Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние экологических условий на разнообразие микробных сообществ солоноватых озер Забайкалья

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Влияние экологических условий на разнообразие микробных сообществ солоноватых озер Забайкалья"

На пра&ах-рукописи

ЕГОРОВА Дарья Васильевна

ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА РАЗНООБРАЗИЕ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ СОЛОНОВАТЫХ ОЗЕР ЗАБАЙКАЛЬЯ

03.02.08 - экология (биологические науки) 03.02.03 - микробиология (биологические науки)

. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

16 МАЙ ¿и 13

005058146

Улан-Удэ - 2013

005058146

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИОЭБ СО РАН)

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук, ученый секретарь ИОЭБ СО РАН Козырева Людмила Павловна

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией микробиологии ИОЭБ СО РАН Намсараев Баир Бадмабазарович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Института эпидемиологии и микробиологии Научного центра проблем здоровья семьи и регродуквди человека СО РАМН Данчинова Галина Анатольевна

кандидат биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» Буянтуева Любовь Батомункуевна

научно-исследовательский институт

биологии при Иркутском государственном университете (г.Иркутск)

гОО

Защита состоится «23» мая 2013 г. в 15ш часов на заседании Диссертационного совета Д 212.022.03 в Бурятском государственном университете по адресу: 670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, Биолого-географический факультет, конференц-зал. Факс: (3012)21-05-88, e-mail: d21202203@mail.ru. daria_ego@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Бурятского государственного университета. Автореферат разослан апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А. Б. Гулгенова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследований. Исследования микробных сообществ содовых и соленых водоемов являются объектом интенсивных исследований, которые не теряют своей актуальности в течение последних десятилетий. Это связано с выяснением роли микроорганизмов в функционировании данных экстремальных мест обитания и открытием новых видов алкало- и галофильных представителей микробного сообщества (Заварзин, 2004; Жилина, 2001; 2005; Pikuta et al., 2003; Гарнова, 2003 и др.). Предметами исследования являлись разнообразие и функционирование микробных сообществ. При проведении этих исследований использованы классические микробиологические методы выявления и изучения физиологических групп, определения скоростей микробных процессов, выделения и описания культур микроорганизмов (Намсараев и др., 1999; Намсараев, Намсараев, 2007; Горленко и др., 1999; Заварзин и др., 1999; Sorokin et al., 2003; Сорокин и др., 2001; Ешинимаев и др., 2001; Жилина и др., 2005; Брянцева, 2000; Jones et al., 1998; Imhoff et al., 1979; Oren, 2000; и др.).

Использование методов молекулярной биологии позволило значительно расширить представление о разнообразии культивируемых и некультивируемых представителей различных местообитаний, в том числе содовых и соленых озер Африки, Америки, Китая и др. регионов (Rees et al., 2003; Mesbah, Abou-El-Ela & Wigel, 2007; Mwirichia et al., 2011; Valenzuela-Encinas et al., 2009 и др.). Однако необходимость проведения этапа клонирования и независимого секвенирования фрагментов рибосомных генов позволяли проанализировать не более сотен последовательностей. Развитие новых технологий секвенирования (пиросеквенирование) сделали возможным одновременный анализ тысяч -сотен тысяч последовательностей (Margulis et al., 2005), что открыло новые перспективы в изучении микробных сообществ различных экосистем (Shokralla et al., 2012; Zinger. et al., 2012). Проведение исследований микробного разнообразия содовых и соленых озер Забайкалья с использованием современных молекулярно-биологических методов дает возможность изучения этих экстремальных мест обитания на новом уровне.

Цель работы: изучить разнообразие культивируемого и некультивируемого микробного сообщества в зависимости от экологических условий и выявить функциональную роль доминирующих бактерий. Задачи:

1. Определить физико-химические показатели исследуемых озер.

2. Определить численность бактерий деструкциоиного звена.

3. Определить таксономическое положение органотрофных бактерий, выделенных из воды и донных осадков солоноватых озер Забайкалья и идентифицировать доминирующих представителей.

4. Оценить генетическое разнообразие культивируемого и некультивируемого сообщества микроорганизмов в различных экотопах озер.

5. Выявить функциональную роль доминирующих бактерий.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые с использованием методов молекулярной экологии проведена оценка разнообразия микробного сообщества различных экониш содово-соленых озер Забайкалья. Впервые с помощью высокопроизводительного секвенирования фрагментов генов 16Б рРНК проведена качественная и количественная характеристика состава бактериальных сообществ донных осадков озер Соленое и Сульфатное, различающихся по содержанию основных анионов. Установлено, что в количественном отношении ведущая роль принадлежит бактериям серного цикла, состав которых зависит от конкретных условий в донных осадках. Показано, что фила Вас1епнёе1е5, наиболее характерная для водной среды, играет большую роль в донных осадках, являясь субдоминантом филы РпйеоЬа^епа. Выделен и описан новый представитель филы Вайеплс^еБ - аэробные, алкалофильные бактерии рода ВеШеПа для которых предложено название «ВеШеИа Ьигуайет1х ер. поу,».

Полученные результаты расширяют представление о разнообразии культивируемого и некультивируемого сообщества содово-соленых озер Забайкалья. Данные по составу бактериального разнообразия донных отложений могут быть использованы для реконструкции путей метаболизма в сообществе и целенаправленном выделении организмов или генов для использования в разработках новых биотехнологий на основе соле- и щелоче-устойчивых ферментов. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе в курсах изучения микробиологии и экологии и подготовке учебно-методических пособий.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были апробированы в виде докладов на Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010; 2012); Всероссийской конференции с международном участием «Современные проблемы микробиологии Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2010); 2-ой Международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011); Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ - Улан-Батор, 2011); Региональной научно-

практической конференции «Структура, функционирование и экологическая безопасность» (Улан-Удэ, 2012). По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзорного анализа литературы, трех глав, изложенных на основании собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы источников, из них-63 Р- зарубежных). Объем работы составляет страниц машинописного текста,

включающего {•? таблиц,рисунка.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю к.б.н. Козыревой Л. П. и научному консультанту д.б.н. Намсараеву Б.Б. за общее научное руководство. Выражаю искреннюю благодарность за помощь на отдельных этапах работы и обсуждении результатов д.б.н. Плотниковой Е.Г. и к.б.н. Ананьиной Л.Н. (ИЭГМ УрО РАН), д.х.н. Раднаевой Л.Д. и к.х.н. Тараскину В.В. (БГУ), а также всем сотрудникам лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН за помощь в работе и поддержку.

Работа выполнена в рамках бюджетного проекта № VI.51.1,8_ , а также поддержана грантами РФФИ № 10-04-01185_а, № 12-04-31187-мола, ФЦП Кадры Соглашение 8116, ФЦП № 11.519.11.2011.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования.

Объектами исследования явились солоноватые озера Забайкалья: Верхнее и Нижнее Белое (В.Белое и Н.Белое), Белое, Соленое, Сульфатное (Бурятия). Для исследования были отобраны пробы воды, донных осадков и микробных матов в летний период с 2009 по 2012 гг. Предметами исследования служили микробные сообщества воды, осадков и микробных матов.

Методы исследования. В полевых условиях определение морфометрических и физико-химических параметров воды в местах отбора проб проводили с помощью портативных приборов и стандартными методами (Намсараев и др., 2006). В лабораторных условиях химический анализ воды выполнен аналитической группой (ИОЭБ СО РАН). Содержание органического углерода (Сорг) в навеске донного осадка определяли методом мокрого сжигания по Тюрину И.В. в модификации Никитина Б.А. (Аринушкина, 1970).

Среды и условия культивирования. Определение численности аэробных и анаэробных бактерий-деструкторов осуществляли посевом

проб на жидкую минеральную среду состава (г/л): КН2Р04 - 0,2; MgCl2 • 6Н20 - 0,1; NH4C1 - 0,5; КС1 - 0,2; дрожжевой экстракт - 0,01; раствор микроэлементов по Пфеннигу — 1мл/л. В качестве субстратов вносили (г/л): для протеолитиков (ПБ) - пептон (15); для целлюлолитиков (НРБ) -полоску фильтровальной бумаги, размером 0,5см* 10 см, для бактерий-бродилыциков - глюкозу (4). Численность органотрофов определяли подсчетом колоний, выросших в чашках Петри при глубинном посеве проб на среду РПА:10 и Plate Count Agar: 10 (РСА) («Difco Laboratories», США). Значения рН и минерализации, соответствующие гидрохимии озер, устанавливали соотношениями NaHC03, Na2C03 и NaCl. 10% растворы гидрокарбоната и карбоната натрия стерилизовали отдельно. Численность протеолитиков, органотрофов и бродилыциков определяли через 3-5 суток культивирования, целлюлолитиков - 30 суток культивирования в термостате при 30°С.

