Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние интенсивности освещения на белок-синтезирующую системы VICIA FABA L.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Влияние интенсивности освещения на белок-синтезирующую системы VICIA FABA L."

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИИ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

РГЗ ОД

На правах рукописи

ЗАК Елена Александровна

ВЛИЯНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ОСВЕЩЕНИЯ НА БЕЛ0К-СШ1ТЕЗИРУ10ЩУ10 СИСТЕМУ VICIA FABA L.

03.00.12 — физиология растении

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Москва — 1993

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук II. Л. КЛЯЧКО

Официальные оппонент ы: доктор биологических наук II. А. ГУМИЛЕВСКАЯ, кандидат биологических наук М. В. ТУРКИНА

Ведущее учреждение — Московский государственный университет.

Защита состоится «../у?...-» февраля 1994 г. в.да^ласов на заседании специализированного совета но присуждению ученой степени кандидата биологических наук К.002.45.01 при Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 35.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН.

Автореферат разослан «.....» января 1994 г.

Ученый секретарь ¡специализированного совета — кандидат биологических наук Л. И. СЕРГЕЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Свет является одним из наиболее сильных факторов, регулирующих процессы жизнедеятельности растительного организма на протяжении всего его онтогенеза. Формирование растения и выполнение им одной из главных функций - фотосинтеза находятся в тесной зависимости от условий освещения. В связи с этим давно исследуются молекулярные, структурные и физиологические основы световой адаптации. Данные, имеющиеся в литературе, свидетельствуют о комплексном характере адаптивных изменений, позволяющих растениям наиболее эффективно использовать доступный поток квантов (Любименко, 1963; Цельннкер, 1978; Anderson, 1986; Bjorkman, 1972; Boardman, 1977; . Lichtenthaler, 1981; Sebaa et al., 1987). Условия освещения при выращивании растений ■влияют на морфологические и анатомические особенности листьев, структуру хлоропластов, их химический' состав, соотношение фотосистем, активность электрон-транспортной цепи и ферментных систем, а также фотостггетическую активность в целом (Anderson et al., 1988; Bjorkman et al., 1972; Bjorkman, 1981; Boardman et al., 1974; Chow et al., 1988; Lichtenthaler, Meier, 1984; Mells, Harvey, 1981; Wild, 1979). Анализ данных, касающихся адаптации растений к режиму освещения, показывает необходимость адаптации и белок-синтезирующей системы к интенсивности света.

Исследование молекулярных механизмов регуляции светом синтеза белка привлекает внимание широкого круга исследователей. В основном такие исследования проводятся на системе первичного позеленения этиолированных тканей. В этой модельной системе- показано, что действие света на белковый синтез проявляется, на всех уровнях его регуляции (Berry et al., 1988; Deng, Gruissem, 1987; Fluhr et al., 1986; Gruissem et al., 1989; Hermann et al., 1985; Klein, Mullet, 1987; Kirk, Kirk, 1985; Klein et al., 1988; Knjpinska, Apel, 1989; Mullet, Wein, 1987; Schrubar et al., 1990; Tobine, 1978). Однако влияние интенсивности освещения на белок-синтезирующую систему растений практически не изучено.

К началу • нашей работы в литературе появилось лишь несколько публикаций относительно влияния интенсивности света на поведение индивидуальных матриц (Jordan et al., 1989; LaRoche et al., 1991; Prioul, Reyss, 1987). Поэтому представляется

интересным изучить реакцию белок-синтезирующего аппарата на различные условия освещения.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучения действия различных интенсивностей света на состояние белок-синтезирующего аппарата листьев бобов Vicia faba L., сорта Русские черные

В задачи работы входило:

1) Изучить влияние даггенсивиости света ha активность различных РНК-полимераз листьев бобов;

2) Исследовать седиментационные свойства и трансляционную активность различных субпопуляций рибосом листьев Vicia faba L\ . •

3) Получить препараты интактных хлоропластов и неда градированных хлоропластных рибосом и изучить их седиментационные свойства;

4) Исследовать фосфорилирование белков препаратов полисом;

5) Провести сравнительный анализ белков препаратов полисом в зависимости от интенсивности освещения и внутриклеточной локализации полисом.

