Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние излучения гелий-неонового лазера на физико-химические свойства крови

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние излучения гелий-неонового лазера на физико-химические свойства крови"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ОБРАЗОВАНИЯ ИНСТИТУТ ВОЗРАСТНОЙ ФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

, 4 ^ 'V УДК 615.849.19.015.4:616.151/. 154/043.3/

4 г м-?;

I о

КАРТУСОВА ЛЮДМИЛА НИКОЛАЕВНА

ВЛИЯНИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ ГЕЛИЙ-НЕОНОВОГО ЛАЗЕРА НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ

03.00.13 — физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва—1996

Работа выполнена в Государственном научном центре лазерной медицин] Министерства здравоохранения РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор,

заслуженный деятель науки

В.И.Козлов

доктор медицинских наук, профессор

Г.Д.Лигвг-н

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН

И.А.Корниенко В.Н.Семенов

Ведущая организация: Московский городской педагогический университет

Защита состоится " 28 " ноября 1996 года в 11 часов на заседании диссертационного совета К 018.01.01 в Институте возрастной физиологии РАО пс адресу: Москва, Погодинская ул., 8, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале №3 Государственной научной педагогической библиотеки им.К.Д.Ушинского при Институте возрастной физиологии РАО.

Автореферат разослан " 28 " октября 1996 года.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Цехмистренко Т.А.

Список сокращений

рН- показатель активной реакции крови

Рзо- давление кислорода, при котором гемоглобин насыщен на 50%

рОг парциальное давление кислорода

рССЬ- парциальное давление углекислого газа

ВЕ- избыток или дефицит оснований

КЩС- кислотно-щелочное состояние крови

кдо- кривая диссоциации оксигемоглобина

гнл- гелий-неоновый лазер

нили- низкоинтенсивное лазерное излучение

нилт- низкоинтенсивная лазерная терапия

влок- внутрисосудистое лазерное облучение крови

чклок- чрескожная лазерная терапия .

ол- общие лип иды

ФЛ- фосфолипиды

сх- свободный холестерин

нэжк- неэтерифицированные жирные кислоты

тг- триглицериды

эх- эфиры холестерина

ЛФТХ- лизофосфатидилхолин

СФМ- сфингомиелин

ФТХ- фосфатидилхолин

ФТЭА- фосфатидилэтаноламин

дс- показатель ненасыщенности двойных связей

пол- перекисное окисление липидов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время одним из наиболее перспективных источников излучения, применяемых в медико-биологических исследованиях и клинической практике, является гелий-неоновый лазер (ГНЛ), работающий на волне 632,8 нм. За сравнительно корЬткий срок низкоинтенсивная лазерная терапия сформировалась как весьма перспективная область медицины, основывающаяся на фотобиологическом эффекте биостимуляции (Т.Й.Кару, 1989; В.И.Козлов и соавт., 1993). Но до сих пор нет полной ясности природы механизма действия лазерного излучения ГНЛ на биологические объекты. Это связано, главным образом, с эмпирическим характером экспериментальных и клинических исследований, направленных на достижение биостимулирующего эффекта. Несмотря на обилие работ в данной области, продолжается период интенсивного накопления фактов, и осмыслить эти факты не всегда просто из-за разрыва между обширностью фактического материала и недостаточностью теоретических представлений о путях реализации фотоэффектов.

Данные экспериментальных исследований, проведенных- за последнее время, свидетельствуют о том, что низкоинтенсивное лазерное излучение, даже при местном применении, оказывает биоспмулирующее действие на ткани и организм в целом, выраженное в наибольшей степени при внутрисосудистой методике применения (Е.Мез1ег е1 а1., 1976; ГВ.Коуасв е1 а!., 1974; В.К.Гостищев и соавт., 1995; В.А.Вертьянов, 1994; Л.О.Шкроб и соавт., 1995 и др.). Имеются многочисленные клинические и экспериментальные данные при лечении воспалительных заболеваний (В.В.Богатов и соавт., 1994; САВавричук, 1994; С.В.Кашин, 1994 и др.), трофических язв и других длительно незаживающих ран (А.Ф.Медведенко и соавт., 1994; П.И.Толстых, Н.Х.Шаропов, В.А.Дуванский, 1995; В.Г.Стенько, Ю.К.Саросек, 1995; И.В.Корпусенко, 1995 и др.), хроническэго остеомиелита (П.И.Толстых, Г.Д.Литвин, В.А.Дербенев, 1995; К.А.Юсупов и соавт., 1995 и др.). Существует опыт лечения гелий-неоновым

лазером стенокардиии (А.И.Коряков, Е.Д.Рождественская, 1995 и др.), гипертонической болезни (В.И.Титов, Т.В.Степанова, 1995 и др.), ишемической болезни сердца (Н.Н.Кипшидзе, 1987; Г.М.Капустина, 1992-1995; Г.В.Бабушкина, И.М.Корочкин, А.В.Картелишев, 1995; С.С.Белоусов, Е.В.Гальперин, В.И.Козлов, 1995; Н.Г.Шевкунов с соавт., 1995; Г.В.Дмитриева, 1996 и др.). Исследователи связывают эффект биостимуляции с повышением степени утилизации кислорода тканями, ускорением окислительно-восстановительных процессов с повышением активности ферментов дыхательной цепи, повышением скорости биохимических процессов (Т.И.Кару, 1983; С.М.Зубкова, 1989; В.И.Козлов, 1993).

