Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития в растительной ткани

Дударева, Любовь Виссарионовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития в растительной ткани
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития в растительной ткани"

На правах рукописи

Дударева Любовь Виссарионовна

ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ПРОЦЕССЫ РОСТА И РАЗВИТИЯ В РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2004

Работа выполнена в Сибирском институте физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, г. Иркутск.

Научные руководители: чл.-корр. РАН,

доктор биологических наук, профессор Р.К. Саляев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.С. Романенко

Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН,

г. Иркутск

доктор биологических наук, профессор Е. В. Шевченко Иркутский государственный медицинский институт, г. Иркутск

Ведущая организация: ИГУ, кафедра физико-химической биологии биолого-почвенного факультета, г. Иркутск

Защита диссертации состоится " 3" ноября 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Факс (3952) 510754; E-mail: laser@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан " 1" октября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Г.П. Акимова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Действие низкоинтенсивного лазерного излучения на живые организмы, в том числе на растения, вызывает интерес исследователей практически с момента изобретения лазера. Однако до настоящего времени нет единой теории объясняющей все эффекты, возникающие при действии света лазера на биологические объекты. Это связано с относительной сложностью биологических систем и трудностями анализа закономерностей преобразования энергии в живых тканях. Считается установленным фактом стимулирующее влияние света лазера на многие физиологические процессы как в организмах человека и животных, так и у растений. При этом механизмы терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения исследуются достаточно интенсивно. Определены ключевые структуры и реакции в клетках и клеточных органеллах, в которых могут формироваться ответы на действие лазерного излучения (Владимиров, 1999, Клебанов, 1999, Кару, 2001). В то же время работы по изучению влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на растительные объекты носят прикладной характер. Как правило, они посвящены практическому применению света лазера для стимуляции процессов роста и развития, увеличения всхожести и энергии прорастания семян и, в конечном итоге, для увеличения урожайности культурных растений. Изучению же возможных путей реализации стимулирующего действия низкоинтенсивного лазерного излучения на растительные объекты посвящены лишь единичные работы. Между тем, именно растения эволюционно более приспособлены к восприятию световой энергии и к ее утилизации. Физиологический статус растения во многом зависит от интенсивности света, его спектрального состава, дозы излучения и периодичности освещения. Поэтому изучение биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения на растения может представлять интерес не только для выявления механизмов его реализации, но и для исследования фундаментальных закономерностей действия света на растительные организмы. По имеющимся сведениям результатом облучения растительной ткани светом лазера может быть как стимуляция различных процессов, так и отсутствие ответа на воздействие, а в некоторых случаях, и ингибирование изучаемого процесса. Условия, при которых осуществляется тот или иной путь реализации действия низкоинтенсивного лазерного излучения на растения, а также их ответные физиологические и биохимические реакции изучены весьма слабо.

Цель и задачи исследования Целью представляемой работы было изучение влияния низкоинтенсивного лазерного излучения (А= 632,8 нм) на процессы роста и развития в культуре растительных тканей. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Выявить дозу облучения растительных объектов (каллусная культура ткани, изолированные вакуоли) светом гелий-неонового лазера, дающую максимальный биологический эффект.

2. Изучить влияние низкоинтенсивного лазерного излучения (Я,=632,8 нм.) на индукцию каллусогенеза у дикорастущих злаков Е1утыэ эШпеш L, А^горугоп епэ1аШт Ь., Ногйвыт Ъгву1эыЪы1аШт Ь..

3. Изучить влияние низкоинтенсивного лазерного излучения =632,8 нм.) на динамику морфогенетических процессов (образование морфогенных каллусов, ризогенез и регенерацию) в каллусной культуре пшеницы сорта Скала.

4. Изучить влияние когерентности и длины волны излучения на эффективность облучения растительной ткани светом лазера. Источники излучения: гелий-кадмиевый лазер (Х=441 нм) и некогерентный красный свет (^=633 нм).

5. Изучить динамику накопления продуктов перекисного окисления липидов в каллусной культуре ткани пшеницы под действием низкоинтенсивного лазерного излучения (632,8 нм).

6. Изучить влияние света лазера (632,8 нм) на гидролитическую активность протонных помп тонопласта - нГ - АТФазу и Н1- пирофосфатазу.

7. Провести сравнительный анализ структуры мембранных липидов, экстрагированных из облученных и необлученных каллусов пшеницы.

Научная новизна. Впервые показано, что низкоинтенсивное лазерное излучение (А,=632,8 нм) оказывает заметное стимулирующее действие на морфогенетические процессы (образование зон вторичной дифференцировки, ризогенез, регенерацию) в культуре ткани пшеницы. Установлено, что это влияние является дозозависимым. Показано различие доз, дающих максимальный эффект действия для растительных и животных тканей. Продемонстрировано, что низкоинтенсивное лазерное излучение в указанных дозах увеличивает способность к каллусообразованию у диких злаков, причем наиболее существенное увеличение получено для Agropyron епэ(аШт Ь., вида с изначально низкой способностью к каллусогенезу. Установлено, что влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на интенсификацию морфогенетических процессов зависит от его длины волны и когерентности. Показано, что одним из путей действия света гелий-неонового лазера является его влияние на мембраны клеток и клеточных органелл. При этом индуцируются процессы перекисного окисления в мембранных липидах, изменяется гидролитическая активность протонных помп, наблюдаются изменения в структуре мембран.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований могут быть полезными для понимания возможных путей действия низкоинтенсивного лазерного излучения на растительные ткани. Данные о том, что первичный ответ культуры ткани на облучение светом лазера, выражающийся в повышении количества продуктов перекисного окисления, в изменении активности мембраносвязанных ферментов, носит характер сходный с реакциями растений на стрессовые воздействия различной природы, вносят вклад в изучение этих реакций.

На основе полученных данных можно рекомендовать низкоинтенсивное лазерное излучение с длиной волны 632,8 нм в качестве индуктора морфогенетических процессов при культивировании растительной ткани. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 8 статей. Результаты исследований были представлены на Третьей Всесоюзной конференции «Применение лазеров в науке и технике» (Иркутск, 1990), на третьем Всероссийском симпозиуме "Новые методы в биотехнологии", (Пущино, 1995), на Международном симпозиуме «Растение и стресс» (Москва, 2001), на восьмой международной практической конференции по квантовой медицине (Словения, 2002), на научных семинарах и сессиях СИФиБР СО РАН.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической и экспериментальной частей, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 21 рисунок и 2 таблицы. Список литературы состоит из 176 источников, в том числе 86 зарубежных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследований. В качестве растительного материала для исследования использовали каллусную культуру ткани пшеницы Triticum aestivum L. сорта Скала сибирской селекции и дикорастущих злаков Elymus sibiricus L., Agropyron cristatum L., Hordeum brevisubulatum L.

Для опытов по изучению влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на гидролитическую активность ферментов использовали вакуоли изолированные из ткани корнеплодов красной столовой свеклы Beta vulgaris L., сорт Бордо. Индукция каллусов. Для получения каллусной ткани пшеницы в качестве эксплантов использовали зрелые зародыши с половинкой эндосперма, а для получения каллусной ткани дикорастущих злаков зрелые зерновки с надсеченным зародышем. Индукцию каллусогенеза проводили на модифицированной среде МС (Murashige, Skoog, 1962) с добавлением 2%-ной сахарозы и 2 мг/л 2,4-Д, рН 6.0. Для приготовления смеси использовали реактивы фирмы (SIGMA, США). Каллусы до и после облучения выращивали в темноте при температуре 28°С.

Облучение исследуемых объектов проводили с помощью созданной в лаборатории установки на базе гелий-неонового лазера ЛГ-75 (Россия), длина волны излучения Х.:=632,8 нм. В ряде экспериментов использовали гелий-кадмиевый лазер ЛПМ - И (Россия), длина волны излучения Я.-=441,6 нм. Кроме лазеров, в состав установки входили оптические элементы - поворотные зеркала, призмы, фокусирующие линзы, юстируемые в трех плоскостях держатели для образцов, измеритель мощности LM-2 (Carl Zeiss, Германия). Источником некогерентного излучения служила лампа накаливания РНФ-20-8 (Россия) с регулируемой в переделах от 5 до 20 мВт мощностью. Для выделения требуемой длины волны использовали узкополосный оптический фильтр производства ЛОМО (Россия).

Дозу излучения во всех случаях рассчитывали по формуле:

где J - интенсивность излучения (Вт/м2), t - время облучения в секундах (Владимиров, Потапенко, 1988). Образцы в виде растворов облучали в прямоугольных кюветах или небольших круглых или конусообразных пробирках. Каллусы облучали непосредственно в стеклянных пробирках, в которых они культивировались. Облучение каллусов проводили на вторые сутки после пересадки на свежую среду. При изучении влияния света лазера на гидролитическую активность lf-АТФазы и Н4 -пирофосфатазы вакуоли в стабилизирующем растворе облучали перед инкубацией в термостате. Оценка морфогенетических параметров в культуре ткани пшеницы. Определяли следующие параметры культуры ткани, характеризующие ее рост и развитие: количество морфогенных каллусов, вторичный ризогенез (корнеобразование) и число регенерантов. Визуальное определение этих параметров проводили с помощью бинокулярной лупы МБС-9 (ЛОМО, Россия) с увеличением в 16 и в 4,8 раза.