Чистые культуры органотрофных бактерий выделяли из изолированных колоний на средах РСА (1:10) и РПА (1:1) (рН 9,0-9,5, NaCl - 3 и 10 г/л). Изоляты из оз. Соленое, отнесенные к роду Belliella, поддерживали на Морском агаре (МА) состава (г/л): бакто пептон - 5; дрожжевой экстракт - 1; Fe3+ - 0,1; NaCl - 19,4; MgCl2- 5,9; Na2S04- 3,2; СаС12 - 1,8; KC1 - 0,5; Na2C03 - 0,16; KBr - 0,08; SrCl2 - 0,034; H3BO3 -0,022; Na-силикэт - 0,004; NaF - 0,002; (NH4)N03 - 0,001; Na2HP04 - 0,008; агар - 15.

Типовой штамм Belliellapelovolcam CC-SAL получен из Корейской коллекции типовых культур (КСТС).

Микроскопические методы исследования. Морфотипы бактерий, размеры, подвижность и спорообразование изучали микроскопированием препаратов с помощью светового микроскопа AxioStar Plus («Karl Zeiss», Германия), оснащенного фотодокументирующей системой Axiovision и фазово-контрастной приставкой (х1000).

Физиолого-биохимические методы. Оптимальные параметры роста и границы гало- и алкалотолерантности выделенных микроорганизмов определяли культивируя организмы в градиенте щелочности (рН 5,3-11,5) и солености (NaCl от 0 до 200 г/л). Различные значения рН устанавливали карбонат-бикарбонатным и фосфатным буферами (Справочник по биохимии, 1996). Температурные диапазоны развития бактерий устанавливали в градиентном термостате в диапазоне от 20 до 60°С. Определение физиолого-биохимических характеристик проводили на основе рекомендуемых стандартных тестов (Методы общей бактериологии, 1984; Большой практикум..., 2005) и с применением наборов реактивов API 20Е и API 50СН («BioMerieux», Франция). Отношение к антибиотикам проверяли с использованием дисков (НИЦ фармакотерапии, СПб, Россия) в соапэгппвиис рекоме!щшиями производителя.

Пигменты экстрагировали из клеток ацетоном/метанолом в соотношении 7:2. Спектры абсорбции определяли на спектрофотометре Shimadzu UV-mini («Shimadzu Scientific Instruments», Япония) в диапазоне длин волн от 350 до 1000 нм.

Определение состава клеточных жирных кислот выполнено на газовом хроматографе Agilent Packard HP 6890 («Agilent Technologies», США) на медицинском факультете БГУ (г. Улан-Удэ)

MALDI-TOF анализ выполнен в ВКМ ИФБМ РАН (г. Пущино).

Молекулярно-биологические методы. Препараты ДНК из микробных матов, воды и чистых культур выделяли с помощью комплекта реагентов «РИБО-сорб», «ДНК-сорб» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) в соответствии с протоколом производителя и методом ферментативного лизиса (Белькова, 2004). Выделение ДНК из донных осадков проводили с использованием набора AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit («Axygen», США).

Амплификацию фрагментов рибосомных генов проводили с использованием набора реагентов «НТИ-Байкал» (г. Иркутск) в термоциклере БИС (г. Новосибирск). Для оценки разнообразия микробного сообщества использовали известные консервативные праймеры на основные филы доменов Bacteria и Archea (домен Eubacteria: 27F - 1492R, 500F - 1350R; 358F - 907R; линия Cyanobacteria: CYA106F - CYA781R; линия Bacteroidetes: CF319F - EUB1350R; линия Actinobacteria: ACT235F -EUB1350R; линия Planctomicetes: EUB338L - PLA930R; классы Alphaproteobacteria и Deltaproteobacteria: ADF681L - EUB1350R; класс Alphaproteobacteria: ALF35L - EUB500R; класс Betaproteobacteria: BET663L - EUB1350R, BET680L - EUB1350R; класс Bacillus: BLS342L - EUB1350R; домен Archaea: 109F - 915R, 344F - 958R). Праймеры синтезированы в ИХБФМ СО РАН.

Секвенирование продуктов амплификации выполняли в ЦКП СО РАН «Геномика» (г. Новосибирск) и ФГБУН Институт экологии и микроорганизмов (ИЭГМ) УрО РАН (г. Пермь).

Нуклеотидные последовательности изучаемых штаммов выравнивали с использованием программы ClustalW, первичный анализ сходства генов 16S рРНК проводили с помощью программного пакета BLAST (Altschul et al., 2010) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon ver. 2.1 (http://www.eztaxon.org), построение филогенетического дерева выполнено в программе MEGA ver.5.01.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез выполнен в лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН в ходе стажировки в 2010 г.

Определение состава оснований ДНК и ДНК-ДНК- гибридизация выполнены к.б.н. Арискиной Е.В. (ИБФМ РАН).

Пиросеквенирование фрагментов гена 16S рРНК выполнено в компании Chunlab Inc. (Южная Корея, г. Сеул) на приборе Roche/454 Genome Sequencer FLX Titanium с использованием бактериальных праймеров 27F (GAGTTTGATCMTGGCTCAG) и 518R (WTTACCGCGGCTGCTGG). Оценку таксономической сложности сообщества проводили с помощью пакета программ CLcommunity (ver 3.1). Идентификация клонов выполнена с использованием сервера EzTaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/; Kim et al., 2012).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика условий обитания микроорганизмов. В

период проведенных исследований отмечено увеличение суммы солей, по сравнению с предыдущими исследованиями. Значения рН воды озер находились в щелочной области и варьировали от 8,9 в оз. Белое до 10,0 в оз. Верхнее Белое (табл.1).

Таблица 1. Физико-химические параметры исследуемых озер

13 Озеро Глуби рН t°C Содержание, мг/дм3

d на, м 2 солей о? НС03" С032- SO/- СГ Na+ К+ Са2+

Соленое 1,8 9,7 25,6 9270 5,9 1400 400 135 3765 3380 84 10 96

о В. Белое 2,5 10,0 27,6 9635 - 1600 1200 2385 1415 2960 28 8 38

о ÍN Н. Белое 2,0* 9,8 30,4 4378 9,1 800 610 465 632 1760 28 12 70

Белое 2,1* 8,9 19,4 2048 5,9 200 81 195 451 760 28 40 292

Сульфат ное 4,7 9,2 20,8 12258 5,9 160 280 7035 1777 2520 84 54 348

Соленое 1,7 10,2 22,9 13419 4,0 2340 2013 165 4778 4000 65 10 48

_ В. Белое 2,0 10,2 20,4 12450 3,2 2400 2135 2100 1776 4000 10 8 21

О Н. Белое 2,0* 10,7 28,7 8445 7,0 1710 1555 1605 778 2740 14 20 22

г-: Белое 2,1* 10,1 25,0 3110 - 380 165 795 561 980 17 50 162

Сульфат ное 4,7 9,3 21,4 16962 3,3 300 91 10705 2007 3500 120 26 212

Примечание: «*» - данные предыдущих исследований; «-» - нет данных.

Характеристика культивируемого сообщества Для количественной характеристики структуры микробного сообщества грунтов была определена численность бактерий аэробной и анаэробной деструкции ОВ (табл.2).

Гидролитические бактерии, осуществляющие деполимеризацию белков и углеводов, в прибрежных донных осадках исследуемых содовых озер присутствуют в количестве от 100 клеток до 1 млрд. клеток в мл. Наибольшая численность всех групп бактерий была отмечена в донных отложениях оз. Сульфатное, Соленое и Нижнее Белое. Во всех пробах озер

отмечается преобладание численности аэробных бактерий в сравнении с анаэробными.

Таблица 2. Численность аэробных и анаэробных бактерий-деструкторов в _донных осадках

Озеро кл./см3 Органот рофы, КОЕ/см3 Содержа . ние С орг,% Описание проб донных осадков

ПБ ЦРБ Бродил ьщики

1 2 1 2

Соленое 108 106 103 104 105 8,4x106 7,50±2,57 черный вязкий ил с запахом Н25

В. Белое 106 104 106 105 107 4,8><102 0,30±0,14 крупный песок серого цвета

Н. Белое 109 ю7 104 103 105 7,7x102 1,15±0,02 ил темно-серого цвета

Белое ю7 103 10" ю2 103 1,6хЮ4 0,90±0,48 мелкий песок серого цвета

Сульфата ое ю9 ю7 ю7 106 ю8 1,бх106 3,06±1,52 вязкий ил черного цвета

Примечание: 1 - аэробы; 2 - анаэробы.

Из проб воды и грунтов содово-соленых озер был выделен 61 изолят органотрофных бактерий. Для 33 изолятов были определены границы и оптимумы роста в диапазоне рН и №С1. Штаммы растут в широком диапазоне рН, проявляя свойства алкалофилии и алкалотолерантности. По отношению к №С1 среди выделенных изолятов только 3 являлись умеренными галофилами с диапазоном роста в пределах 0-200г/л и оптимумом при 50 г/л №С1. Большая группа изолятов имели верхнюю границу роста при 50 г/л и оптимумы 0-15 г/л. Большинство же штаммов являются галотолерантными и растут в интервале 0-200 г/л и оптимумом до 25 г/л (табл.3).

Идентификация выделенных нами изолятов и культур органотрофных бактерий из коллекции экстремофильных микроорганизмов лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, основанная на сравнении данных секвенирования продуктов амплификации генов 16Б рРНК в мировых базах данных, выявила их сходство с известными культурами бактерий на уровне 97-99% (табл.3).

