Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гипербарической оксигенации на спонтанный и индуцированный мутагенами уровень хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов влимфоцитах периферической крови человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние гипербарической оксигенации на спонтанный и индуцированный мутагенами уровень хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов влимфоцитах периферической крови человека"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

_ „ На правах рукописи

ОГК па

И Ч ¡.Н'.1 Е.) ;и

ДУБЫНИН Петр Тарасович

УДК 616-056.7 + 375.224.4/й

ВЛИЯНИЕ ГИПЕРБАРИЧЕСКОЙ ОКСИГЕНАЦИИ НА СПОНТАННЫЙ И ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНАМИ УРОВЕНЬ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ И СЕСТРИНСКИХ ХРОМАТИДНЫХ ОБМЕНОВ В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.15 — «Генетика»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1996

Работа выполнена в лаборатории математического моделирования генетических процессов Медико-генетического научного центра РАМН.

Научный руководитель — д. м.н., профессор А. Н. Чеботарев.

Официальные оппоненты — д. м. н., профессор А. Д. Дурнев,

д. м. н., профессор Ю. А. Ревазова.

Ведущее учреждение—Институт химической физики РАН.

Защита состоится «. 1996 г. в_£^часов

на заседании Диссертационного совета Д.001.16.01 при МГНЦ РАМН по адресу: г. Москва, 115478, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке центра.

Автореферат разослан « ^ »

1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета д. б. н., профессор

Л. Ф. Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия почти во всех областях практической медицины все более широкое распространение получает метод терапии "гипербарическая оксигенация". Несмотря на хорошие клинические эффекты, литературные данные о влиянии этого вида терапии на хромосомы человека противоречивы и имеют в основном негативный оттенок. Такое отношение генетиков и цитологов к ГБО, вероятно, связано с тем, что действующим фактором этой терапии является чистый кислород или его смеси с инертными газами которыми воздействуют на пациента под давлением превышающим атмосферное. Исходя из данных литературы можно предположить, что такое отношение к кислороду связано с исследованиями из которых следует, что за процессами старения и канцерогенеза лежит деятельность свободных радикалов. И. как считают авторы этих работ, - в большей мере кислородных. С тех пор как появилась эта точка зрения под выражением "свободные радикалы" стали понимать главным образом радикалы кислорода, а сам кислород попал в главные виновники таких реакций, как липидная пероксидация и все последующие за ней события. Так или иначе. ГБО стали относить к факторам, вызывающим такие опасные последствия как рост хромосомных повреждений и трансформация клеток в результате липидной пероксидации. Как следует из обзоров (РПйоу1с11, 1977, 1978,1986, СегиШ, 1985) и ряда других авторов. ГБО один из самых сильных факторов вызывающих такие негативные последствия как: 40%-ное ингибирование клеточного синтеза жизненно важных соединений, образование мутаций, трансформацию и гибель клеток. Однако, если посмотреть .на основании каких данных исследователи пришли к этим выводам, то становится очевидным, что они опирались на <" результаты работ в которых культуры клеток выращивали при высоком содержании.и давлении кислорода в течение нескольких суток и недель. В этих условиях часть клеток погибала, а часть приспосабливалась, но уже имея более высокий уровень хромосомных повреждений и числа самих хромосом. Что касается изучения ГБО на уровне организмов, то исследования, проводившиеся на простейших, растительных объектах, насекомых и млекопитающих, противоречивы

из-за разных условий проведения экспериментов. В нашей стране в восьмидесятые годы в Ростовском медицинском институте, группа Гуськова Е.П. проводила исследования влияния ГБО на грызунах и человеке. Они показали., что эта терапия.является очень опасной с точки зрения образования хромосомных аберраций (увеличение до 80% для человека) (Guskov Е.Р. et al., 1989), но. как признают авторы, это не увязывается с клиническими эффектами ГБО (Гуськов Е.П.. 1989). Однако, если принять во внимание хотя бы' величину создаваемого ими давления (от 0,2 до 0,7 МПа), в барокамере и время обработки кислородом (от 1 до 24 час), то возникают сомнения в окончательных выводах относительно влияния терапевтических режимов которые обычно по фактору давления колеблются от 0,12 до 0,15 МПа и времени воздействия - от 40 минут до 1 часа. К этому следует добавить, также некоторые своеобразия в условиях культивирования и времени фиксации клеток. Все вышеперечисленное, а так же то, что терапия ГБО, благодаря коммерческим отношениям стала доступной не только спецконтингентам, привело к необходимости данного исследования.

Цель и задачи исследования. Целью.данной диссертационной ■ работы было исследование влияния гипербарического кислорода в терапевтических режимах подбиравшихся индивидуально на частоту хромосомных аберраций (ХА) и сестринских хроматидных обменов (СХО) в лимфоцитах периферической крови человека In vivo и In vitro.

Для достижения поставленной цели решали следующие основные задачи:

1. Исследовать влияние терапевтических курсов ГБО на спонтанный уровень ХА и СХО в лимфоцитах периферической крови человека In vivo и In vitro.

2. Изучить влияние терапевтических курсов ГБО на уровень ХА в лимфоцитах человека после воздействия ионизирующей радиацией.

3. Исследовать влияние ГБО на уровень ХА в лимфоцитах периферической крови пациентов, которых лечили цитостатическими препаратами.

4. Выяснить изменения уровня ХА в лимфоцитах человека спустя несколько месяцев после окончания последнего сеанса ГБО.

5. Исследовать модифицирующее действие ГБО In.vivo на частоту ХА при воздействии на лимфоциты мутагеном In vitro.

Научная новизна работы. В результате выполненного исследования установлено, что действие ГБО в режимах 1,2 и 1,5 ата (0,118 и 0.147 МПа) не вызывает образования ХА и СХО в лимфоцитах периферической крови человека. Впервые отмечено, что ГБО в вышеупомянутых терапевтических режимах снижает как спонтанный так и индуцированный мутагенами уровень СХО и ХА в лимфоцитах периферической крови человека. Впервые выявлена специфичность в модификации частот различных типов ХА и, что снижение уровня ХА происходит за счет аберраций хромосомного типа. Установлено, что модифицирующий эффект ГБО более выражен при более высоких начальных уровнях ХЛ. Отмечено также, что ГБО действует на клетки таким образом, что они приобретают способность сопротивляться действию мутагенов.

Теоретическая и практическая значимость работы. ГБО в терапевтических режимах не вызывает образование новых хромосомных аберраций и СХО. В то же время терапия ГБО приводит к снижению их первоначального уровня. А способность ГБО повышать устойчивость клеток к воздействию мутагенами позволяет применять данный метод терапии как протекторное средство перед воздействием мутагенов, так и для уменьшения последствий их действия.

Положения выносимые на защиту.

1) Гипербарическая оксигенацпя в терапевтических режимах от 1,2 до 1,5 ата снижает спонтанные и индуцированные мутагенами уровни ХА и СХО в лимфоцитах периферической крови человека in vivo и in vitro условиях.

2) Снижение уровня хромосомных аберраций происходит вследствие уменьшения числа ХА хромосомного типа, частота ХА хроматидного типа практически не меняется.■

3) Модифицирующее действие ГБО заключается в нормализации репаративной, антиоксидантной и других систем клетки, за счет поступления в нее дополнительного количества нормального физиологического акцептора электронов кислорода.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на заседании научного общества по гипербарической оксигенации во Всероссийском бароцентре (Москва, 1992 г..), на 4 съезде Общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова (Минск, 1992 г.), радио-биологическом съезде (Киев, 1993 г.) и семинаре отдела Медико-генетического научного центра РАМН (Москва 1995 г.).

Публикации. Опубликовано работ 7, из них 4 по теме диссертации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц. Список литературы включает 231 источник.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Гипербарическую оксигенацию проводили в серийных одноместных лечебных барокамерах ОКА-МТ на режимах подбиравшихся индивидуально, а именно по максимальному приросту тканевого р02 в ответ на тот или иной пробный режим (Пахомов В.И. и др., 1988). Давление в камере было от 1.2 до 1.5 ата при содержании кислорода от 96 до 98%. Выбранные режимы исключали дозировки гипербарического кислорода, которые могли бы вызывать кислородную интоксикацию. Пациентов или образцы крови помещали в.барокамеру, после чего ее продували кислородом в течение 10 минут для вытеснения атмосферного воздуха. Далее, после заполнения внутреннего пространства камеры кислородом, в течение 5 минут повышали давление до требуемой величины. Число ежедневных , 40-50-минутных сеансов ГБО составляло от 4 до 15 для разных пациентов.

Исследование проводили на восьми пациентах с различной патологией и четырех практически здоровых добровольца«. Во время прохождения ГБО терапии никто из пациентов, за исключением трех, не подвергался другим процедурам и лечению, которые могли бы вызвать хромосомные изменения. Двое пациентов во время ГБО терапии прошли рентгеновское исследование, а один пациент с диагнозом "центральный рак легкого второй стадии" во время курса ГБО не прекращал принимать цитостатический препарат циклофосфан по, 0,25 г ежедневно. Среди больных были две женщины которые прошли курс радиотерапии по поводу рака молочной железы -одна за 1,5 месяца (2000,рад) до начала ГБО терапии, вторая за два дня (4000 рад) до ГБО.' У двух добровольцев повторно проводили забор крови. У первого - через три месяца, а у второго - через четырнадцать месяцев. Необходимо отметить, что второй доброволец

за этот срок перенес ОРВИ и дважды прошел рентгенологическое обследование грудной клетки.

В исследовании индукции хромосомных аберраций in vitro использовали хорошо изученный цитостатик тиофосфамид, при действии которого происходит преимущественно образование хромосомных аберраций хроматидного типа. Длительность обработки клеток мутагеном на стадии G0 до стимуляции ФГЛ (Dlfco "Р") составляла 1 час. после чего культуру дважды отмывали. Кровь для этого эксперимента брали до начала курса ГБО и после последнего сеанса.

Кровь еще трех добровольцев, не входивших в первую группу, подвергали обработке ГБО in vitro в течение 1 часа при давлении 1, 2 ата.

Методика культивирования исключала применение антибиотиков, а в остальном как и фиксация (на 48 - 50 часах), так и приготовление препаратов были общепринятыми (Hungerford D.А., 1965). ' -

Мутагенный эффект определяли по частоте разрывов хромосомных аберраций. В случае обменных аберраций, таких как, дкцентрикл, кольца, хроматидо-хроматидные обмены и интерстициальные делеции, считали, что обмены происходят в результате двух разрывов (по одному у каждой хромосомы или плеча хромосомы). При образовании свободных парных фрагментов, одиночных фрагментов и изохроматидных разрывов считали, что данные аберрации происходят в результате одного разрыва.

Учитывали следующие типы хромосомных аберрации: 1. Аберрации хромосомного типа: а) внутрихромосомные обмены (ацентрические кольца, кольцевые хромосомы, перицентрические инверсии); б) парные Фрагменты; в) межхромосомные обмены (реципрокные транслокации, полицентрические хромосомы). 2. Аберрации хроматидного типа: а) одиночные фрагменты; б) внутрихроматидные обмены; в) внутрихромосомные межплечевые обмены; г) межхромосомные обмены (хроматидо-хроматидные обмены, хроматидо-изохроматидные обмены). 3. Аберрации изохроматидного типа: с полным или неполным слиянием сестринских хроматид в месте разрыва.

Для выявления сестринских хроматидных обменов применяли свежеприготовленный раствор 5-бромдезоксиуридина (БДУ) в

конечной концентрации 10 мкг/мл. который добавляли на 0 и 60 часах. Исследование СХО проводили отдельно от исследования ХА. Отбор метафазных пластинок, учет и классификация хромосомных аберраций соответствовали общепринятым правилам.

Подсчет СХО проводили в метафазах второго митоза, для которых характерно темное окрашивание одной половины хроматид, и светлое - другой.

В метафазах подсчитывали число СХО по всем 46 хромосомам клетки. В каждом варианте опытов анализировали по 25 клеток.

Всего в работе проанализировано 10327 метафазных пластинок.

Для оценки значимости разницы между различными вариантами экспериментов использовали критерий хи-квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ ■

1. Влияние ГБО на уровень хромосомных аберраций и СХО в лимфоцитах периферической крови человека ln vivo и ln vi tro

Данные табл. 1 характеризуют частоты хромосомных аберраций до и после курса ГБО. В ней приведены как общая частота клеток с хромосомными аберрациями, так и частоты разрывов, приведших к тому или иному типу хромосомных аберраций.

Из представленных данных видно, что статистически значимого изменения частоты разрывов в аберрациях хроматидного типа не наблюдается (Хг = 17,91, df =12, р = 0,88), в то время как частота аберраций хромосомного типа снижается после курса ГБО, в среднем в 2,5 раза (X2 = 53,19, df =12. р = 0,9999998).

В табл. 2 представлены доли аберрантных клеток до и после ГБО терапии. Клетки в таблице распределены по типу присутствующих в них хромосомных аберраций.

Из данных этой таблицы видно, что статистически значимых изменений в количестве аберрантных метафаз содержащих аберрации хроматидного типа (X2 = 18,56, df = 12, р = 0,90) и метафаз, содержащих аберрации обоих типов (Хг = 4,52, df = 12, р = 0,03) ■ не наблюдается. Количество метафаз, содержащих аберрации хромосомного типа уменьшается в среднем в 2 раза (X2 = 24,83, df = 12, р = 0,98).

Частота хромосомных аберраций до!и- после курса

гипербарической оксигенации ■ Таблица 1.

Но- Число Дав- Число Доля Хроматидные Хромосомные

мер сеан- ле- проана- абер- разрывы разрывы

инди- сов ни<\ лизиро- рант--

вида ГБО атм ванных ных Все- На 100 Все- На 100

клеток клеток го клетрк 1г го клеток 1г %

-1-1---Т-1-1-1-П-1-1-1-

1 I 2 I ' 3 > 4 | 5 ! 6 I 7 | 8 I 9 | 10 | И

_1_I_I_I_I_I_:_' '_|

1 0 136 8,82 11 8,09 6 4,41

10 1.2" 300 6.00 16 5,33 1,15 3 1.0 5,28

2 0 174 4,67 5 2,87 4 2,30

7 1.2 300 8,00 21 7,00 3,42 5 1,67 0,23

3 0 300 4,67 8 2,67 9 3.00

10 1,2 300 2,67 3 1,00 2,27 5 1,67 1,14

4 0 206 33,01 75 36.41 66 32,04

13 1,5 54 31,48 25 46.30 1.09 8 14,82 4,46

5 0 300 7.67 14 4.67 19 6.33

5 1,5 300 5,67 15 5,00 0,03 8 2,67 4,48

6 0 300 6,67 13 4,33 10 3.3

9 1,2 300 3,00 9 3,00 0,73 2 0,67 5,33

7 0 300 6,00 И 3,67 15- 5.00

10 1,2 244 2,87 3 1,23 3,11 5 2.05 3,19

8 0 267 21,72 10 3,75 117 43,82

9 1,2 147 18,37 8 5,44 0,62 48 32,70 2,96

Таблица 1. (продолжение)

■ - 1 1 1|2| I 1 3 1 1 4 I I ' 1 1 5 1 1 1 6 | 1 7 1 1 1 |8|9 1 1 1 " " 1 1 10 | 1 1 И |

9 0 300 4.67 4 1,33 12 4,00

15 1.2 450 4.22 15 3,30 2.84 5 1. И 6,63

10 0 300 7,00 11 3,67 14 4,67

13 1.2 300 4,00 7 2,33 0,89 6 2,00 3,20

11 0 134 37,30 12 8.81 135 100.75

5 1.2 144 20,83 7 4.86 1,67 85 59.03 15,29

12 0 300 2.00 5 1.67 3 1,00

4 1.2 300 2. 00 6 2.00 0,09 1 0,33 1. 00

До ГБО 3017 10,31 179 5.93 410 13.59

Всего 17,91 53. 19

После ГБО 3139 6. 15 135 4.30 181 5. 77

Число степеней свободы 12 12

Вероятность 0,88 0.9999998

Частота клеток с хромосомными аберрациями в культурах лимфоцитов больных прошедших лечение гипербарической

оксигенацией - Таблица 2.

Номер Число Коли- Доля Клетки содержащие

инди- сеан- чество абер- хроматидные хромосомные оба типа

вида сов просчи- - рант- аберрации аберрации аберраций

ГБО танных ных % абер. % абер. % абер.

клеток клет. клеток X2 клеток X2 клеток X2

% -

1 1 1 I 1 2 I I 3 I .1 1 1 1 4 I | 1 1 5 I ! 1 6 1 1 1 7 1 I ^ 8 | 1 1 9 | 10 ]

1 0 136 8,82 6, 62 2,21 0

10 300 6,00 5,33 0.27 0,67 2. 01 0

2 0 174 4,67 2,87 1,72 0

7 300 8,00 6,33 2,64 1,67 0. 102 0

3 0 300 4, 67 2,67 2, 00 0

10 300 2, 57 1,00 2, 27 1,67 0, 10 0

4 0 206 33. 01 13. 11 12,62 7,28

13 54 31,48 20,37 1,54 7,40 1, 01 3,70 0,84

5 0 300 7.67 3,33 4,00 0,33

5 300 5,67 3,33 - 2,00 2,00 0,33

6 0 300 6,67 3,67 3,00 0

9 300 3. 00 2,67 0.47 0,33 6,28 0

7 0 300 6, 00 3,00 2, 67 0,33

10 244 2.87 1,23 1,92 1,64 0,65 0 0,83

8 0 267 21,72 2,62 17,98 0,75

9 147 18,37 5.44 1,48 12,93 1,49 0 1,07

Таблица 2. (продолжение)

1 1 1 1 2 1 1 3 1 "1 1 1 4 | | г 1 5 I | 1 ' 1.6 | | 1 1 7 • 1 1 1 8 1 г — 1" 9 ! 1 1 loJ |

9 0 300 4,67 1,33 3,33 0

15 450 4,22 3, и 2,37 1,11 4,45 0 -

10 0 300 7,00 3,33 3,33 0,33

13 300 4,00 2,33 0,53 1,67 1,66 0 0,98

И 0 134 37.30 6,72 28,36 2,24

5 144 2о;вз 1,39 4,96 15.97 4,75 2,78 0.80

12 0 300 2,00 1,32 0.66 0 ■

4 300 2,00 1,65 0, 11 0.33 0,33 0 -

До ГБО 3017 10,31 3,75 5.80 0,76

Всего 18,56 24.83 4.52

После ГБО 3139 6, 15 3,38 2.55 0. 22

Число степеней свободы Вероятность

12

О, 90

12

0. 98

12

0.03

В ходе исследования до начала лечения изучено 3017 метафаз и обнаружено 10,31 % аберрантных, из них 3,75 % составляют клетки с аберрациями хроматидного типа, 5,80 % - клетки с аберрациями хромосомного типа и 0,76 % - клетки, содержащие оба типа аберраций.

После окончания ГБО терапии из 3139 исследованных метафаз аберрантными оказались 6.15 %, доля клеток с хроматидными аберрациями составила 3.38 %, клеток с хромосомными аберрациями -2, 55 % и с обоими типами аберраций - 0,22 %.

Сравнение результатов, полученных до и после ГБО, позволяет сделать заключение, что ГБО терапия приводит к снижению аберраций хромосомного типа, не затрагивая частоту аберраций хроматидного типа.

В табл. 3 представлено среднее число СХО у половины обследованных. Номера индивидов в этой таблице соответствуют таковым табл. 1 и 2. Из данных этой таблицы видно, что снижение

среднего числа СХО отмечено на 60 часу фиксации у всех

обследованных, а на 96 часу у пяти из них. У пациента номер 7 отмечено увеличение этого показателя на 96 часу после терапии -ГБО, но у него отмечено так же самое значительное снижение базового уровня СХО. Снижение разности между средним числом СХО на 60 часу фиксации (базовый уровень) произошло у пяти пациентов. Это указывает на процесс репарации повреждений хромосом, ведущих к СХО, под воздействием ГБО.

Число сестринских хроматидных обменов у больных, прошедших курс гипербарической оксигенации

Таблица 3.

Номер Число Давление Число Среднее число СХО на клетку

инди- сеан- ГБО. клеток

вида сов атм. на 60 96 Разность

ГБО 60 и 96 час. час.

часах /

3 0 1.2 25 и 25 7,36 5,32 2,04

10 25 и 25 6,04 4,08 1.96

6 0 1,2 25 и 25 • 6,72 4,40 2,32

9 25 и 25 6,60 3,40 3,20

7 0 1.2 25 и 25 9,64 4,08 5,56

10 25 и 25 8,44 7,00 1,44

8 0 1,2 25 и 25 9,12 4,64 4,48

9 25 и 25 6, 20 3.52 2,68

9 0 1.2 25 и 25 7,80 5,92 1,88

15 25 и 25 4.24 3,32 0,92

10 0 1.2 25 И 25 8,32 5,52 2,80 13 25 И 25 6.04 4,48 -1,56

В табл. 4 представлены изменения числа хромосомных аберраций до и после обработки образцов крови трех доноров в течение часа. Из таблицы видно, что в двух из трех случаев наблюдается резкое снижение аберраций хромосомного типа после обработки tгипербарическим кислородом. В третьем случае аберрации этого типа отсутствовали в контроле. Снижения аберраций других типов нет.