Ряд работ посвящен действию лазерного излучения на кровь, которая очень чувствительна к различным воздействиям и отражает состояние всего организма (Е.Н.Мешалкин, В.С.Сергиевский, 1985; АИ.Гончаров и соавт., 1984; М.Я. Авруцкий и соавт., 1995; В.Н.Кошелев, Ю.В.Чалык, Д.В.Сафронов, 1995; В.А.Шульга, 1995; Ю.И.Гринштейн, 1995; Н.В.Морозова, М.И.Баталова, Г.Я.Левин, 1995 и др.). Особый интерес проявляется к применению внутрисосудистого лазерного облучения крови (БЛОК) у больных сахарным диабетом и другими заболеваниями (О.К.Скобелкин и соавт., 1993; М.Я.Авруцкий и соавт., 1993; Е.В.Лебедьков, 1995 и др.). Применение ВЛОК активизирует противосвертывающую и фибринолитическую активность крови, повышает содержание эндогенного гепарина за счет активации тучных клеток и антитромбина - 3, снижает скорость агрегации тромбоцитов. Внутривенное лазерное облучение крови активизирует катал азу и другие митохондриалыше ферменты, что свидетельствует о единстве точек приложения энергии лазерного излучения на мембранах клеток (Н.И.Белоусова и соавт., 1994). Широко используется ВЛОК при лечении острого инфаркта миокарда и ишемической болезни сердца, что позволяет снизить летальность и сократить поражения в миокарде (И.М.Корочкин, 1983, 1985, 1987; В.С.Сергиевский, 1987; Н.Н.Киппшдзе, 1987; Г.М.Капустина, 1990, 1992 и др.). Имеются сообщения о применении ГНЛ в лечении гнойного панкреатита (В.М.Лисиенко, 1987;

А_А.Мартино, В.В.Павленко, 1995 и др.) и при перитоните (Г.Д.Брилль и соавт., 1995; Б.С.Брискин, И.М. Алиев, А.К.Полонский, 1995; П.М.Назаренко, А.А.Матвеев, 1995; У.М.Корабоев и соавт., 1995 С.Р.Рахимов, А.И.Исаев,

A.Х.Хаджиматов, 1995 и др.).

Первостепенное значение имеет изучение эритроцитов и изменения их свойств под влиянием излучения ГНЛ. Решение этой проблемы привлекает все большее внимание исследователей не только в теоретическом, но и в практическом плане, так как в клинике при различных заболеваниях в качестве биоактиваторов широко используются методы облучения ауто крови низкоинтенсивным лазерным излучением (М.В.Дуткевкч, 1981-1994; Л.Н.Самойлова, 1986-1993; М.В.Пиксин, 1986-1994; М.В.Маянский, 1993;

B.И.Козлов, 1993; О.К.Скобелкин и соавт., 1993; М.Я.Авруцкий и соавт., 1993; А.А.Мартино и соавт., 1994; Т.Н.Демина и соавт., 1995 и др.). Несомненно важным для физиологии и медицины является изучение вопроса ответной фотореакции и адаптации системы крови к лазерному излучению ГНЛ.

Цель и задачи исспедоваия. Основная цель настоящего исследования состояла в изучении изменения физико-химических параметров крови и ее компонентов при воздействии низкоинтенсивного излучения гелий-неонового лазера (длина волны 0,63 мкм).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить влияние излучения гелий-неонового лазера на кислородгранспортную функцию крови и особенности переноса кислорода в цельной крови и суспензии эритроцитов.

2. Изучить влияние излучения гелий-неонового лазера на кислотно-щелочной баланс системы.

3. Изучить влияние излучения гелий-неонового лазера на основные электролкты плазмы крови: ионы калия, натрия и кальция.

4. Изучить влияние излучения гелий-неонового лазера на липидный состав сывортки крови и мембраны эритроцитов у лиц, больных сахарным диабетом.

Научная новизна исследования. В работе впервые проведено сравнительное исследование характера действия излучения ГНЛ на цельную кровь, плазму и суспензию эритироцитов, что позволило установить динамику функциональных изменений эритроцитов и их кислородгранспортной функции, а также выявить резервные возможности цельной крови и плазмы при фотобиологических реакциях организма. Выявлены особенности фотобиологического действия излучения ГНЛ на основные физико-химические показатели крови, что имеет существенное значение для понимания физиологических механизмов действия низкоинтенсивного лазерного излучения. Изучены зависимости фотобиологического эффекта воздействия излучения ГНЛ на кровь от дозы лазерного излучения и от времени, прошедшего после облучения, определены режимы излучения ПШ, оказывающие наиболее выраженное положительное влияние на кислородтранспортную функцию крови. Полученные данные углубляют представление о физиологическом механизме действия низкоинтенсивного лазерного излучения ГНЛ на цельную кровь, в том числе на ее кислородтранспортную функцию и буферные свойства, а также состояние мембран эритроцитов.

Практическая значимость исследования. Результаты исследования были использованы при расчете параметров внутривенного облучения крови, применяемого в клинике ГНЦ ЛМ и нашли отражение в методических рекомендациях по использованию ВЛОК, а также в монографиях В.И.Козлова, 1993,1994гг., в курсе лекций по фотобиологическому действию НИЛИ на кровь.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции по применению лазеров в клинике и эксперименте (декабрь, 1987г, г.Ашхабад); Международной конференции "Новое в лазерной медицине" (ноябрь, 1991г., Брест); Международной конференции "Перспективные направления лазерной медицины"

(октябрь, 1992г., Одесса); Второй конференции Московского региона "Лазеры в медицинской практике" (май, 1992г., Москва); Международной конференции "Клиническое и экспериментальное применение новых лазерных технологий" (сентябрь, 1995г., Казань); Межведомственном научном совете "Лазерная медицина, хирургия и лазерная медицинская техника" Минздравмедпрома РФ и РАМН на тематическом заседании "Внутрисосудистое лазерное облучение крови в медицине",1995г.