Анализ данных показал, что при выделении культур на средах, содержащих сложные белковые и углеводные компоненты, и параметрах рН и солености, соответствующих или приближенных к природным условиям, изолируются представители фил Рн-пнс^ев, АсйпоЬа^епа, Вас1егснс!е1ез и класса а-рпНеоЬайепа. В микробном сообществе они являются деструкторами, окисляющими и сбраживающими ОВ. Их ближайшие гомологи, в основном, выделены из соленых (морских) и щелочных сред. При создании строгих селективных условий,

направленных на выделение специализированных физиологических групп микроорганизмов (Сорокин и др., 2006), изолирована большая группа бактерий класса у-рпЛеоЬайепа. Большинство из них являются сероокисляющими бактериями. Среди выделенных а-протеобактерий большинство принадлежит группе аноксигенных фототрофных бактерий (АФБ) (Брянцева, 2000; Болдарева и др., 2008). Из филы РшшсШеБ выделены бактерии, осуществляющие гидролиз целлюлозы и Сахаров (Жилина и др., 2005).

Таким образом, на настоящий момент, в культивируемом бактериальном сообществе содово-соленых озер Забайкалья наиболее представительна фила РпЛеоЬайепа (57,8%: а-26,6%, у- 28,9%, 8- 2,2%). Би-плс^ез составляют 22,2%, АсНпоЬааепа 11,1% и Вас1его1с!е1е8 8,9%.

Таблица 3. Характеристика органотрофных бактерий и их ближайшие гомологи

Изо-лят Характеристика изолята Ближайший гомолог/№ в базе данных % гомологии Источник выделения /ссылка

1С-5С pH,im/opt7-10/8; 8,5 NaClftn/on, 0-50/10 Belliella pelovolcani CC-SAL 25т/ EU685336 97,197,8 гряз, вулк., Тайвань/ Arun et al., 2009

6С рНшп/opt 5,8-8,5/7,5 NaCllim/oDt 0-25/10 Paracoccus alcaliphi-lus JSM 7364T/AY014177 98,7 почва /Urakami et al.,1989

7С Р^Иш/opt 6,4- 9,5/7,1 NaCllira/opt 0-50/1 Micrococcus endophiticus YM 5623 8T/ EU005372 97,7 корни растений/ Chen et al., 2009

8С pHiim/opt 5,8- 9,5/6,8 NaCllim/opt 0-100/5 Kothia nasimurium CCUG 359571/AJ131121 98,1 носовая полость мыши /Collins et al, 2000

СМ1, СМ2 pH|im/opt6-12/10,3 NaCl,im/op,0-100/15 pHlim/0Pt 7-12/10,2 NaCllim/OBt 0-150/50 Bogoriella caseolytica HKI0088T/Y09911 9fc осадки оз. Богория, Африка/Groth et al., 1997

СМЗ pHlim/opt 6-12/9,2 NaCllim/oot 0-150/10 Bacillus pseudojirmus DSM 8715Т/ X76439 98 прибреж. оз.осадки /Nielsen et al., 1995

СМ4 pH«m/opt7-l 1/8,2 NaCllim/opt 0-50/25 Aliihoejlea aestuarii strain N8 99 прибр.осадки, Корея/Roh et al.. 2008

СМ5 pHlim/opt 6-12/9,2 NaCliim/opt 0-100/100 Marinobacter excel lens KMM 3809т/ AY180101 99 осадки, Японское Mope/Gorshkova et al., 2003

4Су pHlim/opt 6,0-8,0/6,7 NaCliim/on, 0-50/5 Bacillus simplex NBRC 15720 T/AJ439078 99,2 засушлив почвы/ Delaporte et al., 1967

2Су NaCl,im/oPt 0-50/10 Bacillus idriensis SMC 4352-2T/AY904033 95,1 кровь больного/ Ко et al., 2006

ЗСу pH,im/opt 6,0-7,9/7,4 NaCl1¡m/opt 1-50/5 Jeotgalibacillus campisalis SF-57T/ AY190535 97,4 морская соль/ Yoon et al., 2004

5Су pHlim/opt 6,0-10,0/7,1 NaCllim/opt 0-100/5 Sporosarcina aquamarina SW28T/ AF202056 97,2 морская вода /Yoon et al., 2001

7Су pH,im/op, 5,8-10,3/7,5 NaCl,im/opt 0-50/10 Paenibacillus glucanolyticus DSM 5126T/ FJ613558 99,1 водоем, Япония/ Dasman et al. 2002

8 Су PHlim/opt 5,8-9,6/7,8 NaCllim/0Dt 0-150/5 Citricoccus zhacaensis FS 24T/ HU305672 97,3 сол. сточ. воды /Meng et al., 2009

10 Су, Ве а pH,im/opt 5,8-10,0/7,6 NaCl,im/0Dt 0-200/10 Bacillus sqfensis FO 036b T/AF234854 99,3 гюверкн. косм-то аппарата «aíomietaL,2006

СуЮ- NBÍ0-15 > pHiinVcp, 9,212/10,3; 8-10/8,0; NaCl,im/opt 0-100/25 0-200/10 Loktanella vestfoldensR-9477/NR_029021.1 99 микроб, мат, Антаркт. озера /Van Trappen, 2004

Су 104 pH,im/0pt 7,0-10,5/8 NaCllim/0Dl 0-150/25 Pseudomonas peli R-20805/AMI 14534 99 нитриф. Инокулят/ Vanparys et al. 2006

Бе10-6 рНпш/opt 6-10,5/6,5 NaCliimyopt 0-50/0 Rhodococcus cercidiphylli YIM 65003/ EU325542 98 поверхн. растения, Китай /Li et al., 2008

Бе 107 pHiira/opt 7-12,0/10,3 NaCl1¡m/opt 0-200/50 Marinibacillus campisalis strain SF-57/NR 025716.1 99 морские высолы, Корея ÍYoon et al., 2004

Бе 109 pHUm/op, 7-11,0/8,0 NaCliim/oDtO-50/15 Rhodobacter ovatus JA234/AM690348 98,2 загрязн водоемы /Srinivas et al. 2008

Бе 1010 pHlim/opt 7-10,0/8,4 NaCl,im/„D, 0-50/1 Pseudomonas peli R-20805 /AMI 14534 99,7 ншрифиц инокулят /VanpaiysetaL2006

VB1 pH,im/opt 7,5-12,0/8,4 NaCllim/0Dt 0-200/10 Litoribacter ruber YIM CH208 /GU254164 95,8 содов озеро, Китай /Tianet al. 2010

VB6 pH,im/opt 8-12,0/10,3 NaCllim/op, 0-50/1 Xanthomonas sp. ML- 122/ AFI 39997.1/ Tahibacter aquaticus PYM5-11/ AM981201 99/96, 2 оз. Moho Лэйк/ пресный источник данные NCBI/ Makk et al. 2011

VB7 pHHm/opt 10-12,0/10 NaCllim/opt 0-200/25 Bacillus aurantiacus Kl-5 /AJ605773 98,4 содовое озеро, Венгрия /Borsodi et al., 2008

VB9, VB11 pHi¡m/oPt 7-12,0/10,2 NaCllim/0p, 0-200/50 Halomonas ventosae A112/AY268080 98,1 засоленные почвы, Испания /Martínez-Cánovas et al. ,2004

Примечание: Изоляты 1С-5С, выделены из воды, СМ1-СМ-5- из осадков оз. Соленое; 2Су-10Су - из осадков, Су 10-1, Су 10-4 из воды оз. Сульфат-ное; Ве а, Бе 10-6,7,9,10- из воды оз. Белое; УВ-1,6,7,9,11 - из осадков оз. Верхнее Белое; ИВ 1015 — из воды оз. Нижнее Белое.

Новый таксон рода ВеШе11а филы Ва<^ег(И(1е1е$.

Бактерии, относящиеся к филе ВаЫего{(1е1е$, являются одним из доминирующих компонентов микробных сообществ пресноводных, морских, щелочных экосистем. Они характеризуются широким спектром утилизируемых субстратов и способностью адаптироваться к различным условиям обитания.

Из воды оз. Соленое были выделены 5 штаммов (1С6, 2С, ЗС, 4С и 5С), образующих на МА (рН 8) и РСА 1:10 (рН 8), колонии оранжево-красного цвета, диаметром до 2,5мм. Клетки представляют собой грамотрицательные, неподвижные, аэробные палочки, размером 2,9><0,4мкм. Выделенные штаммы являются факультативными алкалофилами (диапазон рН 7,0 - 10, оптимум при 8-9), умеренными галофилами - рост культур отмечен при концентрации №С1 от 0 до 50 г/л с оптимумами при 10-25 г/л (рис.1) и мезофилами - с оптимумами при 26-30°С.

98]

I.Mfi

99

4Г

861 Alpnrinhapus winnpraAskvi 1 -98' Alvarinhapus venmienni

Apnrinhapus antarrticus I.MR .10 r— Alsoriohaeus haloohilus IMSNU 14013 0 A/pnrinhaous lutimaris A/pnrinhnpus a/ka/inhitus Aleorwhasus boritolerans T-22 ~ Alpnrinhtwus hiinnirnla 7-Alsoriohaeus faecimaris Alvnrinhaous marinrnla • RhadnnpUum nsvrhrnnhilum TMSNII ■ Nitritnlra hnlnlknlinhitn 1.W7

x>|-

boo;

ЯйШрНп haltira ПЛ1Я4

Belliella velovolcani CC-SAL-25

5C

4C

2C_

-Eehimcola vietnamrnsis I МГ,

-Erhinicnla narifira KMM

- Cvclnhnrterium Hanum HV9

" Cvrlnhartcrium nmurskvpnse.

■ Cvrlnhnrtpnum mnrinum IД1С

■ Fontibacter /¡avus CC-GZM-130

l LI IIIIUJI It'tlljril runII

-Indtbacter alkaliphilus L\V1 Aauiflpxum haltieum RA1A0

Рис.1. Филогенетическое дерево, построенное с использованием метода "neighbor-joining", отображающее положение изолятов в системе семейства "Cyclobacteriaceae". Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100. нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap''-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%).

Филогенетический анализ показал, что все изоляты являются членами семейства Сус1оЬас1епасеае в составе класса Су1орЬа§1а филы Вас1его1ёе1ез (рис.2). С типовым штаммом близкородственного вида ВеШеПа ре1о\о1сапх СС-8АЬ-25Т исследуемые штаммы проявили до 98,7% сходства нуклеотидных последовательностей. Сравнительный анализ генов 16Б рРНК выявил 100% сходство между изолятами 2С и 4С и отличие от них 1 нуклеотидной заменой в вариабельной области изолята 5С. Данное наблюдение может указывать на то, что изолят является другим штаммом или представителем близкородственного вида.

Штаммы 1С, 2С, ЗС и 5С были подвергнуты дальнейшим исследованиям, основанным на методологии полифазной таксономии. Уровень ДНК-ДНК гомологии с типовым штаммом вида ВеШеПа ре1о\о1сат СС-8АЬ-25Т показал сходство ниже 70%, что свидетельствует о принадлежности их к разным видам. Пара штаммов (2С и 5С) с уровнем гомологии выше 70% принадлежит к одному виду (табл.4).

Таблица 4. ДНК-ДНК гомология штаммов

ВеШеПа pelovolcani CC-SAL-25' х 1С 58,7±1,4%

ВеШеПа pelovolcani CC-SAL-251 х 2С 58.0±1,8%

Belliella pelovolcani CC-SAL-251 * ЗС 64,2±2%

ВеШеПа pelovolcani CC-SAL-251 * 5С 55,6±2,5%

2Сх 5С 87,7±1,4%

Анализ данных штаммов с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии целых клеток - относительно нового метода с высокой степенью таксономического разрешения, используемого для идентификации и классификации близких бактерий, преимущественно на уровне «вид-подвид» подтвердила данные ДНК-ДНК-гомологии. На дендрограмме, построенной на основе данных MPS, штамм ЗС кластерируется с типовым штаммом В.. pelovolcani CC-SAL-257. Штаммы 1С, 2С и 5С образуют на дендрограмме отдельный кластер, что служит доказательством принадлежности их к одному виду.

Доминирующими клеточными кислотами являются isoCi5:0 (25,826,2), isoCl5: 1 G (6,77-7,88), isoC17:l(o9cis (6,25-7,24). Спектральный анализ ацетон-метанольных экстрактов клеток выявил присутствие каротиноидных пигментов в области 450-550 нм.

На основе полученных данных штаммы 2С и 5С предложено выделить в новый вид «ВеШеПа buryatiensis sp. nov.». Штаммы 1С, 2С, ЗС и 5С депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номерами ВКМ В-2721, ВКМ В-2722, ВКМ В-2723, ВКМ В-2724. Культуры 2С и 5С были депонированы в Корейской коллекции культур микроорганизмов под номерами КСТС 32193 и КСТС 32194.

Последовательность культуры 2С зарегистрирована в ENA под номером HF913423.

Описание «Belliella buryaliensis sp. nov.»

«Belliella buryaliensis» (N.L. fem. adj. buryatiensis - относящийся к Бурятии, региону, где находится оз. Соленое, из которого был выделен этот организм). Клетки грам-отрицательные, аэробные, палочковидные с закругленными концами, неподвижные и не образующие спор, длиной 1,92,1 мкм и 0,4 мкм в диаметре. Максимального роста достигает к 36 часам культивирования на морском бульоне при 30°С. На МА рост наблюдается после 24 часов инкубирования. Образует колонии оранжево-красного цвета, гладкие, блестящие и выпуклые, 2,5 мм в диаметре, не флюоресцирующие. Клеточными пигментами являются каротиноиды. Доминирующие жирные кислоты isoC15: 0, isoC15: 1 G, isoC17:lco9cis.

Оптимальная температура для роста 29-30°С. Рост наблюдается в интервале pH 7-10 (оптимум при 8-9), 0-50% NaCl (оптимум при 10-25 г/л). Оксидазо- и каталазо- положительные. Окисляет следующие источники углерода (положительный тест API-50CH): глицерин, L-арабинозу, D-ксилозу, D-галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, метил-аДЭ-глюкопиранозид, амигдапин, арбутин, эскулин, салицин, D-целлобиозу, D-мальтозу, D-лактозу, D-мелибиозу, D-сахарозу, D-трегалозу, D-рафинозу, крахмал, гентибиозу, D-туранозу и калия 2-кетоглюконат. Слабо окисляет D-арабинозу, D-манозу, L-сорбозу, L-рамнозу, метил-а,0-

маннопиранозид, инулин, D-мелицитозу, гликоген, ксилит и калия 5-кетоглюконат. С тестом API-20E положительная реакция на р-галактозидазу, аргинингидролазу, триптофандеаминазу, желатиназу и образование индола. Чувствителен к следующим антибиотикам: ампициллину+сульбактаму, тикарциллину, тикарциллину+клавулановой кислоте, пиперациллину, пиперациллину+тазобактаму, цефепиму, имипенему, меропенему, ципрофлоксацину, гентамицину.

Выделен из воды оз. Соленое (Кяхтинский р-он, Республика Бурятия).

Характеристика разнообразия микробного сообщества молекулярными методами.

Ограничения культуральных методов, позволяющих выделять в культуру не более 0,1-1% представителей микробного сообщества (Fendrich, 1988; Gilbride et al. 2006), не позволяют охарактеризовать имеющееся разнообразие. В связи с этим, для оценки разнообразия необходимым условием является применение молекулярных методов, используемых в настоящее время для решения задач микробной экологии.

Нами для этой цели были использованы три метода -использование ПЦР с групп-специфичными праймерами, ДГТЭ-ПЦР и пиросеквенирование.

Оценка разнообразия с помощью ПЦР с групп-специфичными праймерами. С использованием групп-специфичных праймеров была получена начальная характеристика наличия различных филогенетических групп бактерий и архей в сообществах различных экотопов (рис.2). Во всех пробах положительная ПЦР - реакция была выявлена на домен Bacteria. Доминирующие полосы были получены с праймерами на класс а-протеобактерий в пробах матов, по глубине колонки оз. Соленое, ила и заиленного песка оз. Сульфатное; а-, 8-протеобактерий в тех же пробах, за исключением грунтов оз. Сульфатное; (3 -протеобактерий - в матах и поверхностном слое прибрежных осадков оз. В.Белое; CFB-rpynna (цитофаги-флавобактерии-бактероиды) доминировала в колонке оз. Соленое, бациллы и актинобактерии - в пурпурном мате и заиленном песке оз. Соленое, планктомицеты доминировали в матах, там же выявлялись цианобактерии. Археи присутствовали в некоторых пробах матов и нижних горизонтах колонки оз. Соленое. Наибольшее разнообразие отмечено в грунтах озер, где активно идут различные процессы продукции и деструкции органического вещества.

■пиний Члто «да

ьР Ьр

f BU ВЫ CF BL> AGÍ 1гл CIA AKt ЛКС-tt-B ALf ЛОТ Ш BEI Ct М Ьр

Ь 1500 1500 ,

. % - ад.: „ - _ .. .

! .....a üs • ■ -

>» т

ш

.1500 :1200 1000

_ 500

""""" ™л"",< " «U« !

1500 1200 1000

500 300

Рис. 2. Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР-амплификации с групп-специфичными праймерами в пробах микробных матов и колонке донного осадка. М - маркер молекулярных масс ДНК.

Оценка генетического разнообразия микробного сообщества с помощью ДГГЭ-анализа. К пробам оз. Соленое из различных экотопов (воды, илов, песка, матов, отобранных в прибрежной части озера) был применен ПЦР - ДГГЭ метод. Выявлено отличие образцов по числу таксономических групп бактерий и их составу. Так, в образцах илистого песка присутствовал один уникальный фрагмент 168 рДНК, в пробах поверхностного слоя воды и прибрежного ила три и два, соответственно.

