6D2F1 (Р<0,001;Р<0,01)

Существуют данные, свидетельствующие о влиянии тимуса на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа, которое реализуется через растворимые медиаторы (J.F. Miller, 1979). Можно предположить, что развивающаяся гиперплазия тимуса после кастрации приводит к усилению гиперчувствительности замедленного типа у гонадэктомированных животных.

2.2.3. Влияние гонадэктомии на количество IgM и IgG антителообразующих клеток на Т-зависимый антиген при первичном и вторичном гуморальном иммунном ответе

Срок в 5 недель после кастрации для определения гуморального иммунного ответа был установлен в предварительных опытах. В различные сроки после кастрации определяли массу и клеточность тимуса. Установлено, что максимальное увеличение тимуса происходит на 5-й неделе посткастрационного периода.

Параметры первичного (IgM-AOK) гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ) исследовали в динамике посткастрационного периода через 5 и 12 недель после операции.

Из данных, представленных на рисунке 3, следует, что количество IgM-антителобразующих клеток у кастрированных самцов увеличивалось через 5 недель в среднем в 2,1 раза по сравнению с контролем, через 12 недель после кастрации - в среднем в 3,5 раза.

ззэаэ*

Контроль ДО 5 недель Контроль 12 недель после GE после CiE

*Р<0,001; ***Р<0,05

Рисунок 3 - Количество IgM-AOK на селезенку в динамике посткастрационного периода

Уровень первичного (^О-АОК) и вторичного (1§0-А(Ж) гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ) также исследовали в динамике посткастрационного периода через 5 и 12 недель после операции (рис. 4).

65875*

70000 60000 50000 40000

зоооо 20000 10000 о

Контроль

12 недель после вЕ

***Р<0,05

Рисунок 4 - Количество ¡цО-Л ОК на селезенку при первичном иммунном ответе в динамике посткастрационного периода

Как видно из рисунка 4, количество 1§0-антителобразующих клеток у кастрированных самцов через 5 недель после кастрации увеличивалось в 1,9 раза, через 12 недель - в 2,1 раза.

Таким образом, кастрация приводит к достоверному увеличению абсолютного количества 1§М- и 1§0-антителобразующих клеток, т.е. стимуляции первичного гуморального иммунного ответа.

На рисунке 5 представлены данные о влиянии гонадэктомии на вторичный иммунный ответ (количество ^в-АОК на тимусзависимый антиген в селезенке). Количесво 1§С-АОК в селезенке у кастрированных животных составляет 1583652, что в 1,5 раза превышает показатели у контрольных животных.

500000

1583652*** п=10

1500000

1000000

Контроль

***р<0,05

5 недель после СЕ

2000000

Рисунок 5 - Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса /¡»С па селезенку при вторичном иммунном ответе

Таким образом, отмечалось достоверное усиление вторичного гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген in vivo после орхидэктомии (Р<0,05).

2.2.4. Влияние кастрации на концентрации» ^Е в сыворотке крови

Уровень 1§Е после кастрации представлен на рисунке 6.

***Р<0,05

Рисунок 6 - Концентрация IgE в сыворотке крови у животных в динамике посткастрациониого периода

Содержание IgE в сыворотке крови у гонадэктомированных животных в динамике посткастрациониого периода оставалось на одном уровне - 24,8 и 24,5 мкг/мл через 5 и 12 недель после операции соответственно (рис. 6). Значения антител класса Е в сыворотке крови было в среднем выше в 1,4 раза по сравнению с интактным контролем.

Как видно из рисунка 6, выявляется достоверное повышение продукции IgE in vivo у самцов B6D2F1 в посткастрационном периоде (Р<0,05).

Таким образом, оценивая в целом результаты по влиянию кастрации на гуморальный иммунный ответ, можно отметить его достоверную стимуляцию.

2.2.5. Особенности хронической реакции трансплантат против хозяина у интактных и кастрированных самцов B6D2F1

Хроническая РТПХ как экспериментальная модель системной красной волчанки у мышей используется для изучения как общих механизмов формирования аутоиммунитета, так и люпусного нефрита (R.M. Lewis et al, 1968; J.A. Bruijn et al., 1992). Хроническая РТПХ развивается в полуаллогенной модели DBA/2—»-(C57BL/6 х DBA/2)F1 - при переносе лимфоидных клеток одного из родителей (донора) реципиентам-гибридам. (C.S. Via et al., 1991).

