Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение гуморального и клеточного иммунитета у мышей гибридов F1 после кастрации

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изменение гуморального и клеточного иммунитета у мышей гибридов F1 после кастрации"



Арсёнова Светлана Андреевна

ИЗМЕНЕНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА У МЫШЕЙ ГИБРИДОВ П ПОСЛЕ КАСТРАЦИИ

03. 03.01 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН 2010

004609108

Арсёнова Светлана Андреевна

ИЗМЕНЕНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА У МЫШЕЙ ГИБРИДОВ П ПОСЛЕ КАСТРАЦИИ

03. 03. 01 - физиология АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена на кафедре эпизоотологии и микробиологии в ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет»

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Колесникова Ольга Петровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Деева Валентина Семёновна

кандидат биологических наук Ефанова Нина Владимировна

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита диссертации состоится «30 » О? 2010 г. в /С часов на заседании диссертационного совета Д 220.048.04 при Новосибирском государственном аграрном университете: 630039, г. Новосибирск, ул. Добролюбова, 160. Тел. 8-(383)-267-05-10; 264-28-00.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» (www, nsau.edu.ги).

Автореферат диссертации разослан «_ /S » Ос¥ 2010г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Кастрация - одна из самых распространенных операций в ветеринарной практике. Хирургическое удаление гонад также широко используется как метод в экспериментальных исследованиях для изучения иммунофизиологических механизмов действия половых стероидных гормонов. Известно влияние гонадэктомии (GE) на некоторые параметры иммунной системы. Установлено, что возрастная инволюция тимуса ускоряется во время полового созревания - период, когда резко возрастает уровень половых гормонов (Whitacre С.С., 2001; Ярилин А.А., 2003). В результате кастрации останавливается возрастная инволюция тимуса и наблюдается его гиперплазия (Sutherland J.S., 2005; Safadi F.F., 2000; Fitzpatrick F., 1991). В литературе имеются данные, свидетельствующие о половом диморфизме в иммунном ответе, который обусловлен половыми стероидными гормонами (Myers M., 1972; Кудаева О.Т., 2005). Так женские половые гормоны - эстрогены - обладают стимулирующим влиянием на гуморальный иммунный ответ. Повышенное антителообразование может сопровождаться появлением антител против собственных тканей организма. Тестостерон, напротив, угнетает гуморальный иммунный ответ, а значит, снижается риск проявления аутоиммунных реакций (Grossman Ch.J., 1984; Olsen N.J., 2001). В литературе описано усиление антителообразования после кастрации у мышей, крыс (Ed-inger D.et al., 1972; Tartarcovsky В. et al., 1981; Ainbeder E. et al., 1968), хряков (Ефанова H.В., 2006). При этом антителообразование у кастрированных самцов становится более интенсивным, чем у самок (Edinger D.et al., 1972). Показано, что спонтанный и стимулированный синтез IgM, IgG, IgA клетками селезенки in vitro кастрированных мышей не отличается от интактных, но клетки селезенки кастрированных животных синтезировали высокие уровни аутореактивных антител, антител против IgG (ревматоидный фактор) и тире-оглобулина (Viselli S.M. et al., 1995). Возникает вопрос - возрастает ли риск развития аутоиммунных реакций в организме при такой усиленной продукции антител и является ли этот «аутоиммунный компонент» одним из этиологических факторов, который приводит к увеличению частоты болезней нижних мочевыводящих путей вследствие орхидэктомии?

Известно, что хирургическое удаление гонад приводит к возникновению различных патологий, ухудшающих качество жизни животных, таких как ожирение (Fettman M.J. et al., 1997; Kanchuk M.L. et al. 2002; Nguyen P.G. et al., 2004), сахарный диабет (Hoeng M. et al., 2002; Kanchuk M.L. et al.,2002), гипотиреоидизм (Milne K.L. et al., 1981; Panciera D.L., 1994) и др. Твердо установлено, что гипогонадизм у мужчин (дефицит тестостерона), который приводит к нарушениям костно-кальциевого обмена, является одним из этиологических факторов камнеообразования в почках, а андрогенная терапия статистически значимо замедляет этот процесс (Александров В.П. и др., 2008). У животных разных видов также показано, что кастрация приводит к увеличению частоты болезней нижних мочевыводящих путей (Stubbs W. et al., 1996; Lekcharoensuk С. et al., 2001; Spain C.V. et al., 2002). Однако кон-

з

кретные механизмы развития патологии почек у кастрированных самцов, участие в этом аутоиммунных компонентов, воспаления изучены мало.

Одной из моделей аутоиммунных нарушений, активно используемых в экспериментальных работах, является модель на основе хронической реакции трансплантант против хозяина (РТПХ) в полуаллогенной системе DBA/2->(C57BL/6 х DBA/2)F1 (когда клетки селезенки одного из родителей, самок линии DBA/2, вводят внутривенно гибридам первого поколения) (Via C.S. et al., 1991). Несмотря на генетическую однородность реципиентов, при индукции хронической РПТХ в системе DBA/2-> (DBA/2 х C57B1/6)F1 было обнаружено, что реакция может идти по двум направлениям: у 50-60 % самок мышей развивается аутоиммунный гломерулонефрит на фоне супрессии клеточного и гуморального иммунитета, а у остальных мышей отсутствуют выраженные проявления поражения почек, и к тому же резко выраженная супрессия гуморального иммунного ответа не сочетается с супрессией клеточного ответа (Кудаева О.Т, 1993). Развитие иммунного ответа по клеточному или гуморальному типу связано с преимущественной активацией клонов Т-хелперов 1-го (Thl) или 2-го (Th2) типа, которые различаются по своей функции и по спектру экспрессируемых цитокинов. Тип аутоиммунного заболевания, обусловленный аутоантителами или аутореактивными Т-лимфоцитами, определяется преобладанием соответственно либо Th2-, либо Thl- клеток (Козлов В.А.,1997).