Экстракция липидов из растительной ткани. Липиды экстрагировали из каллусной ткани с использованием системы растворителей хлороформ-метанол-вода (1:2: 0,8; v : v ). К измельченной в фарфоровой ступке ткани добавляли 2-3 мл смеси, которая быстро и эффективно извлекает липиды. Через 10 минут гомогенат переносили в делительную воронку. Экстракт разбавляли смесью воды с хлороформом (1 : 1; v : v), при этом образовывалась двухфазная система, нижний слой которой состоял из хлороформа с липидами, а верхний слой из метанола и воды в присутствии белков. После отделения хлороформного элюата его упаривали под вакуумом на роторном испарителе. В части экспериментов экстракцию липидов проводили непосредственно с пластинки КРС-5 с образцом осторожным добавлением 2-3 капель системы растворителей. Элюат собирали стеклянным капилляром. Экстракцию повторяли несколько раз, контролируя чистоту удаления липидов по изменению интенсивности полосы С=О при 1740-1735 см-1. Качественное изучение химического состава и структуры липидов. Изучение химического состава и структуры липидов, экстрагированных из каллусов пшеницы сорта Скала проводили с помощью метода инфракрасной спектроскопии. Для получения спектров использовали ИК-спектрофотометр IR-75 (Carl Zeiss, Германия). Изменения в структуре липидов, вызванные действием лазерного излучения, регистрировали по молекулярным спектрам в инфракрасной области, характерным для определенных соединений и их функциональных групп. Идентификацию спектров проводили с помощью имеющихся спектральных библиотек и литературных данных. Определение содержания диеновых коньюгатов в растительной ткани. Замороженную жидким азотом навеску каллусной ткани (0,2 г) растирали со смесью гептан-изопропанол 1 : 1, (v : v). Объем перенесенного в центрифужную пробирку гомогената доводили до 9 мл, тщательно

перемешивали и центрифугировали 10 мин при 4000 g. Надосадочную жидкость переносили в градуированные пробирки, добавляли 1 мл дистиллированной воды, встряхивали и оставляли еще на 30 минут. После разделения фаз отбирали 0,5 мл верхней гептановой фракции, помещали в прямоугольную кварцевую кювету и добавляли 2,5 мл этанола. Оптическую плотность измеряли при 233 нм на спектрофотометре СФ-56 (ЛОМО, Россия). Концентрацию диеновых коньюгатов в пробах рассчитывали на основании результатов спектрофотометрии с учетом коэффициента молярной экстинкции (е= 2.2x10"5 см-'хМ1).

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов в растительной ткани. Уровень перекисного окисления липидов тестировали с помощью спектрофотометрического метода (Стальная, 1977) по количеству вторичных продуктов пероксидации липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реактивные продукты). Для этого 0,2 г навески каллусной ткани растирали в гомогенизаторе с 1 мл 80% этилового спирта. К полученному тканевому гомогенату добавляли 0,1 мл насыщенного раствора ТХУ, 1 мл 30% ТХУ и 2 мл 0,06 М ТБК в 50% этаноле. Полученную смесь центрифугировали 10 минут при 4000 g. Объем супернатанта доводили 80% этанолом до 4 мл. Оптическую плотность раствора определяли при 532 нм на спектрофотометре СФ-56 (ЛОМО, Россия). Количество вторичных продуктов перекисного окисления в пробах во всех случаях рассчитывали на основании результатов спектрофотометрии с учетом коэффициента молярной экстинкции (е = 1,56х105 см*'хМ"').

Выделение_изолированных_вакуолей. Выделение проводили

модифицированным макрообъемным методом, разработанным в лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБРа СО РАИ (Саляев и др., 1981). Определение гидролитической активности протонных помп (11 АТФазы и 11 -пирофосфатазы). В пробирки объемом 2 мл вносили по 20-30 мкл изолированных вакуолей и добавляли 0,25 мл среды инкубации (100 мМ КС1, 10 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl2, 0,2 мМ молибдата аммония, 19 мМ трис/Mes, рН 8,0. В том случае, когда изучали активность Н+-АТФазы во все среды инкубации вносили в качестве субстрата 3 мМ АТФ (натриевая соль, Sigma, США), а при изучении активности Н+-пирофосфатазы добавляли 3 мМ пирофосфата (ПФн) (натриевая или калийная соли, Sigma, США). Во всех случаях суспензии вакуолей в рабочих инкубационных средах с субстратами (АТФ и ПФн) и без субстратов выдерживали в термостате при 37°С в течение 30 мин. Затем реакцию гидролиза субстратов останавливали 7% трихлоруксусной кислотой (ТХУ), при этом происходило частичное разрушение вакуолей. Для полного их шокирования пробирки интенсивно встряхивали в течение 15 мин или замораживали в жидком азоте. Затем содержимое пробирок центрифугировали 5 мин на микроцентрифуге Туре-320 (Poland) при 1200 g. Для анализа брали надосадочную жидкость. Активность ферментов определяли по количеству образовавшегося при гидролизе субстратов ортофосфата. Для того чтобы исключить примеси "нереакционного" Фн в опыт были введены два контроля. Первый контроль - среда плюс

субстрат. В этом случае определяли количество Фн, которое образуется при "самопроизвольном" разрушении субстратов. Второй контроль - вакуоли плюс среда без субстратов (АТФ или ПФн), так как вакуолярный сок содержит свободный Фн. Для определения активности ферментов, из общего количества Фн в опытных образцах вычитали значения двух контролей. При определении активности Н+-пирофосфатазы, полученные значения делили на два, так как при гидролизе пирофосфата образуется две молекулы ортофосфата (Катков, 1989). Активность Н+-АТФазы и Н+-пирофосфатазы выражали в условных единицах — мкМ Фн/мМ бетацианина в час (Doll et al., 1979). Изменение активности ферментов выражали в процентах от активности в необлученном контроле.

Статистическая обработка данных. Представленные на рисунках и в таблицах данные отражают средние арифметические величины не менее чем из 3 независимых экспериментов и ошибки средних. Достоверность различия полученных данных оценивали с помощью критерия Стьюдента. При аналитических работах с каллусами в биологическую повторность входило по 5-7 каллусов. Статистическую обработку данных проводили с помощью программных пакетов «GRAPHER V. 1.06» и «STATISTICA V. 5.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оптимизация параметров облучения растительных образцов светом

He-Ne лазера

Необходимым начальным этапом изучения влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на растительные объекты был выбор параметров облучения: длины волны и дозы. Т.к. наиболее широко и, судя по публикациям, эффективно в биологии применяется He-Ne (гелий-неоновый) лазер, в наших исследованиях он и был выбран в качестве источника излучения (Я,=632,8 нм). Интенсивность излучения или плотность мощности у этого типа лазеров составляет 10-25 мВт/см2. Мы предположили, что при облучении растительных объектов дополнительный вклад в поглощение и рассеяние света лазера может внести клеточная стенка. В связи с этим задачей данного раздела работы было определение дозы излучения гелий-неонового лазера, дающей максимальный биологический эффект для объектов растительного происхождения, как имеющих, так и не имеющих клеточной стенки.

Влияние времени экспозиции на выход каллусов из ткани дикорастущего злака

Hordeum Brevisibulatum L. Изучали влияние времени облучения светом лазера (Х=632,8 нм) на выход каллусов из ткани дикорастущего злака Hordeum Brevisibulatum L. Образцы подвергали действию лазерного излучения сразу после посадки на среду культивирования. Количество эксплантов, образовавших каллус, учитывали в процентах от общего числа образцов в контроле и в опыте. Контролем служили необлученные экспланты. В ходе работы было установлено, что изменение времени облучения от 0,5 до 5 минут приводило к заметному увеличению выхода каллусов по сравнению с контролем (рис. 1 а).

Рис. 1. а - зависимость выхода каллусов из ткани дикорастущего злака Hordeum Brevisibulatum L. от времени облучения светом гелий-неонового лазера, б -влияние времени облучения изолированных вакуолей красной столовой свеклы Beta vulgaris L., сорт Бордо светом гелий — неонового лазера на активность эндогенной АТФазы (% к контролю).

Из рисунка 1а видно также, что выход каллусов был максимальным при пятиминутном облучении. Дальнейшее увеличение времени экспозиции до 30 минут не влияло на выход каллусов. Исходя из полученных данных, мы сделали вывод, что пятиминутная экспозиция является в данном случае оптимальной. Доза облучения соответствующая этой экспозиции составила 4,5 Дж/см2.

Влияние времени экспозиции на активность эндогенной Н*-АТФазы (% к

контролю)

В своих экспериментах мы предполагали изучение влияние света лазера не только на морфогенетические характеристики, но и на быстропротекающие ферментативные процессы в суспензии изолированных вакуолей красной столовой свеклы Beta vulgaris L.. Исследуемым параметром была выбрана ферментативная активность Н+-АТФазы. Контролем служили необлученные растворы. Активность фермента учитывали в процентах к активности в контрольных образцах. Из данных представленных на рис. 16 видно, что ингибирующее влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на гидролитическую активность Н+- АТФазы существенно изменялось при изменении времени экспозиции от 0,5 до 3 минут. При увеличении времени облучения до 10 минут дальнейшего уменьшения активности фермента не наблюдали. Более того, наблюдали некоторое уменьшение ингибирующего влияния света лазера на активность Н+- АТФазы. Таким образом, доза

излучения, дающая максимальный эффект биологического действия для изолированных вакуолей составила 0,8-2,7 Дж/см2. Меньшую по сравнению с соответствующей дозой для каллусов величину, мы связываем с наличием у клеток каллусов плотной клеточной стенки, ослабляющей поток энергии излучения, проникающий внутрь клетки.

Полученные результаты показали, что действие лазерного излучения на растительные объекты зависит от дозы излучения. При этом интервал доз, дающих максимальный биологический эффект для изолированных клеточных органелл (не имеющих клеточной стенки) совпадает с таковым у объектов животного происхождения. Для целых клеток и тканей эти дозы были несколько выше, чем для клеток и тканей животных и составили 4,5 Дж/см2. Эта доза была использована в дальнейших экспериментах с культурой ткани.

Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на индукцию каллусогенеза у дикорастущих злаков

Вовлечение геномов диких злаков, обитающих в суровых климатических условиях, в конструирование новых форм пшеницы - одно из перспективных направлений клеточной и генной инженерии. В практике культивирования диких злаков встречаются виды, у которых индукция каллусогенеза затруднена. Мы предположили, что изучение возможного влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на способность к каллусообразованию у дикорастущих злаков может представлять как практический интерес (для решения биотехнологических задач), так и фундаментальный (для выявления закономерностей действия света на культуру ткани растений). Для исследования были выбраны: Б1ушш ъШпст Ь. (пырейник сибирскийЛ НоМеыт Ьг^зыЬыШыт Ь. (ячмень короткоостистый) и Agropyron егч$(аШт Ь. (житняк гребенчатый). Выбор именно этих злаков объясняется трудностями, с которыми мы столкнулись при получении из них каллусов. В качестве эксплантов были взяты зрелые зерновки исследуемых растений. Использовали две дозы излучения - оптимальную и повышенную (4,5 Дж/см2 и 27 Дж/см2). Количество полученных каллусов учитывали в процентах от общего числа эксплантов. Динамика каллусообразования из эксплантов Ногйгыт ЬrevisыЬыlatыm Ь. в зависимости от времени облучения показана на рис. 2а. Выход каллусов в опыте был достоверно выше, чем в контроле для обоих исследуемых вариантов. В экспериментах с тридцатиминутным временем облучения каллусов было получено на 10±2% больше чем в контроле. При пятиминутной экспозиции стимулирующее действие лазера оказалось более существенным, и выход каллусов в эксперименте был на 42±7% больше, чем в необлученных образцах. Этот эксперимент также подтвердил выявленную ранее зависимость выхода каллусов от времени от дозы излучения. Два вида, представленные на рис. 26 обладают разной способностью к каллусообразованию. Как видно из рисунка, выход каллусов для облученных образцов Elymыs siЬiricыs Ь составил 91 ±8%, в то время как для эксплантов не подвергавшихся действию лазера этот показатель был не более 55±6%.

Рис. 2. а - влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на индукцию каллусогенеза у ткани дикорастущего злака Нагйеыт brevisubulatum L., б - влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на индукцию каллусогенеза у тканей дикорастущих злаков Е1утшэШпеш L. и Agropyron cristatum К К — контроль, 5 и 30 мин — время облучения.

Особенно заметно проявилось стимулирующее действие лазерного излучения на экспланты вида Agropyron cristatum Ь, отличающегося стабильно невысокой способностью к каллус огенезу. Количество каллусов образовавшихся в контрольных образцах не превышало в этом случае 10± 1 %, в то время как облученные экспланты давали до 96±3% каллусов. Было установлено, что после облучения светом лазера, вид Agropyron cristatum К обнаруживает способность к каллусогенезу сравнимую с таковой у облученного вида Elymus эШпет К, который неплохо образует каллусы и в контрольной серии (54±4%). Полученные во всех экспериментах данные по облученным эксплантам достоверно отличаются от соответствующих значений в контроле (р<0,001).

При анализе полученных результатов мы пришли к следующему выводу: низкоинтенсивное лазерное излучение (А.=632,8 нм) в указанных дозах увеличивает способность к каллусообразованию у диких злаков. Обращает на себя внимание тот факт, что наибольший эффект облучения проявляется у вида с изначально низкой способностью к каллусообразованию.

Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на морфогенетические процессы в культуре ткани пшеницы сорта Скала

Одной из сложных задач в биотехнологии растений является получение регенерантов. Поэтому задачей этого раздела работы являлось исследование влияния света лазера на морфогенетические и регенеративные процессы в каллусной культуре растительной ткани. Определяли следующие параметры культуры ткани пшеницы: количество морфогенных каллусов, вторичный ризогенез и число регенерантов. Указанные параметры регистрировали для 100 каллусов в опыте и для такого же количества в контроле в трех независимых экспериментах. Число морфогенных каллусов, образовавших зоны вторичной дифференцировки, каллусов с корневыми волосками и число регенерантов учитывали в процентах к общему количеству взятых для исследования образцов. Изученная в ходе опытов динамика образования зон вторичной дифференцировки (морфогенных зон) в каллусной культуре, представлена на рис. За.

40 Время культивирования (дин)

время культивирования (дни)

а б

Рис. 3. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на морфогенетические процессы в культуре ткани пшеницы сорта Скала, а — на количество морфогенных каллусов, б - на выход регенерантов.

Количество морфогенных каллусов в облученных образцах систематически было больше, чем в контрольных. В среднем это превышение составляло 20%, вплоть до того времени (20-25-ый день культивирования), когда начинают образовываться регенераты и каллусы с корневыми зачатками. Затем число морфогенных каллусов в контроле и опыте становилось сравнимым. Этот факт можно объяснить началом активного образования регенерантов и корней из облученных каллусов, поскольку их количество в облученных образцах было

больше, чем в контрольных. При изучении динамики корнеобразования было выявлено, что здесь, также, начиная с 20-25-ого дня культивирования, наблюдали стимулирующее влияние когерентного излучения на образование в каллусах корневых зачатков. Таких каллусов среди облученных образцов было достоверно, в среднем на 10%, больше, чем в контроле. Наиболее интересными, в том числе с точки зрения задач биотехнологии, представляются данные, демонстрирующие динамику образования из каллусов растений-регенерантов (рис. 36). С момента появления первых регенератов и на протяжении всего времени наблюдений их число в облученных образцах превышало соответствующие значения в контроле. В конечном итоге, выход регенерантов в опыте составил в среднем 38% от общего количества взятых для исследования образцов. В то время как в контрольном варианте он не превышал 25%. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что низкоинтенсивное лазерное излучение оказывает стимулирующее действие на морфогенетические процессы в культуре ткани пшеницы, о чем свидетельствует заметное увеличение количества зон вторичной дифференцировки, корневых зачатков и числа регенерантов. Полученные результаты показывают возможность практического использования света Не-№ лазера как фактора, стимулирующего морфогенетические процессы в культуре тканей растений.

Роль физических характеристик лазерного излучения в его биологическом

действии

Одним из самых существенных вопросов при изучении влияния света лазера на растения является вопрос о той роли, которую могут играть особенности этого вида излучения в реализации его биологического действия. Речь идет, в первую очередь, о когерентности и монохроматичности. Имеющиеся на этот счет данные противоречивы (Кару, 1985, Кару 2001, Дубровский и др., 1982). Известно, что у растений регуляция различных процессов жизнедеятельности в значительной степени зависит от спектрального состава и физических характеристик света. Поэтому была поставлена задача: изучить биологическое действие на морфогенетические процессы в культуре ткани пшеницы источников излучения с параметрами, отличными от соответствующих параметров используемого в наших экспериментах гелий-неонового лазера. В качестве таковых были выбраны: гелий-кадмиевый лазер с длиной волны излучения 441,6 нм (синий свет) и некогерентный красный свет с длиной волны 633 нм. Как и в опытах с красным когерентным излучением (632,8 нм), определяли: количество морфогенных каллусов, вторичный ризогенез и количество регенерантов. Количество морфогенных каллусов, ризогенные зоны и число регенерантов учитывали в процентах к общему количеству взятых для исследования образцов. Из рис. 4а видно, что образование морфогенных каллусов в результате действия синего лазера не отличается от необлученного контроля. В варианте опыта с обычным красным светом (длина волны 633 нм) на определенных этапах культивирования наблюдалось некоторое превышение количества морфогенных каллусов над контролем, однако в значительно меньшей степени, чем в случае облучения когерентным красным светом (Не-№

лазером). При изучении влияния этих источников на процессы корнеобразования было обнаружено, что соотношение числа каллусов с корневыми волосками между обоими вариантами опыта и контролем имеет некоторые колебания на протяжении всего времени культивирования. Так, в каллусах, облученных синим лазерным светом, образуется несколько меньше корневых волосков по сравнению с контролем и вариантом с некогерентным красным светом. Облучение красным некогерентным светом, напротив, дает некоторое превышение количества каллусов с корневыми волосками над контрольным вариантом. Это дает основания предполагать, что красный некогерентный свет стимулирует процессы корнеобразования в культуре ткани пшеницы, однако в существенно меньшей степени, чем когерентный красный свет такой же интенсивности.

По результатам экспериментов (рис. 46) можно говорить, что излучение синего лазера не оказывает действия на выход регенерантов в каллусной культуре ткани пшеницы. Опыты с красным некогерентным светом выявили некоторое превышение количества регенерантов по сравнению с контролем. Однако, в существенно меньшей степени, чем для когерентного красного света.

Полученные данные привели нас к следующему выводу: в отличие от когерентного красного света (632,8 нм), который оказывает существенное влияние на морфогенетические процессы в каллусной культуре пшеницы сорта

200

Рис. 4. Влияние синего когерентного излучения (Х.—441 нм) и некогерентного красного света (А. = 6ЗЗнм) на морфогенетические процессы в культуре ткани пшеницы сорта Скала: а - на количество морфогенных зон, б —на число регенерантов.

Скала по всем трем измеряемым параметрам (количество морфогенных зон, вторичный ризогенез, выход регенерантов), синее когерентное излучение не

оказывает влияния на эти процессы. Некогерентный красный свет влияет на морфогенетические процессы в культуре ткани пшеницы, однако, это влияние менее выражено, чем в экспериментах с когерентным излучением той же длины волны.

Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на динамику накопления первичных (диеновые коньюгаты) и вторичных продуктов перекисного окисления липидов

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что низкоинтенсивное лазерное излучение может оказывать стимулирующее действие на различные физиологические процессы, в том числе и на те, между которыми отсутствует выраженная взаимосвязь (каллусогенез и морфогенез). Логично предположить, что, при формировании ответа на действие лазерного излучения должен быть задействован неспецифический, общий для многих процессов механизм. Для объектов животного происхождения установлено, что свет лазера может быть не только стимулирующим, но и стрессовым фактором, особенно на первых этапах облучения (Рогаткин и др., 1999). Известно, что одним из первичных неспецифических ответов на действие многих факторов, в том числе и стрессовых, является усиление процессов перекисного окисления (Клебанов и др., 2001; Кузнецов, 2001; Курганова и др., 1997). Мы сочли вероятным, что подобные процессы могут осуществляться в растениях и представляют интерес для изучения возможных путей реализации биологического действия лазерного излучения на растительные объекты. В связи с этим, нам представлялось важным установить, может ли низкоинтенсивное лазерное излучение являться индуктором перекисного окисления липидов в растительных тканях. Один из путей решения такой задачи - анализ накопления продуктов перекисного окисления. Накопление первичных продуктов окисления тестировали по содержанию диеновых коньюгатов. Накопление вторичных продуктов перекисного окисления определяли по концентрации продуктов реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК - реактивные продукты). Содержание исследуемых соединений в каллусах определяли непосредственно после облучения и спустя 48 часов. Изменения в динамике накопления вторичных продуктов перекисного окисления липидов в культуре ткани пшеницы после действия низкоинтенсивного лазерного излучения были достаточно четкими. Содержание ТБК-реактивных продуктов в ткани непосредственно после облучения существенно возрастало. Через двое суток после облучения эта разница носила менее выраженный характер, но также была вполне достоверной. Спустя 48 часов отмечалось некоторое повышение содержания ТБК— реактивных продуктов в контроле по сравнению с контролем непосредственно после облучения. Судя по литературным данным (Барабой 1991), это может быть связано с циклическим характером реакции культуры ткани на стресс, связанный с пересадкой на новую среду культивирования. Причем, фазы этих циклов у контроля и опытных образцов после облучения лазером, скорее всего, не совпадают. Накопление первичных стабильных продуктов пероксидации липидов определяли по концентрации пероксидов

жирных кислот, содержащих две сопряженные двойные связи (диеновых коньюгатов). Непосредственно после облучения содержание диеновых коньюгатов в опыте была значительно снижено по сравнению с необлученным контролем. Через 48 часов произошло выравнивание этого показателя, концентрации диеновых коньюгатов в контроле и в опыте существенно не отличались. Возникает кажущееся противоречие: с одной стороны облучение низкоинтенсивным светом лазера приводило к увеличению накопления ТБК-реактивных продуктов, что свидетельствовало об интенсификации процессов перекисного окисления липидов, а с другой - мы наблюдали уменьшение количества диеновых коньюгатов (первичных продуктов ПОЛ) в облученных образцах по сравнению с контролем. Однако известно, что в каждый момент времени содержание диеновых коньюгатов это результат двух одновременно протекающих процессов: образования и распада (Мерзляк, 1989). Поэтому снижение уровня их содержания может быть как результатом снижения скорости их образования, так и наоборот - увеличения скорости их распада. В нашем случае мы, скорее всего, имеем дело с индуцированным светом лазера ускорением распада сопряженных двойных связей. Имеющиеся в литературе данные это подтверждают (Мерзляк, Погосян, 1988).

На рисунках 5а, б представлена динамика накопления первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов в культуре ткани пшеницы в течение первых двух суток после облучения.

Рис. 5. Динамика накопления первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов в культуре ткани пшеницы сорта Скала в течение первых двух суток после облучения светом гелий-неонового лазера (доза - 4,5 Дж/см2 ). а - ТБК-реактивные продукты, б -диеновые коньюгаты.

Из результатов представленных на рис. 5 а видно, что общая тенденция, т.е. превышение содержания ТБК-реактивных продуктов в опытном варианте над контролем сохраняется на протяжении всего периода измерений. К исходу вторых суток намечается выравнивание этого показателя. Концентрация диеновых коньюгатов в контрольных образцах постоянно ниже, чем в облученных (рис. 56). К концу вторых суток этот показатель также выравнивается. Следует отметить, что низкоинтенсивное лазерное излучение не меняло волнообразного характера динамики накопления продуктов ПОЛ в ткани пшеницы, характерного для реакций на стрессовое воздействие (Барабой, 1991). В результате проведенных экспериментов было установлено, что первичный ответ растительной ткани на облучение выражался в повышении содержания вторичных продуктов перекисного окисления.

Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на гидролитическую активность протонных насосов вакуолярной мембраны

При анализе полученных нами и литературных данных логично было предположить, основной критической мишенью для действия лазерного излучения на биологические объекты являются мембраны клеток и клеточных органелл (Клебанов, 2001). Поглощение квантов света может инициировать как процессы ПОЛ, так и изменения в конформации мембранных белков и в структуре липидов. Вследствие тесного взаимодействия липидных и белковых компонентов в мембранах, изменения в свойствах липидов неизбежно должны влиять на функции мембранных белков. Фосфогидролазы вакуолярной мембраны пример такого рода белков. На тканях животных и человека (Девятков и др., 1987) показано, что излучение гелий-неонового лазера способно через изменение конформации локальных участков мембраны изменять активность мембраносвязанных ферментов, к которым относятся и фосфогидролазы тонопласта. Учитывая важную роль этих ферментов, как в транспортных процессах, так и в процессах адаптации к неблагоприятным условиям мы поставили задачу изучить возможное влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на активность фосфогидролаз тонопласта: Н+-АТФазу и Н+-пирофосфатазу. Наличие такого влияния могло бы послужить подтверждением того факта, что биологический отклик на действие лазерного излучения происходит на мембранном уровне. Перед инкубацией изолированные вакуоли облучали гелий-неоновым лазером. Активность ферментов выражали в процентах к необлученному контролю. Результаты изучения влияния света лазера на активность протонных помп тонопласта представлены в таблице 1. При анализе полученных данных мы обнаружили следующее. Несмотря на то, что функции этих ферментов сходны, а локализация одинакова, их реакция на облучение различна. В экспериментах было установлено, что активность Н+- пирофосфатазы в результате облучения светом лазера повышалась, в то время как активность Н+- АТФазы во всех вариантах опыта снижалась по сравнению с необлученным контролем.

Таблица 1

Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на гидролитическую активность фосфогидролаз тонопласта

Время облучения, мин Расстояние, м Активность, % к контролю

Н+- АТФаза H+- пирофосфатаз а

0,5 0,3 74±2 120±6

0,5 3 64±21 131±14

3 0,3 78±15 126±2

3 3 56±8 133±11

Активность ферментов выражали в процентах к необлученному контролю. Представлены среднеарифметические значения и их стандартные отклонения (N=6). +

Снижение активности ^-АТФазы с одновременным увеличением активности Н+ пирофосфатазы хорошо согласуется с имеющимися в литературе сведениями о подобной реакции этого фермента в процессе адаптации к неблагоприятным внешним условиям (Опритов, 1993, Davis, 1997, Darley et al., 1995). Другими словами, это снижение активности может быть одним из проявлений неспецифической реакции клеток на стресс, связанный с облучением светом лазера, наряду с установленным нами увеличением накопления продуктов перекисного окисления липидов в облученных тканях. Этот факт косвенно свидетельствует в пользу предположения о том, что ответ растительных тканей на действие низкоинтенсивного лазерного излучения связан с их адаптивной реакцией на вызываемый этим излучением стресс.

Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на структуру липидов В результате анализа данных по стимуляции низкоинтенсивным лазерным излучением морфогенетических процессов в культуре ткани мы предположили, что наблюдаемые изменения должны сопровождаться молекулярными сдвигами и структурными перестройками в облученных тканях.

Структурные перестройки в мембранах в значительной мере касаются липидов. Задачей этой части работы являлось изучение качественных изменений в структуре липидов, вызванных действием низкоинтенсивного лазерного излучения методом инфракрасной спектроскопии. Липиды были экстрагированы из каллусов пшеницы сорта Скала, сибирской селекции (ТгШеыт aestivum Ь.). Контролем служили экстракты из необлученных каллусов. Полученные спектры представлены на рис. 6.

8РЕ00Н0

Рис. 6. Влияние низко интенсивного лазерного излучения на структуру липидов в каллусной культуре пшеницы сорта Скала (по данным ИК-спектроскопии, слева на рисунке - область спектра 400-2000 см'1, справа - 2000-3500 см'1, А-контроль, Б- опыт, 72 часа после облучения).

В опыте в значительной мере уменьшилась, по сравнению с контролем, полоса 3300 см'1, наличие которой свидетельствует о присутствии КН-групп. В спектрах липидов облученных каллусов установлено значительное ослабление полос в области 1730-1690 см"1 , а также 700-900 см'1, свидетельствующих о наличии гетероароматических структур. Зато заметно увеличилась интенсивность полос, которые имеют максимумы при 1220 см'1 и 1050 см'1. Наличие этих полос говорит о присутствии фосфатных и эфирных

группировок. Особенно интересным представляется появление в спектрах облученных образцов полосы 721см-1 маятниковых СН2-колебаний, свидетельствующей о наличии длинноцепочечных алифатических структур в транспланарной конфигурации. Поглощение в области 721см"1 характеризует также преимущественно гексагональную упаковку групп СН2 в алифатических цепях липидов.

Таким образом, биологический ответ каллусной культуры ткани на действие низкоинтенсивного лазерного излучения носит протяженный во времени характер. Отдаленный по времени ответ культуры ткани на действие света лазера, выражается в структурных перестройках клеточных мембран, свидетельствующих об интенсификации процессов мембранообразования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты для удобства обсуждения можно разделить на две части: методическую, в которой были определены параметры облучения и экспериментальную, в которой было изучено влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития в растительной ткани. В методической части было показано, что влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на растительные ткани является дозозависимым, и впервые установлено, что дозы излучения, дающие максимальный эффект действия для растительных объектов превышают терапевтические дозы и дозы, применяемые для объектов животного происхождения. Мы связываем это с наличием у растений клеточной стенки, которая может в заметной степени поглощать и рассеивать излучение. Была изучена зависимость влияния света лазера на ткани растений от физических характеристик излучения: длины волны и главного отличия лазерных источников света от обычных — когерентности. Было показано, что влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на морфогенетические процессы зависит и от его длины волны и от когерентности. Известно, что растения имеют в своем составе большое количество соединений способных реагировать на дозу, длину волны излучения (например, фитохромы, криптохромы). Поэтому можно думать, что в реализации биологического действия света лазера на растения эти характеристики излучения имеют значение. Полученные нами данные говорят в пользу этого предположения.