Последующий анализ полученных характерных ДГГЭ-профилей полос с помощью невзвешенного парногруппового метода кластерного анализа (рис.3) показал, что таксономический состав бактерий зеленого и пурпурного матов был идентичным, но отличался ог такового желтого мата, уровень сходства составил 94,2%. На дендрограмме маты формировали отдельный субкластер. Выявлен высокий уровень сходства таксономического состава бактерий матов и поверхностного слоя илистого песка, равный 88,3%. Фингерпринты проб поверхностного слоя воды и прибрежного ила проявили низкий уровень сходства с пробами матов и илистого песка - 53,0% и 58,9%, соответственно, и образовали отдельные ветви на дендрограмме. Полученные результаты показали высокое сходство таксономического состава бактериальных сообществ матов и поверхностного слоя илистых песков, с которых были отобраны маты, и его отличие от поверхностного слоя воды и прибрежного ила, что, вероятно, связано с физико-химическими характеристиками отобранных проб (насыщенность кислородом, рН, Н28 и т.д.).

»рнб?еяс1шй №1

миш гстмрхнястногс елея

12 3 4 5 6

А В

Рис.3 Схема электрофореграммы разделения фрагментов 16S рДНК (А) и дендрограмма сходства ДГГЭ-профилей фрагментов 16S рДНК (Б): 1 -мат желтого цвета, 2-маг пурпурного цвета, 3 - мат зеленого цвета, 4 - поверхностный слой илистого песка, 5 - прибрежный ил, 6 - поверхностный слой воды

Оценка разнообразия с помощью данных пиросеквенирования. Методом пиросеквенирования исследованы пробы поверхностного слоя (0-2 см) колонки донного осадка оз. Соленое и пробы прибрежного фунта оз. Сульфатное и выявлены их различия.

В обоих образцах доминирует фила Proteobacteria (рис.4). Субдоминантами в сообществе оз. Соленое в относительно равных долях являются Chloroflexi (19%), Firmicutes (17%) и Bacteroidetes (11%); в сообществе оз. Сульфатное только фила Bacteroidetes присутствует в количестве, превышающем 10%. Существенные различия выявлены в разнообразии таксонов и их соотношений (рис.5). Среди Proteobacteria в

пробе оз. Соленое доминируют классы y-proteobacteria (22,3%) и 5-proteobacteria (9,85%). Анализ их таксономического состава указывает на численное превосходство бактерий серного цикла. Так, в классе у-proteobacteria на долю рода Thioalkalivibrio, входящего в семейство Ectothiorodospiraceae, приходится 18 % последовательностей (к видам Th. nitratireducens и Th. paradoxus со сходством 97-99% относится 11,6 % и 0,8%). Известные представители этого рода являются облигатно алкалофильными хемолитоавтотрофными сероокисляющими бактериями, выделенными из образцов содовых озер (Sorokin et al., 2001; Banciu et al. 2005).

Рис. 4. Метагеномный анализ микробных сообществ поверхностного слоя донного осадка оз. Соленое (А) и прибрежного осадка оз. Сульфатное (Б) на основании анализа последовательностей гена 16S рРНК.

В классе 6-proteobacteria 6,33% всех последовательностей принадлежат физиологической группе сульфатредуцирующих бактерий. Среди известных представителей алкалофильных сульфатредукторов со сходством выше 97% выявлен только Desulfonatronum lacustre (0,1%). Большая же часть таксонов имеет сходство с ближайшими родственниками ниже ранга вида - на уровне родов и семейств. Только небольшое количество последовательностей имеет среди ближайших родственников культивируемые виды.

В другую многочисленную . филу Chloroflexi, входят представители трех классов Caldilinea (8,08%), Anaerolinea (6,8%) и Dehalococcoidetes (3,89%). Последовательности, принадлежащие этим классам, не имели среди ближайших гомологов культивируемых представителей. Известные виды Caldilinea и Anaerolinea являются анаэробными нитчатыми бактериями с нейтральным рН оптимумом для роста (Yamada et al., 2006).

.Рг«е*ка cttri* SIS

Б

В филе Firmicutes доминируют классы Bacilli (3,82%) и Clostridia (11,7%) с преобладанием представителей порядков Natranaerobiales и Clostridiales. Почти половина последовательностей Bacilli (1,77%) принадлежит виду Pediococcus lollii (сем. Lactobacillaceae). Этот вид известен как продуцент D- и L-молочной кислоты. Существенная часть (0,5%) принадлежит виду Enterococcus durans (сем. Lactobacillaceae). Natr anaer obiales - анаэробным, галофильным, алкалитермофильным бактериям, впервые выделенным из содового озера Вади эн Натрум (Египет) и кластерирующимися с некультивируемыми клонами и не идентифицированными бактериями из щелочных и соленых местообитаний, принадлежат 6,98% последовательностей сообщества.

Deltaproteobacteria Betaproteo bacte г (а Gammaproteobacteria

Aiphaprotäobacteria

Chroobacteria

Anaeroiineae

Caldillneae

Clostridia

Natranaerobfoles_c Dwlrjococci Ravofcacteiia Coriobacterila

Cytophagfa Bacilli

Oehaiococcoldetes

1Ш1

0.00

m

AF400152_S Thiobacillus_uc

Thioalkaiivibrio nitratireducens

D<>suiforhopaIus...uc

Hydrogenophaga taeniospiralis

Thioalkaiivibrio_uc

Natranaerobiales_uc__s

AY548939_s

Desulfosarcina__uc

Deltaproteobacteria...uc„.s

DQ394968„.f „uc_s

EU245244_g_uc

AJ534681_g_uc

Сульфатное Соленое

Сульфатное Соленое

А Б

Рис.5. «Горячая карта», показывающая % соотношения классов (А) и видов (Б) в образцах грунтов оз. Соленое и оз.Сульфатное (показаны таксоны, составляющие в сообществах более 2%). (АУ548939, 00394968 и др. - некультивируемые бактериальные клоны).

Единственный описанный представитель этого порядка Ыа^апаегоЫш 1кегторЫ1ш в процессе ферментации на сахарозе образует в качестве основных продуктов формиат и ацетат. В порядке Clostridiales (4,71%) 2,5% принадлежат неклассифицированным таксонам, 0,7% составляют последовательности, близкие роду Tindalia -анаэробным ферментирующим бактериям из содовых и соленых озер. Последовательности, близкие роду Апохупа1гопит, включающего единственного валидно описанного представителя Апохупа^опит $Шг1сит -

алкалифильного сахаролитического анаэроба из оз. Нижнее Белое (Бурятия), составляют 0,46%.

Выявленные последовательности филы Bacteroidetes, относятся к классам Bacteroidia (4,1%), Cytophagia (2,33%), Flavobacteriia (4,04%), Sphyngobacteriia (0,42%). Следует отметить, что большая доля последовательностей этого фила имеет наибольшее сходство с некультивируемыми и неклассифицированными бактериями. Только 0,18% последовательностей являются близкородственными с культивируемым видом Rhodonellum psychrophilum - психрофильной и алкалофильной бактерией из Гренландии, а также близки к родам Balneola (0,2%), с валидным видом В. alkaliphila из Средиземного моря и Aquiflexum (0,035%) с единственным видом А. baltika из воды Балтийского моря.

В образце оз. Сульфатное среди протеобактерий доминируют представители классов 6- proteobacteria (19,4%) и ß-proteobacteria (16,6%). Классы а- и у- proteobacteria составляют в сообществе 7,6 и 7,7% соответственно. Среди S-proteobacteria 87% последовательностей принадлежат к группе сульфатредуцирующих бактерий из порядков Desulfobacterales (с равными долями сем. Desulforhopalus и Desulfobacteraceae) и Desulfuromonadales (с доминированием родов из сем. Desulfuromonadaceae). Только 1,38% имели уровень гомологии выше 97% с известными видами сульфатредукторов - Desulfuromonas acetexigens, Desulfomicrobium baculatum и Desulfobacterium catecholicim.

В кл. ß-proteobacteria 7,5% последовательностей принадлежат р. Thiobacillus (сем. Thiobacillus) - чрезвычайно гетерогенному роду, включающему хемолитоавтотрофные и хемоорганогетеротрофные бактерии, окисляющие молекулярную серу и ее минеральные восстановленные соединения до сульфата. 0,47% в сообществе составляют последовательности близкие виду Th. thiophilus - облигатно хемолитоавтотрофной тиосульфат-окисляющей бактерии из нефтезагрязненных осадков, 1,46% - виду Th. thioparus, развивающемуся в нейтральных и щелочных средах. Большинство же (5,58% в сообществе) имели ближайшими гомологами некультивируемые бактерии. С вышеназванными тиобациллами гомология была на уровне 94-95%. Другим многочисленным видом класса ß-proteobacteria является Hydrogenophaga taeniospiralis (2,35%) из р. Hydrogenophaga (сем. Comamonadaceae, пор. Burkholderiales). Род Hydrogenophaga объединяет хемооргано- и хемолитоавтотрофные бактерии, использующие окисление водорода для получения энергии. Вид Я. taeniospiralis способен также и к гетеротрофной денитрификации нитрата (Willems et al., 1989).

К классу y-proteobacteria сем. Ectothiorhodospiraceae, включающего сероокисляющие хемолитоавтотрофные бактерии, принадлежат 0,5 % последовательностей. Последовательности,

относящиеся к роду Thioalkalivibrio, доминирующего в пробе оз. Соленое, составляли всего 0,32%.

Численное большинство (60%) в классе a-proteobacteria составляют последовательности, принадлежащие пор. Rhodobacterales сем. Rhodobacteraceae. Это семейство представлено в образце 37 таксонами родового ранга.

В филе Bacteroidetes (11% сообщества) к классам Bacteroidia относятся 64,8%, Sphyngobacteriia -15%, Cytophagia -10% и Flavobacteriia-8%. Так же, как и для пробы оз. Соленое, отмечается большая доля последовательностей имеющих наибольшее сходство с некультивируемыми и неклассифицированными бактериями.

В отличие от оз. Соленое, большую долю в сообществе оз. Сульфатное занимают Cyanobacteria (7%), преимущественно из класса Chroobacteria. Клоны показывают отдаленное родство с некультивируемым Synechococcus sp. AF400152 из щелочного гиперсоленого озера Моно Лэйк. В сообществе оз. Сульфатное не выявлены Natranaerobiales, широко представленные в осадках оз. Соленое; существенно ниже доля кл. Caldilinea и Anaerolinea филы Chloroflexi. Впервые для содовых озер Забайкалья в прибрежных осадках оз. Сульфатное выявлены последовательности, принадлежащие кл. е-proteobacteria, представленные одним порядком Campylobacterales.

Таким образом, метагеномный анализ, проведенный для осадков двух солоноватых озер Забайкалья, показал, что для их бактериальных сообществ общей чертой является весомая доля бактерий, участвующих на разных этапах в биогеохимическом цикле серы. Окисление серы и ее восстановленных соединений в восстановленном осадке из срединной части оз. Соленое осуществляют сероокисляющие бактерии р. Thioalkalivibrio. Численное превосходство Th. nitratireducens указывает на то, что в анаэробных условиях донных отложений озера окисление восстановленных серных соединений осуществляется с использованием нитратов в качестве конечного акцептора электронов. В прибрежных осадках оз. Сульфатное в процессе окисления восстановленных соединений серы участвуют аэробные бактерии р. Thiobacillus, отсутствующие в пробе оз. Соленое. Восстановление сульфатов в осадках озер осуществляется представителями разных родов. При этом типичные алкалифильные и галофильные сульфатредукторы р. Desulfovibrio, Desulfonatronjvibrio, Desulfonatronum, Desulfohalobium в пробах либо не выявлены (оз. Сульфатное), либо присутствуют в минорном количестве (оз. Соленое).

• В продукции ОВ в прибрежных осадках оз. Сульфатное участвуют цианобактерии, отсутствующие в более глубоких осадках оз. Соленое, где значительная часть органического вещества продуцируется

хемосинтетиками. В гидролизе полимерных соединений важную роль

могут играть бактероиды.

Статистическая обработка полученных результатов исследуемых

образцов с помощью построения кривой Rarefaction (генетическое

расстояние 0,03, соответствующее рангу «вид») показывает, что

достигнутая глубина секвенирования недостаточна для полной

характеристики бактериальных сообществ (рис.7). По количеству

выявленных филотипов и рассчетным коэффициентам видового богатства

бактериальное сообщество прибрежных осадков оз. Сульфатное является

более разнообразным, чем бактериальное сообщество осадков оз. Соленое,

отобранных с глубинной части (табл.5). 2000

О 1000 2000 3000 4000 S000 6000 7000 8000 Чпсю прочтенных последовательностей

Рис.7. Оценка микробного разнообразия сообществ донных отложений

озер.

Таблица 5. Показатели видового разнообразия и богатства для бактериальных сообществ грунтов солоноватых озер Забайкалья (генетическое расстояние 0,03).

Объект/ проба Кол-во валидных послед. Кол-во филотипов (ОТЕ) Коэфф-т Chaol Коэ^ф-т

Оз. Соленое/ колонка, глубинные осадки 2821 553 979 1304

Оз. Сульфатное/ прибрежные осадки 8093 1716 2862 3784

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые для оценки микробного разнообразия солоноватых щелочных озер Забайкалья был применен комплекс культуральных и молекулярно-генетических методов, позволивший охарактеризовать культивируемое и некультивируемое сообщество различных экотопов.

Среди бактерий, обитающих в воде и отложениях озер, представляющих сапротрофный компонент микробных сообществ этих экотопов, и доминировавших в момент отбора проб, нами были изолированы представители фил Firmicutes (кл. Bacilli - В. simplex, В.

safensis, В. aurantiacus, Jeotgal¡bacillus campisalis, Sporosarcina aquamarina, Paenibacillus glucanolyticus, Marinibacillus campisalis), Actinobacteria (кл. Actinobacteria - Micrococcus endophiticus, Rothia nasimurium, Citricoccus zhacaensis, Rhodococcus cercidiphylli), Bacteroidetes (кл. Sphingobacteria -«Belliella buryatiensis sp.nov» ), кл. a-proteobacteria (Paracoccus alcaliphilus, Loktanella vestfoldensis, Rhodobacter ovatus) и кл. y-proteobacteria (Pseudomonas peli, Halomonas ventosae). В основном, их ближайшие гомологи выделены из соленых (морских) и щелочных сред. Анализ собственных и литературных данных позволяет оценить % состав культивируемого бактериального сообщества следующим образом: 57,8%: протеобактерии (а-26,6% , у- 28,9%, 5- 2,2%), 22,2% - Firmicutes, 11,1% составляют Actinobacteria и 8,9% Bacteroidetes. Эти же филы составляли большинство и при оценке сообществ разными молекулярными методами. Применение метода пиросеквенирования позволило дать более полную характеристику состава бактериальных сообществ донных осадков, выявить общие и отличительные черты. Различия в составе микробных сообществ различных экотопов изученных экосистем определяются условиями среды обитания. На основании количественных характеристик доминирующих в бактериальных сообществах филотипов, можно предполагать, что при условиях жесткого селективного давления в оз. Соленое (высокая щелочность, повышенное содержание хлоридов, отсутствие кислорода и света) в большем количестве развиваются анаэробные, алкали- и галофильные и хемосинтезирующие организмы. При снижении селективного давления в оз. Сульфатное (более низком содержании солей углекислоты и хлоридов, доступности света и кислорода, но при этом высоком содержании сульфатов) в продукционном звене увеличивается доля цианобактерий, в деструкционном звене увеличивается доля сульфатредуцирующих бактерий. При этом бактериальное сообщество оз. Сульфатное оказывается более разнообразным и имеющим большее количество филотипов с неясным таксономическим положением.

Анализ полученных данных демонстрирует, что выделенные нами в культуру бактерии слабо представлены в исследованных сообществах. Выявление большого количества бактерий, имеющих наибольшее сходство с некультивируемыми формами и неясным таксономическим положением, свидетельствует как о слабой изученности подобных экосистем, так и об эндемичности обитающих бактерий.

ВЫВОДЫ

1. Выделены, охарактеризованы и идентифицированы 31 культура органотрофных бактерий, доминировавшие в бактериальном сообществе солоноватых озер Забайкалья и относящиеся к филам Bacteroidetes (6), Proteobacteria (10), Firmicutes (10), Actinobacteria (5).

2. Выделены и описаны аэробные органотрофные алкалифильные и галотолерантные бактерии, принадлежащие к новому виду рода ВеШеИа, для которого предлагается название «ВеШеПа Ьигуайетгъ

.ЩПОУ».

3. Методом пиросеквенирования определены составы бактериальных сообществ осадков двух солоноватых озер Забайкалья. В оз. Соленое доминировали бактерии филы РгсЛеоЬайепа (34,8%), субдоминировали СЫогоЯех1 (18,7%), Ктисйев (16,3%) и Вас1его1ёе1ез (10,9%). В оз. Сульфатное более 50% сообщества составляли представители Рго1еоЬас1епа, субдоминировали Вас1его1с1е1е5 (11,1%).

4. В условиях анаэробиоза и карбонатно-хлоридного засоления в бактериальном сообществе в большей степени присутствуют анаэробные и алкали- и галофильные организмы. В условиях сульфатного засоления увеличивается доля сульфатредуцирующих бактерий и общее разнообразие филотипов.

5. В составе бактериальных сообществ солоноватых озер значимая роль принадлежит бактериям серного цикла. Их таксономическое разнообразие зависит от конкретных условий в донных осадках.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Егорова Д.В., Дамбаев В.Б., Жавсац Ч. Физико-химические параметры солоноватых озер Монголии // Вестник Бурятского государственного университета. Серия 2: Химия. Вып. 3, Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2010. -С.22-24.

2. Захарюк А.Г., Егорова Д.В., Намсараев Б.Б. Распространение и морфология бактерий-деструкторов в содовом озере Зун-Торей (Забайкалье) // Вестник Бурятского государственного университета. Серия 2: Биология. Вып. 4, Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2010. - С.91-93.