Научная новизна. Впервые исследовалось влияние освещенности на функциональное состояние белок-синтезирующей системы закончивших рост зеленых листьев как во время выращивания растений, так и при кратковременной смене режима освещения. Показано, что при увеличении интенсивности света снижается удельная трансляционная активность цитоплазматических полисом, при этом активируется РНК-полимераза I, увеличивается относительная доля активно работающих рибосом как в хлоропластах, так и в цитоплазме, увеличивается тотальное фосфорилирования рибосом и в разной степени фосфорилируются индивидуальные бель и рибосом, а также изменяется белковый состав препаратов рибосом.

Впервые показано присутствие полимерного актина в препаратах полисом, «шдетельствующее, по-видимому, о связи растительных рибосом с актиновым тп о« слетом.

Теоретическая и практическая ценность работы. Работа имеет теоретическое и методическое значение для последующих исследований по выяснению действия интенсивности света на метаболизм закончивших рост зеленых листьев растении. Обнаруженный факт присутствия актина в препаратах рибосом предполагает возможность получения новых сведений о пространственной организации синтеза белка и его регуляции в растениях. Работа представляет интерес для специалистов в области физиологии растений, молекулярной биологии и биохимии.

Апробапия работы. Материалы диссертационной работы докладывались на III Всероссийском съезде физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы. •

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов. Работа изложена на КЗУ страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц, 34 рисунка и список цитируемой литературы, включающий . наименований.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом наших исследований были листья бобов Vicia faba L (2-я и 3-я пары), сорт Русские черные. Изменения в их морфологии, биохимическом составе и обмене,'вызванные различиями в освещенности, изучены в работах О.П. Осиповой и М.К. Николаевой (Власова, Осипова, 1973; Николаева, Осипова, 1979; Николаева, Осипова, 1982; Николаева, Власова, 1990; Осипова с соавт., 1977), проведенных в лаборатории фотосинтеза ИФР РАН. Растения выращивали в факторостатных условиях при освещении люминесцентными лампами белого света ЛБ-80. Продолжительность фотопериода 16 ч, температура днем 22°С, ночью 18°С. Интенсивность освещения на уровне растений составляла 10, 50, 80 и 125 Вт/м2 ФАР.

Хроматин выделяли по методу Huang и Bonner (1962). Ядра выделяли как описано в работе Романко с соавт. (1989). Активность РНК-полимераз и

фосфорилирование белков определяли как описано в работах Ромаико с corp. (1978, 1989).

Полисомы выделали модифицированным методом Davies et al. (1972), использу¡ид;,/гомогенизации листьев буфер с высокой ионной силой и высоким pH (8,9). Мембрано-связанные и свободные -полисомы выделали модифицированным методом Davies (1976). Препараты тотальных, свободных и мембран о-связаиных полисом фракционировали в линейном (15 - 55%, вес/объем) градиенте концентрации ' сахарозы. Соотношение полисом и моносом измеряли по площадям соответствующих пиков на кривой поглощения в ультрафиолете.

Интактные хлоропласта выделяли на градиенте Перхолла. Чистоту фракция шггактных хлоропластоа оценивали под электронным микроскопом. Хлоропластные полисомы выделяли модифицированным методом Klein et al. (1986). i Для оценки функциональной активности полисом in vitro использовали бесклеточную систему трансляции из зародышей пшеницы как описано в работе Зак с

соавт (1993). О синтезе белка in vivo судили по включению 14с.лейцина в высечки

i

из листьев.

Электрофорез белков проводили по методу Laemmli (1970).

Для идентификации РБФК в препаратах рибосом проводили иммуноферментный анализ путем двойного иммуномечения кроличьими антителами против РБФК Chlorella с последующей обработкой антикроличьими ослиными антителами мечеными перокендазой

Идентификацию актина проводили двумя способами: 1) с помощью двойного непрямого иммуномечения антиактиновыми кроличьими антителами против гладокомышечного куриного актина с последующей визуализацией антикроличьими ослиными антителами мечеными коллоидным золотом (10 нм, ОД520 - 0.5) так, как это описано (Bogaiyrev et al., 1992); 2) прямым мечением конъюгатом фаллоиднна с коллоидным золотом (10 нм, ОД520 - 0.'). как это описано (Рихтер с соавт., 1990),

1. Влияние интенсивности освещения на РНК-полимеразную активность листьев бобов-

Исследование реакции белоксинтезирующего аппарата бобов на различия в интенсивности освещепия при выращивании растений мы начали с измерения активностей РНК-полимераз, участвующих в синтезе разных классов РНК, in vitro: РНК-полимеразы I, связанной с хроматином, РНК-полимеразы I в изолированных ядрах, РНК-полимеразы II в изолированных ядрах и солюбилизированной РНК-полимеразы хлоропластов.

Активность РНК-полимеразы I линейно возрастала при увеличении интенсивности освещения при выращивании растений от 10 до 125 Вт/м^ (Рис.1). Перенос растений с низкой освещенности на высокую приводил к увеличению активности РНК-полимеразы I, а обратный перенос к её уменьшению. Актйвности РНК-полимеразы II в изолированных ядрах и солюбилизированной РНК-полимеразы хлоропластов практически не изменялись при изменении режима освещения,

Таким образом, наиболее чувствительна к интенсивности освещения активность РНК-полимеразы I, что, по-впдимому, обусловливает общее увеличение количества рибосом в клетках растений, выращенных на высокой интенсивности освещения.

Рис.1. Зависимость активности РНК-полимеразы. I, связанной с хроматином, от интенсивности света при выращива'нии растений.

е

2. Влияние интенсивности освещения на соотношение полисом и моносом в

листьях бобов.

Общее количество рибосом в клетке, безусловно, важный параметр, характеризующий состояние аппарата белкового синтеза, но он не дает представления о том, какова доля рибосом, активно участвующих в синтезе белка. Ответ на этот вопрос можно получить, анализируя соотношение неактивных в синтезе белка моносом и транслирующих полисом. Методическим подходом для такого анализа является ' фракционирование рибосом в градиенте концентраций сахарозы. Мы проанализировали популяции тотальных, свободных, мембрано-связанных и хлоропластных полисом.

' На рис. 2 представлены профили распределения в градиенте концентрации седо розы рибосом, выделенных из 3-й и 2-й пар листьев бобов, взятых на 13-й день после прорастания и выращенных при освещенности 10, 50, 80 и 125 Вт/м^. Доля

# полисом в этих препаратах была невысока и составляла 35 - 50%. Это связано с тем, что для данных опытов были выбраны листья, уже закончившие рост. Доля полисом в

• молодых, растущих листьях бобов была значительно выше. Интенсивность освещения в период выращивания растений влияла на соотношение активных и неактивных в синтезе белка рибосом, хотя различия между вариантами опыта ве были значительными. Наименьшее отношение полисом к моносомам было при 10 Вт/м^, оно возрастало с увеличением интенсивности освещения до 50 Вт/м^ и сохранялось примерно на таком же уровне вплоть до 125 Вт/м^. Краткосрочное изменение режима освещения с низхой интенсивности (10 Вт/м^) на высокую (125 Вт/м^) вызывало относительно быстрое формирование полисом. Через 6 ч и особенно 24 ч после переноса растений доля полисом значительно возрастала. При обратном переносе происходил распад полисом, проявляющийся также уже через б ч после перестановки.

Увеличение интенсивности освещения при выращивании растений приводило также к увеличению доли полисом во фракции свободных и во фракции мембрано-связанных рибосом.

выделенных из 3-й (А) и 2-й (Б) пар листьев растений, выращенных при различных шгтенсивностях освещения. 1 - 10 Вт/м2; 2 - 50 Вт/м2; 3 - 80 Вт/м2; 4 - 125 Вт/м2. М - моносомы. Цифры на рисунке обозначают процент полисом.

Для выделения рибосомных препаратов из хлоропластов потребовалась предварительная работа по разработке оптимальных условий для получения интактных хлоропластов из закончивших рост зеленых листьев на градиенте Перколла и подборе метода выделения рибосом нз них. В результате нам удалось получить сравнительно малодеградированные препараты рибосом и показать, что доля полисом в них увеличивается с увеличением интенсивности освещения (Рис. 3).

Итак, анализ цитоплазматических и хлоропласпшх полисом показал, что во всех исследуемых фракциях происходило изменение в соотношение полисом и моносом под действием различной освещенности при выращивании растений: увеличение освещения приводило к сборке полисом.

Б

» *

____ Цамердфмцич

Рис.3 Профили распределения в градиенте концентрации сахарозы препаратов

хлоропластных тотальных (А) и свободных (Б) полисом, выделенных из 3-й пары листьев растений, выращенных при и 125 Вт/м2 (1, 3) и 10 Вт/м2 (2, 4). Линия разрыва обозначает 2,5-кратное уменьшение шкалы абсорбции в области полисом.

3. Влияние интенсивности освещения на активность трансляции полисом в бесклеточной системе.

Чтобы получить представление о влиянии интенсивности освещения на функциональную активность рибосом, мы транслировали их в бесклеточной системе, полученной из зародышей пшеницы, и сравнивали активность трансляции препаратов рибосом, выделенных из 3-й и 2-й пар листьев растений, выращенных при освещенности 10, 50, 80, и 125 Вт/м2. Удельная активность полисом была одинаковой на кнтенсивностях освещения 50, 80 и 125 Вт/м2, но выше при освещенности 10 Вт/м2 (Рис. 4). При переносе растений с 10 на 125 Вт/м2 на б ч и 24 ч удельная активность полисом уменьшалась, при обратном переносе увеличивалась.

Теоретически удельная активность полисом должна быть постоянной, поскольку . йссклеточная система трансляции оптимизирована, то есть содержит избыток компонентов, необходимых для максимальной скорости белкового синтеза. Однако, в литературе можно найти примеры различной трансляционной аьтивност препаратов полисом (С«гои!г, Оескеп, 1989; Мтеш£ег, 5с!юр?сг, 1983; Кличхс, Бочарова, 1991; Лундева с ссавт., 1993). Такие различия могут проявиться, если изменены сами

la-

~f

íü tó »в itr gff ia iú to go jao ш Jrff ¿so l/nreHCuÍHOC/пь CSOMI BrW*

Рнс.4. Удельная трансляционная активность в бесклеточной системе трансляции из

зародышей пшеницы 'препаратов полисом, выделенных из 3-й пары листьев растений, выращенных при различных интенсивностях освещения.

рибосомы, и эти изменения не исчезают в процессе приготовления их препаратов, или модифицированы белки, тесно ассоциированные с рибосомами и выделяющиеся вместе с ними. Данные по трансляционной активности препаратов полисом в опытах с краткосрочной сменой режима освещения показывают,, что такие изменения возникают относительно быстро, поэтому можно предположить, что они связаны с какими-то модификациями рибосом или ассоциированных с ними белков.

Бесклеточная система трансляции нз зародышей пшеницы является "run off" системой, то есть системой достройки полияептидов, инициация синтеза которых произошла in vivo, поэтому различия в скорости инициации синтеза белка не должны влиять на активность рибосом in vitro. Наиболее вероятным кажется, что различия в трансляционной активности рибосом затрагивают стадию элонгации. В предыдущем разделе мы показали, что доля полисом в листьях из слабо освещенных растений была ниже, чем в листьях, выращенных на высоких интенсивностях освещения. Сам по себе этот факт трудно однозначно интерпретировать, поскольку снижение доли полисом может с равной вероятностью быть результатом как подавления инициации, так и ускорение элонгации. Ускорение элонгации рибосомами, выделенными из слабо

освещенных растений, при их бесклеточной трансляции является доводом в пользу второго механизма, при условии, что опыты по бесклеточной трансляции отражают ситуацию in vivo. Проведенные нами опыты по включению ^С-лейцина в белки in vivo показали, что активность синтеза белка в расчете на сырой и сухой вес листа была выше при 10 Вт/м2 по сравнению с 125 Вт/м2. Для' прямого сопоставления данных по включению 14С -лейцина в белки in vivo с активностью рибосом in vitro необходим пересчет на содержание РНК. Данные по активности РНК-полимеразы I говорят о том, что количество рРНК выше при 125 Вт/м2, в таком случае при пересчете на единицу РНК различия в активности синтеза белка in vivo должны быть еще значительнее и, следовательно, данные полученные в системе in vitro скорей всего коррелируют с данными, полученными in vivo.

4. Влияние интенсивности освещения на фосфорилирование рибосом эндогенными протеинкиназами. Поскольку наиболее часто регуляция трансляции осуществляется за счет фосфорилирования - дефосфорилирования белков - участников синтеза белка, мы исследовали возможность таких модификаций в наших экспериментальных условиях.

В табл. I представлены данные о фосфорилировании препаратов цитоплазматических рибосом, выявленных из 3-й пары листьев растений, выращенных при 10 или 125 Вт/м2. Несмотря на заметный разброс данных отчетлив« можно видеть тенденцию к снижению фосфорилирования рибосом, выделенных из "теневых" растений по-сравненню с рибосомами из "световых" растений. Мы ле обнаружили различий г. ((хкфорилиропатш тотальных препарзюп хлоропластных полисом, выделенных из листьев растений, выращенных при различной освещенности.

На рис. 5 представлено р качестве примера фосфорилирование некоторых инливидуильных белков с мол весом от 50 до 20 кД, то еегь кастоящнх ркбосомнглх белкоп. и более высокомолекулярных нерибосомннх белков. Можно видеть,'что иин-иснпности освещения т>-рпзмпчу влияли на фософрилирование обоях клаесяг, белкчя. ttmn.n'pv» фосфорилиропанис одних, но подавляя фпепфрялирование других.

Таблица {

Слияние интенсивности освещения при выращивании растений на уровень фосфорилирования препаратов тотальных цитоплазматических полисом.

Освещенность Опыт 1 Опыт 2 Опыт 3 Вт/м2 _

включение 33р( имп/мин на пробу

125 10

55390+708 22067+1981

36490+1968 30324+1325

94693+2838 68577+2849

Не&иЪасониые ¿Г/тьчЛ 1 Ри^сонюге Релку |

¿•¿-«V» го-го г о

Рис.5. Фосфорилирование индивидуальных белков препаратов рибосом, выделенных из 3-й пары листьев растений, выращенных при 10 и 125 Вт/м^.

5. Влияние интенсивности освещения на состав белков препаратов рибосом.

Помимо возможных модификаций рибосомных белков, в частности их фосфорилирования, регуляция трансляции может осуществляться за счет действия каких-то специфических ингибиторов или активаторов. Поэтому мы проанализировали состав белков препаратов полисом в разных вариантах опыта. •

На рис. 6 представлены электрофореграммы белков полисом, выделенных из 3-й пары листьев световых и теневых растений. Большая часть белков препаратов ' представлена низкомолекулярными белками, которые являются интегральными рибосомными белками, и относительное количество которых не изменяется в зависимости от условий выращивания растений. Вместе с тем, хорошо видно присутствие двух полипептидов с мол. массами 42 кД и 55 хД, количество которых различается в препаратах рибосом из растений, выращенных при 10 и 125 Вт/м2, что ' говорит об их нерибосомной природе.

Л/г, * "

к-Кэ |

22 ® ¡—й?«®

____ Рлс.б. Электрофореграммы белков препаратов

^Г | тотальных полисом выделенных из 3-й

30-+ ; пары листьев,, растений, выращенных

СТ Ш | при 125 Вт/м2 (1) и 10 Вт/м2 (2).

Щ I

Чтобы иметь возможность корректно сравнивать содержание этих белков в различных препаратах рибосом, мы определяли относительные количества белков по площадям соответсвующих пиков па денситограммах, после чего подсчитывали отношение белков 42 п 55 кД к рибосомным белкам. При таком способе расчета нет необходимости точно выравнивать общее количество белка, наносимого ш дорожку геля. Используя такой подход, мы подсчитали относительное количество данных полипешидов в препаратах полисом из листьев растений, выращенных при разных ннтевемвиоетях освещения, разной температуре, а также кз листьев разного возраста ГГабл.2»

Таблица 3-

Относительное содержание полипептидов 42 кД и 55 кД в препаратах .тотальных' цйтоплазматических полисом, выделенных из 3-й пары листьев, усл. ед.

Номер Интенсивность Содержание Содержание

опыта . освещения, полипептнда полипептида

Вт/м2 42 кД 55 кД •

1 125 0,15 0,38

10 ' 0,04 0,1

2 125 0,21 0,17

10 0,034 0,046 ,

3 125 0,153 0,29

10 0,046 0,07

4 125 0,174 0,42

10 0,062 0,13

5 125 0,14 0,52 .

10 0,033 0,19

Среднее 125 0,16+0 0'2 0,36+0,6

значение 10 0,04«,008 ' 0,10+0,03

Из данных, представленных в таблице, видно, что относительное количество полипептида 42 кД было в несколько раз выше в препаратах рибосом, выделенных из "световых" растений по сравнению с препаратами рибосом из "теневых" растений. •Количество полипептида 55 кД заметно варьировало от опыта к опыту , но тоже было выше в препаратах рибосом из листьев растений, выращенных при 125 Вт/м2. Количество полипептида 42 кД увеличивалось • при переносе теневых растений на высокую интенсивность света, и снижалось при обратном переносе. Что касается полипептида 55 кД, то изменения в его содержании были более заметны при переносе растений с низкой освещенности на высокую, чем при противоположной смене режима освещения.

Повышение температуры в камере фитотрона до 27°С приводило к резкому повышению содержания белка 42 кД полисомах. При этом сохранялось, хотя и становлюсь менее выраженным различие между препаратами полисом, выделенными из теневых и световых растений. Содержание полипептида 55 кД практически не изменялось при повышении температуры выращивания растений.

Сильное влияние на количество полипептида 42 кД в препаратах рибосом оказывал возраст листьев. На рис. 7 представлено содержание белка 42 кД в препаратах рибосом, выделенных из листьев 2-го, 3-го и 4-го ярусов растений, выращенных при высокой или низкой освещенности. Хорошо видно, что полисомы из наиболее молодых растущих листьев 4-го яруса содержали небольшие количества полипептида 42 кД, и различие между вариантами освещения не были достоверными. Количество белка заметно возрастало в полисомах из 3-й и особенно 2-й пар листьев.

»5.

I №

Ч

1

| I

Рис.7. Влияние интенсивности освещения и возраста листьев на относительное содержание полшшпида 42 кД в препаратах полисом.

Ц>лара Запора ¿гларо

На рнс. S представлены злектрофореграммы белков препаратов мембрано-связанных (МСП) и свободных (СП) полисом.

» е

tk

nQx

tr. 43-

го--

-¿»Я, -4M?«

Рис.8. Злектрофореграммы белков препаратов свободных (I) и мембрано-связанных полисом (2),-выделенных из 3-й пары листьев растений, выращсных при 113 Вт/м2 (А) и 10 Вт/м2.

ЖЯ 9£з

Можно видеть, что оба полипептида присутствуют как во фракции МСП, так и во фракции СП. Однако, полипептид 55 кД сосредоточен главным образом в СП, в то время как полипетяд 42 кД присутствует в большем количестве в МСП. Относительное количество полипептида 42 кД в обеих фракциях полисом было хорошо воспроизводимо в разных опытах и возрастало с увеличением возраста листьев, а также было выше у растений, выращенных при 125 Вт/м2.

Анализ содержания полипептидов 42 и 55 кД в • препаратах рибосом, фракционированных в градиенте концентрация сахарозы, показал, что распределение полипептида 42 кД коррелировало с распределением рибосом и его относительное количество та одну рибосому сохраняясь примерно постоянным в разных фракциях градиента (Рис. 9). Такое распределение белка говорят о том, что ои вероятно доволыто прочно связан с рибосомами, а не просто соосождается с ними. Полипептид 55 ;;Д, ¡мггротаз, с основном ■ был - сосредоточен в верхней области градиента коштггрзюш сахарозы, где практически отсутствуют рибосомы. При проведет»« пуромкцппогоЗ реахтт я фракционирования субъединяп рибосом в гртнентс. концентрации сахарозы с Рис. 10) тмттегпия 55 кД кояцснтрирпяался я лоне «мш субьезиякцы рибосом я в более легких фракциях, где находятся освобожзешше ■.(РНК. Обработка препаратов

Белки Зоны градиента

5 II III IV

• полисомы мокосомы

Ркбосомпые белки 70 1518 1267 414

42 кД 0 83 79 22

42 кД/.Риб-е.белхи 0 0,06 0,06 0,05

55 кД 0 45 47 89

55 кД/Риб-е.белки 0 0,03 0,04 0,22

Рас.9. Относительное содержание полипептидов 42 кД и 55 кД в разных фракциях ' сахарозного градиента препарата цитоплазматических тотальных полисом.

Рис.31. Электрофореграммы белков из разных фракций сахарозного градиента препаратов рибосом, диссоциированных на субьединвцы.

Л - большая субъединица рибосом. . Б - малая субъединица рибосом.

в - асйооаладенщм° нАтрацы.

рибосом РНКазоа А ие влияла на содержание полипетида 55 хД в препаратах полисом. Это означает, что полипептид 55 кД не связан ни с рибосомами, ни с мРНК, а коэффициент седиментации наиболее тяжелых ¡уз образуемых этим полниептидом. комплексов достигает 403. На основании мол. н распределения во фракциях клеточного гомогената мы предположили, что имеем дело с большой субьединицей РБФК. На рис. И представлены данные иммунофермпгтного анализа препаратов МСП и СП с использование кроличьих антител к РБФК СЫогеНи. РБФК действительно присутствовала в препаратах обеих субпопуляций полисом.

Д<2

V

а-«» -

АЗ

V

а

¿23

Рис. 11. Относительное содержание РБФК в. препаратах мембрано-связанных (2) и свободных (3) полисом.

(1) - 0,1% бычий сывороточный альбумин.

•Совпадение мол. веса второго из изучаемых иэмн поляпептидов с мел. весом актива, в также появившиеся в литературе сведения о существовании шгтоскелетао-связаяяых полисом у животных позволили нам предположить, что присутствующий в препаратах полисом полипмтгад 42 кД является актином.

О присутствии актина з препаратах тотальных, мембранио-связанных и свободных полисом мы судили, чспользуя анти-ахтияовые «грольчьи акгитела, а также токсин - фаллоидян, специфически реагирующий с полимерной формой актина (Р-актнн). На рис, 12 можно видеть, что аьтин действительно присутствует в препаратах полисом, причем в полимерной форме. Учитывая, что мол. вес актина находится в области; 42 - 45 кД, мы предположили, что именно поляпепгид • 42 *Д являете® актином.

I

г& С Q |

ШСР© ® # #

■0 0 О •

в б во .

J

Рис.12. Дот-блот идентификация содержания актина в препаратах тотальных

читоплазматнческих полисом, выделенных из 2-й (1) и 4-й (2) пар лкстьея бобов. 3 - куриный гладкомышечный аютяя. А - Нммуномечевяе антнактиновыми кроличьими антителами с последующей визуализацией аятикролнчьими ослиными антителами мечеными коллоидным золотом.

Б - Прямое мечепке кояьюгатом фая/тоидин-коллоидкое золото.

Свазь определенной субпопуляции полисом с актиновнмп микрофиламентами хорошо похазака для полисом из животных объектов, таще всего 'f.) Ky.7bntEH)>v-vbix клетск (Nielsen, 1983; Heskcth, Pryme, 1991). Для ' растительных объектов нам неизвестны попытки обнаружить . фракцию полисом, связанных с ш{тоске «юя.

Поскольку гомогенизация таких растительных объектов, как листья растений должна быть достаточно жесткой, трудно предположить сохранение целостности цитоскелета, но его' обрывки, возможно, могут попадать во фракцию полисом, если они прикреплении к рибосомам. Имеющиеся в настоящее время литературные данные не позволяют пока делать каких-либо определенных выводов о функциональном значении связи рибосом с цитоскелетом даже для животных клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования показывают, что в белок-сшггезирующей системе зеленых закончивших рост листьев происходят изменения в зависимости от - интенсивности света. Они проявляются как при постоянном выращивании растений при разной' освещенности, так и при кратковременной смене режима освещения и заключаются в изменении общего объема белок-синтезирующей системы, доли функционально активных рибосом, кх трансляционной активности, степени фосфорнлирования и в составе белков препаратов рибосом.

Значительное увеличение трансляционной активности рибосом, выделенных из "теневых" растений, в сочетании со снижением общего количества рибосом и доли полисом в них, возможно, является механизмом поддержания постоянного уровпя синтеза белка при изменении освещенности. Таким образом, акктвацню трансляции можно рассматривать как специфический механизм, компенсирующий возможно слишком сильные и иеспецнфические ответы белок-синтезирующей системы

на освещение.