облученных тканях, т.к. липиды являются основными структурообразующими компонентами мембраны. Было установлено, что низкоинтенсивное лазерное излучение является индуктором перекисного окисления липидов в каллусной культуре тканей пшеницы, о чем свидетельствовало повышение в облученных каллусах содержания вторичных продуктов окисления (ТБК-реактивных продуктов). Вследствие тесного взаимодействия липидных и белковых компонентов в мембранах, изменения в свойствах липидов неизбежно должны влиять на функции мембранных белков. При изучении влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на активность фосфогидролаз тонопласта (Н+-АТФазу и Н+-пирофосфатазу) было показано, что в результате действия света лазера активность Н+-АТФазы снижается, в то время как активность Н+-пирофосфатазы увеличивается. Подобная реакция этих ферментов наблюдается и в случае действия на клетку различных стрессовых факторов, например, низкой температуры и гипоксии. Известно, что помимо общих, каждая из этих протонных помп имеет свои способы регуляции, которые могут включаться при изменении гомеостаза, в том числе и в стрессовых ситуациях (White et al., 1990; Nakamura et al., 1990; Davies, 1997). Тогда снижение активности одной протонной помпы компенсируется активацией другой. Другими словами противоположное влияние лазерного излучения на активность протонных помп может служить еще одним подтверждением стрессового характера действия этого фактора. Методом инфракрасной спектроскопии показано, что отдаленный по времени ответ культуры ткани на действие света лазера, выражается в структурных перестройках клеточных мембран, свидетельствующих об интенсификации процессов мембранообразования.

ВЫВОДЫ

1. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития (например, на морфогенетические процессы) в растительных тканях является дозозависимым. Доза, дающая максимальный эффект биологического действия для интактных клеток составила 4,5 Дж/см2. Для клеточных органелл, не имеющих жесткой клеточной стенки эта величина несколько ниже (0,8-2,7 Дж/см2).

2. Низкоинтенсивное лазерное излучение (Х=632,8 нм) в указанной дозе увеличивает способность к каллусообразованию у диких злаков. Наибольший эффект облучения был получен для Agropyron cristatum L., вида с изначально низкой способностью к каллусообразованию (выход каллусов увеличился на 80% по сравнению с необлученным контролем).

3. Низкоинтенсивное лазерное излучение =632,8 нм) оказывает заметное стимулирующее действие на морфогенетические процессы (образование зон вторичной дифференцировки, ризогенез, регенерацию) в культуре ткани пшеницы.

4. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на интенсификацию морфогенетических процессов зависит от длины волны и от когерентности. Синее когерентное (А.=441нм) излучение не оказывало стимулирующего действия на морфогенетические процессы в культуре ткани пшеницы.

Красное некогерентное (А=633 нм) стимулировало их в существенно меньшей степени, чем когерентное.

5. Излучение гелий-неонового лазера в указанных дозах является индуктором процессов перекисного окисления липидов в каллусах пшеницы.

6. В результате действия света гелий-неонового лазера происходят структурные изменения в мембранных липидах. В частности в ИК-спектре поглощения липидов, экстрагированных из облученных каллусов была зарегистрирована полоса 721 см'1, которая свидетельствовала об интенсификации процессов мембранообразования в облученных тканях.

7. Низкоинтенсивное лазерное излучение (Х=632,8 нм) оказывает влияние на гидролитическую активность протонных помп - Н+-АТФазу и Н+-пирофосфатазу. При этом в результате действия света лазера активность Н+-АТФазы снижается, а активность Н+-пирофосфатазы увеличивается.

8. Реакция культуры ткани, связанная с облучением светом лазера, имеет два ответа, разобщенных во времени. Это первичное стрессовое воздействие, выражающееся в повышении количества продуктов перекисного окисления, изменении в активности мембраносвязанных ферментов. И более длительные вторичные реакции, связанные с адаптивными изменениями метаболизма, проявляющимися в структурных перестройках в мембранах, в интенсификации процессов мембранообразования, стимуляцией морфогенетических, в том числе регенеративных, процессов.

Основные публикации по теме диссертации

1. Озолина Н.В., Прадедова Е.В., Дударева Л.В., Саляев Р.К. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на гидролитическую активность протонных насосов вакуолярной мембраны //Биологические мембраны. -1997..-Т. 14. -С. 125-127.

2. Ozolina N.V., Pradedova E.V., Dudareva L.V., Salyaev R.K. The Effect of low-intensity Laser Irradiation on the Hydrolitic Activity of Vacuolar Membrane Proton Pumps //Membr. Cell Biol. - 1997. - V. 11(1). - P. 157-159.

3. Саляев Р.К., Дударева Л.В., Ланкевич СВ., Сумцова В.М. Влияние низкоинтенсивного когерентного излучения на морфогенетические процессы в каллусной культуре пшеницы //Доклады АН. - 2001. - Т. 376. (6). - С. 830832.

4. Саляев Р.К., Дударева Л.В., Ланкевич СВ., Сумцова В.М. Влияние низкоинтенсивного когерентного излучения на каллусогенез у дикорастущих злаков // Доклады АН. - 2001. - Т. 379. (6). - С. 819-820.

5. Саляев Р.К., Дударева Л.В., Ланкевич СВ., Сумцова В.М., Выговский Ю.Н., Малов А.Н., Неупокоева А.В., Тимина О.О., Фещенко B.C. Влияние пространственной структуры электромагнитного поля на эффективность лазерной биостимуляции // Медицинская физика. -2001. №11. - С. 34-36.

6. Salyaev R.K., Dudareva L.V., Lankevich S.V., and Sumtsova V.M. Low-power laser irradiation as a possible morphogenesis inductor in wheat cultivar callus.// Annual Wheat Newsletter. - 2002. - V.48. - P. 140-141.

7 Salyaev R К, Dudareva L V, Vigovsky Yu N, Malov A N, Malov S N, Bogdan, I V, Neupokoeva A V, Timina О О, Feshchenko V S Effect of Electromagnetic Field Spatial Structure on the Efficiency of Laser Biostimulation //Laserphysics.-2003 -V 13 (6) -P 839-847

8 Саляев Р К, Дударева Л В , Ланкевич С В , Сумцова В М Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы перекисного окисления липидов в культуре ткани пшеницы // Физиология растений - 2003 - Т 50 (4) -С 498-500

9 Дударева Л В, Макаренко С П Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на скорость окисления тканей растений / Сб Применение лазеров в науке и технике - Тезисы докладов третьей всесоюзной конференции -Иркутск, 1990 -С 113-114

10 Саляев Р К , Дударева Л В , Екчмова Е Г , Ланкевич С В , Сумцова В М -Влияние низкоитпенсивного когерентного излучения на динамику перекисного окисления липидов в каллусной культуре пшеницы -Международный симпозиум «Растение и стресс» FEBSP - Москва 23-28 октября2001 -С 251

11 Саляев Р К , Дударева Л В , Макаренко С П, Ланкевич С В , Сумцова ВМ -Влияние низкоинтенсизного когерентного излучения на структуру и химический состав липидов в каллусной культуре пшеницы -Международный симпозиум « Растение и стресс» FEBSP -Москва 2328 октября 2001 -С 252

12 Саляев Р К , Дударева Л В , Ланкевич С В , Екимова Е Г , Сумцова В М, Выговский Ю Н, Малов А Н, Малов С Н, Неупокоева А В , Тимина О О, Фещенко В С Влияние пространственной структуры электромагнитного поля на эффективность лазерной биостимуляции //Сборник трудов Восьмой международной научно-практической конференции по квантовой медицине Словения, - Блэд, - М Изд Ассоциации квантовой медицины и ЗАО «Милта-ПКПГИТ» -2002 -Ч 1 -С 85-97

1 78 2»

РНБ Русский фонд

2005-4 15234

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дударева, Любовь Виссарионовна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. УСТРОЙСТВО ЛАЗЕРА. ФИЗИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

1.2. ПЕРВЫЕ ПОПЫТКИ ИЗУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ СВЕТА ЛАЗЕРА

1.2.1. Изменения в биологических системах, происходящие под действием лазерного излучения

1.2.2. Биотехнологические и аналитические применения лазеров

1.2.3. Оценка степени опасности лазерного излучения для организма человека и животных

1.3. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

1.3.1. Роль физических характеристик лазерного излучения в его биологической активности

1.3.2. Проникновение лазерного излучения в живые ткани

1.3.2.1. Проникновение в ткани человека и животных.

1.3.2.2. Распространение света лазера в тканях растений

1.4. ОСНОВНЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ МЕХАНИЗМОВ БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ (НИЛ)

1.4.1. Поглощение света лазера биологическими структурами. Поиск специфического акцептора лазерного излучения.

