Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние генетической модификации на онтогенетическое развитие карпа (CYPRIHUS CARPIO LIHNEAUS)

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние генетической модификации на онтогенетическое развитие карпа (CYPRIHUS CARPIO LIHNEAUS)"

Г б сл

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

Шан Лицзюсть

575.113:597.5:597.553.2

ВЛИЯНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ НА ОНТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗВИТИЕ КАРПА (CYPRINUS CARPIO LIHNEAUS)

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре эмбриологии биологического фа] тета Московского государственного университета име! М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Голиченков В.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических науй , профессор Зеленин А.Б. кандидат биологических наук Белова Н.В.

Ведущее учреждение - Институт биологии развития АН СССР ик Н.К.Кольцова

нии специализированного совета д.uod.ua.ь« при московском госу дарственном университете им. М.Б.Ломоносова по адресу: 11989 Москва, ГСП-3, В-234, Ленинские горы, МГУ, Биологический факуль тет. М!

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологичес кого факультета Московского государственного университета.

Автореферат разослан "&6 " . 1994 г.

Защита состоится

заседа

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Калистратова Е.Н

Актуальность проблемы. Развитие молекулярной генетики сде-ло возможным конструирование специальных нуклеотидных последо-тельностей, состоящих из функционально завершенных блоков, яючающих сигналы управления транскрипцией и собственно гены и их кДНК-копии (Щелкунов.1987). Использование техники реком-нации фрагментов ДНК позволило создать конструкции, обладающие особностью встраиваться в геном организмов любых систематичес-х групп и там нормально экспрессироваться (Горман. 1988). Тем мым была открыта возможность клонировать отдельные гены и ис-льзовать их для генетической трансформации про- или эукариоти-зких клеток, а также многоклеточных организмов (Jaenlsch, 38). В настоящее время их принято называть генетически модифи-рованными организмами (ГМО).

Новая область естествознания, получившая название генети-зкой инженерии, привлекла к себе внимание биологов не только тому, что с ее помощью стало возможно получать животных с та-ш признаками, которых ранее у них не было, но и в силу того, з инсерция трансгена в хромосомную ДНК представляет собой ввейте в геном информации, написанной на том языке, который гено-понятен. и следовательно, ответ на интеграцию новых фрагмен-з ДНК будет с его стороны адекватен. Надо полагать, изучение жций генома, особенно в плане его онтогенетического раскры-я, получит значительный толчок благодаря развитию генной инже-зии.

Начало эпохи трансгенных животных может быть датировано 12 г. Именно тогда Пальмитер и Бринстер опубликовали первые зультаты по введению с помощью микроинъекций гена гормона рос-человека в пронуклеус и цитоплазму зигот мыш (Palmiter. .nster. 1982)

Уже через 2-3 года практически одновременно в разных )анах внимание исследователей было обращено к рыбам (Maclean, iwer, 1984; Rokkones. et al.,1985; Chourrout, et al. ,1986). )бенности биологии развития - большое число созревающих прак-гески одновременно яйцеклеток, наружное оплодотворение, отно-:ельной короткий период эмбрионального развития, проходящего шостью в контролируемых и доступных для наблюдения условиях, )бычайно широкие возможности по клонированию, получению гете-шоидных жизнеспособных потомков, пол которых можно переопре-

делять гормональными воздействиями, а также высокая хозяйственная значимость и доступность,- сделали рыб самым перспективным объектом генетической инженерии и прекрасной моделью для биотехнологии, сельского хозяйства и медицины (Lewis, 1988; Maclean, 1989).

Генетическая модификация высших эукариотических организмов, за исключением некоторых специальных случаев, выполняется на стадии зрелого оплодотворенного яйца. Поэтому весь эмбриогенез протекает под влиянием трансгена, который в этот период может пребывать в разных состояниях: эписомном, ассоциированном и интегрированном. Понятно, что как его присутствие, так и возможная экспрессия могут влиять на ход нормального развития. Кроме того, сами генноинженерные манипуляции часто являются причиной появления уродств и аномалий развития, нередко приводящих к летальному исходу (Мерфи, Хэнсон. 1989; Capecchi et al.,1989; Chen, Powers,1990}. Нормальное эмбриональное развитие рыб исследовано достаточно полно (Игнатьева Т. И.,1975,1985.; Павлов Д.А., 1990, Малюкина А.П. и мн.др.). Данные же о влиянии на него процессов генетической трансформации появились лишь в последнее время.

Цель и задачи исследования, иель настоящей работы состояла в том. чтобы получить трансгенных карпов путем микроинъекций растворов рекомбинантной ДНК. исследовать применимость метода импрегнации спермиев этими же растворами с последующим использованием их в качестве носителей ("живых" векторов) чужеродной ДНК при оплодотворении интактных яйцеклеток, а также определить влияние этих методов генетической модификации на общие параметры эмбрионального развития карпа. Кроме того, в лабораторных условиях предстояло более полно исследовать эмбриональное развитие данио (Danio rerio) и модернизировать методику использования его яйцеклеток для микроинъекций, что объясняется большой значимостью этого вида аквариумных рыб в проведении модельных экспериментов. Достижение указанной цели связывалось с решением следующих задач:

1. Исследовать корреляцию между ядерным и клеточным циклами в раннем эмбриогенезе данио и карпа, уточнить значения т0 для развития в температурном оптимуме, выполнить сравнительный анализ продолжительности клеточных циклов у контрольных и трансформированных эмбрионов.

2. Изучить характер и динамику связывания ДНК со спермиями карпа в зависимости от экспозиции, в присутствии ДМСО и некоторых полиэлектролитов.

3. Разработать среду для культивирования эмбрионов данио, ферментативно или хирургически лишенных внешних яйцевых оболочек. и выполнить с использованием этой среды микроинъекции.

4. Провести эксперименты по микроинъекционному введению растворов ДНК (рекомбинантные зекторы интеграции, несущие гены гормона роста - быка и белого толстолобика) в бластодиск оплодотворенных яйцеклеток карпа.

5. Выполнить эксперименты по оплодотворению яйцеклеток карпа спермой, импрегнированной ДКК, и исследовать эффективность ее переноса по экспрессии гена ß-галактозидазы.

6. Получить образцы тканей презумптивно трансгенных особеГ карпа и провести их исследование с помощью PCR и блот-г:*??идкэо--ции по Саузерну.

7. Классифицировать аномалии развития и уродства у трансгенных эмбрионов карпа.

Решение этих задач дает новый материал для создания аналитических основ в изучении генетически модифицированных организмов, расширяет методическую базу исследований, позволяет более полно и точно охарактеризовать процессы, происходящие в ранний период развития трансгенных рыб, новых, по сути, биологических существ, созданных в лабораторных условиях.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на семинарах~кафедры эмбриологии, представлены на Y Международном Симпозиуме по генетике в аквакультуре (июнь 1994, Галифакс, Канада), I Международном Симпозиуме по полноцикличному рыбоводству (август 1994, Осло, Норвегия), Всероссийской конференции "Новые направления в биотехнологии" (май 1994, Пущино-на-Оке, Россия), Всероссийского съезда Вавиловского Общества генетиков и селекционеров (декабрь 1994, Саратов. Россия) и в статье (Онтогенез, том 26, N2, в печати).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, объектов и методов исследования. изложения результатов, их обсуждения и выводов. Завершается диссертация списком использованной литературы. Работа изложена на 110 страницах, вклэчает в себя 12 таблиц, ^рисунков. В библиографическое описание включено 125"названий.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в течение экспериментальных сезонов 1992 - 1994 г.г. на кафедре эмбриологии биологического факультета МГУ и Всероссийском НИИ прудового рыбного хозяйства (ВНИ-ИПРХ).

Обработка полученных данных выполнялась с привлечением методов вариационной статистики. Молекулярно-биологический анализ выполнялся в Институте молекулярной биологии им В.А.Энгельгардта РАН, Институте физико-химической биологии им А.Н.Белозерского и в Венском Университете.

Объект исследований: Основным объектом исследования служили развивающиеся эмбрионы карпа (Cyprinus carpió L.). Икру и сперму получали сцеживанием у предварительно наркотизированных хиналь-дином самок 3 - 5-летнего возраста и 2 - 4-летних самцов. Партии икры от отдельных самок оплодотворяли смесью предварительно тес-тированой спермы т.н. сухим способом и инкубировали при комнатной температуре. В некоторых экспериментах модельного характера использовали яйцеклетки данио (Danio rerio). Производителей да-нио содержали в аквариальной. Использовали естественно созревавших самцов и самок, которых в ночь перед экспериментом ссаживали в нерестовый аквариум в отдельные секции сетчатого садка. Синхронизации созревания производителей добивались путем поддержания специально подобранных температурных и световых режимов по методу Вестерфильда (Westerfield, 1991). Оплодотворение икринок производили In vitro, что позволяло получать эмбрионы с точно датированным биологическим возрастом.

Методы исследований

Определение длительности митотческих циклов.

Закладка (хождение) борозд первых делений дробления у ранних эмбрионов костистых рыб ведет к разделению бластодиска на частично обособленные бластомеры, связанные между собой периб-ластической зоной свободной цитоплазмы. Первые три деления обычно следуют одно за другим с почти равными интервалами времени, и используются для вычисления длительности митотического цикла, совпадающего в этот период с полусуммой интервалов между закладкой II и IY борозд. Измеренная, как было указанно выше, длительность митотического цикла, принятая за единицу, получила наименование т0 (ДетлафТ.А., ДетлафА. А., 1960). Ее использование

бенно удобно в раннем эмбриогенезе, до начала десинхронизации точных циклов. Поскольку микроинъекции выполняются именно в т период, то конкретизация моментов, наиболее благоприятных введения чужеродных молекул ДНК, и сопряжение их с соответс-1зщим числом т0, в значительной степени облегчает стандартиза-> процедуры и облегчает сопоставление результатов. Собственно шчину 10 определяли как прижизненно (под визуальным контро-0, так и на гистологических препаратах. Последние изготавли-ти из материала, фиксированного жидкостью Бродского или Карнуа зез каждые 0,1 (карп) или 0,3 (данио) т0. После соответствую-

I проводки зародышей заливали в парафин. Серийные срезы толщи-3 5-7 мкм изготавливали на микротоме "Ее^аП-Лиад" и переноли на предметные стекла. Готовые препараты окрашивали гематок-лином по Караччи и заключали в бальзам.

Определение способности опершее связывать ЛНК из растворов. Для экспериментов использовали образцы свежеполученной спер-от самцов 2-4-летнего возраста с содержанием клеток не менее

II на 1 мл. Физиологическую активность сперматозоидов контро-ровали разведением в дистиллированной воде и определяли общую (ассовую) подвижность, а также время сохранения поступательного дакения у приблизительно 50% исходно активных спермиев.

С тем, чтобы снизить влияние компонентов семенной плазмы на юцесс связывания ДНК, образцы спермы (0.2 мл) разводили пяти-эатным объемом р-ра Гольтфреттера тройкой концентрации (ЗхГ) ш О, 9% р-ра ИаС1 и в течение 1-2 мин центрифугировали при 2 ¿с. оборотов (ОПН-8). Надосадочную жидкость отбирали чистой пи-эткой, а осадок ресуспендироваж и повторяли процедуру отмывки.

Отмытые спермин обрабатывал;: раствора:-:;:, г:сб?зз=:»зи меченую по 32Р ДНК спермы лосося в виде фрагментов длиной 3-5 тпн концентрации 50 мкг/мл. Связывание ДНК определяли по остаточ-ой радиоактивности в пробе после двухкратной отмывки, йсследо-али влияние на этот процесс продолжительности коинкубации спер-:иев с ДНК и присутствия в растворе ДМСО в концентрации 5,10,15%. Среда для культивированая- эмбрионов дата Лабораторные исследования в различных областях биологии >азвития с использованием данио становятся в последние годы все юлее популярными. В нашей работе мы также использовали этот збъект для отработки методики микроинъекций в оплодотворенные зйпэклетки растворов рекомбннантных векторных конструкций с

целью получения трансгенных особей. Учитывая отсутствие естественной клейкости у икринок и сложности манипулирования с ранними зародышами с применением микроприсосок, мы предприняли попытку создания вязкой инертной среды, обладающей высокой газопроницаемостью и совместимостью с большинством используемых в практике подобного рода работ ионов, обычно входящих в состав физиологических растворов. Применимость различных композиций оценивали по следующим параметрам:

- механическая связанность целых икринок и дехорионизиро-ванных эмбрионов, допускающая микрохирургические процедуры;

- топологическая правильность дробления;

- отсутствие нарушений бластуляции и гаструляции;

- выживаемость эмбрионов до стадии выклева:

- частота аномалий развития.

В результате проведенных исследований выбор был сделан в пользу растворов метилцеллюлозы средней молекулярной длины и вязкостью (по 2% р-ру) около 400 сП. Наиболее подходящими оказались растворы, содержащие 0,5 - 0,1% метилцеллюлозы на 0,5хГ для дехорионизированных эмбрионов и на 0,3% NaCl для интактных. В растворах указанного состава эмбриональное развитие данио проходило без особенностей, в отсутствие достоверных по отношению к контролю отклонений от нормы. Благодаря высокой вязкости раствора, целые икринки и эмбрионы, лишенные оболочек, сохраняли ту ориентацию, которую им придавали с помощью микроинструментов, не выскальзывали из под микропипетки при ее введении в бластодиск и не тянулись за ней в процессе выведения.

Рекомбинаклшые векторные конструкции

В работе использовали четыре конструкции: pRSV-bGH-att, pmMTl-bGH-att, pESV-lacZ и prtMTa-scGH. Первые три конструкции созданы в Институте молекулярной биологии им. В. А.Знгельгардта А.Б.Жадановым. Две из них включали полноразмерный хромосомный ген гормона роста крупного рогатого скота (bGH) с собственной трейлерной последовательностью. С 5' конца конструкции были дополнены DCR-подобным районом (att) из а-глобинового домена кур, содержащим сайт гиперчувствительноста к ДНКазе 1, два участка прикрепления к ядерному матриксу (MAR),сайт инициации репликации клеточной ДНК. Различались эти конструкции промоторно-энхансер-ной областью: в первом случае был использован фрагмент индуци-бельного"металлотионеинового гена мыши 1 (mMTl). а во втором -

мотор из ранней области генома вируса саркомы Рауса (RSV). тья конструкция, использовавшаяся наш в качестве репортер, включала в себя ген р-галактозидазы (lacZ) под контролем мотора RSV.

В конструкции prtMTa-scGH, предоставленной для эксперимен-проф. Г.Брэмом (Венский Университет, Австрия), ген гормона та белого толстолобика (scGH) находился под контролем промо-а и энхансера металлотионеиновсго гена "а" радужной форели МТа). Таким образом, в случае получения трансгенных особей па предоставлялась возможность сравнения эффективности разных промоторов, а также отдаленнородственного (bGH) и близко-.ственного (scGH) соматотропинов.

Микроинъекции растворов рекомбинантнъа конструкций в опло-1воренные яйцеклетки карпа.

Генетическая модификация карпа представляла большой интерес двум причинам: во-первых, карп - один из основных объектов ;сийской аквакультуры и прудового рыбоводства, является также Енейшим объектом аквакультуры Китая, где благодаря климатичес-[ условиям возможно круглогодичное его выращивание и быстрое ¡учение половозрелых особей, что делает карпа удобной моделью [ многих видов лабораторных исследований. Во-зторых, в отличие данио, карп дает возможность получения больших количеств га-1 от единичных производителей, что очень важно при выполнении 1Внительного анализа результатов экспериментальных воздейс-гй, а также при разработке новых методов, например, использо-¡ия сперматозоидов в качестве носителей чужеродной ДНК.

Микроинъекции выполняли с помощью микропипеток, собственно-изготовления через микродозатор, собранный на базе микрошпри-фирмы Hamilton. Его поршень был соединен с шаговым двигателем зференциальным микрометрическим винтом. Электронный блок уп-¡ления позволял установить необходимую скорость автоматическо-продвижения поршня, ускоренного перемещения и разовых пусков, дай из которых перемещал поршень на 5 мкм. В зависимости от Зема микрошприца, объем однократной дозы мог быть установлен в эделах 1 - 10 нл. Яйцеклетки карпа после контакта с водой прилетают значительную клейкость и могут прочно прикрепляться к 5ым гидрофильным поверхностям. Благодаря этому отпадает необ-шмость в их специальной иммобилизации в период выполнения фоинъекций. Яйцеклетки после смешения со спермой, предвари-

тельно разбавленной экстендером в соотношении 1:3, с помощью акрилового шприца-диспенсера по одной наносили на дно стеклянно] чашки Петри рядами (десять рядов по десять икринок в каждом), отмечали маркером начало первого ряда, и, осторожно прилив воду, активировали яйцеклетки. Все остальные процедуры выполняли« в обычным порядке. Начало микроиньекций соответствовало 0,3 т0 ; момента активации, окончание - 3,5 -с0. В протокол заносилис; сведения о геометрическом месте инъекции, времени, дозе и ви» рекомбинантной конструкции.

Использование спершее в качестве переносчиков ДНК В этих экспериментах для обработки сперматозоидов карпа < последующим оплодотворением ими яйцеклеток применялась конструкция pRSV-lacZ. После предварительной отмывки и мягкого центрифугирования осевшие сперматозоиды быстро ресуспендировали в растворе, содержащем 130 мМ NaCl, 10 мМ СаС12, 100 мг ДМСО и 50 мю ДНК вышеназванной конструкции в одном мл. Процедура выполняла« при комнатной температуре, но через 5 минут после ресуспендиро-вания образец помещали в смесь вода со льдом (t °С = 0) на 1 минуту, затем еще на 1 минуту в водяную баню +40 °С, после чегс разводили 1:3 дистиллированной водой и сразу же приливали полученный раствор к подготовленным заранее яйцеклеткам. Через 1 минуту взвесь сперматозоидов отмывали от яйцеклеток и оставляли ю набухать в чистой воде. Эффективность переноса pRSV-lacZ определяли гистохимически, по окрашиванию гомогенатов тканей постличинок (после резорбции желтка) в присутствии субстрата XGal. Молекулярно-биологический и феношпический анализ Образцы крови (100 мкл), полученные из хвостовой вены, ил> фрагменты плавников (100 мг) диспергировали в 700 мкл лизирующе-го буфера с последующим внесением протеиназы К в конечной концентрации 100 мкг/мл. Выделение-ДНК выполняли хлороформ-феноль-ной экстракцией, и после очистки хранили под спиртом. Перед использованием растворяли в ТЕ буфере. Анализировали ДНК подопытных и контрольных животных методом PCR, с последующей блот-гиб-ридизацией положительных образцов по Саузерну. Праймеры для выполнения PCR к bGH и фрагменту att , синтезированы Г.Дворянчико-вым, к scGH - сотрудниками лаборатории проф. Г. Брэма.

Во время взятия образцов выполняли индивидуальное мечение рыб порционовыми красителями или навесными метками. Рыб измеряла и взвешивали с тем чтобы проследить динамику изменения массы.

- 9 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Длительность митотического цикла у ранних эмбрионов да-шо (рис. 1а) определяли как макроморфологически (по закладке зорозд дробления), так и на гистологических препаратах. Индивидуальные особенности самих зародышей и отдельных.. кладок икры имеют следствием дисперсию этого параметра. В связи с чем представить некую усредненную размерность х0 можно лишь на основании статистических данных. Эмпирически значение х0 было найдено у групп зародышей в интервале температур от 22,5 °С до 31,0 °С. После обработки методом наименьших квадратов получили функциональную зависимость длительности первых митотических циклов от температуры.

Наибольший интерес для нашей работы представляла детализация картины кариокинеза от момента активации яйца до образования четырех бластомеров. Поэтому, зная уже общую зависимость т0 от температуры, гистологический контроль был выполнен только для одной - оптимальной для развития - температуры: 28,5 °С.

Обзор гистологических препаратов позволил, с одной стороны, • убедиться, чтг легко идентифицируемые одноименные стадии митоза (метафаза I и II) отстоят друг от друга на ту же величину, что и закладка соответствуювдх борозд (около 15 мин), а с другой, что уже второе деление дробления мо.?:ет происходить с некоторым расхождением в фазах преобразования сестринских ядер, увеличивающимся с каждым последующим циклом.

Формирование пронуклеусов и их сближение происходит в течение 1,0 - 1,3 т0. Контакт и последующее слияние наблюдаются в период от 1,3 до 1,6 т0, вслед за чем, после относительно короткой профазы, уже к 2,0 т„ наблюдается метафаза, а еще через 0,3 т0 анафаза-телофаза. К моменту перехода в интерфазу-раннюю профазу формируются ядра с хорошо очерченными оболочкой границами, и начинается цитотомия (2,5 - 2,6 т0). Второе деление ядер происходит в течение одного т„, и соответственно, к 3,0 т0 на срезах вновь наблюдается метафаза. Следует отметить, что при этом могут быть обнаружены картины как поздней профазы, так и ранней анафазы, что справедливо и для момента появления метафазных хромосом в период достижения биологического возраста 4,0 т0.

II. Определение длительности митотического цикла у ранних зародышей карпа выполняли аналогичным образом (рис.16), но с более высокой дробностью фиксации проб (0,1 т0), т.к. по данным Игнатьевой (Игнатьева Г.К.,1974) завершение преобразований ядра

Рис.1. Графическая зависимость продолжительности одного ми-тотического цикла (т0) в период первых делений дробления от температуры у карпа (а) и данио (Ь). Ео оси X - температура б градусах Цельсия, по оси 71 - продолжительность т0 в минутах для карпа, по оси У2 - то же для данио.

готы и первое деление дробления протекают у карпа несколько ютрее, чем у многих других видов рыб. Некоторые, наиболее ин-¡ресные для нас события, начиная с момента оплодотворения, для 1брионов, развивавшихся при температуре 20 °С, соответствуют юдующим точкам временной шкалы: 0,2 т, - zona radíala на ани-шьном полюсе образует купол, под которым формируется периви-зллиновое пространство, спермий сливается с мембраной яйца; 0,2 0,3 т, - завершается второе деление мейоза, образуется второе шравительное тельце; 0,4 - 0, 7 i0 - преобразование материнско-з ядра в пронуклеус, окруженный радиальной лучистостью, разрых-зние хроматина ядра спермия, потеря им четких очертаний; 0,7 -,0 т0 - сформированы оба пронуклеуса, начинается из сближение; ,1 - 1,3 т0 - контакт и слияние пронуклеусов, увеличение конт-астной структурированности ядра зиготы, соответствующее началу пирализации хромосом; 1,4 - 1,5 т0- образование веретена, про-аза и прометафаза; 1,6 т0- метафаза; 1,7 - 1,9 t0 - завершение ервого митотического цикла, анафаза и телофаза; 2,0 i0 - обра-ование интерфазного ядра, и 2,1 - 2,2 х, цитотомия. Препараты, ' олученные в более поздние сроки, позволили буявитъ метафазу торого и третьего делений ядер. Как и следовало ожидать, они бнаруживались к 2,6 ± 0,1 и 3,7 t 0,2 т0.

III. Связывание спермиями ДНК из ее растворов показано для ;ногих животных, в том числе и для рыб (Bracket et al.1971, :astro et al. 1990, Horan et al. 1991). Этот факт послужил отп->авной точкой для разработки метода использования живых спермиев i качестве переносчика рекомбинаягных конструкций в яйцеклетки в гроцессе оплодотворения (Arezzo, 1989, Lavltrano et al. 1989,91) 1олученные авторами результаты оказались весьма противоречивыми, 1То в значительной степени скомпрометировало этот метод в глазах ^следователей. Однако низкую воспроизводимость опытов можно объяснить многими причинами, в том числе слабой изученностью ме-<анизмов связывания ДНК со сперматозоидами, нестандартностью выполнения процедур, видоспещфическими различиями и многими другими факторами. Сперматозоиды рыб могут быть в этом отношении эчень удобной модельной-системой, имеющей в случае успеха прямой выход в практику. В предварительных экспериментах с фрагментиро-ванной ДНК спермы лосося подбирали условия, обеспечивающие более эффективное ее связывание со спермиями карпа. Так, удалось показать. что без дополнительной обработки остаточная радиоактив-

ность пробы достигает плато (насыщение) через 15 минут коинкуба-ции, но легко понижается последовательными отмывками. Присутствие в пробе ДМСО в количестве 5, 10 и 15%% увеличивает эффективность связывания почти в два раза, но последняя из указанных концентраций отрицательно влияет на фертильность спермы. Дополнительным приемом, повышавшим количество связанной ДНК, служил кратковременный двунаправленный термический шок: охлаждение смеси спермы с ДНК на 20 °С с последующим нагревом на 40 0С и' возвратом к исходной - комнатной (20 °С). В совокупности, с помощью перечисленных выше воздействий, удалось повысить связывание спермиями ДНК из раствора в три раза относительно исходных значений.

В экспериментах с конструкцией pRSV-lacZ осеменение подготовленной группы яйцеклеток выполняли спермой непосредственно после ее обработки без дополнительной отмывки, так как жизнеспособность спермиев после термического шока падает до нуля в течение нескольких минут. Всего было использовано 600 яйцеклеток, из которых оплодотворение и дальнейшее нормальное эмбриональное развитие отмечено у 230. Через неделю после вылупления 60 постличинок перешедших на активное внешнее питание было использовано для гистохимического определения экспрессии трансгена по реакции с XGal - искусственным субстратом для (5-галактозидазы. Только у 4 из 60 исследованных объектов интенсивность окрашивания пробы была сравнима с заведомо отрицательным контролем, тогда как у остальных 56 значительно превосходила таковую (-lgE = 0,47-1,39, Xmax = 480 нм). Таким образом, свыше 90% от исследованной молоди карпа продемонстрировали наличие и экспрессию трансгена в их организме. Учитывая, что полученные результаты могут отражать различные состояния трансгена, а, соответственно, экспрессия может иметь транзиентный характер, еще 44 особи были проанализированы в возрасте годовика. Свежие мазки периферической крови фиксировали в 2,0% глютаровом альдегиде, отмывали в PBS, подвергали преинкубации в смеси ферроцианидов калия на PBS в присутствии Triton Х-100, а затем проводили реакцию с XGal, который добавляли до конечной концентрации 400 мкг/мл. Стекла просматривали под микроскопом, отмечая окраску клеток белой крови и сравнивали с контролем. Параллельно 100 мкл крови от каждой особи использовали для выделения ДНК, как это было описано в разделе "Материалы и методы". Тщательный просмотр мазков крови позволил в 7 сучаях

тко идентифицировать рыб, в лимфоцитах и лейкоцитах которых ределялось голубовато-зеленое окрашивание. В основном, оно бы-диффузным, но в некоторых клетках отмечалась цитоплазматичес-я зернистость. Точная идентификация клеток не производилась, к как дополнительное окрашивание мазков сопровождается маски-щим эффектом. Блот-гибридизация ДНК из проб, положительных по сту на присутствие 0-галактозидазы, позволила детектировать мплиментарное связывание меченных дигоксигенином зондов в 6 из случаев, что можно рассматривать, как указание на возможную .теграцию трансгена.

IY. Яйцеклетки данио, оплодотворенные in vitro, использова-[ в экспериментах по микроинъекционному введению красителей юрционовый красный, Procion red M4RS) в недробящийся бласто-tcK, в один из двух, четырех или восьми бластомеров. Порционо-й красный хорошо диффундирует внутри цитоплазмы, но не прони-1ет через клеточную мембрану. Поэтому, его распределение в ран-IX зародышах может служить показателем наличия вдтоплазматичес-зй связей между отдельными бластомераки. Исходя из данных по зеобразованию ядра в первые циклы дробления, наиболее удачным зриодом для микроинъекций является возраст зародыша до 1,0 -3 г0. Именно этому периоду соответствует фаза S1, когда проис-здит редупликация геномной ДНК и высока вероятность включения в зб чужеродных фрагментов. Второй такой период будет иметь место поздней телофазе - интерфазе. Но, учитывая тот факт, что на гот период хромосомы оказываются заключенными в ядро, микроинъ-щии следует выполнять в период, соответствующий анафазе, т.е. эжду 2,0 и 2,3 т0. Тогда благодаря высокой концентрации векторах молекул в цитоплазме часть из них окажется вовлеченной в реду формирующегося ядра и будет способна взаимодействовать с озяйской ДНК. Очевидно, такие периоды будут повторяться в каж-ом клеточном цикле. Однако, вероятность интеграции трансгена ри этом будет снижаться, а вероятность получения мозаиков увенчиваться. Существенную роль при этом будет играть равномер-ость распределения инъецированного материала между бластомера-и. Инъекции растворов красителей показали, что прохождение пер-ой борозды не препятствует их "перетеканию" из одного бластоме-а в другой, инъекции в один из четырех бластомеров также допус-имы, поскольку интенсивность их окрашивания практически вырав-ивается в течение менее чем 1,0 т0, при этом вначале прокраши-

вается бластомер первой степени родства, а затем бластомеры второй степени. Инъекции в один из 8 бластомеров не сопровождаются равномерным распределением красителя: он проникает в бластомеры первой, частично, второй, и лишь в следовых количествах - третьей степени родства. Таким образом, учитывая более высокую подвижность красителя по сравнению с высокомолекулярными молекулами ДНК. инъекции растворов последней можно выполнять до достижения зародышами биологического возраста 3,3 i0, т.е. до закладки второй борозды дробления. Согласно результатам этих, предварительных экспериментов мы провели серии инъекций растворов конструкции pRSV-bGH-att в периоды 0,3-1,3, 2,0 - 2,3 и 3,0 - 3,3 т0. В каждой- серии было проинъецировано по 20 икринок: {20+(10+10)+(10+10)]. Двухнедельная молодь из этих партий (16+12+13) была проанализирована с помощью PCR. Положительные образцы были обнаружены в каждой из серий, но только в первой был наименьшим отход (4+8+7), наименьшим число уродств (2+4+4), и наибольшим - число положительных по PCR-тесту особей (5+2+1).

Y. Микроинъекции в оплодотворенные яйцеклетки карпа выполняли с учетом данных, полученных на данио и с учетом данных цитологического контроля. Всего было проинъецировано свыше 3 ООО яйцеклеток в периоды, соответствующие 0,7 - 1,1 и 1,7 - 2.0 t0. Данные по использованным в экспериментах конструкциям, выживаемости эмбрионов, полученным личинкам и сеголеткам приведены в табл. 1.

Из этих данных, в частности видно, что постинъекционная гибель эмбрионов невысока, т.е. выбранные параметры процедуры микроинъекций не является травматичными. Частота аномалий развития и гибели эмбрионов в эмбриогенезе наивысшая при использовании prtMTa-scGH в кольцевой форме (в дальнейших экспериментах не использовалась), далее pRSV-bGH-att и, наконец, pmMtl-bGH-att и prtMTa-scGH в виде линейного фрагмента (с удаленными плазмидными последовательностями). Постэмбриональная смертность была относительно низкой во всех грушах, и до возраста сеголетка удалось подрастить 2500 мальков (около 70%). Во время зимовки при пониженных температурах воды и кормлении искусственными кормами наблюдали несколько вспышек заболеваний невыясненной этиологии. При этом отход из-за болезней в опыте был достоверно выше, чем в контроле (48% и 13%). Таким образом, генетическая модификация, возможно, приводит к снижению сопротивляемости организма

- íc -

Таблица 1

Суммарные данные об использовании рекомбинантных Еекторных конструкций в экспериментах по микроинъекции их растворов в цитсплавму бластодиска оплодотворенных яйцеклеток карпа.

1аименование конструкции Всего про-инъециро-ванно яйцеклеток, экз. * Постинъекционная гибель, экз./2 ОТХОД Е период эмбриогенеза, экз./% Всего получено, ЭКЗ./Х

личинок сеголетков годовиков

iRSV-bGH-att 1850 205/11 999/54 646/35 511/79 320/63

nMtl-bGH-att 1103 95/9 250/23 757/69 668/88 384/53

rtMTa-scGH кольцевая) 864 55/6 548/63 260/30 28/11 ■jWOWC 20/71

rtMTa-scGH Еинейная) 1147 32/8 429/37 626/55 580/93 295/51

иактный знтроль 1000 | 197/20 820/82 711/87 519/73

мечания:

ютинъекционная гибель регистрировалась в первые часы после >екций.

1бщее число погибших эмбрионов (без постинъекционного отхода) начала инкубации вплоть до завершения вылупления. Число личинок в процентах к инъецированным яйцеклеткам, сего-ков - к числу полученных личинок, годовиков - к сеголеткам. "Низкий отход объясняется тем, что малочисленную группу сего-ков из этой серии опытов содержали в лучших условиях.

болезням и другим неблагоприятным факторам, что ранее неоднок ратно отмечалось в опытах на млекопитающих (Pursei.1991).

Для анализа ДНК использовали форменные элементы крови, оС разцы которой получали из хвостовой вены годовиков гепаринизирс ванными одноразовыми иглами, или ткани плавников. На первом эте пе проводили PCR-скрининг, с помощью которого было установленс что частота обнаружения трансгена от одной серии опытов к друге изменяется: от менее, чем 10 до более, чем 20% в группах, полз ченных при введении в яйцеклетку конструкции, содержащей г« scGH. Аналогичный скрининг последовательностей, принадлежав фрагменту "att" или непосредственно гену bGH дал более высош результаты в отношении конструкций pRSV/mMTl-bGH-aU: от 15 , 60%.

Следует подчеркнуть, что данные PCR анализа нельзя тракт< вать как доказательство истинной трансгенности животных, хо' трудно предположить, что за несколько месяцев в активно пролиф рирующих гемопоэтических тканях введенные конструкции сохран лись в эписомном состоянии. Вместе с тем, учитывая возможное мозаичной интеграции трансгена отрицательность проб ДНК клет крови еще не означает, что примордиальные половые клетки не пр терпели хотя бы частичной трансформации. Т.е., сперматозоиды яйцеклетки подопытных рыб могут нести трансген в противоречии данными PCR. Отсюда следует, что в дальнейших эксперимент именно анализу - в том числе и с помощью PCR - зрелых полое клеток необходимо будет уделить основное внимание. Выборочк анализ по Саузерну положительных по PCR образцов ДНК показа что связывание зонда происходит с высокомолекулярной фраквд нерестривдрованной ДНК, а при гибридизации с обработанной Ре или HindlII - помимо основных полос, соответствующих размер рестриктов собственно конструкции, выявляются дополнительные, положение на фореграммах ДНК, полученной от разных рыб, отли* ется, что можно рассматривать как свидетельство интеграции ] комбинантных конструкций в геном, поскольку именно в этом слу1 следует ожидать появление геномных фланкирующих фрагментов н< редсказуемой длины, характеризующих индивидуальные особенно! микроокружения сайта интеграции трансгена.

YI. Влияние генетической модификации на индивидуальное р, витие рыб многогранно и во многом пока еще не ясно. Наибо. часто в работах разных авторов указывается на повышение уро

смертности в эмбриогенезе, появление аномалий развития и уродств, которые могут иметь как специфический (не встречающиеся в норме), так и неспецифический характер (встречающиеся в норме при воздействии некоторыми повреждающими агентами различной природы) . Аномалии развития первого и второго рода могут быть летальными и не летальньми. При этом гибель зародышей, находящихся на ранних стадиях развития, как правило, приурочена к началу гаструляции. Известно, что в этот период начинается собственная морфогенетическая функция ядер, и любые структурные нарушения хромосом хозяйского генома, чем бы они не были вызваны, будучи множественными, приводят к гибели зародыша. По аналогии с описанными ранее эффектами такого рода, вызванными облучением или химическими мутагенами, можно говорить о том, что множественная инсерция трансгена также выполняет роль мощного геномного мутагена. Следует ожидать, что для нее будет наблюдаться дозозависи-мость и неспецифичность по отношению к конкретному гену, использованному в конструкции. С другой стороны, можно предположить, что продукт экспрессии трансгена, - а многие рекомбинантные конструкции могут транскрибировать и транслировать кодируемый трансгеном белок с самых ранних периодов жизни эмбриона - интенсивно вмешивается в нормальный метаболизм зародыша. Но тогда его действие будет иметь характер, свойственный синтезируемому белку. Т.е., у него много шансов вазвать аномалии развития специфического рода, но мало шансов вызвать гибель эмбриона в период гаструляции. Отсюда следует, что для каждой конкретной конструкции вопросы, связанные с ее возможной патоморфологической функцией, необходимо рассматривать как в ключе специфических, так и в ключе неспецифических эффектов.

В наших опытах неспецифический эффект был прослежен для использованных конструкций путем варьирования количеством инъецируемой ДНК в одной дозе, вводимой в различные отделы бластодиска или бластомера.

В период эмбриогенеза вели постоянные наблюдения за развитием зародышей, отделяли имевших те или иные аномалии и систематизировали их в следующем порядке.

1. Нарушения в формировании бластодиска;

2. Нарушения равномерности дробления;

3. Аномалии процесса гаструляции;

4. Морфологические отклонения от нормы в период закладки

- 18 -

осевых структур и органогенеза;

5. Дефекты морфо-функциональной организации;

6. Пролиферативные уродства;

7. Сочетанные и неидентифицированные аномалии развития.

Наиболее существенным фактором, влияющим на частоту наруше

ний нормального развития, оказалось количество ДНК. При ее вве дении свыше 80 пг/кл. гибель эмбрионов в период гаструляции был, близка к тотальной (г=0,9). Этот эффект усиливался при использо вании кольцевых молекул (г=0,8) и при иньекциях в один из дву или в оба бластомера в поздний период существования стали; (г=0,83). Большие, но не летальные (50-70 пг/кл.) дозы ДНК спо' собны увеличивать продолжительность первых циклов дроблени; бластодиска, что, однако, не сказывается на общей продолштель' ности эмбриогенеза. Ведение ДНК из расчета 5-15 пг/кл. не оказы вает заметных отрицательных воздействий на эмбрионы карпа. Хот. частота аномалий развития, их разнообразие и выраженность в опы те все же выше, чем в контроле. Особенно при использовании коне трукций с промотором ЙБУ (табл.1, стр.15). К ним можно отнесг: случаи солитарного морфогенеза, когда из клеточной массы ранне; гаструлы к завершению обрастания желтка бластодермой формируете: зачаток какого-либо одного или группы связанных между собой ор' ганов, грубой унилатеральной дисплазии, когда наблюдается проли' ферация клеточных масс только с одной стороны зародыша, а таюа случаи более мягких пролиферативных аномалий, типа разрастани: плавниковой каймы в виде ундулирущей мембраны.

В первый год жизни у подопытных и контрольных особей карпа существенных морфологических отличий не выявлено. С одной стороны, мальки имеющие грубые аномалии развития не жизнеспособны, I другой, у исходно фенотипически нормальных особей, новых признаков в постэмбриональном онтогенезе не появляется. Вместе с тем размерно-весовые показатели в указанных группах различались довольно существенно (табл.2). Обращает на себя внимание тот факт что трансгенные особи встречаются как среди наименьших, так ] среди наибольших по размерам и весу экземпляров (рис.2).

Следует отметить, что двух-трехкратное различие в массе соседствует со значительно меньшими различиями между средними вв' личинами длины тела. Не исключено, что получившие некоторое пре^ имущество "на старте", трансгенные карпы подавляли развитие № трансгенных. Этот эффект известен для содержащихся при повышен'

Таблица 2

Размерные показатели контрольных и подопытных годовиков карпа, полученных в экспериментах с микроинъекционным введением растворов рекомбинактных векторов, несущих гены СТГ КРС (ЬЕН) и белого толстолобика (бс5Н)

Группа особей Длина тела L, Масса тела М,

см SD г SD

Подопытные, позитивные по PCR на присутствие ЬоН 12,3 2,74 98,7 '• 21,6

Подопытные, позитивные по PCR на присутствие scGH 15,5 3,70 159,9 18,1

Подопытные, отрицательные по PCR на присутствие трансСТГ 9,1 4,35 45,0 11,4

Мятактный контроль 11,7 3,22 • 75,6 13,2

■ i EZ32

Рис.2. Гистограммы распределения выборки из 77 подопытных годовиков карпа (использовалась конструкция pmMTl-bGH-att) по средним ксссаи (£) и положительным сигналам PCR (1), полученным при испсд>всвании в реакции праймеров к фрагменту att.

ной-плотности карпов и хорошо подтверждается сравнением данных из последних двух граф таблицы 2. Таким образом, истинные соотношения могут быть на самом деле несколько иными. Наиболее точно оценить фенотипическую экспрессию чужеродных генов СТГ станет возможным по рыбоводно-биологическим параметрам потомства ) трансгенных и не трансгенных сибсов, с учетом кормового коэффициента, удельной скорости роста, упитанности и других морфомет-рических индексов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Б результате проведенных исследований удалось показать, что правильный выбор моментов выполнения микроинъекций, сопряженный с видоспецифическим биологическим возрастом зародышей, позволяет значительно повысить эффективность генетической модификации, а процедуры, способствующие связыванию чужеродной ДНК со спермия-ми, позволяют использовать их в качестве естественных переносчиков рекомбинантных векторов в яйцеклетку. Можно считать, что спор между противниками и сторонниками этого способа генетической модификации животных найдет свое окончательное разрешение, когда будут найдены методы максимальной "загрузки" сперматозоидов такими векторами. Ясно, что при ограниченном числе переносимых молекул векторной ДНК, от характеристик последней зависит очень многое. При прочих равных условиях преимущества будут иметь защищенные от действия, внутриклеточных нуклеаз, хорошо амплифицирующиеся, сравнительно короткие и легко интегрируемые в хозяйский геном конструкции. Например, изготовленные на базе ретровирусов. В любом случае, этот метод перспективен и заслуживает дальнейзеГ: разработки.