Течение хронической РТПХ у самок может быть направлено по двум разным путям: с преобладающим влиянием Th2- клеток (группа lupus, в которой развивается иммунокомплексный гломерулонефрит) или Thl-клеток (группа nonlupus без развития нефрита) (Кудаева О.Т., 1993). Иммунопатологическое состояние, возникающие в результате индукции РТПХ, хорошо изучено и описано на самках и практически нет данных о возможности индукции этого состояния на самцах.

Цель исследования. Охарактеризовать влияние кастрации на параметры гуморального и клеточного иммунного ответа в динамике у интактных мышей гибридов F1 и частоту развития аутоиммунного расстройства в экспериментальной модели.

Задачи исследования

1. Изучить влияние кастрации на массу и количество ядросодержащих клеток тимуса и селезенки у самцов гибридов B6D2F1.

2. Изучить выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у кастрированных животных.

3. Исследовать влияние кастрации на количество антителообразующих клеток селезенки (IgM-AOK и IgG-AOK) во время первичного и вторичного гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген.

4. Изучить влияние кастрации на частоту развития люпус-нефрита у животных в разные сроки относительно индукции хронической РТПХ.

5. Определить влияние мурамилдипептида (MDP) на частоту развития люпус-нефрита у кастрированных животных после индукции хроничекой РТПХ.

6. Исследовать уровень IgE и тестостерона в сыворотке крови у интакт-ных кастрированных самцов и кастрированных самцов с хронической РТПХ.

Научная новизна работы

Впервые получены данные по усилению интенсивности гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у кастрированных самцов B6D2F1. Отмечено повышение ГЗТ у мышей в разные сроки после проведения кастрации.

Впервые выявлено повышение иммуноглобулина класса Е в сыворотке крови интактных кастрированных самцов B6D2F1 через 5 и 12 недель после проведения операции и кастрированных самцов B6D2F1 с ТЬ2-вариантом течения хронической РТПХ.

Впервые показаны различия в содержании тестостерона в сыворотке крови у самцов с Thl- и Th2- вариантами течения хронической РТПХ в системе DBA/2->(C57BL/6 * DBA/2)F1. Выявлено, что развитие иммуноком-плексного гломерулонефрита у интактных самцов после индукции РТПХ приводит к резкому снижению тестостерона в сыворотке крови.

Впервые показано, что кастрация самцов приводит к уменьшению числа животных lupus в экспериментальной модели, и баланс Thl/Th2 клеток у оперированных самцов сдвигается в сторону Thl, т.е. преобладания числа животных nonlupus. Установлена возможность модуляции течения хронической РТПХ у кастрированных животных под действием препарата, изменяющего соотношение Thl/Th2 в момент индукции реакции у самцов B6D2F1. Введение мурамилдипептида (MDP) приводит к увеличению числа мышей lupus с аутоиммунным гломерулонефритом.

Научная и практическая значимость работы

Полученные данные представляют дополнительный материал для понимания механизмов иммунореактивности у кастрированных самцов. Показано, что кастрация приводит к усилению интенсивности специфического первичного и вторичного гуморального и клеточного иммунного ответа у интактных самцов гибридов B6D2F1. Кастрация самцов B6D2F1 до или после индукции аутоиммунного расстройства снижает риск развития аутоиммунных реакций в организме, обусловленных аутоантителами. Однако введение кастрированным самцам B6D2F1 бактериального антигена (мурамилдипептида), который вызывает поликлональную активацию В-клеток и усиливает стимулирующее влияние ИЛ-4 на активированные В-лимфоциты, в момент индукции аутоиммунного заболевания увеличивает риск развития аутоиммунных реакций - число случаев иммунокомплексного гломерулонефрита возрастает. Эти данные позволяют рекомендовать проводить профилактику бактериальных инфекций мочевыводящих путей и ограничение использова-

ния иммуностимуляторов поликлонального действия у кастрированных самцов, как факторов провоцирующих поражение почек.

Положения, выносимые на защиту:

1. Кастрация стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ у самцов мышей Вби2Р1, максимальная стимуляция отмечается с пятой недели после операции.

2. Индукция хронической РТПХ в системе аллогенного переноса у интактных самцов В6Э2Р1 приводит к формированию преимущественно Т1)2-зависимого иммунопатологического состояния, у кастрированных самцов В6Б2Р1 - ТЫ-зависимого иммунопатологического состояния.

3. Формирование ТЬ2-зависимых иммунопатологических состояний у интактных самцов В6В2П приводит к резкому снижению тестостерона в сыворотке крови, у кастрированных самцов В6Б2Р1 - к увеличению 1§Е в сыворотке крови.

4. Введение мурамилдипептида в момент индукции РТПХ у кастрированных самцов ВбБ2Р1 увеличивает число мышей с ТЬ2-ответом.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на трех этапах Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (Новосибирск, Омск, Москва, 2008, 2009), на VII Межрегиональной конференции молодых ученых и специалистов аграных вузов Сибирского федерального округа (Новосибирск, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе одна статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста, работа иллюстрирована 15 рисунками, 9 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, их обсуждения и выводов. Библиографический список включает 241 источников, из них 29 отечественных авторов и 212 зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Животные. Исследования проводились на базе НИИ клинической иммунологии СО РАМН и кафедре эпизоотологии и микробиологии НГАУ. Материалом для экспериментальных исследований служили самцы мыши -гибриды первого поколения (С57В1/6хВВА/2)Р \ В6В2Б1, самки БВА/2 9-16-недельного возраста. Содержали животных в соответствии с правилами, 6

принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

Культуральиые среды и реагенты. RPMI-1640 (НПО «Вектор»); физиологический раствор, забуференыый фосфатным буфером рН 7,4 (ЗФР); Kumsai brilliant blue (Loba Feinchemie); уксусная кислота; соляная кислота; комплемент морской свинки (НПО «Биомед», г. Пермь); антитела кролика против цельной молекулы IgG мыши (RAM) (БИОС, Новосибирск); Twecu 20 («Sigma»); этиловый спирт; мурамилдипептид («Sigma»),

Кастрация. Опытным мышам проводили кастрацию открытым способом с использованием Zooletil*" в качестве наркоза в дозе 5 мг/кг.