1.4.2. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на протекающие в мембранах процессы

1.4.3. Фотодинамические эффекты

1.4.4. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на транскрипцию

1.5. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМАХ НИЗКОИНТЕНСИВНОЙ ЛАЗЕРНОЙ ТЕРАПИИ

1.5.1. Первичные клеточные механизмы биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения

1.5.1.1. Дыхательная цепь митохондрий — возможный акцептор низкоинтенсивного лазерного излучения

1.5.1.2. Лазериндуцированный локальный нагрев поглощающих хромофоров

1.5.1.3. Участие кислорода и продуктов перекисного окисления в формировании реакции на облучение светом лазера

1.5.2. Вторичные (темновые) клеточные механизмы биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения

1.5.2.1. Цепь усиления и передачи фотосигнала

1.5.2.2. Вторичные процессы в митохондриях

1.5.3. Термодинамический подход к выяснению вторичных ответов на действие лазерного излучения

1.5.4. Мембранный механизм терапевтического действия лазерного излучения

1.6. ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА РАСТЕНИЯ

1.6.1. Свет лазера, как индуктор мутагенеза

1.6.2. Лазерная стимуляция семенного материала

1.6.3. Физиологические проявления действия света лазера на растения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития в растительной ткани"

Действие лазерного излучения на живые организмы, в том числе на растения, вызывает неослабевающий интерес исследователей практически с момента изобретения лазера, т.е. примерно с середины 60-ых годов двадцатого века. Однако и до настоящего времени нет единой теории объясняющей все эффекты, возникающие при действии света лазера на биологические объекты. Это связано с относительной сложностью биологических систем и трудностями анализа закономерностей преобразования энергии в живых тканях.

Особый интерес представляет действие на биологические объекты лазерного излучения низких интенсивностей. Это действие, как правило, не носит повреждающего характера. Напротив, считается установленным фактом его стимулирующее влияние на многие физиологические процессы как в организмах человека и животных, так и у растений. При этом механизмы терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного излучения исследуются достаточно интенсивно. Показано, что в тканях животных и человека первичными акцепторами света лазера могут быть компоненты дыхательной цепи митохондрий, в частности, молекула цитохромоксидазы, ферменты-антиоксиданты, молекулярный кислород, порфирины (Кару, 2001). Получены данные о том, что существуют как минимум три первичных фотохимических реакции, лежащих в основе терапевтического действия лазерного излучения. Это фотодинамическое перекисное окисление липидов, фотореактивация Cu-Zn-супероксиддисмутазы и фотолиз N0-геминовых комплексов (Владимиров, 1999). Определены ключевые структуры в клетках и клеточных органеллах, в которых могут формироваться ответы на действие лазерного излучения.

В то же время работы по изучению влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на растительные объекты носят фрагментарный характер. Как правило, они посвящены практическому применению света лазера для стимуляции процессов роста и развития, увеличения всхожести и энергии прорастания семян и, в конечном итоге, для увеличения урожайности культурных растений. Так, например, в восьмидесятые годы в сельском хозяйстве широко применялось облучение семян светом гелий-неонового лазера. Были даже созданы промышленные установки для облучения семян методом просыпки на базе все тех же гелий-неоновых лазеров. С известными ограничениями в результате их применение увеличивало всхожесть семян и урожайность некоторых культур. Изучению же возможных путей реализации стимулирующего действия низкоинтенсивного лазерного излучения на растительные объекты посвящены лишь единичные работы. Между тем, именно растения эволюционно более приспособлены к восприятию световой энергии и к ее утилизации в физиологических целях. Как известно, действие света на растения не ограничивается фотосинтезом, существует множество фотобиологических процессов, среди которых следует, в первую очередь, выделить процессы фоторегуляции. Физиологический статус растения во многом зависит от интенсивности света, его спектрального состава, дозы излучения и периодичности освещения. Помимо хлоропластов, в которых под действием солнечного света протекают фотосинтетические реакции, растительные ткани богаты пигментами-сенсибилизаторами, выполняющими в клетках растений разнообразные функции, в первую очередь сигнальные. Поэтому изучение биологического действия низкоинтенсивного лазерного излучения на растения может представлять интерес не только для выявления механизмов его реализации, но и для исследования фундаментальных закономерностей действия света на растительные организмы. По имеющимся сведениям результатом облучения растительной ткани светом лазера может быть как стимуляция различных процессов, так и отсутствие ответа на воздействие, а в некоторых случаях, и ингибирование изучаемого процесса. Условия, при которых осуществляется тот или иной путь реализации действия низкоинтенсивного лазерного излучения на растительные объекты, а также ответные физиологические и биохимические реакции растений и растительных тканей на облучение слабо изучены. В связи с этим целью представляемой работы было изучение влияния низкоинтенсивного лазерного излучения (Х= 632,8 нм) на процессы роста и развития в культуре растительных тканей.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

При анализе литературы обращает на себя внимание тот факт, что большинство исследований возможных механизмов влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на живые организмы посвящено объектам животного происхождения, в первую очередь его медицинским применениям. Работы по изучению влияния света лазера на растения немногочисленны и носят в основном прикладной характер. Поэтому современные подходы к изучению механизмов реализации биологического действия лазерного излучения будут рассмотрены на тех материалах, где объектами исследований служили ткани животных и человека.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Дударева, Любовь Виссарионовна

5. ВЫВОДЫ

• 1. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития (например, на морфогенетические процессы) в растительных тканях является дозозависимым. Дозы, дающие максимальный эффект биологического действия для интактных л клеток составляли 4-5 Дж/см. Для клеточных органелл, не имеющих жесткой клеточной стенки эти дозы несколько ниже (0,8-2,7 Дж/см2).

2. Низкоинтенсивное лазерное излучение (1=632,8 нм) в указанной дозе увеличивает способность к каллусообразованию у диких злаков. Наибольший эффект облучения был получен для вида с изначально низкой способностью к каллусообразованию (выход каллусов увеличился на 80% по сравнению с необлученным контролем).

3. Низкоинтенсивное лазерное излучение (Х=632,8 нм) оказывает заметное стимулирующее действие на морфогенетические процессы (образование зон вторичной дифференцировки, ризогенез, регенерацию) в культуре ткани пшеницы.

4. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на интенсификацию морфогенетических процессов зависит от длины волны и от когерентности. Синее когерентное (А,=441нм) излучение не оказывало стимулирующего действия на морфогенетические процессы в культуре ткани пшеницы. Красное некогерентное (А=633 нм) стимулировало их в существенно меньшей степени, чем когерентное.

6. В результате действия света гелий-неонового лазера происходят структурные изменения в мембранных липидах. В частности в ИК-спектре поглощения липидов, экстрагированных из облученных каллусов была зарегистрирована полоса 721 см"1, которая свидетельствовала об интенсификации процессов мембранообразования в облученных тканях.

7. Низкоинтенсивное лазерное излучение (А,=632,8 нм) оказывает влияние на гидролитическую активность протонных помп -Н+АТФазу и ЬГ^-пирофосфатазу. При этом в результате действия света лазера активность Н^-АТФазы снижалась, а активность Н+-пирофосфатазы увеличивалась.

1. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты для удобства обсуждения можно разделить на две части: методическую, в которой были определены оптимальные параметры облучения и экспериментальную, в которой было изучено влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития в растительной ткани.

В методической части было показано, что влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на растительные ткани является дозозависимым, и впервые установлено, что оптимальные дозы излучения для растительных объектов превышают терапевтические дозы и дозы, применяемые для объектов животного происхождения. Мы связываем это с наличием у растений клеточной стенки, которая может в заметной степени поглощать и рассеивать излучение. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что при работе с изолированными вакуолями оптимум используемых доз снижается и практически не отличается от оптимума для животных объектов. Нами была изучена зависимость влияния света лазера на ткани растений от физических характеристик излучения: длины волны и главного отличия лазерных источников света от обычных -когерентности. При этом было показано, что влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на морфогенетические процессы зависит и от его длины волны и от когерентности. Эффект стимуляции был получен для когерентного красного света с длиной волны 632,8 нм. Известно, что растения имеют в своем составе большое количество соединений, способных реагировать на дозу, длину волны излучения (например, фитохромы). Поэтому можно думать, что в реализации биологического действия света лазера на растения эти характеристики излучения имеют значение. Полученные нами результаты говорят в пользу этого предположения.

В экспериментальной части работы нами установлено, что низкоинтенсивное лазерное излучение оказывает стимулирующее действие на процессы роста и развития в растительных тканях. При этом оказалось, что процессы, подверженные влиянию света лазера могут иметь не связанные между собой пути регуляции (например, каллусогенез и морфогенез). Это навело нас на мысль о том, что в данном случае может иметь место неспецифическая реакция ткани на излучение света лазера, который выступает как стрессовый фактор. Неспецифические реакции клетки на стрессовые воздействия в значительной степени определяются изменениями мембранного аппарата (Чиркова, 2002). Поэтому нами были изучены процессы перекисного окисления липидов в облученных тканях, поскольку липиды являются основными структурообразующими компонентами мембраны. Было установлено, что низкоинтенсивное лазерное излучение является индуктором перекисного окисления липидов в каллусной культуре тканей пшеницы, о чем свидетельствовало повышение в облученных каллусах содержания вторичных продуктов окисления (ТБК-реактивных продуктов). При дальнейшем культивировании облученной ткани содержание продуктов ПОЛ выравнивается с контролем. Вследствие тесного взаимодействия липидных и белковых компонентов в мембранах, изменения в свойствах липидов неизбежно должны влиять на функции мембранных белков. При изучении влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на активность фосфогидролаз тонопласта (Н^АТФазу и FT-пирофосфатазу) было показано, что в результате действия света лазера активность Н*-АТФазы снижается, в то время как активность Н^пирофосфатазы увеличивается. Подобная реакция этих ферментов наблюдается и в случае действия на клетку различных стрессовых факторов, например, низкой температуры и гипоксии. Известно, что помимо общих, каждая из этих протонных помп имеет свои способы регуляции, которые могут включаться при изменении гомеостаза, в том числе и в стрессовых ситуациях (White et al., 1990; Nakamura et al., 1990; Davies, 1997). Тогда снижение активности одной протонной помпы компенсируется активацией другой. Другими словами противоположное влияние лазерного излучения на активность протонных помп может служить еще одним подтверждением стрессового характера действия этого фактора. Методом инфракрасной спектроскопии показано, что отдаленный по времени ответ культуры ткани на действие света лазера, выражается в структурных перестройках клеточных мембран, свидетельствующих об интенсификации процессов мембранообразования.