Изменения в активности рибосом, происходящие достаточно быстро, могут быть связаны с какими-то модификациями их компонентов или обратимым присоединением каких-то специфических ингибиторов или активаторов трансляции. Действительно, препараты рибосом различались как по активности тотального включения фосфора в белки, так и по степени фосфорнлирования пндошвдуалышх рибосомных белков. Различалйсь препараты рибосом и по составу белков. Два полипелтида нерибосомного происхождения ' присутствовали » большем количестве в препаратах полисом из

"световых" растений. Один из них оказался большой субьедшшцей РБФК, а другой, с мол. весом 42 кД - актином. Полипептид 42 кД был прочно связан с рибосомами и его содержание зависело от освещенности листьев, их возраста и температуры. Этот факт позволил нам предположить существование в растениях субпопуляции полисом, связанных с актиновым цитоскелетом. Различия в содержании этого белка в препаратах рибосом из "теневых" и "световых"- растений возможно, отражают изменения в локализации полисом под действием интенсивдости света. Связь растительных рибосом с цитоскелетом до сих пор не была показана и ее изучение является одним из возможных направлений дальнейшего развития данной работы. '

ВЫВОДЫ . \

1. Изучено влияние шгтенсивности освещения на активность РНК-полимераз листьев бобов. Показана активация РНК-полимеразы I при увеличении интенсивности освещения от 10 до 125 Вт/м2 при постоянном выращивании растений на различных

*

интевслвностях света.,. 2. Показано увеличение доли полисом в препаратах тотальных, свободных, мембрано-связапньи цитоплазматических рибосом.

3. Подобраны оптимальные условия для выделения шпактных хлороплатов из закончивших рост листьев бобоз и препаратов хлропласткых; полисом.' Показано увеличение доли полисом в препаратах тотальных н стромальных хлоропластных рибосом при увеличении освещенности.

4. Удельная трансляционная активность была одинакова для препаратов цитоплазматических полисом, выделенных из листьев растений, выращенных при освещенности 50, 80 и 125 Вт/м2, но выше в 2 - 2,5 раза у препаратов полисом, выделенных из листьев растений, выращенных при 10 Вт/м2.

5. Показаны различия в активности .тотального фосфорилярования препарзтов полисом нз "теневых" и "световых" растений, а также различия в степени . фосфоряяиропаиия -индивидуальных белков этих препаратов. Препараты хлоропластных полисом не различались по активности тотального фосфорилироваиня эндогенными протеинхиназами.

6. При краткосрочных (б - 24 ч) изменениях в режиме освещения: происходили такие же изменения в активности РНК-полимеразы I, доле полисом в перпаратах тотальных пито плазматических полисом, трансляционной активности препаратов полисом и их фосфоршшровании, как и при длительном выравнивании растений при разной освещенности.

7". Обнаружено присутствие двух белков верибосомиого происхождения с мол. массой 55 и 42 кД в препаратах цито плазматических рибосом, относительное содержание которых было выше в препаратах рибосом из "световых" растений. Количество полипептида 42 кД увеличивалось также в зависимости от возраста листьев и температуры выращивания.

8, Полипептид 55 кД идентифицирован как большая субьединица РБФК. Показано, что он не связан с рибосомами а осаждается в виде крудньгх агрегатов с коэфициентом седиментации, достигающим 40S.

9. Полипептид 42 кД идентифицирован как актин. Этот белок достаточно прочно связан с рибосомами и его присутствие, по-видимому, отражает связь полисом с актиновым цитоскелетом.

Списох работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Зак Е.А., Клячко ИЛ., Романко Е.Г., Николаева М.К. Влияние интенсивности освещения на активность РНК-полимеразы I и уровень клеточных полисом в листьях бобов. Физиология растений, 1991, Т.38, Вып.67, С.1102.

2. Романко Е.Г., Зак Е.АМ Селивашиша С.Ю., Ннхолаева М.К. Зависимость РНК-полимеразной и протеинкиназной активностей препаратов хроматина, ядер и солюбилизированной РНК-полимеразы хлорошшстов от интенсивности освещения при выращивании растений. Физиология растений, 1992, Т.39, Вьга.5, С.917.

3. Зак Е.А., Романко Е.Г., Николаева М.К., Клячко H Л. Влияние интенсивности освещения на трансляционную активность цитоплазматнческих рибосом я состав ^белков, ассоциированных с моно- и полирибосомами из листьев Vicia faba L. Физиология растений, 1993, Т.40, No.56, С.721.

4. Зак Е.А., Ромаяко Е.Г., Николаева М.К., Клячко Н.Л. Адаптация растений

1

Vicia faba L. к различным интенсивностям освещения на уровне белок-синтезирующей системы. Тезисы докладов III съезда Всероссийского общества физиологов растений, Санкт-Петербург, 1993, С.565.