3. Егорова Д.В., Козырева Л.П. Деструкция органических веществ в донных осадках содово-соленых озер Забайкалья // Вестник Бурятского государственного университета. Серия 2: Биология. Вып. 4, Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2011. - С.158-162.

4. Захарюк А.Г., Козырева Л.П., Егорова Д.В., Намсараев Б.Б. Физико-химическая и микробиологическая характеристика песчаных матов содового озера Зун-Торей (Забайкалье). // Вестник Московского государственного областного университета, №1, 2010 г. - С. 104-107.

Статьи в нерецензируемых журналах:

5. Егорова Д.В., Ананьина Л.Н., Козырева Л.П., Захарюк А.Г., Плотникова Е.Г. Физико-химические свойства и микробное разнообразие озера Соленое (Республика Бурятия). // Вестник

Пермского университета. Серия: Биология. Вып.1, Пермь: Изд-во ПГУ, 2011. - С.55-60.

Тезисы:

6. Егорова Д.В., Козырева Л.П., Ананьина Л.Н. Разнообразие доминирующих культивируемых бактерий содовых озер Бурятии. // Материалы 2-ой междунар. Науч. конф. «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии», Улан-Удэ, Изд-во БНЦ СО РАН, 2011. С.168-170.

7. Егорова Д.В., Ананьина Л.Н. Оценка микробного разнообразия озера Зун-Торей (Забайкальский край). // Материалы междунар. конф. «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний», Улан-Удэ - Улаанбаатар, Изд-во БГУ, 2011. С.77-79.

8. Захарюк А.Г., Егорова Д.В. Бактерии-деструкторы органического вещества в щелочных озерах Бурятии и Забайкальского края // Материалы 6-ой молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2010. С. 99-102.

9. Егорова Д.В., Козырева Л.П. Целлюлозоразлагающие бактерии содово-соленых озер Забайкалья и Монголии. // Материалы Всерос. конф. с междунар. участием «Современные проблемы микробиологии Центральной Азии», Улан-Удэ, Изд-во БГУ, 2010 г. С.25-30.

10. Егорова Д.В. Филогенетическое разнообразие микробных сообществ в озере Соленое, Республика Бурятия // Материалы Региональной научно-практической конференции «Структура, функционирование биосистем и экологическая безопасность», Улан-Удэ, Изд-во Бурятского госуниверситета, 2012. 4.2. С. 174-178.

11. Егорова Д.В., Козырева Л.П. Таксономическое разнообразие бактериального сообщества иловых отложений оз. Соленое (Бурятия) // Материалы 8-ой . молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, 2012. С. 99-102.

Подписано в печать 19.04.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,6 печ. л. Тираж 100. Заказ №20.

Отпечатано в типографии Изд-ва Федерального государственного бюджетного учреждения науки БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Егорова, Дарья Васильевна, Улан-Удэ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ СО

РАН

На правах рукописи

П4201355^67

Егорова Дарья Васильевна

ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА РАЗНООБРАЗИЕ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ СОЛОНОВАТЫХ ОЗЕР ЗАБАЙКАЛЬЯ

03.02.08 — экология (биологические науки) 03.02.03 - микробиология (биологические науки)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук Козырева Л.П.

Научный консультант: доктор биологических наук Намсараев Б.Б.

Улан-Удэ - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ ..........................................4

ВВЕДЕНИЕ ................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика Забайкалья и распространение

минеральных озер на его территории ........................................................8

1.2. Микробные сообщества содово-соленых озер ....................................12

1.2.1. Трофические взаимодействия и активность процессов ............14

1.3. Основные подходы к изучению микробных сообществ ..........20

1.4. Применение методов молекулярной биологии ................................22

1.4.1. Биохимические методы ..........................................................................................23

1.4.2. Методы на основе нуклеиновых кислот ..................................................24

1.4.3. Профили микробных сообществ ....................................................................26

1.4.4. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) ....................................33

1.4.5. Микробная идентификация на основе экологических функций ..................................................................................................................................34

1.4.6. Технологии микрочипов ........................................................................................35

1.5. Заключение к литературному обзору ..........................................................37

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика исследуемых озер ............................................................39

2.2. Методы отбора проб ................................................................................................41

2.3. Методы полевых и лабораторных химических исследований ..................................................................................................................41

2.4. Оценка активностей процессов разложения белка и целлюлозы в осадках исследуемых озер ................................................42

2.5. Методы учета численности бактерий ......................................................42

2.6. Методы выделения и поддержания чистых культур ..................43

2.7. Методы изучения морфологии клеток ......................................................44

2.8. Методы исследования экофизиологических и биохимических характеристик штаммов ..............................................44

2.9. Хемотаксономические методы характеристики штаммов ... 45

2.10. Генетические методы ..............................................................................................45

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Краткая характеристика объектов исследования ..........................51

3.2. Характеристика культивируемого микробного сообщества озер

3.2.1. Количественная характеристика структуры микробного сообщества осадков озер ........................................... 55

3.2.2. Вертикальное распределение бактерий в донных осадках

оз. Соленое, Верхнее Белое и Зун-Торей ........................ 57

3.2.3. Оценка активностей процессов разложения белка и целлюлозы в осадках исследуемых озер ........................ 60

3.3. Характеристика разнообразия культивируемого бактериального сообщества различных экотопов озер ....... 61

3.3.1. Экофизиологическая характеристика культивируемых бактерий ............................................................... 62

3.3.2. Генотипическая характеристика культур ....................... 65

3.3.3. Новый таксон рода Belliella филы Bacteroidetes ............... 73

3.4. Характеристика микробного сообщества молекулярными методами ............................................................... 80

3.4.1. Оценка разнообразия с помощью ПЦР с групп-специфичными праймерами ....................................... 82

3.4.2. Оценка разнообразия микробного сообщества оз. Соленое с помощью ПЦР - Д11 Э-анализа .................................. 88

3.4.3. Использование ДГГЭ-анализа для оценки разнообразия накопительных культур ............................................ 90

3.4.4. Оценка разнообразия с помощью данных пиросеквенирования ................................................ 96

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................... 107

ВЫВОДЫ ........................................................................... 108

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ......................... 110

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АБС - бактериохлорофилл-я содержащие бактерии

АФБ - аноксигенные фотоэубактерии

ДГГЭ (DGGE) - денатурирующий градиентный гель-электрофорез

мМ - миллимоль

нк - накопительные культуры

ОВ - органическое вещество

ОМ - общая минерализация

OTE - операциональная таксономическая единица

ПБ - протеолитические бактерии

ПЦР - полимеразная цепная реакция

рДНК - рибосомальная дезоксирибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомальная рибонуклеиновая кислота

Сорг - углерод органический (органическое вещество)

ЦРБ - целлюлозоразлагающие бактерии

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность

Микробные сообщества содовых и соленых водоемов являются объектом интенсивных исследований, которые не теряют своей актуальности в течение последних десятилетий. Это связано с выяснением роли микроорганизмов в функционировании данных экстремальных мест обитания и открытием новых видов алкали- и галофильных представителей микробного сообщества (Заварзин, 2004; Жилина, 2001, 2005; РИсЩа е1 а1., 2003; Гарнова, 2003 и др.). Предметами исследования являлись разнообразие и функционирование микробных сообществ. При проведении этих исследований использованы классические микробиологические методы выявления и изучения физиологических групп, определения скоростей микробных процессов, выделения и описания культур микроорганизмов (Намсараев и др., 1999; Намсараев, Намсараев, 2007; Горленко и др., 1999; Заварзин и др., 1999; Богокт е1 а1., 2003; Сорокин и др., 2001; Ешинимаев и др., 2001; Жилина и др., 2005; Брянцева, 2000; 1опез е1 а1., 1998; 1т1ю1Т е1 а1., 1979; Огеп, 2000; и др.).

Использование методов молекулярной биологии позволило значительно расширить представление о разнообразии культивируемых и некультивируемых представителей различных местообитаний, в том числе содовых и соленых озер Африки, Америки, Китая и др. регионов (ДееБ е1 а1., 2003; МезЬаЬ, АЬои-Е1-Е1а & \Vigel, 2007; МмапсЫа ег а1., 2011; Уа1епгие1а-Епстаэ е1 а1., 2009 и др.). Однако необходимость проведения этапа клонирования и независимого секвенирования фрагментов рибосомных генов позволяли проанализировать не более сотен последовательностей. Развитие новых технологий секвенирования (пиросеквенирование) сделали возможным одновременный анализ тысяч - сотен тысяч последовательностей (Ма^иНБ е1 а1., 2005), что открыло новые перспективы в изучении микробных сообществ различных экосистем (8Ьокга11а а1., 2012; ZmgQr е1

5

а1., 2012). Проведение исследований микробного разнообразия содовых и соленых озер Забайкалья с использованием современных молекулярно-биологических методов дает возможность изучения этих экстремальных мест обитания на новом уровне.

Цель исследования: изучить разнообразие культивируемого и некультивируемого микробного сообщества в зависимости от экологических условий и выявить функциональную роль доминирующих бактерий. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить физико-химические показатели исследуемых озер.