Генетическая модификация, рассматриваемая не как однократное действие, а как процесс, показывает, что большинство экстремальных вариантов ее реализации элиминируется еще в эмбриогенезе. Безусловно, рыбы, как объект исследований, в этом отношении дают богатую и очевидную информацию, практически недоступную при исследованиях на млекопитающих. Наблюдения за ходом эмбриогенеза становятся наиболее удобными при использовании предложенной нами среды, изготовленной на основе метилцеллюлозы, позволяющей, как бы, "подвешивать" в ней развивающиеся яйцеклетки (в оболочках или без таковых), что облегчает выполнение микроинъекций и других манипуляций с эмбрионами. После прохождения двух важных ру-

Эежей эмбрионального отбора: гаструляции, началу которой соответствует активация генома и гибель эмбрионов с серьезными его нарушениями, и вылупления. самостоятельно совершить которое могут лишь те эмбрионы, у которых отсутствуют значительные мор-фо-функциональные аномалии, молодь подопытных рыб развивается в целом подобно интактному контролю. Использованные нами конструкции, содержащие гены гормона роста весьма отдаленнородственного СЬСН) и близкородственного (зсБН) происхождения, не вызывают появления каких бы то ни было новых признаков морфологического порядка. Все морфологические аномалии, встречаемые у подопытной молоди, носят неспецифический характер. Они наблюдаются, хотя и значительно реже, в контроле, к в группах рыб, в процессе эмбриогенеза испытавших на себе действие неблагоприятных факторов химической или физической природы. Поэтому, у нас нет оснований считать, что генетическая модификация рыб с помощью конструкций, экспрессирующих гены, не имеющие конкретных морфогенетически активных мишеней, повлияет каким-то образом на видоспецнфические признаки. Сказанное, однако, не распространяется на признаки пластические. Многие из них контролируются гормонально, а гормон роста является ключевым полипептидом в сложной системе регуляции пролиферативной активности клеточных масс мышечной, соединительной и, отчасти, костной ткани. Учитывая это, в качестве отсроченных эффектов экспрессии чужеродных генов СТГ можно ожидать не только увеличения темпов роста. Не исключено также, что в некоторых случаях, особенно при нарушении структуры интегрированного гена и, соответственно, структуры полипептида, последний окажется способен выполнять функции антигена. А. это неминуемо приведет к серьезным нарушениям нормального иммунного ответа организма рыб.

Большое значение в исследовании генетически модифицированных животных имеют данные о развитии потомства исходных трансгенных особей, о сохранении и преобразованиях трансгена, об эффектах его гомозиготизации, экспрессии у гибридов. Эти и многие другие вопросы могут быть успешно решены для рыб уже в ближайшие годы.

- 22 -ВЫВОДЫ

1. Наиболее благоприятные моменты для микроинъекционнол введения растворов рекомбинантных конструкций, непосредствен» предшествующие максимальной деслирализации хромосом, соответствуют биологическому возрасту 0,3 - 1,3 и 2,0 - 2,3 х0 эмбрионо! данио, 0,4 - 1,1 и 1,1 - 2,0 т„ эмбрионов карпа.

2. Диметилсульфоксид в концентрации 10% и термический шок I амплитудой ± 20 °С относительно температуры инкубации способствует инкорпорации чужеродной ДНК в сперматозоиды карпа.

3. Вязкая инкубационная среда на основе 0,5 - 0,7% раствор« метилцеллюлозы не нарушает эмбриогенеза данио, способствует выполнению микроинъекдай, облегчает визуальный контроль за развитием эмбрионов, в том числе и при удалении яйцевых оболочек.

4. Эффективность переноса репортерной конструкции рНЗУ-1ас; спермиями карпа по результатам тестирования ее экспрессии у ранней молоди превысила 90% и составила 15% у годовиков, что говорит о значительной доле особей, демонстрировавших транзиентну} экспрессию трансгена.

5. Микроинъекционное введение растворов рекомбинантных векторных конструкций, несущих гены СТГ различного происхождения, I цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток данио и карпа, по данньв полимеразной цепной реакции позволило достичь эффективности д( 60%, что, с одной стороны, указывает на применимость использованных конструкций в экспериментах на рыбах, а с другой на правильность выбора момента и самой процедуры микроинъекций.

6. Генетическая модификация карпа с использованием сперматозоидов в качестве переносчиков чужеродной ДНК не сопровождается какими-либо изменениями в онтогенетическом развитии подопытных особей.

7. Эмбриогенез карпов после микроинъекций 80 и более пг ДШ на яйцеклетку сопровождается множественными неспецифическими нарушениями развития, приводящими к гибели 90 и более процента эмбрионов, в основном на стадиях поздней бластулы - ранней гаст-рулы.

8. Частота аномалий развития и уродств выше в тех случаях, когда для генетической трансформации используются кольцевые молекулы плазмидных векторов, а при их линеаризации - при использовании тканенеспецифических промоторов вирусного происхождения.

9. В возрасте годовиков и двухлетков у карпа наблюдаете? фенотипическая экспрессия трансгена, выражающаяся в том, чте средняя масса особей, несущих в себе чужеродный ген гормона роста, достоверно превышает среднюю массу нетрансгенных.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Барминцев В.А., Голиченков В.А., Шан Лицзюань. Бенюмов А.0. Патоморфогенез у трансгенных рыб.//Сборник тезисов докладов VI Конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии".- 24-26 мая 1994г.-Пущино.-1994.-С.131.

2. Барминцев В.А., Кузнецов А.Е.. Шан Лицзюань. Получение трансгенных карпов с помощью микроинъекций и оплодотворения яйцеклеток спермиями, импрегнированными в растворе рекДНК.//сборник тез.докл. VI Конф. Российской Федерации"Новые направления биотехнологии". - 24-26 мая 1994г.-Пущино.-1994.-С.132.

3. Barmlntsev V.А., Shan,L. Creation of transgenic carps by microinjection and fertilization of eggs by sperm cells impregnated in DNA solution.// Abstr. 5th Int. Symp. on Genetics in Aquaculture, Halifax, Canada June, 1994).- p.5.

4. Barmintsev V.A., Shan L.. Khafagi 0. Creation of transgenic carps and sturgeon by microinjection.//Abstr. 1st Int. Symp. on sustainable fish farming. Oslo, Norway, 28-31 Aug. 1994,- p. 94.

5. Хафаги 0., Барминцев В.А., Шан Л. Сперматозоиды могут быть использованы для переноса рекомбинантных конструкций, экс-прессирующих ген {5-галактозидазы в тканях личинок карпа.//Генетика. - 1994.-Т.30 (Приложение).- С.169-170.

6. Шан Л.. Бенюмов А.0., Голиченков В. А. Аномалии эмбриогенеза у трансгенных Danlo rerio.//Генетика.- 1994.-Т.30 (Приложение).- С. 180.

7. Бенюмов А. 0., Дубровская Т. А., Барминцев В. А., Шан Л. Продолжительность первых митотических циклов и стадирование эмбриогенеза Danio rerio.//Онтогенез.- 1995,- т.26.- N 2 (в печати).

Тираж 100 экз.