На основании полученных результатов мы предполагаем, что реакция культуры ткани, связанная с облучением светом лазера, вероятно, имеет два ответа, разобщенных во времени. Первый — это первичное стрессовое воздействие, выражающееся в повышении количества продуктов перекисного окисления, изменении в активности мембраносвязанных ферментов. Второй -более длительные вторичные реакции, связанные с адаптивными изменениями метаболизма, проявляющимися в структурных перестройках в мембранах, в интенсификации процессов мембранообразования, стимуляцией морфогенетических, в том числе регенеративных, процессов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дударева, Любовь Виссарионовна, Иркутск

1. Аджимолаев Т.А., Зубкова С.Н., Лапрун И.В. Средства и методы в квантовой электронике в медицине. Саратов.: Изд. СГУ, 1976. -156 с.

2. Асхарьян Г. А. Просветление мутных физических и биологических сред при сжатии // Природа. 1983. № 5. - С. 7278.

3. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск.: ИЦиГ СО РАН, - 1993. - 240 с.

4. Барбараш О.Л., Марцияш А.А., Шейбак Т.В., Чукаева И.И., Корочкин И.М., Сырнев А.А. Стресс-модулирующие эффектылазеротерапии у больных ишемической болезнью сердца // Тер. Архив. 1996. №12. - С. 50-53.

5. Браун Г., Уолкен Дж. Жидкие кристаллы и биологические структуры. М.: Мир, 1982. - 198 с.

6. Букатый В.И., Карманчиков В.П. Воздействие лазерного излучения на семена сельскохозяйственных культур. В кн. Лазер и урожай: Монография. Барнаул: Изд-во АТУ, 1999. - 58 с.

7. Булякова Н.В., Зубкова С.М., Азарова B.C., Варакина Н.И., Михайлик Л.В. Регенерация облученной, механически поврежденной скелетной мышцы крыс после действия инфракрасного лазерного излучения // Доклады АН. — 1998. -Т. 359. № 1.-С. 123-127.

8. Векшин Н.Л. Светозависимое фосфорилирование в митохондриях // Молекулярная биология. 1991. - Т. 25. №1. - С. 54-59. Векшин Н.Л., Миронов Г.П. Флавин-зависимое потребление кислорода в митохондриях при освещении // Биофизика. - 1982. -Т. 27.-С. 537-538.

9. Величко О.И., Демкив О.Т. Влияние лазерного освещения семян и проростков на активность карбоангидразы в проростках кресс-салата // Физиология и биохимия культурных растений. — 2003. -Т. 35. №1.-С. 22-28.

10. Горбатенкова Е.А., Владимиров Ю.А., Парамонов Н.В., Азизова О. А. Красный свет гелий-неонового лазера реактивирует супероксиддисмутазу // Бюлл. эксп. биол. мед. — 1989. Т. 57. № 3. - С.302—305.

11. Девятков Н.Д., Зубкова С.М., Лапрун И.Б., Макеева Н.С. Физико-химические механизмы биологического действия лазерного излучения // Успехи современной биологии. 1987. - Т. 103. вып. 1. -С.31-43.

12. Дмитриева Н.А., Дудин Г.П. Влияние лазерного и гамма-излучений на частоту Waxu-мутаций ячменя / Применение низкоэнергетических физических факторов в биологии и сельском^ хозяйстве. Тезисы Всесоюзной научной конференции. 1989. -Киров, С. 67-68.

13. Дроздова И.С., Бондар В.В., Бухов Н.Г., Котов А.А., Котова Л.М., Маевская С.Н., Мокроносов А.Т. Влияние спектрального состава света на морфогенез и донорно-акцепторные отношения у растений редиса // Физиология Растений. -2001. Т. 48. №4. — С. 485-490.

14. Дубровский В.А., Гусев В.В., Астафьева О.Г. О роли физических характеристик лазерного излучения в поглощении света гемосодержащими биологическими молекулами // Биофизика. -1982. Т. 27. №5. - С. 908-910.

15. Жуманкулов М.С., Шабуневич Л.В., Басиладзе Л.И., Александрова Л.А. Фотореактивация церулоплазмина как один из механизмов действия гелий-неонового лазера на кровь // В кн.: Лазеры и медицина. М., 1989. - С. 73-74.

16. Звелто О. Принципы лазеров. М.: Мир, 1984. - 400 с. Зубкова С. М. О механизме биологического действия излучения гелий-неонового лазера // Науч. докл. высшей школы. Биол. Науки. - 1978. № 7. - С. 30-35.

17. Зубкова С. М., Крылов О. А. Действие гелий-неонового лазера на окислительно-восстановительные процессы в митохондриях // В кн. Труды ЦНИИ курортологии и физиотерапии. 1976. Т. 32. - С. 18-19.

18. Илларионов В.Е. Основы лазерной терапии. — М.: Респект, 1992. -122 с.

19. Инюшин В.М. Лазерный свет и живой организм. Алма-Ата, 1970.-46 с.

20. Каплан М.А. Лазерная терапия механизмы действия и возможности / Тезисы межд. Конф. "Laser Health'97" - М.: фирма «Техника», 1997. - С. 88-92.

21. Кару Т.И., Афанасьева Н.И. // Цитохром-с-оксидаза как первичный фотоакцептор при лазерном воздействии света видимого и ближнего ИК-диапазона на культуру клеток // Доклады АН. -1995.-Т. 342.-С. 693-697.

22. Кару Т.Й., Афанасьева Н.И., Кольяков С.Ф., Пятибрат Л.В. Изменение спектра поглощения монослоя живых клеток после низкоинтенсивного лазерного облучения // Доклады АН: — 1998. -Т. 360. С. 267-270.

23. Кару Т.Й., Календо Г.С., Летохов B.C. Лобко В.В. Зависимость биологического действия низкоинтенсивного видимого света на клетки HeLa от когерентности, дозы, длины волны и режимаоблучения. Ч. I // Квантовая электроника. — 1982. Т. 9. — С. 17611767.

24. Кару Т.Й., Календо Г.С., Летохов B.C. Лобко В.В. Зависимость биологического действия низкоинтенсивного видимого света на клетки HeLa от когерентности, дозы, длины волны и режима облучения. 4.II // Квантовая электроника. — 1983. Т. 10. — С. 1771-1776.

25. Козлов В.И., Буйлин В.Н. Лазеротерапия. — М.: Медицина, 1993. -149 с.

26. Лобко В.В., Кару Т.Й., Летохов B.C. Существенна ли когерентность низкоинтенсивного лазерного света при его воздействии на биологические объекты // Биофизика. 1985. — Т. 30. Вып. 2.-С. 366-371.

27. Людковская Р.Г., Бурмистров Ю.Я. Фотобиоэлектрические процессы в возбудимых клетках // Биофизика живой клетки. Вып. 2. Пущино. 1972. - 50 с.

28. Малов А.Н. Лазерная биостимуляция, как самоорганизующийся неравновесный процесс /Тезисы Четвертого Международного Конгресса «Проблемы лазерной медицины». — Москва-Видное. 1997.-С. 278-279.

29. Малов А.Н., Выговский Ю.Н. Физика лазерной биостимуляции. -М.: МИЛТА, 2002. - 77 с.

30. Мамонтова Л.И. Лазерная терапия крови / «Калужский лазер», 1996. N11(32).-С. 3-6.

31. Мандоли Д.Ф., Бриггс У.Р. Световоды у растений // В мире науки. -1984. №10.-С. 66-75.

32. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки // Итоги науки и техники. Сер. Физиология растений / Под ред. И.И. Иванова. М. -1989.-Т. 6.-165 с.

33. Рогаткин Д.А., Черный В.В. Низкоинтенсивная лазерная терапия. Взгляд физика на механизмы действия и опыт применения // Взаимодействие излучений и полей с веществом / под ред. Ю.Н. Денисюка. Иркутск, 1999. С. 366-378.

34. Рубин А.Б. Биофизика. М.: КД Университет, 1999. Т. 1. - С. 425456.

35. Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Хаптагаев С.Б., Копытчук В.Н. Выделение и очистка вакуолей и вакуолярных мембран из клетокрастений // Физиология растений. 1981. — Т. 28. Вып. 6. - С. 1295-1305.

36. Файн С., Клейн Э. Биологическое действие излучения лазера. М,: Атомиздат, 1968. - 103 с.

37. Федосеева Г.Е. Кару Т.Й., Ляпунова Т.С., Помощникова М.Н., Мейсель М.Н. Чувствительность различных дрожжевых культур к действию низкоинтенсивного красного света // Микробиология. -1987.-Т. 56.-С. 792-796.

38. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. -Изд-во Санкт-Петербургского Ун-та, 2002. — 244 с. Шмидт Р., Тевс Г. Физиология человека. 1996. — М.: Мир. Т. 1. -С. 502-556.

39. Berger F, Brownlee C. Physiology and development of protoplast obtained from embryos using laser microsurgery // Protoplasma -1995. V. 186. - P. 63-71.

40. Bjorn L.O. Reply to comment on measurement of light gradients and spectral regime in plant tissue with a fibre optic probe // Physiologia plantarum. -1986. V. 67 (3). - P. 494-497.

41. Brown G.C. Control of respiratory and ATP synthesis in mammalianmitochondria and cells // Biochem. J. 1992. - V. 284. - P. 171-172.

42. Brown G.C. Nitric oxide and mitochondrial respiration // Biochem. etbiophys. acta. 1999. - V. 1411. - P. 351-369.

43. Chain С. -K., Hofrichter J., Eaton W.A. Optical triggers of proteinfolding // Science. 1996. - V. 274. - P. 628-629.

44. Chance B. Cellular oxygen requirements // Federat. Proc. Fed. Amer.

45. Soc. Exptl Biol. 1957. - V. 16. - P. 671-680.

46. Dalton T.P., Schertzer H.G., Puga A. Regulation of gene expression byreactive oxygen // Annual Rev. Pharmacol. Toxicol. 1999. - V. 36. 1. P. 67-101.

