Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние иммобилизации в полисахаридные гранулы на функциональные свойства клетов животных

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние иммобилизации в полисахаридные гранулы на функциональные свойства клетов животных"

О

ИНСТИТУТ цитологии РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

дьяконов

Иван Андреевич

ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗАЦИИ В ПОЛИСАХАРИДНЫЕ ГРАНУЛЫ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

А ВТОР ЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

Работа выполнена в Институте цитологии РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук Пинаев Георгий Петрович.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Кудрявцев Борис Николаевич; кандидат биологических наук Коробицын Леонид Павлович.

Ведущее учреждение: Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина РАН.

на заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, С.-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

&С>

Защита состоится

часов

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Автореферат разослан «д/»

1993 г.

Л. И. Писарева

(С) Институт цитологии РАН

Актуальность проблемы. Современные биотехнология и биомедицина нуждаются в новых методах культивирования клеток. Одним из наиболе перспективных способов подготовки клоток для их практического использования является технология иммобилизации клеток в полимерные гели, среди которых основное место занимают полисахариды. Иммобилизация клеток позволяет увеличивать удолъдый выход продукта в биореакторе, создавать различные системы перфузии й перемешивания, снижать расхода на очистку конечного продукта, создавать системы, основанные на совместном культивировании нескольких штаммов клеток, повышать устойчивость клеточных популяции, экспрессируюцих плазмиды, и генетических штаммов. При медицинском приложении иммобилизация обеспечивает изоляцию пересадочного материала от иммунной системы.

В организме" многоклеточных животных ткани сформированы из клеток, связанных между собой с помощью межклеточных контактов, а также с помощью находящегося между ними матрикса из гликопроте-инов и протеогликанов. Протеогликаны и их полисахаридные части -гликозаминогликаны - оказывают существеное влияние на клетки. Многочисленные свидетельства роли полисахаридов животных в регуляции Функционирования клеток позволяют предположить, что иммобилизация в гели растительных полисахаридов будет оказывать регуляторное влияние на клетки. Вместе с тем, данные о Функционировании клеток в гранулах из полисахаридов являются весьма немногочисленными и нечеткими. Вследствие этого актуальной является задача изучения воздействия на клетки полисахаридов различного происхождения в двух аспектах: как биоактивных веществ в культуре клеток и как матрицы, внутри которой заключены клетки.

Цель и задачи исследования. Цзлью работы явилось исследование Функциональных свойств клеток животных, заключенных в гранулы растительных полисахаридов и изучение влияния полисахаридов, используемых при иммобилизации, на свойства клеток в монослояноя культуре. При этом решались следующие задачи:

1) анализ способности полисахаридов поддерживать дифференцировку клеток на примере первичной культуры гепатоцитов крысы;

2) изучение влияния полисахаридов на характеристики пролиферации клеток в монослойной культуре на примере первичной культуры Фибробластов человека и культур трансформированных Фибробластов;

3) оптимизация методики включения жизнеспособных клеток в полимерный гель кальциа-связывающих полисахаридов и термолабильных полисахаридов; 4) исследование ростовых свойств и функциональной активности иммобилизованных делящихся клеток-продуцентов на примере клеток, гийридомы; 5) изучение Функционирования иммобилизованных клеток при органоти мческой иммобилизации на примере Фрагментов семенников человеческих плодов.

Научная новизна. В данной работе впервые обнаружено, что альгинат способен влиять на ростовые свойства клеток и на их Функциональную активность не только при иммобилизации внутрь альгинатных гранул, но и в виде добавки в среду культивирования, клеток. Показано, что альгинат способен: снижать индекс включения тшидоша в первичных культурах фибробластов человека и эффективность клонирования трансформированных Фибробластов; стабилизировать Функцию Формантов детоксикации дифференцированных гепато-цигов крыс в первичной культуре. Обнаружено также, что полисахариды различного происхождения в той или иной степени проявляют аналогичную альгинату способность влиять на культивируемые клотки. При культивировании в гранулах обнаружено повышенное содержание ДНК в ядрах клеток гийридомы при сохранении жизнеспособности и секреции моноклональных антител в течение длительного срока. Показана лучшая сохранность структуры и более высокая секреторная активность Фрагментов семенных канальцев эмбрионов ¡рловека в гранулах по сравнению со свободной культурой.

Практическая ценность. Создана установка для быстрого получения больших количеств гранул с иммобилизованными клетками. Усовершенствована методика получения гранул, ориентированная на клотки животных. Показана возможность использования иммобилизованных клоток гибридомы как продуцентов антител в биотехнологии. Получоны гранулы с иммобилизованными Фрагментами семенников крыс, которые могут служить в качестве трансплантатов для коррекции недостаточности мужской гормональной Функции. Совместно с Военно-модицинскоа академией и 1 С-Ш Медицинским институтом им. акад. Павлова разрабатываются экспериментальные модели для последующего внедрения в клиническую практику.

Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертационной

работе, докладюались на школо-семинаре "Иммобилизованные клотки" (Пуидоно, 1986), Всесоюзном совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов" (Владивосток, 1987), Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Лрпшгград, 1987), совещании "Генная и клеточная инженерия в решении Фундамонтальных проблем биотехнологи" (Тарту, 1988), конференции "Cellular and molecular Ьав1в of liver cirrosis" (RenriBB. 1991), Седьмой международной конференции ■ Международного общества дифференцировки "Cellular, ргокгаипев for growth, differentiation, arel neoplaeia", (Helsinki, 1D92)

Публикации. По томе диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах иашинопошеного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и основные методы исследований.

1 Полисахариды, использованные в работе.

В работе использовались полисахарида: альгинат, \-кзрраги-нан, гепарин, пуллшан и агэроза тип 7 производства Фирмы Siena, декстран сульфат производства Фирмы Fluka, карбоксиметил хитозан и карбоксиметил целлххлозаполучены из Московского технологического института легкой промышленности, хитозан и ж-каррагинан получены из Тихоокеанского института био орг а ниче ской химии ДВО РАН, несколько галактоманнанов из грибов (крилан, родексман, родексман сульфат, SP-50, В678, аубазидан, пуллшан) получены из С-Ш Химико-Фармацевтического института.

2 Используемые клетки и условия их культивирования.

а) Гепатоциты взрослых крыс изолировали из печени по методу Сеглена и высевали на среде Вильямса Е без сыворотки с добавлением бычьего инсулина (10 мкг/мл) и гидрокортизона (3,4х10_6М). б) Клетки мышиной гибридомы клона 218Д5 выращивали на смеси сред Дальбекко и F1Z (1:1) без сыворотки с добавлением инсулина (10 мкг/мл), трансФеррида (5 мкг/мл), этаноламина и селенита натрия (Зх10-9М). в) Фрагменты семенников эмбрионов человека выращивали на той же базовой среде с добавлением 10%

эмбриональной телячьей сыворотки, г) Первичные человеческие фийробласты на 5-12 пассажах выращивали на смеси сред MEM и 199 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, д) Трансформированные ФИбробласты лшша СНО и L929 выращивали на среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. 3 Методика иммобилизации клеток. . .

а) Клетки гийридомы иммобилизовали в гранулы агарозы по модифицированой методике Гдльссона, путем диспергирования нагретого до температуры 40°С 0.65S раствора агарозы с клетками в вазелиновом масле с последующим охлаждением полученной дисперсии до 0°С, после чего масляную Фазу удаляли и к осадку гранул добавляли избыток свешй среда для культивирования. Клетки в количестве З.бгХО7 иммобилизованные в гранулах в объеме 6 мл, культивировали при постоянном встряхивании в 50 мл среды без сыворотки. В качестве контроля использовали неиммобилизованные клетки в суспензионной культура, б) Фрагменты семенных канальцев эмбриона человека иммобилизовали в гель кальций-альгината по модифицированному, методу Лима. Фрагменты ткани диаметром 0,5-1 мм В 1,2% растворе алытшата натрия (Keltone LV + Keltone HV и, Keiko), 2,5% глюкозе при рН 7,5 прокалывали в 0,8% раствор хлорида кальция, 1,25% глюкозы рН 7,5. Через 10 минут образовавшиеся гранулы промывали дважды 2,5% раствором глюкозы и дважда - средой для культивирования.

4.Определение цитотоксичности альгинатов и других полисахаридов.

а) Цитотоксичность полисахаридов определяли по снижению уровня накопления витального красителя нейтрального красного в культурах гарвичных гепатоцетов. Клетки инкубировали в течение двух часов с нейтральным красным (50 мхг/мл среда), промывали два раза ФосФатно-солевым буфером Дальбекко и Фиксировали кальцша-Формоловым раствором (4% формалин, 156 хлористый кальций). Краситель экстрагировали и концентрацию его регистрироэли по поглощению при 540 нм. б) Цитотоксичность альгинатов определяли' также по снижению Эффективности клонирования трансформированных ФИбробластов линий СНО и L929 при посеве с плотностью 100 клеток на чашку диаметром 40 мм в присутствии 0,5Ж альгинатов в среде. 5. Определение активности Ферментов детоксикаци гепатоцитов.

Активность ЭтоксиразоруФин-О-деалкилазы (ЭРОД) и шнтокси-

резоруфин-0-деалкилазы (ПРОД) измеряли методом сгюктроФлюоро-метрии на живых клетках. ЭтоксирезоруФин и пентоксирезоруфин в концентрации 5х10_вМ использовали как субстраты. Дальнейший метаболизм получаемого продукта блокировали добавлением 1,5 мМ салициламвда. Активность Ферментов выражали в пМ продукта (резоруФина) за единицу вреиеяи. удельную активность определяли по отношению к количеству белка в пробе. Для индукции ЭРОД и ПРОД за 48 часов в культуры добавляли 5х10_6М 3-метляхолантрена или Зх10_"Н) фенобарбитала соответственно, в. Определение уровня секреции клеточных продуктов.

Количество в среда, Моноклояальных антител, продуцируемых клетками гиЗрИдомы 218/15 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Концентрацию тестостерона в культу-ральвой среде Фрагментов семенных канальцев определяли радиоиммунным методом.

7. .Анализ включения тимвдина в культурах Фибробластов.

Остановку Фибробластов в Фазе eQ клеточного цикла производили, помещая их в Среду с 0,5Ж эмбриональной телячьей сыворотки на 48 - 72 часа. Затем в клетках стимулировали синтез ДНК добавлением среда с 10$ эмбриональной телячьей сыворотки. Одновременно с сывороткой добавляли растворы исследуемых полисахаридов и тимидин (1 мкКюри/мл), через 24 часа пробы анализировали на радиоактивность. При использовании в качестве стимулятора эпидермального Фактора роста (10 нг/мл) эксперименты проводили по той же схеме, как и с сывороткой, за исключением того, что всю работу вели в среде без сыворотки.

8. Определение содержания ДИК в иммобилизованных клетках.

ЦигоФЛюориметрото ДНК ядер клеток гибрвдомы.в гранулах проводили на цигоФлюориметре Ломам-ИУФ (ЛОНО) при длине волны 385 нм после Фиксаций препаратов 70Х этиловым спиртом и окраски красетелем Hoechet 33258. Результаты представлены в виде гистограммы распределения ядер клеток по классам в зависимости от содержания ДНК, выраженного в условных единицах свечения.

9. Иммуноцитохимическое' окрашивание клеток.

Выявления в гепатоцитах изоФормы цитохрома Р-450, индуцируемой Фенобарбиталом, осуществляли с помощью моноклоналых антител (получены во Всесоюзном онкологическом цэнтре РАМН)

Фиксироваж клетки 2% Формалином, окрашивали с помощью конъюгата вторых антител с пвроксидазои хрена и диамшюбетоидина. 10. Механические испытания гранул.

Механические испытания проводили на гранулах размером 2-3 мм из 2% раствора альгината, шдершнных в растворе хлористого кальция в теченш 1,5 часов и промытых даажды Физиологическим раствором ыаС1. Снятие кривой "напряжение-деформация" проводили на приборе УМИВ-3 в статических условиях. Модуль упругости определяли для малых деформация <до 1%), прочность - по максимальной силе сопротивления при сдавливании гранулы на 20%.

Результаты.

1. Характеристика полисахаридов как биосовместимых веществ.

Для оцонки цитотоксичности препаратов альгинатов и других полисахаридов было использовано несколько методов. О жизнеспособности клеток в первичной культуре гепатоцитов судили по накоплению ими витального красителя нейтрального красного. В двухдневной культуре гепатоциты в присутствии большинства полисахаридов нормально включали краситель. Исключением являлся лггозан, который ощутимо (в два раза) снижал способность тепатоцитов накапливать краситель. Некоторые полисахарвду, а именно: декстран' сульфат, Л-кэррагинан, бр-50 и гепарин, на 10-20% снижали накопление красителя, Альгинат совершенно да нарушал транспорта нейтрального красного, следовательно, его можно считать нетоксичным для клеток. Некоторые полисахариды, например, карбоксиметил производные и нейтральные полисахарида из грибов: крилан, аубазвдан, дуллюлан, - оказывала слабое стимулирующее влияние на включение красителя. На четвертые сутки культивирования отличия между опытными и контрольными вариантами были еще менее заметны. Единственным полисахаридом, который тормозил накопление, был хитозан. В присутствии _многих полисахаридов уровень включения нейтрального красного оказался несколько выше, чем в контроле. Интересно отметить, что некоторое снижение транспорта нейтрального красного ва вторю сутки наблюдалось при добавлении именно тех полисахаридов, которые при дальнейших исследованиях оказались наиболее биоактивными.

Эффективность клонирования линия ь929 и СНО в присутствии О.БЖ альгинатов в культурзльной среда оказалась чувствительным показателем, позволяющим определить степень чистоты образцов альгинатов, как отечественных так и импортных. Очистка загрязненных альгинатов несколькими переосаждениями этиловым спиртом или соляной кислотой снимает их токсический зФФект для клеток.

2. Влияние полисахаридов на поведение клеток в . культуре.

2.1 Влияние полисахаридов на морфологию и распластывание

гепатоцитов.

Распластывание оцзнивзли визуально под микроскопом. В контрольных культурах клетки имели плоскую Форму и ламеллы по краям клеток, через 5 суток в культуре наблюдали образование плоского монослоя. Некоторые полисахариды не оказывали влияния на Форму клеток и культуры в их присутствии не отличались от контрольных (Табл. 1, оценка 0). В то же время в большинстве культур с полисахаридами, было отмечено уменьшение распластанности клеток. В первые сутки в культурах, обработанных дэкстран сульфатом встречались наименее распластанные, практически круглые клетки (Табл. 1). В поздаих культурах такие клетки Формировали агрегаты. Более уплощенмо клетки, но С отчетливой границей и без ламелл, были характерны для культур, обработанных родексман сульфатом, гепарином, криланом. Впоследствии такие клетки оставались слабо распластанными и образовывали "балочные" структуры с хорошо заметными "желчными протоками" между клетками. Еще более распластанные клетки, среди которых встречались как клетки без ламелл, так и с ламеллами, находили в культурах с алытшатом и зостерином. Через 5 суток такие клетки образовывали монослоа, но более "поджатый", чем контрольные культуры. 2.2. Влияние полисахаридов на Функцию детоксикации гепатоцитов.

В работе рассматривается Фенотипическэя экспрессия двух изоформ цитохрома Р-450. Одна проявляет активность этоксирезо-руФин О-деалкилазы (ЭРОД), и эта активность сильно стимулируется под действием ксенобиотика метилхолантрена. Другая проявляет активность пентоксирезоруфин 0-дзалкилазы (ПРОД), которая индуцируется в присутствии Фенобарбитала. Как показано на рис.1,

ГРУППА НАЗВАНИЕ ОБОЗНАЧЕККЕ СТЕПЕНЬ

ВЛИЯНИЯ

АНИОННЫЕ альгинат А +

ГЕЛЕОБРАЗУВДЕ ЗОСТЕРИН г

СУЛЬФАТИРОВАННЫЕ РОДЕКСИАН СУЛЬФАТ RS +++ •

АНИОНШЕ ДЕКСТРАН СУЛЬФАТ VS +Н+

Я.-КАРРАГИНАН LC ++++

эе-КАРРАГКНАН КС +++

АНИОННЫЕ КМ-ЦЕЛЛЩОЗА ССВ +

КАРБОКСИМЕ- КМ-ДЕКСТРАН CMD 0

ШЗАМЕЩЕННЫЕ КМ-ШОЗАН cai +

НЕЙТРАЛЬНЫЕ SV-50 SP -Н+

КРИЛАН CR ++

ИЗ ГРИБОВ В-678 В +

РОДЕНСМАН Н +

АУБАЗИДАН АО 0

НУЛЯМАН ю 0

ГЛИКОЗАЫЙНО- ГЕПАРИН ни ++

ГЛИКАНЫ

Табл.1. Влияние полисахаридов на распластываниэ гепатоцотов в первичной культура

++++- - максимальный ОФФект,- + - минимальный зффокт; О - нет Эффекта.

на протяжении всего ¡¡рамени культивирования в ваших опытах (8 суток) имели место изменения активности Ферментов дэтоксинации гепатощтгов, связанные с адаптацией этих клеток к условиям культивирования. При этом активность.ЭРОД возрастала на 4 дзнь в 1,5-2 раза, а активность ИРОД - падала в три раза. Гепарин в концентрации 2Б0 мкг/мл существенно стимулировал рост активности ЭГОД и задерживал падение активности ПРОД. Наийолзе отчетливо, заметно влияние полисахаридов на активность ЭРОД .и ПРОД на Фоне их индукции специфическими индукторами, З-кетшаолантраном и Фенобарбиталом (Рис.2). Если индукторы повышали активности ЭРОД и ПРОД в десятки раз, то полисахариды способствовали повышению активностей в несколько раз. Наибольшим влиянием на подаэрканда

пМ/мг бежа-мин

пМ/мг белка-мин

50-

*о-

J0

Ю

г -

1 -

аг

—i— d4

de

dí

—i— d4

d8

Рис.1. Зависимость изменения активности ЭРОД (А) и ПРОД (В.) от времени культивирования геатоцитов в контрольной культуре (с) и в присутствии 100 мкг/мл гепарина (ы> на вторые (<й). четвертые <<М) и восьмые (ав) сутки культивирований.

пМ/мг белка-мин

Рис.2. Специфическая индукция ПРОД в гепатоцитах на четвертые сутки культивирования в присутствии полисахаридов в среда: а - альгинат, (2Б0 мкг/мл), гв - родексман сульфат,. (100 мкг/мл), da - декстрзн сульфат, (5 мкг/мл), cch - карбоиметил хитозан, (100 мкг/мл), ъ - BS78, (100 мкг/мл), ср - крилан, (100 мкг/мл), hm - ■ гепарин, (100 мкг/мл), с-контроль без добавок, (В) -нестимулированные культуры, <g) - стимулированные культура.

экспрессии активности обеих изоФорм на фоне индукции обладали декстран сульфат и гепарин. Насколько меньший эффект оказывали родексман сульфат и карбоксиметил хитозан. Галактоманнан из гриЗов, крилан, и альгинат практически не оказывали воздействия на экспрессию Функции Фермента ПРОД, но поддерживали экспрессию

Фермента ЭРОД. Другой жа галактоманнан из грибов, В678, даже слегка понижал уровень активности фермента ПРОД, в то время как уровень экспрессии ЭРОД практически не изменялся в присутствии этого полисахарида. Следует подчеркнуть, что изоформа с активностью ЭРОД намного сильнее зкспрвссируется после индукции по сравнению с изоФормой ПРОД. Даншо биохимических тестов- были годгваршны с помощью иммуноцитохимического окрашивания Фвнобар-битал-шшиируомой изоФормы цитохрома Р-450 в гепатоцигах, Если контрольные культуры слабо окрашивались антителами к Фенобар-битал-индуцируемой изоформе Фермента, то культуры в присутствии гепарина и особенно декстран сульфата окрашивались очень интенсивно. Культуры с алъгинатом имели промежуточную степень окраски. После индукции Фенобарбиталом часть клеток в контрольной культуре окрашивалась,но в присутствии гепарина и декстран сульфата окраска была ещэ более интенсивной- В случае декстран сульфата трудно было различить стимулированные клэтки и вэ стимулированные, потому что окраска настимулированных клеток уже достигала насыщения. 2.3. Влияние полисахаридов на стимуляцию синтеза ДНК в первичных Фибробластах.

Как показано на рис.За, ряд полисахарвдов,. включая и альгшат, блокируют стимулирующее действие сыворотки на включение тимвдина в клетки. Гепарин, декстран сульфат и альгинат обладали ингибирующим действием, тогда как другой заряженный полисахарид, родвксман су,яь4>ат, мм не обладал. Возможно, эффект полисахаридов зависит от их строения. В нескольких лабораториях изучается влияние гепарина и родственных ему полисахаридов на _ рост таких клеток, как клетки гладкой мускулатуры сосудов, эндотелия сосудов и другие. ИнгаЗирующзв влияние гепарина на рост клеток приписывают в данном случае его способности инактдаиравать действие ростовых Факторов, которые обладают способностью непосредственно взаимодействовать с гепарином, например Фактора роста Фибробластов. С ирлью проверить эту гипотезу мы использовали' опидермалыши Фактор роста, который, судя по данным литературы, но связывается с гепарином. Стимуляция синтеза ДНК под действием Фактора также подавлялась в присутствии полисахаридов (Рис.36). Причем наблюдалась та же зависимость от типа полисахарида, что и при действии цзлой сыворотки.

имп Ю^/иин

имп 10а/мин

О

1

О

+ - А Н ОБ Ив + - А Н ОБ ВЭ

А Б

Рис.З. Включение меченого тимвдина посла стимуляции синтеза ДНК в покоящихся ФИбробластах в присутствии полисахаридов в среде:

А) стимуляция 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Б) стимуляция зпидермальным Фактором роста. + - контрольная культура, стимулированная к синтезу ДНК; - - контрольная культура без добавок; а - альгинат, 250 мкг/мл-, ь - гепарин, 100 МКГ/МЛ; ав -декстрап сульфат, 5 мкг/мл; гэ - родексман сульфат, 100 мкл/мл.

16 14 13 10

а

а

4

а о

Рис.4. Эффективность клонирования клеток линии ОНО в присутствии полисахаридов в среде <5мг/мл):

с - контрольная культура без добавок, ав - агароза, а - альгинат, т.- зостерин, кс - каппа каррагинан, 1с - лямбда каррагинан, ав -декстран сульфат, а - декстран, сг - крилан, сев - карбоксиметил целлюлоза.

2.4. Влияний полисахаридов на эффективность клонирования клеток.

При анализе токсичности образцов альгинатов нами было обнаружено, что даже чистые образцы альгинатов и других полисахаридов в концентрации б мг/мл снижают эффективность клонирования трансформированных ФИбробластов линиии ОНО и 1.329 примерно на 40-50%. Был проведен анализ влияния различных полисахаридов на эффективность клонирования линии СНО (Рис.4). Показано, что araроза, зостерин, дэкстран сульфат и каррагинаны снижали эффективность клонирования в 2,5-3,5 раза, а крилан, карбоксиметил целлюлоза, декстран и альгинат снижали эффективность клонирования в 1,5-2 раза.

Многие исследователи связывают проявление специфической диффвренцировки клеток и запуск клеточной пролиферации с изменениями Формы клеток,- Однако, подученные данные нэ позволяют провести четкой корреляции между морФогенетическим потенциалом изучаемых полимеров и их свойствами влиять на пролиферацию и диФФеронцировку клеток. Объяснение механизма влияния злъгината и * других полисахаридов на клетки может быть двояким: 1) прямое действие альгината на неизвестную мишень в клетке; 2) опосредованное действие, например через взаимодействие с какими-то ростовыми Факторами.

3. Характеристика иммобилизованных клеток и Фрагментов тканей. 3.1 Оптимизация процесса образования гранул альгината кальция.

Гранулы, полученные по способу Лима обладали низкой, прочностью и упругостью (Табл.2). С целью повышения прочности гранул и их устойчивости мы предприняли поиски в следующих направлениях: оптимизация состава растворов, применяемых при иммобилизации, и изучение зависимости свойств гранул от химического строения и молекулярного веса образующего их полимера. В результате проведенной работы были предложены следующие модификации метода Лима: в растворы, содержанию низкиз концентрации натрия и калия, добавляли глюкозу в качестве Физиологической среды; использовали альгинат с максимальным соотношением гулуроновой кислоты к маннуроновой и молекулярным весом не ниже 100 тыс Дальтон; Как ввдно из Табл.2, гранулы, полученнные по

усовершенствованной нами методике прочнее и устойчивее, чем гранулы, полученные по методу Лима.

Образец альгината Режим грануло-образования Модуль упруго-• сти (Па) Прочность (Па)

Мапи<зе1 (Ке1ко) по Лиму 7250-1300 5300-300 '

с глюкозой 18000^3300 5900-400

Магшсо1 (Ке1ко) по Лиму 4000 2250-150

с глюкозой 0500 3200-500

Табл.2. Прочность и упругость гранул альгината, полученных различными способами.

Воздушный способ сдувания капель, примененный Лимом, имеет рад недостатков: поток воздуха должен быть стерильным, что усложняет установку! масштабирование в . достаточной стетеви затруднено; производительность одаого сопла на очень высока -1 мл/мин. С целью повышения производительности установки, упрощения ее конструкции, наш применен метод создания капель с помощью вибрационного разбивания струи раствора альгината. Струя раствора подается из сопла и разбивается на каши под действием волновых колебаний звуковой частоты, которые приложены к соплу в направлении падения струи раствора. Разработанная наш установка отличается большой производительностью - 16 ил дин для одного сопла. Кроме того оца более компактна, легко стерилизуется, допускает насштабированиэ с увеличением числа сопел.

' 3.2 Иммобилизация клеток гибридокы в агарозные гранулы.

Клетки гибрицомы культивировали в щмобшизованном состоянии в гранулах агарозы в течение длительных сроков, максимально до 28 дней. Контрольные суспензионные культуры гибридомных клеток при достшьнш плотности клеток 1-2 млн/мл среда погиЗают, если их не пересеять с разбавлением в новую сряду. Иммобилизованные клетки остаются жизнеспособными по крайней мере на всем протяжении опыта и секретируют моноклональныэ антитела (Рис.б).

Однако, следует отметить, что концентрация антител в суспензионной культуре при культивировании с пересевом была выше, чем у иммобилизованной культуры (Рис.5). Возможным объяснением сниженное продукции антител иммобилизованными клетками могут быть йедостаточно адекватные методы иммобилизации и культивирования.

о г» 4 в в 1о |г и

время (сутки)

Рис'.Б. Продукция антител клетками иммобилизованной (-»-) и ,суспензионной (-+-) культур габридомы 218/15. Стрелкой опиечены шресевы суспензионной культуры.

3.3 Пролиферация иммобилизованных клеток гибридомы в гранулах агарозы.

Клетки гибридомы относятся к суспензионным клеткам, у которых прикрепление к подложке не имеет существенного значения для включения механизмов деления. Вследствие этого, теоретически они должны были бы свободно делться внутри гранул. Однако, уже на вторые-третьи сутки культивирования клетки в гранулах ? становятся крупнее, но их количество существенно' не увеличивается. С помощью цитоФлюорииетрии был проведен анализ содержания ДНК' в кштках, окрашенных ДНК-тропным красшшюм. Оказалось, что, начиная со вторы* суток, в иммобилизованных Клетках имеет место повышение. содержания ДНК в ядрах. По мере культивирования нарастает число клеток, ядра которых содержзт в 50-100' раз . больше ДНК, чем у неиммобилизованных клеток. В контрольной суспензионной культуре, которую выращивали без пэресева, напротив, уже на шестые сутки начинается гибель клеток, сопровождающаяся снижением содержания ДНК в пересчете на ядро. Аналогичные данные были получены для гибрвдомных клеток.

иммобилизованных в гранулы альгината (Марквичева Е.П., 1992).

В качестве возможной причины повышения содержания ДНК в иммобилизованных клетках можно предположить наличие механических препятствия для разделения мигготических клеток, которые находятся внутри геля, при сохранении нормального синтеза ДНК. Исходя из этого, интенсивно долящиеся суспензионные клетки, вероятно,более целесообразно иммобилизовать в капсулы, внутреннее пространство которых не создает механических препятствий для клеточного деления. С другой стороны, принимая во внимание результаты, изложенные в предыдущих разделах, иммобилизацию в гранулы можно предложить для неделящихся или медленно делящихся дифференцированных клеток, для которых необходимо поддерживать высокий уровень специфической Функциональной активности. 3.4 Характеристика Функционирования тканевых Фрагментов семенных канальцев в иммобилизованном состоянии.

Фрагменты семенных канальцев эмбрионов человека сохраняли в гранулах альгината кальция свою гистиотипическую структуру. Клетки имели гистологические характеристики жизнеспособных клеток: большое светлое ядро, окруженное аморфной цитоплазмой без разрывов или включений, правильную Форму. В неиммобилизованных Фрагментах, клетки отличались темным конденсированным ядром, разорванной цитоплазмой и другими признаками мертвых клеток. Тканеподобная организация Фрагментов отсутствовала. форма свободных Фрагментов оставалась нерегулярной, края рваными. Кусочки ткани в гранулах, напротив, по мере культивирования приобретали округлцю Форму, края сглаживались. Кроме того, на 5 день культивирования отчетливо становилась видна окружающая каждый Фрагмент однослойная капсула. Иммобилизованные Фрагменты секретировали в 2-3 раза больше тестостерона, чем семенные канальцы в суспензионной культуре (Рис.6). При длительном культивировании в течение 14 дней секреция продолжалась на всем протяжении эксперимента, вместе с тем отмечалось снижение концентрации тестостерона в среде в поздние сроки культивирования по сравнению с началом эксперимента. Таким образом, на основе наших данных и данных литературы можно сделать вывод, что иммобилизация является перспективным способом для организации микроокружения при культивировании Фрагментов тканеа.

нг/мл

1.6 г 1.2 -о.а -

0 -1-1-,-1-1- , I_

О 2 4 6 В 10 12

.время (сутки)

Рис.6. Содержание тестостерона в культу рзлыюй среде иммобилизованных (-*-) и свободно культкультивируемых <-+-) Фрагментов семенных канальцев в одаом эксперименте и ..иммобилизованных Фрагментов в независимом эксперименте (-*-),

Мы рассмотрели влияние полисахаридов на поведение клеток животных как в свободном, так и в иммобилизованном состоянии. Обобщая наш результаты следует сказать, что технология включения в полисахэрвдныэ гранулы кажется йам весьма подходящей для иммобилизации клеток животных именно потому, что полисахариды не являются нейтральными по отношению к клеткам. В результате • дальнейшего , изучения влияния полисахаридов на иммобилизованные * клетки можно будет конструировать гранулы с заранее заданными I свойствами. Можно будет модифицировать как механические характеристики гранул, так и состав полимеров, и создавать оптимальное микроокружение дм клеток. Альгинат не является наиболее активным полисахаридом из тех, которые протестированы. в нашей работе. Такие молекулы как декстран сульфат или гопарии, по ввдимому, могут Сьпгь использованы с большей эффективностью для создания микроокружения дифференцированных клеток. Получение протеогликзяов Непосредственно из тканей животных даст еще более специфический и активный материал, который в перспективе можно использовать для добавления в алытшатные гранулы, в целях оптимизации их состава.

РыТОЛН,

1. Альгинат, используемый в виде геля при иммобилизации клеток, влияет на процессы клеточной пролиферациии и домвренцировки и при добавлении его в виде раствора в среду для их , культивирования. Альгинат блокирует индукцию включения тимидана в первичных культурах фибробластов, стимулированных к делению сывороткой, либо эпидермальным Фактором роста; снижает эффективность клонирования трансформированных Фибробластов; стабилизирует Функции Ферментов дэтоксикации в первичной культуре гепатоцетов.

2. Различные полисахариды, исследованные в работе, в той или иной степени обладают действием на клетки, аналогичным действию альгината, а иногда и превосходящим его.

3. Гибрвдомныа клетки после иммобилизации в гранулы агароэы длительно сохраняют жизнеспособность и секретирукгг моноклональные антитела. При этом они активно синтезируют ДНК, но, в отличиэ от суспензионных культур, их делание нарушается, что приводит к значительному увеличению содержания ДНК в' ядрах иммобилизованных клеток.

4. Иммобилизованные Фрагаэнты семенных канальцев эмбрионов человека в отличиэ от суспензионной культуры при длительном культивировании сохраняют гистотипичэскую структуру и секретирукгг тестостерон.

5. Иммобилизация в гранулы может быть рекомендована для поддеркания Функционирования дифференцированных не делящихся или медяенно делящихся клеток. Клетки, отличающиеся высокой скоростью размножения, болэе целесообразно иммобилизовать в полые капсулы, чем в гранулы.

6. Замена ионов натрия на глюкозу в растворах для иммобилизации улучшает условия образования гранул и увеличивает их прочность, а предложенный штод образования капель с помощь» вибрационного разбивания струи позволяет существенно увеличить производительность установки по иммобилизации клэток.

Список работ, опубликованных ш теш диссертации.

1. Пинаэв Г.П., Кухарева Л.В., Дьяконов и.А., Блинова М.И. Иммобилизация и инкапсуляция культивируемых клеток животных. Сб. "Иммобилизация и инкапсуляция культивируемых клеток", Пущино, 1987. С. 48-56.

2. Кухарева Л.В., Дьяконов И.А., Блинова М.И. Использование водораслевых полисахаридов для иммобилизации клеток животных. Тез. докл. на совещании "Биологически активные вещества при комплексной утилизации гидробионтов". Владивосток, 1987, с. 48-56.

3. Кухарева Л.В., Дьяконов И.А., Блинова М.И., Николаевко Н.С., Пинаев Г.П. Влияние иммобилизации в агарозных гранулах на некоторый свойства культивируемых клеток гибрицомы. Тез. докл. Всесоюзного совещания "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 19»7), Цитология, 1987, Т.29, ».9, C.1090.

4. Кухарева Л.В., Дьяконов И.А., Блинова М.И., Николаеико Н.С., "Пинаев Г.П. Продуцировванио моноклональных антител к

а2-интерФерону человека иммобилизованными метками гибридомы. Сб. "Фундаментальные проблемы биотехнологии", Тарту, 1989, т.2, С.63-88.

5. Кухарева Л.В., Дьяконов И.А,, Блинова М.И., Николаенко Н.С., Пинаев Г.П. Культивирование клеток гибридомы в гранулах агэрозы. ЦИТОЛОГИЯ, Т.32, Н.4, 1990, с.364-370.

6. Diakonov IJL, Guiilouzo А. Influence of various polyeaccarideo on morphology arrl function of adult rat hepatocytee in prymary culture. In: Cellul&r and nolccular basis of liver cirrliosia, Ed: Clement В., Guillouzo A., Parle-Londori, 1091 - p. 227-232

7. Diakonov 1-A_, Suolov D.M. Long-tena survival and production of testosterone by immobilized human testis fragments. Cytotechnolosy* 1992, v.B, p.249-251-

8. Diakonov • Ivan. Adhesion features and cytookeleton structured of hepatocyteo - plated in the preoence of protein-free polysaccharides. Proc. 7tli Int.Conf.Int.Soc. Differentiation, (Не1е1лк1Д992), p35.