Диссертационная работа обсуждена на совместной конференции сотрудников медико-биологичекого и клинического отделов Государственного научного центра лазерной медицины, кафедры анестезиологии и реаниматологии Учебно-научного центра Медицинского центра управления делами при Президенте Российской Федерации.

Работа является самостоятельным разделом комплексной темы "Действие лазерного излучения на биологические ткани" Государственного научного центра лазерной медицины Минздравмедпрома РФ, номер государственной регистрации 01870096370.

Реализация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано в журналах, сборниках научных трудов, материалах конференций 9 научных работ, отчет по НИР (№ государственной регистрации 01870096370).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указателя. Работа иллюстрирована 30 рисунками, 17 таблицами. Библиографический указатель состоит из 178 источников, в том числе иностранных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Низкоинтенсивное лазерное излучение вызывает доза-зависимые изменения в газовом составе, КЩС, в липидном составе как плазмы, так и

эритроцитов, а также сродства гемоглобина к кислороду. Эти изменения носят устойчивый характер, сохраняясь на протяжении суток после воздействия.

2. Изменения физико-химических свойств крови, связанные с увеличением содержания в плазме триглицеридов, а в эритроцитах - с общим снижением фосфолипидов и увеличением эфиров холестерина, существенно отражается на микрореологических условиях гемодинамики в организме и транспортной функции крови.

3. Внутривенное лазерное облучение нормализует показатели липидного состава крови и ее транспортную функцию.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты исследования. Объеюгом исследований служили интакгные и облученные расфокусированным светом ГНЛ кровь, суспензия эритроцитов и плазма крови человека.

Исследовали кровь 158 доноров в возрасте 18-55 лет. Забор крови производился в отделении переливания крови Городской клинической больницы № 51, г.Москва.

Кровь здоровых людей брали из локтевой вены, используя в качестве антикоагулянта гепарин (в 1мл - 25000 ЕД).

Плазму получали центрифугированием крови на приборе МЦ-3 при 3000 оборотах в минуту в течение 10 минут.

Эритроциты исследовали в модельной системе, в которой плазма крови замещалась физиологическим раствором. При приготовлении суспензии эритроцитов верхний слой эритроцитарного осадка, содержащий белые клетки крови, тщательно удаляли с помощью пипетки. Оставшиеся эритроциты промывали один раз физиологическим раствором. Супернатант удаляли. Осадок эритроцитов смешивали с физиологическим раствором (0,15М раствор NaCl) в соотношении 1:1 по объему.

В качестве контроля использовалась кровь тех же доноров, выдержанная на воздухе в течение времени эксперимента.

Учитывая теоретический интерес и практическое значение использования лазерного излучения в биологической модели, мы исследовали кровь людей, больных сахарным диабетом. В этой части работы исследовался липидный состав сыворотки и мембран эритроцитов При этом сравнивалась эффективность внутривенной и чрескожной лазерной терапии. В соответствии с поставленными задачами и в зависимости от доступа лазерного- воздействия больные были разделены на две группы.

Пациенты первой группы (16 больных), наряду с приемом сахаропонижающих препаратов, получали внутривенную лазеротерапию. Через инъекционную иглу вводили световод в локтевую вену и облучали кровь в течение 30 минут гелий-неоновым лазером "Алок -1" (длина волны 632,8 нм) с выходной мощностью 5 мВт ежедневно в течение 10 дней, доза 9 Дж.

Вторую группу контрольных больных (51 человек) составляли пациенты, получавшие традиционную медицинскую помощь без применения лазеротерапии.

Дополнительно в качестве контроля использовалась кровь от здоровых доноров, которые составили группу из 10 мужчин и женщин в возрасте от 45 до 60 лет, в генеалогическом дереве которых отсутствовали больные сахарным диабетом и которые имели нормальные показатели гликемии. ■

Во всех группах больных сахарным диабетом базисная терапия проводилась по общепринятым принципам. Обследованные группы были примерно одинаковыми по составу пациентов: по полу, возрасту, формам сахарного диабета и выраженности симптомов интоксикации.

Больных курировали руководитель отделения хирургической инфекции ГНЦ лазерной медицины МЗ РФ, д.м.н., профессор П.И.Толстых и главный научный сотрудник Центра, д.м.н. В.А.Дербенев.

Всего от больных взято 134 образца крови.

Общее количество проб крови - 292.

Используемые источники излучения. В данном исследовании использовались отечественные низкоинтенсивные лазерные аппараты на базе

гелий - неоновых лазерных излучателей - "ЛГ-75" для модельных экспериментов и "АЛОК-1" для внутривенного облучения крови. Определение мощности излучения проводили с помощью измерителя средней мощности и энергии оптических квантовых генераторов ИМО-2. Энергетические параметры

лазерного излучения по всем группам экспериментов представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Параметры лазерного излучения, использованные в экспериментальных исследованиях.

Лазер Длина Режим Выходная Время Доза, Дж

волны, нм излучения мощность, экспози-

мВт ции, мин

ЛГ-75 632,8 Непрерывн 8 15 7 Л

ый 30 14,4

60 28,8

АЛОК-1 632,8 Непрерывн 5 30 9,0

ый

Плотность мощности (W) рассчитывалась по принятой в лазеротерапии методике (В.И.Козлов и соавт., 1993): W = P/S. В условиях наших экспериментов плотность мощности составляла - 2,55 мВт/см2. Плотность энергии при 15 минутной экспозиции составляла - 2,29 Дж/см2; при 30 минутной — 4,58 Дж/см3; при 60 минутной — 9,17 Дж/см2. Энергетическая доза - 7,2 Дж, 14,4 Дж, 28,8 Дж, Статистическая обработка результатов. Полученные результаты обработаны методом вариационной статистики. Анализ данных проводили в выборках с симметричным распределением значений признаков. Для каждого вариационного ряда рассчитывали среднюю арифметическую, среднее квадратичное отклонение, среднюю ошибку среднего арифметического. Вероятность отличий определяли по таблице Стьюдента. Для статистической

обработки полученных данных использовали программируемый калькулятор "Hewlett Packard 9815А" (США).