2. Определить численность бактерий деструкционного звена.

3. Определить таксономическое положение органотрофных бактерий, выделенных из воды и донных осадков солоноватых озер Забайкалья и идентифицировать доминирующих представителей.

4. Оценить влияние экологических условий в исследуемых озерах на разнообразие культивируемого и некультивируемого сообщества микроорганизмов.

5. Выявить функциональную роль доминирующих бактерий.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые с использованием методов молекулярной экологии проведена

оценка разнообразия микробного сообщества различных экониш содово-

соленых озер Забайкалья. Впервые с помощью высокопроизводительного

секвенирования фрагментов генов 168 рРНК проведена качественная и

количественная характеристика состава бактериальных сообществ донных

осадков озер Соленое и Сульфатное, различающихся по содержанию

основных анионов. Установлено, что в количественном отношении ведущая

роль принадлежит бактериям серного цикла, состав которых зависит от

конкретных условий в донных осадках. Показано, что фила Вас1его1ёе1ез,

наиболее характерная для водной среды, играет большую роль в донных

6

осадках, являясь субдоминантом филы РпЛеоЬайеиа. Выделен и описан новый представитель филы Вас1егчлс1е1е8 - аэробные, алкалофильные бактерии рода ВеШеПа для которых предложено название «ВеШеПа ЪигуаИет1$ эр. поу.».

Полученные результаты расширяют представление о разнообразии культивируемого и некультивируемого сообщества содово-соленых озер Забайкалья. Данные по составу бактериального разнообразия донных отложений могут быть использованы для реконструкции путей метаболизма в сообществе и целенаправленном выделении организмов или генов для использования в разработках новых биотехнологий на основе соле- и щелочеустойчивых ферментов. Результаты исследований могут быть использованы в учебном процессе в курсах изучения микробиологии и экологии и подготовке учебно-методических пособий.

Апробация работы.

Материалы диссертации были апробированы в виде докладов на Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010; 2012); Всероссийской конференции с международном участием «Современные проблемы микробиологии Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2010); 2-ой Международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011); Международной конференции «Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов экстремальных местообитаний» (Улан-Удэ - Улан-Батор, 2011); Региональной научно-практической конференции «Структура, функционирование и экологическая безопасность» (Улан-Удэ, 2012).

Публикации

По результатам исследований опубликовано 11 печатных работ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика Забайкалья и распространение минеральных озер на его территории

Забайкалье находится практически в центре азиатской части материка и представляет собой обширную природную территорию России, к востоку и юго-востоку от озера Байкал. Здесь расположены Забайкальский край, Бурятия. Протяжённость с запада, от берегов Байкала, на восток, до слияния рек Шилка и Аргунь, свыше 1000 км. Протяженность с севера (Патомское и Северо-Байкальское нагорья) на юг (государственная граница России с Монголией и Китаем) около 1 ООО км Рельеф Забайкалья определяется чередованием среднегорных хребтов (Даурский, Малханский, Олёкминский Становик) и межгорных котловин (Баргузинская, Верхнеангарская и т. д.). В северной и западной части Забайкалья сильнорасчлененные высокогорные хребты Станового нагорья с ледниками(Атлас Забайкалья, 1967).

Значительная часть Забайкалья относится к зоне тайги, граничащей на юге с лесостепями и сухими степями. Горно-котловинный рельеф обуславливает переплетение горизонтальной зональности и высокогорной поясности ландшафтов. Низкогорья и равнины юго-восточного Забайкалья и часть котловин заняты злаково-разнотравными степями.

Климат Забайкалья резко континентальный, характеризуется значительными суточными и годовыми колебаниями температуры воздуха (от - 40 до + 40°С), малым количеством осадков (возрастает с юго-востока на северо-запад и от котловин - 300 мм, к вершинам хребтов - до 1000 мм в год), неравномерным распределением их по сезонам (более 70 % выпадает летом) и большой сухостью воздуха. Большинство водоемов в засушливые годы пересыхают до дна и вновь наполняются в дождливое время. Многие озера относятся к соленым озерам, опресняющимся в период многоводья, и минерализация их постоянно меняется (Власов, Филиппова, 1973; Иванов, 1977; Уфимцев, 1998). К концу 21 века температура воздуха в Забайкалье,

8

возможно, увеличится на 3,5-4,5 °С, атмосферные осадки - на 10-15% (больше в зимнее время). Такие региональные прогнозы были получены при оценке возможных климатических изменений Забайкалья с использованием данных 4-го доклада Межправительственной группы экспертов по изменению климата (1РСС, 2007).

На территории Забайкалья выявлено около 800 минеральных озер (Содовые озера Забайкалья, 1991). Данные озера являются типичными озерами континентального типа, которые никогда не были связаны с морем. Все озера характеризуются крайне неустойчивым режимом, и состав воды резко меняется не только в годичном цикле, но и в одни и те же периоды разных лет в зависимости от метеорологических условий. Большое влияние на формирование режима озер влияет многолетняя и сезонная мерзлота. Водонепроницаемый слой многолетней мерзлоты, повышая уровень грунтовых вод, ускоряет процесс засоления почв, а следовательно, и накопление солей в озерах (Малышев, 1927).

Основное водно-солевое питание озера Южного Забайкалья получают за счет временных дождевых потоков и грунтовых вод. Также формирование химического состава воды происходит вследствие вымораживающего и испарительного концентрирования солей. Ионный состав вод озер формируется благодаря увеличению концентрации ионов натрия, хлора, сульфатов и гидрокарбонатов, в то время как концентрация ионов кальция, магния, калия и карбонатов изменяется мало. Аналогичные закономерности характерны для озер, расположенных на территории России, Австралии, Монголии и других регионов (Алекин, 1973).

По минерализации озера Южного Забайкалья относятся в основном к олигогалинному и мезогалинному типам, содово-галитному подтипу, соотношение сульфатов к хлоридам в этих озерах колеблется в пределах от 0,1 до 0,9. Среди катионов в воде преобладают щелочные металлы, т.е. ионы К+, М§2+, Са2+. В летнее время щелочность среды поддерживается в

озерах за счет утилизации свободной углекислоты фитопланктоном. Озерные воды летом умеренно жесткие, зимой - жесткие. В водах содовых озерах Забайкалья преобладают ионы Са2+, исчезновение М§ из озерного раствора происходит за счет его связывания в органоминеральные коллоиды или в результате обменной реакции с ионами Са (Содовые озера Забайкалья, 1991).

В зимний период во многих озерах замерзает не только вода, но и донные осадки, и илы, выстилающие дно озерных котловин. При полном замораживании озерной воды происходит подледная садка солей, которая наблюдается и в слабоминерализованных озерах. В основном кристаллизуется мирабилит, гидрогалит, углекислый газ, десятиводная сода, гидрокарбонат и другие соли. С наступлением весны при таянии льдов многие соли, такие как гидрогалит, десятиводная сода и гидрокарбонат и некоторые другие, переходят в раствор, а тогда как мирабилит остается нерастворенным на дне озера. Весной и летом в связи с переходом водорастворимых солей, в том числе карбонатов, бикарбонатов и хлоридов в раствор повышается соленость и общая щелочность, а также значения рН воды. Водородный показатель в некоторых озерах увеличивается до 11, а соленость до 100 г/л (Локоть и др., 1991).

В условиях теплого сухого климата сочетание частичного задержания кальция на водосборах, его осаждения в самих озерах и интенсивных продукционных процессов приводит к формированию содовых озер и гидрокарбонатно-магниевых озер эвтрофного и гипертрофного типов. Главная климатическая черта лесостепной и степной зон - превышение испарения над осадками, поэтому в формировании химического состава вод начинают играть роль испарительная концентрация элементов в озерах и осаждение труднорастворимых солей кальция (Моисеенко, Ганшина, 2005).

В степных участках имеется большое количество соленых озер, основные из них расположены в замкнутых межгорных котловинах -

Баргузинская, Боргойская, Селенгинская и озера Онон-Борзинской (Забайкальский край) и Онон-Керуленской группы (Монголия).

Самая крупная группа - Онон-Керуленская, насчитывает приблизительно 500 водоемов (Дзюба и др., 1997). Озера данной группы являются мелководными и имеют относительно малую площадь от 0,5 до 3,8 км2. рН озер варьирует от 8,1 до 10,5. По минерализации озера подразделяются на солоноватые (5,3-30,08 г/л) и рассольные (50,0-382,8 г/л). Преобладающим катионом является ион натрия, анионами - карбонаты, гидрокарбонаты и хлорид-ионы. По классификации М.Г. Валяшко озера относятся к сульфатно-хлоридному, сульфатно-натриевому и карбонатному типам.

Торейские озера - Зун-Торей и Барун-Торей - расположены на границе Читинской области и Монголии. Считается, что 150-80 млн. лет назад огромная территория от южных отрогов Могойтуйского хребта до северных степей Монголии была покрыта водами древнего Проторейского моря (составлявшего часть океана Тетис). Остатками этого моря и являются Торейские озера, а также множество мелких содово-соленых озер, разбросанных в степи на всем протяжении от российско-мон