В табл. 5 показаны частоты аберрантных клеток. В одном случае (донор женщина) отмечено статистически значимое снижение числа клеток с аберрациями хромосомного типа (X2 = 5,551, df = 1, р = 0,38).

Влияние ГБО на хромосомы человека in vitro. Таблица 4.

Но- Число Число Число Доля

Хромосомные разрывы

мер сеан- проа- абер- абер- Хроматидного Хромосомного Изохроматидного

до- сов нал. раций раций типа типа типа

но- ГБО клет. % Все- На X2 Все- На X2 Все- На Xе

ра и го 100 го 100 го 100 и режим кле- кле- клеток

пол ток ток

Контр. 276 24 8,70 14 5.07 9 3,26 4 1,45 1 ГБО 2.44 5,027 0.016

M 1,2ата 154 -5 \ 3,25 3 1.95 0 0 2 1.30

50 мин.

Контр. 152 14 9,20 9 5,90 5 3,30 2 1,32 2 ГБО 1,342 6.816 0,009

Ж 1,2ата 210 10 4,76 7 3,30 0 0 3 1,43

ата

50 мин.

Контр. 217 8 3,69 7 3,23 0 0 2 0,92 3 ГБО 0,630 1,873 1,070

M 1,2ата 116 3 2,59 2 1,72 1 0,86 0 0 50 МИН.

Влияние ГБО на хромосомы человека in vitro (клетки). Таблица 5.

Ном. Чис- Кол. Кол. Клетки содержащие следующие типы аберраций

до- , ло прос- абер-

но- се- чи- рант- Хроматид. Хромосомн. Изохр. Хс+Хд"

ра ан- тан- ных % абер. % абер. % абер. % абер.

и сов ных клет. клеток X* клеток %г клеток У? клеток Хг

пол ГБО клет. и

режим

■ Конт-

1 роль 276 23 4.71 1,81 1,45 0,36

м ГБО 2.05 2,79 0,02 0.67

1.2ата154 5 1.95 0 1.30 0

50 мин.

Конт-

2 роль 152 14 5. 26 2,63 1,32 0

ж ГБО 0,812 5.551 0.008 -

1.2ата210 10 3.33 0 1.43 0

50 мин.

Конт-

роль 217 8 2.76 0 0.92 0

3 ГБО 0, 341 1.873 1.070

м 1,2ата116 3 1.72 0.86 0 0

50 мин.

2. Частота хромосомных аберраций у лиц, подвергшихся воздействию ионизирующих излучений с терапевтическими целями до и во время прохождения курса гипербарической оксигенации

Среди лиц, проходивших курсы ГБО, четыре человека подверглись воздействию ионизирующими излучениями. Две женщины с диагнозом " рак молочной железы" прошли терапевтическое облучение на аппарате " Рокус " с источником Со60 . Облучение проводили в течение пяти дней и суммарные дозы составили в одном случае (8) - 2000 рад, а в другом (И) - 4000 рад. Промежуток от окончания облучения до начала сеансов ГБО у первой составил 1,5 месяца, у второй - 2 дня.

Ещё два человека прошли рентгенологическое исследование грудной клетки во время курса ГБО. Номер 6 - после 7 сеанса, номер 9 - после 10 сеанса.

Кровь для анализа брали перед началом ГБО терапии и через день после последнего сеанса. Полученные данные представлены в табл. 6 и 7.

В табл. 6 представлены частоты разрывов хроматидных и хромосомных типов аберраций. Из этих данных видно, что изменений в количестве аберраций хроматидного типа не наблюдается (X2 = 5,86. df = 4. р = 0,79). Число аберраций хромосомного типа достоверно снизилось в два раза (X2 = 30,21, df = 4, р = 0.9999).

В табл. 7 представлены данные о количестве аберрантных клеток, содержащих только хроматидные или только хромосомные аберрации, а так же клетки, содержащие оба типа аберраций. Как видно в случае клеток с хроматидным и смешанным типом аберраций изменений в их количестве не отмечено. Однако в случае с клетками, содержащими только хромосомные аберрации произошло их достоверное снижение в два раза (X2 = 16,97, df = 4. р = 0,998). Снижение количества клеток с аберрациями видимо связано с большой элиминацией мутантных клеток вследствие воздействия мутагена прямого действия - ионизирующей радиации, вызывающей перегруженность клеток аберрациями. С этим можно связать и снижение количества клеток с аберрациями хромосомного типа в эксперименте In vitro у женщины (табл.5).

Частота хромосомных-'аберраций у лиц, подвергшихся воздействию ионизирующих излучений в терапевтических целях до или во время курса ГБО

Таблица 6.

Но- Число Дав- Число Доля Хроматидные разрывы Хромосомные разрывы мер сеан- ление проа- абер- Всего На 100 Всего На 100

ин- сов в. нал. рант- клеток %г клеток X2

ди- ГБО ата клет. ных ви- клеток

да %

0 роо 6.67 13 4,33 10 3.3

6 1.2 0,73 5,33

9 300 3, 00 9 3, 00 2 0, 67

0 267 21,72 10 3.75 117 43,82

8 1.2 0,62 2,96

9 147 18.37 8 5,44 48 32,70

0 300 4.67 4 1,33 12 4, 00

9 1,2 2,84 6,63

15 450 4,22 15 3,30 5 1, И

0 134 37,30 12 8,81 135 100,75

11 1.2 1.67 15,29

5 144 20, 83 7 4,86 85 59,03

До ГБО 1001 14,19 39 3,90 274 27,37

Всего 5.86 30,21

После ГБО 1041 8,17 39 3,75 140 13,45

Число степеней свободы 4 4

Вероятность 0,79 0,9999

Частота клеток с хромосомными аберрациями у лиц, подвергшихся воздействию ионизирующих излучений в

терапевтических целях до и во время курса ГБО

Таблица 7.

Но- Число Число Доля Клетки содержащие

мер сеап- проа- абер- Хроматидпые Хромосомные 00а типа

ин- сов нал. рант- аберрации аберрации аберраций

ди- ГБО клеток ных % X2 % X2 % Хг

ви- кле- абер. абер. абер.

да ток % клеток клеток клеток

0 300 6,67 3,67 .3,00 0

6 0,47 6.28 -

9 300 3.00 2,67 0,33 0

0 267 21,72 2,62 17,98 0.75

8 « 1,48 1,49 1, 07

9 147 18,37 5,44 12, 93 0

0 300 4,67 1.33 3. 33 0

9 2, 37 4.45 -

15 450 4,22 3, 11 1. И 0

О 134 37, 30 6,72 28,36 2,24

И 4.96 4.75 0,80

5 144 20.83 1, 39 15.97 2.78

До ГБО 1001 14. 19 3,20 10,49 0,49

Всего 9,28 16.97 1,87

После ГБО 1041 8, 17 3, 07 4,71 0,38

Число степеней свободы 4 4 4

Вероятность 0.9455 0, 998 0,24

3. Влияние ГБО на уровни ХА в лимфоцитах периферической крови человека, принимавшего цитостатик циклофосфан до и во время курса ГБО. .

В табл. 8 представлены результаты исследования хромосом в лимфоцитах периферической крови больного с установленным диагнозом "центральный рак легкого второй стадии", который в течение нескольких месяцев до и во время ГБО постоянно принимал цитостатический препарат циклофосфан по 0,25 г в сутки. Для этого препарата характерна способность индуцировать главным образом аберрации хроматидного типа. Здесь также отмечается достоверное снижение ХА хромосомного типа (р = 0,965) и отсутствие достоверных изменений в ХА хроматидного типа. Одновременно (табл. 9) у него не отмечается достоверного снижения количества аберрантных клеток, что вероятно можно объяснить нормализацией репарационных систем и снижением загруженности клеток аберрациями.

Частота хромосомных аберраций до и после ГБО у больного постоянно принимающего циклофосфамид Таблица 8.

Число Число Число Доля Хроматидные разрывы Хромосомные разрывы

сеан- проа- абер- абер- Всего На 100 Всего На 100

сов нали- раций раций клеток X2 клеток X2

ГБО зиров. %

клеток

0 206 101 49.03 75 36,4 66 32,04

1,08 4,46

13 54 • 25 46.30- 25 46,3 8 14,82

Вероятность . 0,70 , 0,965

Частота аберрантных клеток (тот же больной) Таблица 9.

Се- Число Число Доля Клетки содержащие

анс проа- абер. абер. Хроматидные Хромосомные Смешанные

ГБО нали- кле- кле- ' аберрации аберрации аберрации

зиров.ток ток Все- % абер.Х2 Все- % абер.Х2 Все- % абер.Х2

клеток % го клеток го клеток го клеток

0 206 68 33, 01 27 13, 11 26 12,62 15 7,28

1, 54 1,01 0.84

13 54 17 31,48 И 20,37 4 7,40 2 3,70

Вероятность 0, 785 0,685 0,64

4. Исследование уровня ХА в крови добровольцев спустя несколько месяцев после окончания последнего сеанса гипербарической оксигенации

В табл. 10 представлены уровни хромосомных повреждений до начала ГВО, после окончания последнего сеанса и спустя три месяца для первого добровольца и 14 месяцев для второго, который за это время перенес острую респираторную вирусную инфекцию и подвергся рентгенологическому исследованию грудной клетки. Из этой таблицы видно, что статистически значимых изменений в частоте ХА хроматидного типа нет (X2 = 5,815, df = 4, р = 0,79).

В таблице 11 представлены данные о количестве аберрантных клеток до начала ГБО, после окончания последнего сеанса и спустя несколько месяцев. Здесь приведено общее количество аберрантных клеток; число клеток, содержащих только аберрации хроматидного типа; клеток с аберрациями только хромосомного типа и клеток, содержащих оба типа аберраций. Статистически достоверное изменение (снижение) отмечено только для клеток с хромосомными аберрациями (X2 = 10,2, df = 4, р = 0,96).

Частота хромосомных аберраций у добровольцев, прошедших курс ГБО через три и четырнадцать месяцев спустя. Таблица 10.

Номер Момент Число Число Доля Хромосомные разрывы инди- анали- проа- абер- абер- Хроматидные Хромосомные да за нал. раций раций Все- На 100 Все- На 100

клет. % го клеток го клеток

До

ГБО 300 25 8.33 14 4.67 19 6.33

После

1 ГБО Спустя 300 18 6,00 15 5,00 8 2, 67

3 мес. 150 7 4,67 5 3,33 2 1,33

До

ГБО 300 14 4,67 8 2,67 9 3,00

После

2 ГБО Спустя 300 8 2,67 3 1,00 5 1,67

14 мес. 217 8 3,69 9 4,15 0 0

X2 . 5.815 14,95

Число степеней свободы ~ 4 4

Вероятности 0,790 0,995

Таблица 11.

Частота клеток с хромосомными аберрациями у добровольцев, прошедших курс ГБО через три и_ четырнадцать месяцев спустя

Но- Момент Число Число Доля Клетки содержащие

мер ана- проа- абер- абер- Хроматидные Хромосомные Оба типа

ин- лиза нал. рант- рант- аберрации аберрации аберраций

ди- клет. ных ных Все- - % Все- % Все- - %

ви- клет. клет. го абер. го абер. го абер.

дп % кл. кл. кл.

До

ГБО 300 23 7.67 -10 3,33 12 4. 00 1 0,33

После

1 ГБО 300 17 5,67 10 3, 33 6 2.00 1 0.33

Спустя

3 мес. 150 6 4,00 5 3,33 1 0.67 0 0

До

ГБО 300 14 <1. 67 8 2, ел 6 2, 00 0 0

После

2 ГБО 300 8 2,67 3 1. 00 5 1. 67 0 0

Спустя

14 мес. 217 8 3.69 8 3. 69 0 0 0 0

Хг

Число степеней свободы Вероятность

4. 08 4

О, 60

10, 2 4

0.96

5. Влияние ГБО in vivo на способность клеток отвечать на воздействие тиофосфамидом in vitro

Для выяснения того, каким образом ГБО влияет на способность клеток взаимодействовать с мутагеном лимфоциты периферической крови четырех человек обрабатывали тиофосфамидом до начала курса ГБО и после окончания его. Суть и порядок выполнения этого эксперимента описан в разделе "Материалы и методы".

В табл. 12 представлены по две повторности для каждого из четырех индивидов. Из этих данных видно, что клетки лиц, прошедших терапию ГБО реагируют на этот мутаген незначительно, либо совсем не реагируют на него (особенно это заметно в группе, где представлены хромосомные аберрации). Кроме этого можно отметить, что реакция (если под ней понимать снижение числа ХА) тем больше, чем больше был уровень ХА до ГБО. Т.е. с увеличением числа аберраций степень сокращения числа аберраций хромосомного типа увеличивается.

Из табл. 13, где представлены данные о числе клеток с аберрациями того или иного типов, так же видно, что действие тиофосфамида, как и в случае с аберрациями, либо совсем на проявляется, либо проявляется значительно слабее после терапии ГБО. Отсюда можно сделать предположение, что ГБО нормализует метаболизм клеток в целом и, в частности, репаративные и антиоксидантные системы настолько, что в некоторых случаях действие ТиоТэф сводится на нет.

Злияние ГБО на способность лимфоцитов периферической

фови человека реагировать на воздействие тиофосфамидом

In vitro (хромосомные аберрации) Таблица 12.

^ом.Се- Кон- Число Число Хроматидные разрывы Хромосомные разрывы

га- анс цент- проа- абер- На На

ш- ГБО рация нали- раций Всего 100 X2 Всего 100 X2

ни- ТиоТЭФ зиров. . клеток клеток

зида мкг/мл клеток

0 0 300 25 14 4, 67 19 6,33

5 0 300 18 15 5.00 0,03 8 2,67 4,48

0 10 192 33 И 5,-73 31 16, 15

5 10 300 22 15, 5,00 0,118 9 3,00 24,99

0 0 300 ' 7 5 1,67 3 1, 00

4 0 300 6 6 2, 00 0, 091 1 0, 33 1. 00

0 10 187 28 15 8,02 18 9.63

4 10 100 9 7 7. 00 0,089 3 3. 00 3,91

0 0 300 14 4 1.33 12 4. 00

15 0 450 19 15 3, 30 2,84 5 1, 11 6, 63

J 0 10 300 54' И 3,67 45 15,00

15 10 300 21 16 5,30 0,93 6 2. 00 29, 82

0 0 300 22 И 3,67 14 ,4.67

13 0 300 12 7 2,33 0,89 6 2,00 3,20

4 0 10 300 50 20 6,61 33 11,00

13 10 300 15 8 2.61 5, 14 8 2.61 15,24

Влияние ГБО на способность лимфоцитов периферической крови.-'человека реагировать на воздействие " тиофосфамидом in vi tro (аберрантные клетки). Таблица 13.

Но- Се- Кон- Число Абер- Клетки содержащие

мер анс цент- проа- рант- Хроматидные Хромосомные

ин- ГБО рация нали- ные аберрации аберрации

ди- ТиоТЭФ зиров. клетки Все- % ■ Все- %

ви- мкг/мл клет. Все- % го абер. X2 го абер. X2

да го кл. кл.

0 0 300 23 7.67 10 3,33 12 4,00

5 Л .0 300 17 5.67 10 3,33 - 6 2,00 2,00

1 0 10 192 33 17,20 И 5,73 22 11,5

5 10 300 20 6,67 13 4.33 0,47 6 2,00 18,39

о

4

300 300

6 2,00 4 6 2,00 5

1,32

1,65 0,111

0.66

О, 33 0, 333

О 10 187 25 13,40 14 7,49 10 5,35

4 10 100 9 9,00 7 7,00 0,02 2 2,00

1,75

О 15

О' О

300 450

14 19

4,67 4 4,22 14

1,33 3,11

2,37

10 5

3.33 1. И

4,45

О 10 300 54 18.00 И 3,67 15 10 300 21 7.00 18 6.00 1,70

43 14,33 3 1.00 34.63

О

13

О О

300 300

21 7,00 10 12 4,00 7

3,33

2,33 0,53

10 5

3,33 1,67'

1,66

О 10 300 49 16,30 19 6,30 13 10 300 14 4,61 6 2,00

6,71

29 7

9.61

2.33 13,44

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты, полученные в данной работе, показывают, по метод терапии "Гипербарическая оксигенация" в режимах, юдбиравшихся индивидуально для каждого пациента не только 1е вызывает повышение уровня ХА. как это следует из ряда ^следовании (СегыШ Р. Л.. 1985; Гуськов Е. П. и др., 1985, 1989), а наоборот приводит к снижению спонтанных и шдуцировашшх урорней ХА и охо.

Уменьшение числа разрывов хромосом на фоне не изменяющейся юли аберрантных метафаз скорее всего свидетельствует о том, -!то ГБО вызывает восстановление репаративных процессов через юрмализацию метаболизма в целом, в результате чего и происходит /меньшение нагруженности клеток аберрациями. В ряде случаев )тмечается одновременно и снижение числа аберрантных клеток. Но это отмечается только тогда, когда воздействие мутагеном было зчень сильным и прямым, как, например, воздействие ионизирующей радиацией. В этих случаях снижение числа аберрантных клеток можно збъяснить за счет элиминации тех из них, которые не могли быть зосстановлены. Усиление способности клеток противостоять действию мутагенов после ГБО также можно объяснить нормализацией метаболизма и, возможно, еще созданием некоторого резервного [юнда кислорода в липидных частях клетки, который в дальнейшем может использоваться для защиты и восстановления клеточных структур от действия мутагенов, при условии наличия способных с работе органелл гслетки. Таким образом, можно предположить, что юрмализация метаболизма происходит за счет появления в деобхо'димых количествах физиологического акцептора электронов сислорода. который является основным фактором модифицирующего действия ГБО. На это указывают не только представленные дезультаты, но и данные наблюдений за людьми ранее проходившими "БО терапию, а, именно, появление волосяного покрова на руках гациентов много лет назад утративших его и появление окраски юлос у седых пациентов. За всем этим стоят метаболические фоцессы, для которых в качестве акцептора электронов необходим сислород.

ВЫВОДЫ

1. Воздействие лечебного курса, из ежедневных 50-минутных сеансов гипербарической1оксигенации в нетоксических режимах при давлении в камере от 1.2 до 1,5 ата не обладает мутагенным эффектом на хромосомном уровне в лимфоцитах периферической крови человека.

2. После окончания данной терапии отмечено значимое снижение частот спонтанных и индуцированных физическими и химическими факторами хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов.' :

_ 3. Модифицирующий эффект гипербарической оксигенации выражен более значительно при более высоких начальных уровнях хромосомных аберраций в.'лимфоцитах периферической крови человека.

4. Отмечено, что снижение общего числа хромосомных аберраций происходит за счет уменьшения частоты аберраций хромосомного типа Частота аберраций хроматидного типа практически не изменяется.

5. Снижение.хромосомных аберраций.после ГБО происходит в основном без снижения количества аберрантных клеток, т.е. снижается число аберраций на аберрантную клетку.

6. Модифицирующее действие гипербарической оксигенации проявляется как после воздействия мутагенного фактора, так и до воздействия им.

7. Сниженная частота хромосомных аберраций после терапии гипербарической оксигенацией у пациентов наблюдается, по крайней мере, в течение нескольких месяцев.

8. Обнаруженные эффекты гипербарической оксигенации на частоту хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов подтверждают гипотезу о ликвидации кислородной недостаточности в клетках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1). А. Н. Чеботарев, В. И. Пахомов, П. Т. Дубинин, В. И. Платонова, В. А. Маслов, Снижение частоты хромосомных аберраций после курса гипербарической оксигенации. Бюллетень экспер. биологии и медицины, 1991, т. 5, стр. 532 - 534

:). П. Т. Дубинин. Модифицирующее действие гипербарического :ислорода на частоту хромосомных аберраций и сестринских :роматидных обменов в лимфоцитах периферической крови человека, [атериалы 4 съезда Общества генетиков и селекционеров [м. Н. И. Вавилова. Минск, 23 - 27 ноября. 1992, том 1. стр. 114.

I

!). А. Н. Чеботарев. В. И. Пахомов, П. Т. Дубынин, ¡. И. Платонова, В. А. Маслов. Модифицирующее действие чшербарического кислорода на частоту хромосомных аберраций и :естринских хроматидных обменов в лимфоцитах периферической крови 1еловека. Сборник "Теоретические и прикладные проблемы шдицинской генетики", Москва, 1993, выпуск 1, стр. 72 - 85.

О. П. Т. Дубынин, А. Н. Чеботарев. Снижение терапевтическими сурсами гипербарической оксигенации частоты хромосомных аберраций I сестринских хроматидных обменов в лимфоцитах пациентов, юдвергшихся ионизирующему излучению и воздействию цитостатиками. Гез. докл. радио-биологического съезда, Киев, 20 - 25 сентября, 1993, том 1. стр. 325.

Тим. «Нефтяник». _3ак." /С? Тир ЛОГ