Методы исследования.

Кислородтранспортную функцию эритроцитов изучали, снимая кривые диссоциации оксигемоглобина на приборе Hem-O-Scan (США).

Кислотно-щелочное состояние (КЩС) крови исследовали с помощью автоматического анализатора газов крови "AVL-945" (Швейцария).

Проведена дополнительная серия опытов по изучению устойчивости фотоиндуцируемых изменений в крови после однократного лазерного облучения крови ГНЛ (Д=14,4 Дж).

Концентрации ионов калия и натрия в плазме определялась с помощью пламенного фотометра (Германия).

Концентрация ионов кальция определялась флуориметрическим методом в плазме крови на приборе FP-9 (Финляндия) с помощью стандартного набора реактивов фиры Boehringer Mannheim GmbH, Wien-Export.

Определение липидного состава мембран эритроцитов и сыворотки крови проводили с помощью тонкослойной хроматографии со специфическими проявителями после предварительной экстракции липидов хлороформом. Количественное соотношение фракций липидов и фосфолипидов оценивали с помощью денситометра "Карл Цейс" (Германия).

Определение уровня ненасыщенности липидов сыворотки и мембран эритроцитов проводили методом озонирования (С.Д.Разумовская, Г.Е.Заиков, 1975) совместно с д.м.н., профессором Л.Ф.Марченко, д.м.н.Т.И.Туркиной и д.м.н. М. А.Сопромадзе на приборе АДС - 4M.

Результаты проведенных исследований и их обсуждение.

Влияние лазерного излучением ГНЛ на кислотно-щелочное состояние крови рН

7,67,55 7,5 7.45 7,47,35 7.3 7.25

7.2 14.4 28,8 Рис.1. Влияние разных доз излучения ГНЛ на рН крови.

На рисунке 1 представлена диаграмма, отражающая влияние дозы облучения гелий-неонового лазера на рН крови. Как видно из рисунка зависимость эффекта от дозы облучения выражена слабее при Д=28,8 Дж: увеличение дозы в четыре раза не сопровождалось повышением эффекта по сравнению с начальной экспозицией (ДрН при Д=7,2 Дж - 0,138; Д=28,8Дж -0,114). При этом применение 30 минутной экспозии (Д=14,4 Дж) позволило получить наиболее выраженный эффект увеличения рН (ДрН составило 0,160).

По данным разйых исследователей действие излучения гелий-неонового лазера различной, в том числе и близкой мощности, на цельную кровь вызывает не одинаковые последствия: по разному изменяются биохимические свойства плазмы и эритроцитов (Б.В.Радионов и соавт., 1991). В целях выяснения механизма такого влияния нам представилось полезным исследование действия излучения ГНЛ на кислотно-щелочное состояние не только цельной крови, но и отдельных ее компонентов.

Парциальное давление кислорода, также как и рН, возрастает после облучения. При этом максимальное увеличение отмечено в плазме (на 43,7%,

сравнительно с контролем) и цельной крови (на 17,5%, сравнительно с контролем) и минимальное увеличение во фракции эритроцитов (10,7%,

сравнительно с контролем). %

| ■ рР2 в сравнении с контролем (в%) [

кровь эритроцитов

Рис.2. Изменение рОг цельной крови, суспензии эритроцитов н плазмы после облучения (Д=14,4 Дж) в процентах в сравнении с контролем.

Сравнение рН цельной крови и ее компонентов после 30 минутной экспозиции показывает, что гораздо боыпие изменения отмечаются в плазме и цельной крови (соответственно на 4,3% и 2,0% в сравнении с контролем), а во фракции эритроцитов рН после облучения изменяется всего на 0,8%.

Изменение парциальнго давления углекислого газа рСОг носит противоположный характер, снижаясь после облучения сравнительно с контролем в крови. Однако, как и в отношении рОг, максимальные изменения отмечаются также в плазме и цельной крови (соответственно на 57% в плазме и 44% в цельной крови) и значительно меньшее уменьшение рС02 отмечено во фракции эритроцитов (на 32,3%, сравнительно с кошролем).

Зависимость рН и рС02 от дозы облучения проходят через максимум при Д=14,4 Дж, однако, величина зависимости рСОг существенно меньше.

Сравнительно с показателем рН, рССЪ по мере удлинения экспозиции резко падает. •> ■

Облучение в дозе 14,4 Дж обусловливало неоднозначное изменение показателя концентрации оснований (ВЕ) составных частей крови. В цельной крови выявляется изменение в сторону снижения дефицита оснований, то есть увеличивается количество кислот на 19%, тогда как в плазме обратная картина: резко, на 92,0%, увеличивается избыток оснований, достигая 11,8 ±3,67 ммоль-л против 6,14 ±3,05 ммоль-л в контроле.

В эритроцитах же зафиксирован стабильный уровень ВЕ как в контроле, так и после облучения ( -16,2 ±1,06 ммоль-л против -16,2± 1,15 ммоль-л при облучении).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что лазерное облучение влияет на буферное состояние системы. Наиболее сильное влияние облучение ГНЛ оказывает на параметры плазмы крови, причем изменения рСОз в плазме того же порядка, что и в цельной крови. В то же время, значения рН, ВЕ, рОг, а также исходные (до лазерного облучения) величины рН и рОг ближе для цельной крови и суспензии эритроцитов. Во всяком случае облучение ГНЛ крови и ее компонентов (суспензии эритроцитов и плазмы) при довольно широком диапазоне исходных значений параметров КЩС приводит хотя и к различным по величине, но одинаковым по знаку изменениям этих параметров.

Подводя итоги изучения изменения физико-химических параметров крови и ее компонентов (суспензии эритроцитов и плазмы) при лазерном облучении в красном диапазоне спектра, можно констатировать, что во всех случаях реакция системы на воздействие носила доза-зависимый характер. Причем, по мере увеличения дозы лазерного воздействия, степень ответной реакции нарастала. При воздействии лазерным излучением в течение 60 минут (Д = 28,8 Дж) происходило снижение, либо стабилизация уровня эффекта. Максимум эффекта достигнут при Д=14.4 Дж и 30 минутной экспозиции. Таким образом, при

плотности мощности лазерного излучения 2,55 мВт/см1 четко прослеживается экстремальная зависимость изменений от времени экспозиции.

Устойчивость фотоиндуцируемых изменений в крови после однократного лазерного облучения крови ГНЛ (Д = 14,4Дж)

Исследование динамики рН крови после 30 минутного облучения показало, что рН продолжает расти в течение нескольких часов (максимальное значение 7,563±0,02 отмечено через 2,5 часа после облучения), при этом только через сутки после облучения рН снижается до уровня одночасового промежутка после облучения (7,502±0,02 против 7,504± 0,02 спутся 1 час после облучения).

Таким образом, фотобиологичесий эффект в крови после однократного лазерного воздействия (Д=14,4 Дж) сохраняется на протяжении суток.

Как известно, биологическое действие низкоингенсивного лазерного излучения определяется наличием в биообъекте фоточувствительных акцепторов (хромоформных групп), поглощающих излучение определенной длины волны. Так, в роли первичных фотоакцепторов излучения гелий-неонового лазера могут выступать гемоглобин, имеющий различные полосы поглощения в зависимости от состояния в окси- или дезокси- форме, порфирины, молекулярный кислород, окислительно-восстановительные ферменты, фермент-субстратные комплексы, спектры которых имеют полосы поглощения в красной областа (Г.Ф.Абкарович, 1990; С.Д.Захаров и соавт., 1989; С.М.Зубкова, 1987; Т.И.Кару, 1986; Н.ВЛысенков, 1981; G.Parlato et all, 1983; O.Tiphlova, T.Karu, 1989; В.И.Елисеенко, 1991). Лазерное излучение позволяет концентрировать энергию соответствующей длины волны по принципу резонанса определенными молекулами (Т.А.Аджималаев и соавт., 1976). Квант света, энергия которого соответствует энергетической емкости молекулы, поглощается ее электрическим облаком, приводя молекулу в возбужденное состояние, то есть изменяется ее химическая активность (Б.А.Атчабаров, З.Ф.Бойко, 1980). В результате локальных атомно-молекулярных изменений после первичной резонансной абсорбции

энергии кванта света или распределения поглощенной энергии между колебательно-возбужденными состояниями отдельных атомных группировок возникают конформационные перестройки макромолекул (Н.Д.Девятков и соавт., 1987).

Таким образом, энергия кванта света лазерного излучения используется для преодоления активационных барьеров химических превращений и вызывает электронно-конформационные изменения в фотоактивном хромоформном комплексе, включающие перенос заряда, образование первичных химических продуктов, включающихся в биохимичесие процессы,и, в конечном счете, выливающаяся в фотобиологический эффект.

Влияние лазерного облучения на кислородтранспортную функцию.

Исследование кислородсвязывающей функции гемоглобина крови показывает, что облучение вызывало достоверное снижение Р50 при всех трех дозах облучения, что свидетельствует о повышении сродства гемоглобина к кислороду. При этом, темп изменения носил неравномерный характер. Снижение Р50 при дозе 7,2 Дж и 15 минутном облучении составило 1,12%; при дозе 14,4 Дж и 30 минутной экспозиции - 5,95% и при Д = 28,8 Дж и 60 минугиом облучении - 8,18%. В контрольной группе средняя величина Р50 соответствовала нормальным значениям 26,9±0,46 мм рт.ст. Однако, после 15 минутной экспозиции начинается снижение этого показателя (26,6±0,23 мм рт.ст.), продолжая постепенно уменьшаться до 25,3±0,29 мм рт.ст. и далее до 24,7±0,27 мм рт.ст. после 60-минугаой экспозиции. Это указывает на то, что отдача кислорода в данных условиях затруднена, хотя присоединение его к гемоглобину облегчалось. Отражением этого явилось увеличение кооперативное™ гемоглобина.

Облучение влияет на кислородсвязывающую функцию гемоглобина и во фракции эритроцитов. При этом кривая диссоциации оксигемоглобина взвеси эритроцитов сдвигается вправо (удаление от оси ординат), что свидетельствует об уменьшении сродства гемоглобина к кислороду. Среднее значение изменения

величины Рм составило 3,5 ± 0,9 ммрт.ст. (Д=14,4Дж). Таким образом, характер изменения Р» гемоглобина эритроцитов, лишенного возможности взаимодействия с буферными системами плазмы, аналогичен характеру изменения Р50 гемоглобина цельной крови, но при пониженном рН.

Облучение при Д=14,4 Дж приводит к росту кооперативного связывания кислорода гемоглобином (коэффициент Хилла при облучении в течении 30 минут при Д - 14,4 Дж в случае цельной крови увеличивает на 11%, а в случае взвеси эритроцитов - на 6%. Изменение функциональных свойств (кооперативности) гемоглобина обусловлено изменением электростатических свойств его молекулы и, вероятно, связано с изменением соотношения структурных форм его субъединиц.

Среди основных причин сдвига КДО ведущую роль играют значения рН, рССЬ, температуры крови, содержание 2,3 -ДФГ в эритроцитах и структурные особенности гемоглобина. Показатель Р», определенный в стандартных условиях, отражает влияние, только двух последних факторов, что явно недостаточно для оценки адаптационных возможностей системы. Изменения КЩС могли послужить причиной сдвига КДО влево. По мере увеличения рН крови после ее облучения уменьшалась величина Р», однако не пропорционально дозе облучения, то есть изменение концентрации ионов водорода не являлось единственной и основной причиной увеличения сродства гемоглобина к кислороду.

В условиях патологии возможны существенные нарушения газообмена. После облучения крови ГОЛ увеличивается резервное насыщение гемоглобина кислородом и этот феномен может быть эффективно использован. Это обеспечит увеличение потребления кислорода тканями.

Обнаруженное в эксперименте изменение сродства гемоглобина к кислороду позволяет предположить, что воздействие излучения гелий-неонового лазера приводит к конформационным превращениям гемоглобина и изменению во взаимодействии субъединиц белка. По-видимому, увеличение сродства к

кислороду неоксигеиированных гемовых групп в результате облучения крови гелий-неоновым лазером является следствием конформационных изменений в области гемового кармана гемоглобина, подобных изменениям, происходящим при переходе Т-структуры молекулы гемоглобина в Л-структуру. Смещение равновесия в сторону Я-структуры гемоглобина приводит к повышению гидрофобности его молекулы (Е.Уйгапо, А.Сирапе, Ь.Сог<1опе, 1984).

Таким образом, одним из основных физиологических механизмов адаптации крови к излучению гелий-неонового лазера является увеличение содержания в крови гемоглобина с измененными кислородсвязывающими свойствами. Физиологическим откликом на фотохимическое раздражение, обусловленное низкоинтенсивным лазерным излучением, может быть увеличение оксигенации тканей, что нашло свое подтверждение в работах В.И.Козлова (1993) и др. Выводы нашего исследования согласуются с данными работ А.В.Шапошникова н Т.АЛинника (1990), которые при облучении донорской крови лучами гелий-неонового лазера обнаружили прогрессирующее увеличение в крови оксигемоглобина в среднем на 28% и 2-кратное уменьшение содержания метгемоглобина при практически постоянной концентрации гемоглобина.

При исследовании суспензии эритроцитов мы наблюдали инверсию знака эффекта показателя Р50 после 30 минутного облучения. По-ьидимому, это подтверждает тесную связь кислородтранспортных и буферных свойств гемоглобина и позволяет полагать вероятным изменение при этом констант диссоциации протонируемых групп белка.

Полагают, что система солевых мостиков, образованных остатками аминокислот гемоглобина, в частности гистидином, специфические контакты субъединиц, поворот субъединиц относительно оси вращения и изменение взаиморасположения их, связывание 2,3 - ДФГ способствуют тому, что четыре группы гема в условиях пониженного рН суспензии эритроцитов (7,258x0,057 против 7,317±0,059 в контроле, р<0,05) находятся в состоянии пониженного сродства к кислороду (градиент величины Р50 составляет 3,5 мм.рт.ст.). При рН

меньше 7,4 в гемоглобине Иэр 146 образует солевые мостики и таким образом в гемоглобине может акцептироваться больше Н+. 146 ответственен

приблизительно за 40% общей величины эффекта Бора. А при рН больше 7,4 имидазольное кольцо Ш5р-146 не участвует в электростатических взаимодействиях (Ш.ВаЫотп, 1976; С.СЬоШ, 1979).

Обратимая реакция Н*НЬ + Ог <=>Н+ + НЬОг и конформационные изменения, которые претерпевает гемоглобин при присоединении и освобождении кислорода, имеют фундаментальное значение для физиологии дыхания.

Возможно, что биологическое действие гелий-неонового лазера на 1фовь связано не только с поглощением света различными хромофорными группа, но и с включением тригтерных механизмов. При взаимодействии НИЛИ на биообъекты возможна реализация трех типов тригтерных молекулярных механизмов:

1. Окислительно-восстановительные реакции комплексных соединений с участием тема (Т.О.Беккер, 1976).

2. Окислительно-восстановительные реакции с участием синглетного кислорода, генерация которого осуществляется непосредственно лазерным излучением без участия фотосенсибилизаторов (А.М.Прохоров и соавт., 1990).

3. Фотосенсибилизированные окислительно-восстановительные реакции с участием эндогенных порфиринов (С.П.Гладких, 1991).

Отсюда следует, что триггерными механизмами, обеспечивающими формирование конечного биологического эффекта низкоинтенсивного лазерного излучения являются окислительно-восстановительные реакции комплексных соединений, физическая сенсибилизация с последующей активацией синглетного кислорода, прямая генерация синглетного кислорода и химическая сенсибилизация субстрата. В формировании интегральных эффектов терапии ведущую роль могут играть как отдельные триггерные механизмы, так и их различные комбинации, что, по-видимому, встречается наиболее часто.

Исследование влияния облучения ГНЛ на состав электролитов плазмы показало, что концентрация ионов натрия в исследуемом диапазоне доз не меняется, отмечено увеличение концентрации ионов калия пропорционально дозе облучения, концентрация ионов кальция при дозе воздействия 7,2 Дж и экспозиции 15 минут ниже порога чувствительности, в то время как облучение крови в течении 30 минут (Д=14,4 Дж) приводит к двухкратному увеличению концентрации ионов кальция. Эффект 15 минутной экспозиции можно рассматривать как реакцию биологической системы на возникновение минимальных додеструкшвных повреждений мембран клеток, выводящих систему из равновесия. Дальнейшее увеличение экспозиции приводит к изменении, ионной проницаемости эритроцитарной мембраны и осмотичесикх свойств эритроцитов, что отражается в перераспределении катионов между плазмой и эритроцитами в крови.

Влияние низкоинтенсиввного лазерного излучения на липидный состав

сыворотки крови и мембран эритроцитов.

Сахарный диабет представляет большую социальную проблему в ""вязи с возрастающим количеством больных данной патологией. Поэтому новые данные по коррекции данного состояния организма стимулирует разработку новых методов лечения, в частности с помощью лазерного излучения.

У больных сахарным диабетом отмечается гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия. При анализе фосфолипидных фракций в сыворотке крови обнаружена дисфосфолипидемия, проявляющаяся уменьшением относительного содержания СФМ-р<0,001 по сравнению с контрольной группой. Снижение отношения СФМ/ФТХ, отражающего соотношение "жестких" и "жидких" ФЛ в 2 раза (р<0,001) обусловлено дефицитом СФМ. Выявлена также тенденция к повышению содержания фракции ЛФТХ по сравнению с контрольной группой. Отмечено также накопление ФХ и тенденция к снижению относительного содержания легкоокисляемой фракции ФТЭА.

Липидный состав мембран эритроцитов больных отличается от аналогичного состава мембран эритроцитов контрольной группы уменьшением процентного содержания ФЛ (р<0,05), более высоким содержанием ЭХ (р<0,001) и повышением более чем в 2 раза соотношения ЭХ/ФЛ. К выявленным особенностям фосфолипидограммы эритроцитов относится достоверное уменьшение процентного содержания СФМ (р<0,001). При анализе содержания фракций ФЛ обнаружено "обогащение" пула эритроцитов ФТХ (р<0,05), а также достоверное повышение ЛФТХ в эритроцитах больных сахарным диабетом (р<0,05).

При исследовании показателя ДС установлено, что у больных сахарным диабетом отмечались более низкие средние показатели ДС по сравнению с контролем (р<0,01).

Таким образом, у больных сахарным диабетом происходит нарушение липидного обмена в клеточной мембране, последствия чего достаточно серьезны.

При оценке- показателей липидограммы после лазеротерапии выявлены благоприятные изменения в липидном и фосфолипидном составе сыворотки крови: снижена концентрация СХ (р<0,05), ТГ (р<0,05), увеличена концентрация СФМ (р<0,05). При этом при ВЛОК обнаружено уменьшение концентрации СХ ( до ЛТ 0,88 ±0,04; после ВЛОК - 0,75±0,04, р<0,05), ТГ ( до ЛТ 1Д9±0,09; после ВЛОК - 1,25±0,12, р<0,05), увеличение СФМ ( до ЛТ 8,95±0,47; после ВЛОК -10,3б±0,91, р<0,05), в то время как при ЧКЛОК отмечалось лишь снижение уровня СХ (до ЛТ 0,88 ±0,04; после ЧК ЛОК - 0,75±0,03, р<0,05).

Лазеротершшя приводит к нормализации показателей липидного состава мембран эритрощггов.При этом выявлено достоверное повышение концентрации ФЛ (р<0,05) при стабильных показателях СХ, более выраженное при ВЛОК, снизилось содержание ЛФТХ (р<0,05), в большей .степени при ВЛОК. Коэффициент "жесткости" мембран составил до ЛТ - 0,72; ЧК ЛОК -0.55; ВЛОК - 0,45; контрольная группа - 0,35. Коэффициент СФМ/ФТХ увеличился (до ЛТ -

0,23; ЧК ЛОК - 0.24; БЛОК - 0,26; контрольная группа - 0,35). Отмечена нормализация количества ненасыщенности двойных связей в углеводородных цепях фосфолипидов ("показателя ненасыщенности") - до ЛТ - 174,82±13,73; ЧК ЛОК - 169,14± 14,34; БЛОК - 263,83±17,78; контрольная группа - 260,00±20,00). При этом, наилучшие результаты были получены при ВЛОК.

Нормализация показателей липидного состава мембран эритроцитов также была хорошо выражена: отмечено достоверное повышение ФЛ (до ЛТ - 27,61+ 1,34; ЧКЛОК - 28,17+1,67; ВЛОК - 34,38 +2,05; контр, группа - 33,38+2,1; р<0,05) при стабильных показателях СХ, что свидетельствовало об уменьшении вязкости и "жесткости" мембран, а также об изменении их поверхностного заряда; снизилось содержание ЛФТХ (до ЛТ - 1,42+ 0,17; ЧКЛОК - 1,19+0,26; ВЛОК -0,53 +0,06; контр, группа - 1,06+0,004; р<0,05). Коэффициент ЭХ/ФЛ составил 0,72 - 0,55 - 0,45 против 0,35 в контр, группе, отражающий структурные и функциональные мембранные перестройки. После ЛТ происходила также нормализация показателя ненасыщенности двойных связей (ДС) — до ЛТ -174,82+ 13,73; ЧКЛОК - 169,14+14,31; ВЛОК - 264,83 +17,78; контр, группа -260,00+20,00; больше выраженная при ВЛОК, что также сказывается на стабильности мембран эритроцитов.

Приведенные данные свидетельствуют, что более значительные изменения показателей липидного и ФЛ обмена у больных сахарным диабетом происходит после ВЛОК, чем при ЧКЛОК. Выражается это в усилен™ метаболического оборота, обновлении . и- стабилизации липидной компоненты мембран эритроцитов в большей степени при ВЛОК.

Следовательно, в формировании интегральных эффектов низкоинтенсивное лазерное излучение на биосистему влияет не только длина волны данного излучателя, но и доза облучения, исходное состояние объекта. Ответная реакция системы может проходить как по отдельному триггерному механизму, так и в различных их комбинациях.

Таким образом, нами выполнено комплексное исследование действия низкоингенсивного лазерного излучения на параметры крови, характеризующие ее функциональное состояние. Фрагмент работы, выполненный на клиническом материале, позволил дать физиологическое обоснование оптимизации доз для облучения крови и сделать предложение по методике лечения сахарного диабета, которые включены в методические разработки Государственного научного центра лазерной медицины. В этой связи обсуждены возможности физиологического и фотобиологического механизма действия лазерного излучения красного спектра облучения на кровь.

ВЫВОДЫ

1. Наиболее сильному влиянию излучения низкоингенсивного красного лазера (ГОЛ) в дозе от 7 до 30 Дж подвержены такие структурно чувствительные парамепры крови как рН и Р50.

2. Воздействие излучения красного лазера на цельную кровь приводит к структурно-конформационным изменениям гемоглобина, следствием чего является изменение его сродства к кислороду, и, возможно, параметров гемоглобиновой буферной системы. Лазерное облучение крови при нормальных параметрах КЩС сродство гемоглобина к кислороду повышает, а при пониженном рН, в том числе при исследовании суспензии эритроцитов, и повышенном рСОг • понижает.

3. Облучение крови ГОЛ увеличивает резервное насыщение гемоглобина кислородом, что повышает адаптационные возможности организма при различных нарушениях газового состава тканей.

4. В результате взаимодействия цельной крови с излучением ГОЛ (Д-28, Дж) происходят изменения в структуре белков плазмы - освобождается значительное количество ионов кальция, в тоже время изменения протеиновой буферной системы незначительны. Это способствует улучшению электростатических взаимоотношений в крови.

255. Одним из ведущих фотоакцепторов излучения красного лазера в криви является гемоглобин эршродитов и, опосредованно, их мембранные структуры.

6. Изменения физико-химических свойств крови при сахарном диабете сопряжены с увеличением содержания в плазме триглицеридов, а в эритроцитах -с общим снижением фосфолипидов и увеличением эфиров холестерина, что существенно отражается на микрореологических условиях гемодинамики в организме и транспортной функции крови.

7. Внутривенное лазерное облучение крови у больных сахарным диабетом в терапевтических дозах вызывает нормализацию соотношений фракций липидов и в плазме, и в мембране эритроцитов, что влияет на повышение текучести крови.

8. Действие красного лазера на физико-химические свойства крови как in vitro, так и in vivo зависит то дозы светового потока. Огимальный эффект на свойства крови отмечен при облучении в дозе 7-14 Дж.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Влияние излучения гелий-неонового лазера на физико-химическое состояние крови.// Применение лазеров в клинике и эксперименте. -Тез. Всесоюзной конфер. по применению лазеров в клинике и эксперименте, 1987г., С.133-143. Авторы: Карту сова Л.Н., Корепанов В.И.

2.Действие лазерного излучения на физико-химическое состояние крови. Отчет по НИР, № государственной регистрации 01870096370, 1991г., 42с. Авторы: Картусова Л.Н. .

3.Влияние излучения гелий-неонового лазера на кислородтранспортную функцию эритроцитов в условиях in vitro. //Новое в лазерной медицине, Тез. межд.конф., Москва-Брест, 1991г., С.99. Авторы: Картусова Л.Н., Литвин Г.Д., Картусов С.Н

4.Оценка кислород-транспортной функции крови до и после облучения ее излучением гелий-неонового лазера. //Лазеры в медицинской практике. Сб.

тезисов 2конфе-ренции московского региона, Москва, 1992г., С. 124. Авторы: Картусова Л.Н., Литвин Г.Д., Картусов С.Н

5.Влияние излучения гелий-неонового лазера на кислотно-щелочное состояние (КЩС) крови. //Перспективные направления* лазерной медици, Материалы межд. Конф., Москва-Одесса, 1992г., С.309-312. Авторы: Картусова Л.Н., Литвин Г.Д., Картусов С.Н.

6.Тригтерные молекулярные механизмы формирования биологических эффектов при низкоэнергетической лазерной терапии различных патологических состояний. //Клиническое и экспериментальное применение новых лазерных технологий. Материалы международной конференции, Москва-Казань, 1995г., С.288-290. Авторы: Гладких С.П., Алексеев Ю.В., Эпштейн H.A., Картусова Л.Н.

7. Действие лазерного излучения на кровьУ/Материалы съезда морфологов, Астрахань, 1996г. С. 109. Авторы: Картусова Л.Н.ДГетухов М.И.

8. Липидный и фосфолипидный спектр сыворотки. крови и мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом с гнойно—некротическими поражениями нижних конечностей. /Военно-медицинский журнал, 1995, №3, С.7-8. Авторы:Сопромадзе М.А., Толстых П.И.,Марченко Л.Ф., Картусова Л.Н., Кривихин В.Т.. Лебедьков Е.В.

9. Measirement of the true absorption coefficient of blood plasma in the visible region by an infra-red imager. The European Biomedical Optics Week, Vienna, Austria, 1996,2924-28. Armichev A.W., Cherniy W.W., Kaitusova L.N.

Подписано в печать J KC.96, Формат 60* IV/f6 Заказ 2

Усл.печ.л. 4, В Тираж 4 ¿5

Типография Россельхозахадемии