Подсчет количества лейкоцитов и лимфоцитов. Для подсчета абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови 5 мкл крови разводили в 20 мкл 5%-го раствора уксусной кислоты (разведение 1:20). Подсчет числа лейкоцитов проводили в камере Горяева. Для расчета относительного количества лимфоцитов мазок крови фиксировали в спирт-эфирной смеси (1:1) 20 мин, окраску мазка крови проводили по Романовскому - Гимза.

Выделение клеток селезёнки, тимуса. Мышей забивали методом дислокации шейных позвонков. Тимус извлекали путём срединного (продольного разреза) верхней части грудной клетки и вскрытия грудной полости. Селезёнку, тимус помещали во флакончики со средой, расстригали ножницами, многократно пропускали через шприц с иглой, фильтровали через металлическую сеточку. Осадок клеток селезёнки, тимуса рссуспендировали в среде и подсчитывали их общее количество.

Определение массы и количества ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке. Массу тимуса и селезенки определяли путем взвешивания. Количество ядросодсржащих клеток тимуса и селезенки подсчитывали в камере Горяева и рассчитывали по формуле

V Ах20 л г- V Л X 200 , г

Ri =-х4,ь; К2=--х4,5,

1600x1/4000 1600x1/4000

где К; - количество ядросодержащих клеток тимуса; К2- количество ядросодсржащих клеток селезенки; А - количество клеток, подсчитанное в 100 больших квадратах; 1600 - количество маленьких квадратиков в 100 больших квадратах (100x16=1600); 1/4000 - объем счетной камеры (1/4000мкл); 20 - степень разведения клеток тимуса; 200-степень разведения клеток селезенки; 4,5 - объем (мл) суспензии тимуса (селезенки).

Определение первичного гуморального ответа (IgM и IgG-AOK) на Т-зависимый антиген (эритроциты барана ЭБ). Количество антителообра-зующих клеток, синтезирующих антитела класса М, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 5-е сутки после внутривенной иммунизации эритроцитами барана в дозе 10'/мышь по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом (Cunningham A J., 1968). У мышей после дислокации шейных позвонков извлекали селезенку и помещали в пенициллиновый флакон с 0,5 мл среды 199. Каждую се-

лезенку помещали в отдельный флакон. Все процедуры с клетками проводили на льду. Клетки селезенки разводили в 5 раз. Объём клеточной суспензии доводили до 4,5 мл. Затем готовили инкубационную смесь: 500 мкл суспензии селезенки, 500 мкл суспензии эритроцитов барана, 500 мкл комплемента, предварительно разведённого в 5 мл среды. Компоненты перемешивали, и смесь заливали в стеклянные камеры. Камеры помещали в термостат и инкубировали 1,5 ч при +38°. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой (увеличение х 42) по формуле

kAOKxVksxR

Абс.АОК --

Vk

где Абс. АОК - абсолютное количество антителообразующих клеток; кАОК - количество антителообразующих клеток на камеру;Vk - объем камеры; Vks - объем клеточной суспензии; R- разведение.

Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса G, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 9-е сутки после внутривенной иммунизации 2%-м раствором эритроцитов барана (Cunningham A.J., 1968). Объём клеточной суспензии селезенки доводили до 4,5 мл. Клетки селезенки разводили в десять раз. Затем готовили инкубационную смесь: 700 мкл суспензии селезенки, 100 мкл суспензии эритроцитов барана, 100 мкл комплемента, предварительно разведённого в 1,5 мл среды, 100 мкл антисыворотки. Камеры, заполненные инкубационной смесью, помещали в термостат и инкубировали 2 часа при t +38°. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой.

Определение вторичного гуморального ответа (IgG-AOK) на Т-зависимын антиген (ЭБ). Для определения вторичного гуморального иммунного ответа проводили внутривенную иммунизацию 2% раствором ЭБ в дозе 0,5 мл двукратно с интервалом 30 дней. Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса G, в селезенке мышей оценивали на пике иммунного ответа на 4-е сутки после повторной иммунизации. Клетки селезенки разводили в 200 раз. Затем готовили инкубационную смесь: 700 мкл суспензии селезенки, 100 мкл суспензии эритроцитов барана, 100 мкл комплемента, предварительно разведённого в 1,5 мл среды, 100 мкл антисыворотки. Камеры, заполненные инкубационной смесью, инкубировали в термостате 2 ч при +38°. После инкубации подсчитывали зоны гемолиза под бинокулярной лупой (Sterzl J., Riha I., 1965).

Оценка клеточного ответа на Т- зависимый антиген. Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа: величины отёка лапы после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным. Для этого мышей предварительно иммунизировали внутрибрюшинно сенсибилизирующей дозой -0,25% ЭБ в объёме 0,5 мл (2,5x107 ЭБ/мышь). Разрешающую дозу -50% ЭБ в объёме 50 мкл (5x108 ЭБ/ мышь) вводили под подошвенный апоневроз задней правой лапы на 4 сутки. В контралатеральную лапу вводили среду в том

же объёме. Учёт реакции проводили через 24 ч по величине местного отёка (Crawle A.J., 1975).

Хроническую РТПХ осуществляли путём переноса самцам B6D2F1 лимфоидных клеток родительской линии - клеток селезенки самок DBA/2. Вводили клетки селезёнки, выделенные ex tempore, в стерильной среде RPMI-1640. Каждая мышь-реципиент получала по 65x106 клеток путём, внутривенной инъекции в хвостовую вену в объеме 0.5 мл среды двукратно с интервалом в пять дней.

Определение белка в моче. О развитии гломерулонефрита судили по стойкому появлению белка в моче. Содержание белка в моче определяли колориметрически с красителем Kumsai brilliant blue (Loba Feinchemie) с помощью Titertec Multiskan, длина волны 570 nm; калибровочную кривую строили по BSA 100-1000 мкг/мл. На сроке от 8-й до 12-й недели после индукции РТПХ определяли протеинурию. Стойкая протеинурня (уровень белка в моче более Змг/мл регистрировали не менее 3 раз подряд при еженедельном тестировании) свидетельствует о развитии иммунокомплексного гломерулонефрита у мышей, что коррелирует с морфологическим подтверждением болезни.

Введение мурамилдипептида (MDP). MDP водили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг массы тела в первый день переноса полуаллогенных лимфоидных клеток и через 10 дней.

Определение IgE в сыворотке. Иммуноглобулин Е в сыворотке определяли иммуноферментным методом ELISA (BD OptEIA™) с помощью Titertec Multiskan, длина волны 450 nm.

Определение тестостерона в сыворотке. Тестостерон в сыворотке определяли иммуноферментным методом ELISA (ИФА-БЕСТ™) с помощью Titertec Multiskan, длина волны 450 nm.

Морфологический анализ. Морфологический анализ органов мышей-гибридов B6D2F1 как интактных, так и с РТПХ, индуцированной иммунопатологией проводили методом обзорной микроскопии и общегистологическими полуколичественными методами совместно с сотрудниками Института клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, канд.мед.наук В.А. Логиновым и канд.мед.наук Л.А. Обуховой.

Статистическую обработку результатов проводили методом непараметрической статистики с использованием U-критерия Маниа-Уитни (Гублер Е.В.,1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние кастрации на количество лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови

Как известно, семенники являются основным органом, продуцирующим тестостерон. После хирургического удаления гонад концентрация тестостерона в сыворотке крови резко падает (Charing С. R., 1988; Kashwagi В. et. al., 2005). Так, у крыс Wistar через 6 ч после кастрации концентрация тестостерона в сыворотке крови уменьшается на 50% (Kashwagi В., et.al,, 2005).

Нами для контроля кастрации также проведено определение уровня тестостерона. Забор крови для определения тестостерона проводили в первой половине дня, так как имеются данные о том, что концентрация тестостерона у мышей линии C57BL16 выше в утренние часы (J. F. Sayegh et al., 1990).

Как видно из данных рис. 1, после гонадэктомии мышей происходило достоверное снижение концентрации тестостерона в сыворотке крови - в среднем в 4,8 раза через 5 недель после операции. В эти сроки значение тестостерона в среднем составляло 11,2 нмоль/л, тогда как у контрольных мышей 54 нмоль/л. Через 12 недель после кастрации концентрация тестостерона оставалась сниженной в среднем в 4 раза и составляла 13,5 нмоль/л.

60 50

^ 40 Л

4 30 о

5 20 f

S

1С

54

11,2*

контроль 5 недель 12 недель после ПЕ иные ПЕ

*Р<0,001

Рис.1. Концентрация тестостерона в сыворотке крови у кастрированных мышей В6В2Р1

Далее исследовали содержание лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови в сроки через 5 и 12 недель после орхидэктомии.

Таблица - 1. Количество лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови, масса тимуса и селезенки, количество клеток в тимусе и селезенке в ___динамике посткастрационного периода____

Показатели Контроль 5 недель после кастрации 12 недель после кастрации

Количество лейкоцитов, х 109/л 19,3 25,9 22,0

Количество лимфоцитов, % 61,5 80,5** 81,2**

Количество лимфоцитов, Ю'/л 11,9 20,8 17,8

Масса тимуса, мг 27,1 77,6* •l'y 7**

Количество клеток тимуса, х 106 47,9 157** 65,2*

Масса селезенки, мг 105 91,8 104

Количество клеток селезенки, х 10® 121,3 130 125,2

*Р<0,001; **Р<0,05.

Установлена тенденция к увеличению абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови. Как видно из данных табл. 1, относительное количество лимфоцитов в периферической крови достоверно повышалось через 5 и 12 недель после кастрации. Относительное количество лимфоцитов в крови гоиадзктомированных животных было в среднем выше в 1,3 раза, чем у интактного контроля. Разница в показателях абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови у кастрированных и интактных животных не являлась достоверной, тем не менее, отмечалась тенденция к повышению абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови у кастрированных животных.

Влияние кастрации на массу и количество клеток в тимусе и селезенке

Из данных литературы известно, что после кастрации останавливается возрастная инволюция тимуса и наблюдается его гиперплазия (Sutherland J.S., 2005; Safadi F.F., 2000; Fitzpatrick F., 1991). Результаты исследования

и

массы и абсолютного количества ядросодержащих клеток тимуса у самцов B6D2F1 через 5 и 12 недель после кастрации представлены в табл. 1.

Как видно из приведенных данных, масса тимуса у мышей B6D2F1 через 5 недель после кастрации составила в среднем 77,6 мг, через 12 недель -37,7, у интактного контроля в среднем 27,1 мг. Масса тимуса через 5 недель после кастрации была в среднем в 2,9 раза больше, чем у контрольных мышей, через 12 недель - в 1,4 раза.

Общее количество ядросодержащих клеток тимуса у кастрированных мышей в среднем было в 2,6 раза больше, чем у контрольных животных, через 5 недель после кастрации (157 х 10й в опытной группе и 47.9 х10б в контрольной) и в 1,4 раза выше через 12 недель (65,2 х 106 в опытной группе). Таким образом, во все исследуемые сроки установлено достоверное увеличение массы и клеточности тимуса у гонадзктомированных самцов B6D2F1 (Р<0,001; Р<0,05). Увеличение массы тимуса после кастрации можно объяснить усиленной пролиферацией незрелых тимоцитов и стромальных клеток тимуса за счет снижения суппрессорпого влияния тестостерона на апдроген-ные рецепторы клеток тимуса (Aboudkhil S. el al., 1991; Sutherland J.L. et al., 2005; Roden A.J. et al, 2004). Во все сроки наблюдения у кастрированных самцов B6D2F1 не установлено каких-либо отличий по массе и количеству ядросодержащих клеток в селезенке по сравнению с интактными мышами, тогда как по литературным данным у кастрированных мышей выявляется не только значительное увеличение массы селезенки за счет экспансии В-лимфоцитов, но и изменение субпопуляционного состава клеток органа (снижение количества зрелых Т-лимфоцитов, увеличение количества CD5 В-клеток) (Viselli S.M. ct al.5 1995).

Развитие гиперчувств нтелышети замедленного типа при кастрации

Клеточный иммунный ответ у кастрированных самцов оценивался с помощью измерения ГЗТ. Степень гиперчувствительностн замедленного типа у мышей определяли через 5 и 12 недель после проведения, кастрации.

Как видно из данных рис. 2, после кастрации происходило изменение выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа. Через 5 недель после кастрации у опытных мышей гиперчувствительность замедленного типа достоверно увеличивалась - в среднем в 1,6 раза по сравнению с контролем. Через 12 недель после кастрации гиперчувствительность замедленного типа у опытных мышей была в среднем в 1,7 раза выше, чем в контроле.

Таким образом, кастрация приводит к достоверному увеличению клеточного иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ГЗТ) у самцов B6D2F1 (Р<0,001; Р<0,01)

*P<0,G01; **P<(),01

Рис. 2. Влияние кастрации на гиперчувствительность замедленного типа в динамике посткастрацаонного периода

Существуют данные, свидетельствующие о влиянии тимуса на развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа, которое реализуется через растворимые медиаторы (Miller J.F., 1979). Можно предположить, что развивающаяся гиперплазия тимуса после кастрации приводит к усилению гиперчувствительности замедленного типа у гонадэкхомированных животных.

Влияние гонадэктомии на количество 1§М ш Т«0 антител ообразуюших клеток на Т-зависимый антиген при первичном и вторичном гуморальном иммунном ответе

В литературе имеются данные о повышении продукции иммуноглобулинов класса М и О на тимуснезависимые и тимусзависимые антигены при первичном и вторичном иммунном ответе (ЕзсИг^ег О., 1972).

Срок в 5 недель после кастрации для определения гуморального иммунного ответа был установлен в предварительных опытах. В различные сроки после кастрации определяли массу и клеточность тимуса. Установлено, что максимальное увеличение тимуса происходит на 5-й неделе посткаст-рационного периода.

Параметры первичного (^М-АОК) гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ) исследовали в динамике посткастрационного периода через 5 и 12 недель после операции.

Из данных рис 3. следует, что количество ^М-антителобразующих клеток у кастрированных самцов увеличивалось через 5 недель в среднем в 2,6 раза по сравнению с контролем, через 12 недель после кастрации - в среднем в 3,5 раза.

59489*

..............................._.......1 "124

...............................................

........................... И

45000

Ъ аооэо

5 35,030

% зодао

I 25030 £ 20030 ^ 1505» 10000 < 5030 0

иыщюль 5 ти п» контроль 1.2 недель после (Ж после (ИТ.

*.Р<0,001; **Р<0,05

Рис. 3. Количество 1§М-АОК на селезенку в динамике посткастрацион-ного периода

Уровень первичного (¡^С-АОК) и вторичного (1§0-А0К) гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген (ЭБ) также исследовали в динамике посткастрационного периода через 5 и 12 недель после операции.

70000

& 60000

50000

41 ...

« г? 40000

V

»000

¿2 20000

< 10000

.«151.

"■•34684.....

9692

М«ИИ

контроль 5 недель кит роль 12 недель теле КЕ после СЕ

*Р<0,05

Рис. 4. Количество 1§0-А0К на селезенку при первичном иммунном ответе в динамике посткастрационного периода

Как видно из рис. 4, количество 1§0-антителобразующих клеток у кастрированных самцов через 5 недель после кастрации увеличивалось в 1,9 раза, через 12 недель - в 1,5 раза.

Таким образом, кастрация приводит к достоверному увеличению абсолютного количества и 1§0-антителобразующих клеток, т.е. стимуляции первичного гуморального иммунного ответа.

контроль

S недель после GE

*Р<0,05

Рис. 5. Количество антителообразующих клеток, синтезирующих антитела класса при вторичном иммунном ответе

На рис. 5 представлены данные о влиянии гонадэктомии на вторичный иммунный ответ (количество IgG-AOK на тимусзависимый антиген в селезенке). Количесво IgG-AOK в селезенке у кастрированных животных составляет 1583652, что в 1,5 раза превышает показатели у контрольных животных.

Таким образом, отмечалось достоверное усиление вторичного гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген in vivo после орхидэк-томии (Р<0,05).

Влияние кастрации на концентрацию IgE в сыворотке крови

Содержание IgE в сыворотке крови у гонадэктомированных животных в динамике посткастрационного периода оставалось на одном уровне - 24,8 и 24,5 мкг/мл через 5 и 12 недель после операции соответственно (см. рис. 6). Значения антител класса Е в сыворотке крови было в среднем выше в 1,4 раза по сравнению с интактным контролем.

Как видно из рис.6, выявляется достоверное повышение продукции IgE in vivo у самцов B6D2F1 в посткастрационном периоде (Р<0,05). Эти результаты находят подтверждение в данных других исследований. У кастрированных самцов CBA/J после интраназальной иммунизации PLA2 отмечалась более высокая продукция IgE через 14 дней после кастрации, чем у ложноопе-рированных самцов (Yamamoto Т., 2001).

г s

j 24,8* 24,5"

I

i 17,7 ■

]

!

контроль

5 недель после 12 недель

сж сж

*Р<0,05

Рис.6. Концентрация IgE в сыворотке крови у животных в динамике посткастрационного периода

Таким образом, оценивая в целом результаты по влиянию кастрации на гуморальный иммунный ответ, можно отметить его достоверную стимуляцию. Предполагается, что усиление антнтелообразования может быть связано с гиперплазией тимуса, увеличением количества В-клеток в костном мозге и селезенке (Eidinger D., 1972; Elis Т.М. et al., 2001). Однако пусковые механизмы эффекта кастрации на иммунную систему остаются неизвестными, дисрегуляция в В-клеточном комтгартменте может быть вызвана нарушением нормальных механизмов Т-клеточиого контроля. (Viselli S. et al., 1995).

Особенности хронической реакции трансплантат против хозяина у иптактпых и кастрированных самцов B6D2F1

Физиологические различия между самками и самцами включают также и иммунную систему. Более высокий уровень нормальных иммуноглобулинов (Butterworth М. et al., 1967), антителопродукции после иммунизации (Eidinger D., Garett T.J., 1972), пониженная чувствительность к инфекциям (Huber S.A. et al., 1982), сниженная реакции отторжения (Altaian S.R. et al., 1931), а также превалирование аутоиммунной патологии у самок связаны с половыми различиями в иммунном ответе (Treurniet R.A, et al., 1993). Тем не менее, патогенетические механизмы, объясняющие эти различия, до сих пор не известны. Показана более высокая чувствительность самок к развитию гломеруло-нефрита после индукции хронической РТПХ (Van Griensven М. et al., 1997).

Хроническая РТПХ как экспериментальная модель системной красной волчанки у мышей используется для изучения как общих механизмов формирования аутоиммунитета, так и люиусного нефрита (Lewis R.M. et al, 1968; Bruijn J.A. et al., 1992). Хроническая РТПХ развивается в полуаллоген-

ной модели DBA/2—»(C57BL/6 х DBA/2)F1 - при переносе лимфоидных клеток одного из родителей (донора) реципиентам-гибридам. Чаще используется модель переноса клеток селезенки родителя DBA/2 (самки или самцы) реципиентам-гибридам B6D2F1 или B10D2F1 (самки или самцы) (Via C.S. et al., 1991).

Показано, что перенос лимфоидных клеток от самок DBA/2 интактным реципиентам-самцам B10D2F1 не приводил к развитию аутоиммунного гло-мерулонефрита (Treumiet R.A. et al., 1993). Добавление гонад-эктомированным самцам эстрогенов не приводит к появлению протеинурии и развитию нефрита, введение андрогенов снижало уровень протеинурии у реципиентов-самок (Van Greinsven М. et al., 1997).

Детальное изучение хронической РТПХ в модели DBA/2-»B6D2Fl на самках-реципиентах показало, что в зависимости от преобладающего соотношения Thl/Th2 CD4+ Т-лимфоцитов в ключевой момент развития реакции течение хронической РТПХ может направляться по двум оппозитным вариантам: Thl-зависимой иммунопатологии (группа nonlupus, без развития им-мунокомплексного гломерулонефрита) и Th2- зависимой иммунопатологии (группа lupus, при этом развивается иммунокомплексный гломерулонефрит) (Сафронова И.В., 2001; Кудаева О.Т., 2003).

Индукцию РТПХ проводили на интактных и кастрированных самцах. При этом кастрацию осуществляли в разные сроки относительно индукции РТПХ.

Частота развития люпус-нефрита у интактных и кастрированных животных

Как видно из данных рис.7, у 72% интактных самцов B6D2F1 после индукции РТПХ развивается lupus-нефрит, индукция РПТХ на 5-й неделе после кастрации приводила к достоверному снижению числа случаев lupus-нефрита - только у 38,4% мышей развивался иммунокомплексный гломерулонефрит.

Проведение кастрации на 7-й день после индукции РТПХ не изменяет частоты возникновения lupus-нефрита у мышей, она составляет 33%. Показано, что длительный дефицит андрогенов у мышей С57В1/6 вследствие кастрации в возрасте 1,5 мес, приводил к 2-6- кратной стимуляции продукции ИЛ-2 и к 3-7-кратному увеличению продукции ИФу СопА-стимулированными клетками селезенки in vitro, что соответствует профилю Thl (Viselli S.M. et al., 1995). Можно предполагать, что эта девиация продукции цитокинов вследствие кастрации приводит к изменению соотношения Thl/Th2 в сторону Thl и, следовательно, снижению числа случаев lupus-нефрита.

Рис. 7. Течение хронической РТПХ у интактных самцов, кастрированных самцов и после введения MDP у кастрированных самцов B6D2FI

Ранее показано, что введение во время индукции РТПХ препаратов, сдвигающих соотношение Thl/Th2, изменяет частоту развития клинических вариантов расстройства иммунитета - lupus" или lupus" (Кудаева О.Т. , 2005). Для модуляции развития хронической РТПХ у самцов в сторону Т1з2-вари-анта был использован компонент клеточной бактериальной стенки мурамил-дииептид. Введение MDP, который стимулирует выработку провоспалитель-ных цитокинов, вызывает поликиональную активацию В-клеток и усиливает стимулирующее влияние ИЛ-4 на активированные В-лимфоцигш в момент ипдукции РТПХ на 5-й неделе после кастрации, увеличивает число животных lupus' с 38 до 60% (см. рис.7).

РТПХ, №29, К

ишь

штт, mi, %

Уровень IgE в сыворотке крови у мышей до и после индукции РТПХ у интактных и кастрированных животных

Как следует из данных литературы (Grossman Ch.J. et ai., 1990) и полученных результатов, гонадэктомия приводит к усилению гуморального иммунного ответа и увеличению продукции антител класса IgM, IgG и IgE. Продукция IgE у мышей регулируется также ТЬ2-цитокинами (Snapper С.М., 1987). Было изучено влияние гонадэктомии на содержание IgE в сыворотке крови у мышей после индукции РТПХ (см. табл. 2). 18

Таблица - 2. Влияние кастрации на уровень ^Е в сыворотке крови у самцов В6Р2Е1 после трансплантации полуаллогенных лимфоадных клеток

Показатель РТПХ GE+РТПХ

lupus nonlupus lupus nonlupus

Уровень IgE мкг/мл 26,4 16,1 33,2* 17,4

*Р<0,05 (между группой lupus и nonlupus у гонадэктомированных самцов).

Как видно из данных, представленных в табл. 2, у гонадэктомированных животных в группе lupus, которая характеризуется преобладающим влиянием ТЬ2-ответа, достоверно увеличивается концентрация IgE в сыворотке крови в 1,9 раза по сравнению с группой nonlupus. У негонадэктомиро-ванных животных группы lupus отмечается тенденция к повышению IgE в сыворотке крови. Таким образом, иммунокомплексный гломерулонефрит у гонадэктомированных самцов сопровождается усилением продукции IgE.

Влияние хронической РТПХ на содержание тестостерона в сыворотке крови у интактных и кастрированных самцов B6D2F1

Установлены различия в уровне сывороточного тестостерона у интактных и кастрированных самцов с индуцированной РТПХ (см. табл. 3). Видно, что у некастрированных особей с ТЬ2-зависимым вариантом РТПХ (с поражением почек) отмечалось достоверное снижение концентрации тестостерона - в 3,5 раза по сравнению с мышами с Thl-зависимым вариантом хронической РТПХ (без поражения почек). У гонадэктомированных самцов с развившимся аутоиммунным гломерулонефритом концентрация тестостерона составила 8,8 нмоль/л. Это значение ниже показателей тестостерона у особей с Thl- вариантом РТПХ в 1,2 раза, но различие не является статистически достоверным.

Таблица - 3. Концентрация тестостерона в сыворотке крови в группах

lupus и nonlupus у мышей

Показатель РТПХ GE+РТПХ

lupus nonlupus lupus nonlupus

Тестостерон, нмоль/л 16,8* 58 8,8 10,7

*Р<0,05 (между группой lupus и nonlupus у интактных самцов).

Полученные результаты подтверждают наличие изменения гормонального статуса у самцов поп1ирш- и 1ирш-рсциписнтов. У самцов формирова-

19

ние Независимого 1ирш-вариаита связано с резким снижением уровня тестостерона, что может объясняться действием комплекса факторов, а также сложным взаимодействием тестостерона и провоспалительных цитокинов. Известно, что половые гормоны способны влиять на продукцию провоспалительных цитокинов. Так, эстрогены и тестостерон повышают концентрацию провоспалительных цитокинов (ФНО-а и ИЛ-1(5) при аутоиммунном миокардите. Гонадэктомия самцов приводит к уменьшению провоспалительного ци-токина ИЛ-1р, тем самым снижая проявления аутоиммунного миокардита (РаилуеаШег Б., 2004). Сложные процессы, происходящие после индукции РТПХ, в частности цитокиновый шторм, могут влиять на изменение содержания тестостерона у самцов.

Сравнительная морфология почек у самок и самцов после проведения хронической РТПХ

По нашим данным, при переносе 150x106 клеток селезенки от самок БВА/2 интактным самцам ВОР1 частота развития иммунокомплексного гло-мерулонефрита (ИКГ) составляет 72%, что практически совпадает с данными о частоте возникновения ИКГ у самок при переносе такого же количества клеток - он составляет 60% (Сафронова И.В., 2001). У гонадэктомированных самцов частота возникновения ИКГ достоверно снижается и составляет 35%.

Таблица - 4. Относительная площадь структур на срезе коркового и мозгового вещества почки (в % от площади среза)_

Показатель самки самцы

контроль lupus контроль lupus

Корковое вещество почки

Канальцы 90,2 66,3"* 90,8 88,1*

Клубочки 3,4 1,5* 3,9 2,0*

Кровеносные сосуды 5,9 2,1*# 5,3 3,4*#

Лейкоцитарные инфильтраты 0,2 13,2*# 0 0*

Цилиндры 0 7,4* 0 3,6*

Кисты и полости с жидкостью 0 9,5* 0 2,9*

Мозговое вещество почки

Канальцы и трубочки 95,8 94,9 97,5 97,:3

Кровеносные сосуды 4,0 1,3*" 2,5 2,2*

Цилиндры 0 3,8'# 0 0,5**

(Р<0,05): * - между контрольной и опытной группой;

# - между опытными группами.

По данным Кудаевой О.Т. (2006), у самок lupus обнаруживается более высокий уровень тестостерона в сыворотке крови по сравнению с nonlupus. По нашим данным, у самцов lupus по сравнению с nonlupus наблюдается резкое снижение концентрации тестостерона. Уровень иммуноглобулина Е как у самок, так и у самцов более высокий у особей с lupus-нефритом. Как у самок, так и у самцов удается модулировать течение хронической РТПХ в сторону Th2- варианта с помощью MDP. Таким образом, индукция РТПХ у самок и самцов имеет как сходства, так и различия.

Наблюдаемые особенности течения хронической РТПХ у самцов и самок возможны и в отношении морфологического проявления гломерулонеф-рита. Для выявления этих особенностей были проведены гистологические исследования почек у самцов и самок с иммунокомплексным гломерулонеф-ритом (см. табл. 4).

Морфологическое исследование почек показало, что развитие аутоиммунного гломерулонефрита у самцов характеризуется меньшей выраженностью поражения клубочков и канальцев, отсутствием лейкоцитарных инфильтратов и поражения стенок сосудов по сравнению с самками. Лейкоцитарный инфильтрат почек самок представлен преимущественно лимфоцитами. Наличие соединительной ткани в корковом и мозговом веществе почек не отмечается, что указывает на отсутствие склероза почечной ткани (см. табл. 4). Не выявлялось наличие кровоизлияний в почках у животных с гломеруло-нефритом (см. табл. 4).

Таким образом, характер поражения почек у самцов с иммунокомплексным гломерулонефритом отличается от такового у самок. Развитие аутоиммунного гломерулонефрита у самцов характеризуется меньшей выраженностью деструктивных процессов в почках по сравнению с самками.

ВЫВОДЫ

1. Относительное количество лимфоцитов, масса тимуса и общее число ядросодержащих клеток тимуса достоверно выше через 5 и 12 недель после кастрации по сравнению с контролем.

2. Кастрация приводит к усилению интенсивности гуморального иммунного ответа in vivo. Происходит достоверное повышение абсолютного числа IgM-AOK и IgG-AOK в селезенке при первичном иммунном ответе на Т-зависимый антиген через 5 и 12 недель после кастрации. Достоверно увеличивается количество IgG-AOK в селезенке при вторичном иммунном ответе на Т-зависимый антиген через 5 недель после кастрации. Концентрация IgE в сыворотке интактных кастрированных животных достоверно увеличивается во все сроки наблюдения по сравнению с контрольными животными.

3. После кастрации достоверно возрастает клеточный иммунный ответ. ГЗТ увеличивается в 1,7 и 1,5 раза через 5 и 12 недель после операции соответственно по сравнению с контролем.

4. Проведение кастрации в различные сроки относительно индукции РТПХ достоверно снижает частоту развития иммунокомплексного гломеру-

21

лонефрита по сравнению с интактными животными. У интактных самцов после индукции РТПХ иммуннокомплексный гломерулонефрит развивался в 72,4% случаев, у кастрированных - в 38,4%.

5. Введение мурамилдипептида одновременно с индукцией РТПХ приводит к увеличению частоты иммунокомплексного гломерулонефрита до 60% случаев.

6. Индукция РТПХ приводит к достоверному повышению уровня IgE в сыворотке крови у кастрированных животных группы lupus по сравнению с группой nonlupus.

7. Индукция РТПХ у интактных самцов сопровождается резким достоверным снижением концентрации тестостерона в сыворотке крови в группе с иммунокомплексным гломерулонефритом lupus по сравнению с группой nonlupus.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. У кастрированных животных целесообразно проводить профилактику бактериальных инфекций при патологиях почек и болезнях нижних мочевыводящих путей, а также профилактические мероприятия по предупреждению воспалений мочевывыдели-тельной системы.

2. При терапии кастрированных животных рекомендуется исключить применение препаратов, обладающих поликлональными иммуностимулирующими свойствами, как факторов, провоцирующих поражение почек.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние гонадэктомии и на антителообразование и продукцию IgE у интактных мышей й мышей с аутоиммунным гломерулонефритом / С.А. Арсенова, О.Т. Кудаева, Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - №2/1. - С. 16-17.

2. Арсенова С.А. Уровень тестостерона у самцов в эксперимен-таль-ной модели аутоиммунного гломерулонефрита / С.А. Арсенова // Инновационный потенциал молодых ученых в развитии агропромышленного комплекса Сибири: материалы VII Межрегион, конф. молодых ученых и специалистов аграрных вузов Сиб. Федерал, округа. - Новосибирск, 2009. -С. 148-150.

3. Влияние кастрации на частоту развития аутоиммунного гломе-ру-лонефрита и уровень IgE / С.А. Арсенова, О.Т. Кудаева, Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Патология продуктивных и нерепродуктивных животных: материалы 8-й межрегион, науч,-практ. конференции - Омск, 2009. - С. 189-194.

4. Арсенова С.А. Влияние кастрации на параметры гуморального иммунного ответа / С.А. Арсенова, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных: материалы междунар. науч.-практ. конф. - Троицк, 2009.-С. 237-239.

5. Влияние гонадэктомии на уровень ^Е в экспериментальной модели аутоиммунного гломерулонефрита / С.А. Арсенова, О.Т. Кудаева, Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман, О.П. Колесникова, В.Н. Кисленко // Симбиоз Россия 2009: материалы II Всерос. с междунар. участием конгр. студентов и аспирантов-биологов (25-29 мая), - Пермь, 2009. - С. 268-270.

Подписано в печать 15.06.2010 г. Формат 60x84 1/16 Объем: Усл.,- изд. л, 1,0 Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №110

Отпечатано в ООО «Копи-Трейд» г. Новосибирск, ул. Кошурникова 53/1 Тел.: (383) 267-97-97,256-13-43 E-mail: Info@copytrade.ru