Детальное изучение хронической РТПХ в модели DBA/2->B6D2Fl на самках-реципиентах показало, что в зависимости от преобладающего соотношения Thl/Th2 CD4 Т-лимфоцитов в ключевой момент развития реакции течение хронической РТПХ может направляться по двум оппозитным вариантам: Thl-зависимой иммунопатологии (группа nonlupus, без развития иммуноком-плексного гломерулонефрита) и Th2- зависимой иммунопатологии (группа lupus, при этом развивается иммунокомплексный гломерулонефрит) (И.В. Саф-ронова, 2001; О.Т. Кудаева, 2003).

Индукцию РТПХ проводили на интактных и кастрированных самцах. При этом кастрацию осуществляли в разные сроки относительно индукции РТПХ.

Частота развития люпус-нефрита у интактных и кастрированных

животных

Как видно из данных, представленных на рисунке 7, у 72% интактных самцов B6D2F1 после индукции РТПХ развивается lupus-нефрит, индукция РПТХ на 5-й неделе после кастрации приводила к достоверному снижению числа случаев /г/^ы^-нефрита - только у 38,4% мышей развивался иммунокомплексный гломерулонефрит.

Рисунок 7- Течение хронической РТПХ у интактных самцов, кастрированных самцов и после введения МОР у кастрированных самцов В602П

Проведение кастрации на 7-й день после индукции РТПХ не изменяет частоты возникновения lupus-нефрита у мышей, она составляет 33%. Можно предполагать, что девиация продукции цитокинов вследствие кастрации приводит к изменению соотношения Thl/Th2 в сторону Thl и, следовательно, снижению числа случаев lupus-нефрита.

Ранее показано, что введение во время индукции РТПХ препаратов, сдвигающих соотношение Thl/Th2, изменяет частоту развития клинических вариантов расстройства иммунитета - lupus или nonlupus (О.Т. Кудаева, 2005). Для модуляции развития хронической РТПХ у самцов в сторону ТЬ2-варианта был использован компонент клеточной бактериальной стенки мурамилдипептид. Введение MDP, который стимулирует выработку провоспалительных цитокинов, вызывает поликлональную активацию В-клеток и усиливает стимулирующее влияние ИЛ-4 на активированные В-лимфоциты в момент индукции РТПХ на 5-й неделе после кастрации, увеличивает число животных lupus+ с 38 до 60% (рис.7).

Уровень IgE в сыворотке крови у мышей до и после индукции РТПХ у иптактных и кастрированных животных

Как следует из полученных результатов, гонадэктомия приводит к усилению гуморального иммунного ответа и увеличению продукции антител класса IgM, IgG и IgE. Продукция IgE у мышей регулируется также ТЬ2-цитокинами (С.М. Snapper, 1987). Было изучено влияние гонадэктомии на содержание IgE в сыворотке крови у мышей после индукции РТПХ (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние кастрации на уровень в сыворотке крови у самцов В6П2Р1 после трансплантации полуаллогенных лимфоидных клеток

Показатель Контроль, п=4 РТПХ п=16 GE+РТПХ n=15

lupus nonlupus lupus nonlupus

Уровень IgE, мкг/мл 17,3 26,4 16,1 33,2*** 17,4

***Р<0,05 (меаду группой lupus и nonlupus у гонадэктомированных самцов).

Как видно из данных, представленных в таблице 2, у гонадэктомированных животных в группе lupus, которая характеризуется преобладающим влиянием Т112-ответа, достоверно увеличивается концентрация IgE в сыворотке крови в 1,9 раза по сравнению с группой nonlupus. У негонадэктомированных животных группы lupus отмечается тенденция к повышению IgE в сыворотке крови. Таким образом, иммунокомплексный гломерулонефрит у гонадэктомированных самцов сопровождается усилением продукции IgE.

Влияние хронической РТПХ на содержание тестостерона в сыворотке крови у интактных и кастрированных самцов В602Р1

Установлены различия в уровне сывороточного тестостерона у интактных и кастрированных самцов с индуцированной РТПХ (табл. 3). Видно, что у некастрированных особей с Т112-зависимым вариантом РТПХ (с поражением почек) отмечалось достоверное снижение концентрации тестостерона - в 3,5 раза по сравнению с мышами с ТЫ-зависимым вариантом хронической РТПХ (без поражения почек). У гонадэктомированных самцов с развившимся аутоиммунным гломерулонефритом концентрация тестостерона составила 8,8 нмоль/л. Это значение ниже показателей тестостерона у особей с ТЫ- вариантом РТПХ в 1,2 раза, но различие не является статистически достоверным.

Таблица 3 - Концентрация тестостерона в сыворотке крови в группах lupus и nonlupus

у мышей

Показатель Контроль, п=20 РТПХ п= 10 GE+РТПХ n=10

lupus nonlupus lupus nonlupus

Тестостерон, нмоль/л 54 16,8 58*** 8,8 10,7

***Р<0,05 (между группой lupus и nonlupus у интактных самцов).

Полученные результаты подтверждают наличие изменения гормонального статуса у самцов nonlupus- и lupus-рсципиентов. У самцов формирование Th2-зависимого lupus-варианта связано с резким снижением уровня тестостерона, что может объясняться действием комплекса факторов, а также сложным взаимодействием тестостерона и провоспалительных цитокинов. Сложные процессы, происходящие после индукции РТПХ, в частности цитокиновый шторм, могут влиять на изменение содержания тестостерона у самцов.

Сравнительная морфология почек у самок и самцов после проведения хронической РТПХ

По нашим данным, при переносе 150x106 клеток селезенки от самок DBA/2 интактным самцам BDF1 частота развития иммунокомплексного гломе-рулонефрита (ИКГ) составляет 72%. У гонадэктомированных самцов частота возникновения ИКГ достоверно снижается и составляет 35%.

Индукция РТПХ у самок и самцов имеет как сходства, так и различия. Наблюдаемые особенности течения хронической РТПХ у самцов и самок возможны и в отношении морфологического проявления гломерулонефрита. Для выявления этих особенностей были проведены гистологические исследования почек у самцов и самок с иммунокомплексным гломерулонефритом (табл. 4).

Таблица 4 - Относительная площадь структур па срезе коркового и мозгового вещества почки (в % от площади среза)

Показатель самки самцы

контроль | lupus контроль | lupus

Корковое вещество почки

Канальцы 90,2 66,3 90,8 88,1"

Клубочки 3,4 1,5* 3,9 2,0***

Кровеносные сосуды 5,9 2,1** 5,3 3,4****

Лейкоцитарные инфильтраты 0,2 13,2 *# 0 0*

Цилиндры 0 7,4* 0 3,6***

Кисты и полости с жидкостью 0 9,5* 0 2 9***

Мозговое вещество почки

Канальцы и трубочки 95,8 94,9 97,5 91,г

Кровеносные сосуды 4,0 1,з-# 2,5 2,2*

Цилиндры 0 3,8"* 0 0,5*"

(Р<0,05): *** - между контрольной и опытной группой; # - между опытными группами.

Морфологическое исследование почек показало, что развитие аутоиммунного гломерулонефрита у самцов характеризуется меньшей выраженностью поражения клубочков и канальцев, отсутствием лейкоцитарных инфильтратов и поражения стенок сосудов по сравнению с самками. Лейкоцитарный инфильтрат почек самок представлен преимущественно лимфоцитами. Наличие соединительной ткани в корковом и мозговом веществе почек не отмечается, что указывает на отсутствие склероза почечной ткани. Не выявлялось наличие кровоизлияний в почках у животных с гломерулонефритом (табл. 4).

Таким образом, характер поражения почек у самцов с иммунокомплекс-ным гломерулонефритом отличается от такового у самок. Развитие аутоиммунного гломерулонефрита у самцов характеризуется меньшей выраженностью деструктивных процессов в почках по сравнению с самками.

3. ВЫВОДЫ

1. Через 5 и 12 недель после проведения кастрации достоверно увеличивается масса тимуса и общее число ядросодержащих клеток тимуса. Во все сроки наблюдения у кастрированных самцов B6D2FI не установлено каких-либо отличий по массе и количеству ядросодержащих клеток в селезенке по сравнению с контрольными животными.

2. Кастрация приводит к усилению интенсивности гуморального иммунного ответа in vivo. Через 5 и 12 недель после кастрации происходит достоверное повышение абсолютного числа IgM-AOK и IgG-AOK в селезенке при первичном иммунном ответе на Т-зависимый антиген. Через 5 недель после кастрации достоверно увеличивается количество IgG-AOK в селезенке при вторич-

17

ном иммунном ответе на Т-зависимый антиген. Концентрация IgE в сыворотке кастрированных животных достоверно увеличивается во все сроки наблюдения по сравнению с контрольными животными.

3. В результате проведенных исследований установлено, что кастрация приводит к стимуляции показателей клеточного иммунного ответа in vivo. У опытных животных через 5 и 12 недель после операции гиперчувствительность замедленного типа увеличивается в 1,7 и 1,5 раза соответственно по сравнению с контролем.

4. Проведение кастрации в различные сроки относительно индукции РТПХ достоверно снижает частоту развития иммунокомплексного гломеруло-нефрита по сравнению с интактными животными. У интактных самцов после индукции РТПХ иммуннокомплексный гломерулонефрит развивался в 72,4% случаев, у кастрированных - в 38,4%. Введение мурамилдипептида одновременно с индукцией РТПХ приводит к увеличению частоты иммунокомплексного гломерулонефрита до 60% случаев у кастрированных животных.

5. Кастрация влияет на уровень IgE в сыворотке крови в зависимости от варианта иммунопатологического состояния, возникающего в результате индукции РТПХ (lupus, nonlupus). Индукция РТПХ приводит к достоверному повышению уровня IgE в сыворотке крови у кастрированных животных группы lupus по сравнению с группой nonlupus.

6. Индукция РТПХ у интактных самцов сопровождается резким достоверным снижением концентрации тестостерона в сыворотке крови в группе с имму-нокомплексным гломерулонефритом lupus по сравнению с группой nonlupus.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У кастрированных животных целесообразно проводить профилактику бактериальных инфекций при патологиях почек и болезнях нижних мочевыво-дящих путей, а также профилактические мероприятия по предупреждению воспалений мочевыделителъной системы.

2. При терапии кастрированных животных рекомендуется исключить применение препаратов, обладающих поликлональными иммуностимулирующими свойствами, как факторов, провоцирующих поражение почек.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Арсенова, С.А. Влияние гонадэктомии и на антителообразование и продукцию 1#Е у интактных мышей и мышей с аутоиммунным гломерулонефритом / С.А. Арсенова, О.Т. Кудаева, Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2/1. - С. 16-17.

2. Колесникова, О.П. Эффекты кастрации на иммунный ответ у мышей самцов разных генотипов и индукцию аутоиммунного заболевания / 18

О.П.Колесникова, О.Т. Кудаева, С.А. Арсенова, Ю.А.Капелькина // Вестник НГАУ. - 2010. - № 2(14). - С.59-62.

3. Арсенова, С.А. Уровень тестостерона у самцов в экспериментальной модели аутоиммунного гломерулонефрита / С.А. Арсенова // Инновационный потенциал молодых ученых в развитии агропромышленного комплекса Сибири: материалы VII Межрегион, конф. молодых ученых и специалистов аграрных вузов Сиб. Федерал, округа. - Новосибирск, 2009. - С. 148-150.

4. Арсенова, С.А. Влияние кастрации на частоту развития аутоиммунного гломерулонефрита и уровень IgE / С.А. Арсенова, О.Т. Кудаева, Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Патология продуктивных и нерепродуктивных животных: материалы 8-й межрегион, на-уч.-практ. конф,- Омск, 2009. - С. 189-194.

5. Арсенова, С.А. Влияние кастрации на параметры гуморального иммунного ответа / С.А. Арсенова, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных: материалы междунар. науч.-практ. конф. - Троицк, 2009. - С. 237-239.

6. Арсенова, С.А. Влияние гонадэктомии на уровень IgE в экспериментальной модели аутоиммунного гломерулонефрита / С.А. Арсенова, О.Т. Кудаева, Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Симбиоз Россия 2009: материалы II Всерос. с междунар. участием конгр. студентов и аспирантов-биологов (25-29 мая). - Пермь, 2009. - С. 268-270.

На правах рукописи

Арсёнова Светлана Андреевна

ВЛИЯНИЕ КАСТРАЦИИ НА ПАРАМЕТРЫ ИММУННОГО ОТВЕТА У

МЫШЕЙ В6В2П

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 25.12. 2011 г. Формат 60x84 1/16 Объем: Усл.,- изд. л. 1,0 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №110

Отпечатано в ООО «Копи-Трейд» г. Новосибирск, ул. Кошурникова 53/1 Тел.: (383) 267-97-97,256-13-43 E-mail: Info@copytrade.ru