47. Darley C.P., Davies J.M., Sanders D. Chill-induced changes in the activity and abundance of the vacuolar proton-pumping pyrophosphatase from mung bean hypocotyls // Plant Physiol. 1995. -V. 109. N2.-P. 659-665.

48. Davies J. Vacuolar energization: pumps, shunts and stress // J. Exp. Botany 1997 - V. 48. N 308 - P. 633-641.

49. Davies J. Vacuolar energization: pumps, shunts and stress // J/ Exp. Botany 1997. - V.48. N 308. - P. 633-641.

50. De Boer AH, Van Duijn B, Giesberg P, Wegner L, Obermeyer G, Kohler K, Linz KW. Laser microsur-gery: a versatile tool in plant (electro) physiology // Protoplasma — 1994;-V. 178:-P. 1-10.

51. Doll S., Rodier E., Willenbrink J. Accumulation of sucrose in vacuoles isolated red-beet tissue // Planta. 1979. - V. 144. №5. - P. 404-411.

52. Dube A., Gubta P.K., Bharti S. Redox absorbance changes of the respiratory chain components off following He-Ne laser irradiation // Lasers Life Sci. 1997. - V. 7. - P. 173-180.

53. Ferrando R.E., Schuschereba S.T., Quong J., Bowman P.D. Carbon dioxide laser induction of heat shock protein 70 synthesis: comparison with high temperature treatment // Laser Med. Science. 1995. - V. 10.-P. 207-212.

54. Gamaley I.A., Klybin J. Roles of reactive oxygen species: signaling and regulation of cellular functions // Internat. Rev. Cytology. 1999. - V. 188.-P. 155-203.

55. Gordon S.A., Surrey K. Red and far-red light action on oxidative phosphorylation // Radiat. Res. 1960. - V. 12. - P. 325-339. Govindjee R. (Ed.) Photosynthesis. - V. 1. N.Y.: Acad. Press, 1982. -123 p.

56. Greulich КО, Weber G. The light microscope on its way from an analytical to a preparative tool // J. Microscopy. -1992.-V. 167.-P. 127-51.

57. Grishko V.P., Grishko V.I., Glick B.R. Molecular laser biotechnology

58. Biotechnology Advances. 1999. - V. 17. - P. 341-362.

59. Guo Y, Liang H, Berns MW. Laser-mediated gene transferin rice // Physiol Plant. 1995. - V. 93. - P. 19-24.

60. Haas A.F., Wong J.W., Iwahashi C.K., Halliwell В., Cross C.E., Davis

61. P.A. Redox regulation of wound healing NF-kappaB activation incultured human keratinocytes upon wounding and the effect of lowenergy HeNe irradiation // Free Radic. Biol. Med. -1998. V. 25(9). 1. P. 998-1005.

62. Ham W.T. Jr, Schmidt F.H., Williams R.C., Ruffin R.S., Shaffer M.C., Guerry D. Flash burns in the rabbit retina as a means of evaluating the retinal hazard from nuclear weapons // Am. J. Ophthalmol. Nov. -1958. V. 46 (5 Part 1). - P. 700-23.

63. Ham W.T. jr., Williams R.C., Geeraets W.J., Ruffin R.S., Mueller H.A.Optical Masers (lasers) // Acta Ophthalmol, (copenh). 1963. - V. 17: supp. 176.-P. 60-78.

64. Henriksen GH, Taylor AR, Brownlee C, Assmann SM. Laser microsurgery of higher plant cell walls permits patch-clamp access // Plant Physiol.- 1996.-V. 110.-P. 1063-1068.

65. Kaneko M., Signal P.K., Dhalla N.S. Alteration in heart sarcolemmal

66. Ca -ATPase and Ca -binding activities due to oxygen free radicals //

67. Basic Res. Cardiol. 1990. - V. 85. - P. 45-54.

68. Karu T. // The science of low power therapy. — London:Gordon and1. Breach, 1998.- 320 p.

69. Karu T. Primary and secondary mechanisms of action of visible-to-near IR radiation on cells // J. Photochem. Photobiol: B. Biology. 1999. -V. 49(1).-P. 1-17.

70. Karu Т., Andreichuk Т., Ryabykh T. Changes in oxidative metabolism of murine spleen following diode laser (660-950nm) irradiation: effect of cellular composition and radiation parameters // Lasers Surg. Medicine. -1993. V. 13(4). - P. 453-462.

71. Karu Т., Tiphlova O., Esenaliev R., Letokhov V.S. Two different mechanisms of low-intensity laser photobiological effects on

72. Escherichia coli И J. Photochem. Photobiol: B. Biology. 1994. - V. 24(3).-P. 155-161.

73. Karu T.I. // Photobiology of low-power laser therapy. London: Harwood, Acad. Publ., 1989. (a)

74. Karu T.I. Photobiological fundamentals of low-power laser therapy // IEEE J. Quantum Electron. 1987. QE-23(10).- P. 1703-1717. Karu T.I. Photobiology of low-power laser effects // Health Physics. -1989. - V. 56(5). - P. 691-704. (b)

75. Karu T.I., Kalendo G.S., Letokhov V.S., Lobko V.V. Biostimulation of HeLa cells by low-intensity visible light. II. Stimulation of DNA and RNA synthesis in a wide spectral range // II Nuowo Cimento D. -1984.-V.3.- P. 308-318. (a)

76. Karu T.I., Kalendo G.S., Letokhov V.S., Lobko V.V. Biostimulation of HeLa cells by low intensity visible light. III. Stimulation of nucleic acid synthesis in plateau phase cells // II Nuowo Cimento D.,1984. V. 3. P. 319-325. (b)

77. Karu T.I., Letokhov V.S., Lobko V.V. Biostimulation of HeLa cells by low-intensity visible light. IV. Dichromatic irradiation // II Nuowo Cimento D. 1985. - V. 5(6). - P. 483-496.

78. Karu T.I., Tiphlova O.A., Letokhov V.S., Lobko V.V. Stimulation of E.coli growth by laser and incoherent red light // II Nuowo Cimento D. -1983.-V. 2(4).-P. 1138-1144.

79. Kato M., Shinizawa K., Yoshikawa S. Cytochrome oxidase is a possible photoreceptor in mitochondria // Photobiochem. Photobiophys. 1981. - V. 2. - P. 263-269.

80. Khan S., O' Brien P.J. Modulating hypoxia-induced hepatocyte injury by affecting intracellular redox state // Biochem. et biophys. acta. -1995.-V. 1269.-P. 153-161.

81. Klein E., Fine S., Ambrus J., Cohen E., Neter E., Ambrus C., Bardos Т., Lyman R. Interaction of laser radiation with biologic systems. 3. studies on biologic systems in vitro II Fed Proc. 1965. -V. 24. 14. -P. 104+.

82. Mailer K. Superoxide radical as electron donor for oxidative phosphorylation of ADP // Biochem. and Biophys. Res. Communs. -1990.-V. 170.-P. 59-64.

83. Manteifel V., Bakeeva L., Karu T. Ultrastructural changes in chondriome of human lymphocytes after irradiation with He-Ne laser: appearance of giant mitochondria // J. Photochem. Photobiol: B. Biology. 1997. - V. 38. - P. 25-30.

84. Morimoto Y., Arai Т., Kikuchi M., Nakayama S., Nakamura H. Effectof low-intensity argon laser irradiation on mitochondrial respiration //1.sers Surg. Med. 1994. - V. 15. - P. 191-199.

85. Murashige Т., Skoog F. A revisied medium for rapid growth andbioassay with tobacco tissue culture // Phys.Plant. 1962. №15. - P.473.497.

86. Ratajczak R. Structure, function and regulation of the plant vacuolar H+- translocating ATPase // Biochimica et Biophysica Acta. 2000. -V. 1465.-P. 17-36.

87. Rea P.A., Sanders D. Tonoplast energisation: two -pumps, one membrane // Physiol. Plantarum. -1987. V.71, №1. - P. 131-141. Saks N.M., Roth C.A. Ruby laser as a microsurgical instrument // Science. - 1963. - V. 141. - P. 46-47.

88. Saks N.M., Zuzolo R.C., Kopac M.J. Microsurgery of living cells by ruby laser irradiation // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1965. - V. 122. - P. 695-712.

89. Salet C., Moreno G., Vinzens F. A study of beating frequency of a single myocardial cell. III. Laser micro-irradiation of mitochondria in the presence of KCN or ATR // Exp. Cell Res. 1979. - V. 120. - P. 25-29.

90. Senger H. (Ed.) Blue light effects in biological systems. Berlin: Springer Verlag, 1984. 538 p.

91. Smirnoff N. The Role of Active Oxygen in the Response of Plants to Water Deficit and Desiccation // New Phytol. 1993. - V. 125. - P. 2758.

92. Timoshin A.A., Beker M.E. Influence of low-intensity radiation from a helium-neon laser on the formation of ethanol when culturing

93. Zymomonas mobilis bacteria II Doklady Biophysics. 1990. - V. 310/312. - P. 93-95.

94. Tiphlova О. Karu T. Action of low intensity laser radiation on CRC //

95. Critical Rev. Biomed. Eng. 1991. - V. 18. - P. 387-412.

96. Tuner J., Hode L. Low level laser therapy. Stockholm: Prima Books,1999.

97. Vacca R.A., Marra E., Quagliariello E., Greco M. Effect of helium-neon laser irradiation on replication, transcription and translation activities in rat liver mitochondria and in isolated systems // Ital. J. Biochem. 1994. - V. 43. - P. 200A-201 A.

Информация о работе

Дударева, Любовь Виссарионовна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2004
ВАК 03.00.12

Диссертация

Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процессы роста и развития в растительной ткани - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы