Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние бутилкаптакса и дроппа на структурно-функциональное состояние митохондрий и микросом печени крыс в эмбриогенезе

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние бутилкаптакса и дроппа на структурно-функциональное состояние митохондрий и микросом печени крыс в эмбриогенезе"

ЛКАДЕЛШЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

УДК: 616.36:577.15.025.3:576.311.347.332:618.3

ТУЙ Ч И ЕВА Дильфуза Сидикджановна

ВЛИЯНИЕ БУТИЛКАПТАКСА И ДРОППА НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МИТОХОНДРИЙ И МИКРОСОМ ПЕЧЕНИ КРЫС В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ

03.00.25 — клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1994

Диссертационная работа выполнена в лаборатории структурной организации биологических мембран Института биохимии АН РУз

Научный руководитель: Доктор биологических наук,

профессор А. К- Мирахмедов

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор П. И. Ташходжаев

Доктор биологических наук, профессор К. Т. Алматов

Ведущая организация: Институт физиологии и биофизики АН РУз

Защита состоится » Г.С^Сс .1994 г. в «.

часов на заседании специализированного совета Д 015.16.21 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии АН РУз по адресу: 700143, г. Ташкент, проспект академика X. Абдуллаева, 56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН РУз.

Автореферат разослан

_1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

С. А. БУРХАНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

№туалы]ость_ПЕоблемы. Проблема охрани внеЕней среды от загрязнения химическими веществами и защиты населения от их 1ействия в настоящее время приобрела особую актуальность. 1ервостепенное знамение имеет влияние широко применяемых в зельском хозяйстве пестицидов на будуцие поколения ладей. Это влияние паяет реализоваться за счет мутагенных, эмбриотоксических и тератогенных свойств этих ядохимикатов (А. Иералиев, 1985; 3-Й- Колесников. 1986). Накопление ядохимикатов в организме беременных женщин может привести к хроническим интоксикациям и генетическим сдвигам у потомства, к появлению у него скрытых биохимически "запечатленных" в эмбриогенезе паталогий плода. В литературе имеются данные, что пестициды способны проникать через, плаценту (А.А- Динерман, 1980; Б.Е. Каган, 1931 .ЛгкЗо ег а!.,1965).

Среди различных подходов. используемых для расви^ровки механизма действия химических веществ, большая роль принадлежит биохимическим и электронномикроскопическич методам исследования на субклеточном уровне. Особенно важны они для выявления первичных взаимодействий чужеродного , вещества с внутриклеточными компонентами.

В анализе токсического действия химических веществ особое место занимает их влияние па структуру и функцию мембран митохондрий и микросоп, поскольку именно эти субклеточные структуры наиболее вероятные мнтени их действия- Показано, что при действии пестицидов нарушаются важнейшие процессы, связанные с мембранами этих органелл. их сложной организацией, обеспечиванием направленность и скорость протекания той или иной клеточной функции (Е-Г- Шабарчин, 1979; Меркурьева, 1982).

Ц2ль_и__задачи_цсследо§шшя ■ Исследовать эмбриотоксическое

действие бутнлкаптакса и дроппа на структурные и функциональные параметры гепатсцитов и субклеточных органелл клеток печени т различные сроки эмбрионального развития.

В рамках этой цели представляло решить следующие задачл:

- Исследовать электронномикроскойическуп картину под влиянием пестшшдсв - бутнлкаптакса и дроппа на гегптоциты и субклеточные структуры печ«ни беременных ирис и их эмбрионов.

- Изучить влияние бутнлкаптакса и дроппа на фос-фолипидный

состав митохондриальной и микросомальной фракции печени беременных крис и их эмбрионов.

- Исследовать влияние бутилкаптакса и дроппа на перикисное окисление липидов митохондриальной и * микросомальной фракции печени беременных крыс и их эмбрионов.

- Изучить действие бутилкаптакса и дроппа на биоэнергетические параметры митохондрии и монооксигеназную активность микросом печени беременных крис и их эмбрионов.

11а^НИаа_112Еизиа. с позиции современной мембранологии и токсикологии проведен комплексный анализ механизма морфо-функциональных перестроек субклеточных структур печени в динамике после повторного введения бутилкаптакса и дроппа с применением комплекса электронномикроскопических, биохимических и

биофизических методов исследования.

1. Введение животным• бутилкаптакса и дроппа приводит к структурным нарушениям субклеточных компонентов печени беременных крыс и эмбрионов■ укладывающихся в картину хронического гепатита.

2. При отравлении вышеперечисленными пестицидами, наблюдаются значительные изменения в фосфолшшдном составе и в процессах свободнорадикального окисления липидов (НОЛ) мембран исследуемых субклеточных структур во время беременности- и эмбрионального развития.

3. Показано, что бутилкаптакс и дропп вызывают сдвиги в ряде функциональных параметров ' митохондрии и микросом печени беременных крыс и эмбрионов. Влияние пестицидов на плод зависит от стадии эмбрионального развитии -

Полученные данные ,.расширяют наии представления о механизме-возникающих изменений в структурных и функциональных параметрах митохондрии и микросом в период беременности и эмбрионального развития. Результаты исследовании расширяют паши представления о формировании химического порааения клетки, способствуют решению вопросов, связанных с изучением развития аномалий и отклонений от нормы при отравлении ядохимикатами эмбрионов на разных этапах морфо-функциональной дифф-еренциры-ки. а также в период беременности.

ПШШШ£!ШМШ1Шосхь. Выполненные исследования по1 огут выявить закономерности, возникающие при действии пестицидов на структурно-функциональные состояния субклеточных структур печени

и в целом организма, которые следует учитывать при разработке санитарно-гигиенических регламентов по производству и применении пестицидов, а также дополняют .существующие представление о механизме повреждающего действия этих ядохимикатов, и на основе этого можно разработать методы профилактики и лечения болезней химической этиологии.

¿□ЕОбацид. Материалы диссертации доложены на 20-й конференции Федерации Европейских биохимических обществ (Будапешт. 1990), 3-м Европейском конгрессе клеточной биологии (Флоренция, 1990), V конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Таикент, 1991), Республиканской научно-практической конференции "Актуальные экологические проблемы Кыргызстана" (Ош, 1993), объединенном семинаре лабораторий клеточной биологии, структурной организации биологических мембран, радиационной биотехнологии Института Биохимии АН рУз.

Публикаций- По теме диссертации опубликовано 5 работ.

С1Р¥К1УМ_И__QSbgM__caioia- Диссертация изложена на ЮЗ

страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, и двух глав, заключения и выводов. Текст иллюстрирован 15 таблицами и 16 рисунками. Список использованной литературы включает ibC источников,в том числе i'*' отечественных и SC зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовали белых крыс - самок массой 150 -180г. Затравку животных бутилкаптаксом и дроппом в дозе 1/10 ЛД50 проводили внутривелудочно специальным зондом на 3, 13 и 19-й дни беременности, соответствующие имплантационному периоду, органогенезу и плодному периоду эмбрионального развития.

Митохондрии и микросомы гепатоцитов выделяли методом дифференциального центрифугирования.

Для электронномикроскопических исследований образцы тканей печени фиксировали в 2,5^-ном растворе глвтароальдегида на 0,1мИ.,. фосфатном буфере (рИ 7,4) с последующей дофиксацией в -ЦИюм растворе OsO^. После обезвоживания материал заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы получали на ультратоме ШЗ-1П (Швеция). Препараты контрастировали уранилацетатом с цитратом

свинца, затем исследовали ь электронном микроскопе. Дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий исследовали

полярографическим методом(Chance,Williams,1955), НАД.Н-оксидазную и сукцинатоксидаэную активности митохондрий определяли по методу Y.Hatefl et al.(1962) в модификации Рахимова и Алпатова (1977), цитохром-с-оксидазную активность - по методу D.C. Wharton et D.S.Grlííeth3 (1961), содержание цитохрома р-450 в микросомах -пометоду T.Omura, P.Sato (1954), интенсивность перикисного окисления липидов (ПОЛ) в митохондриях и микросомау - по содержанию малоновогодиальдегида (ИДА). Липиды экстрагировали по методу î-ольча (1951) и фракционировали методом тонкослойной хроматографии (Ахрем, Кузнецов, 1965).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ни изучали ультраструктуру гепатоцитов беременных крыс и их эмбрионов, отравленных в разные сроки беременности бутилкаптаксом и дропгюм.

При отравлении бутилкаптаксом на 3-й день беременности наблюдаются изменения структуры и формы митохондрий. Многие иэ них с мутным матриксом. Характерно появление в митохондриях единичных вакуолей, че^о не наблюдается в норме. Отмечается резкая очаговая гиперплазия гранулярного ретикулума.

В случае затравки дроппом на • 3-й день беременности для материнских гепатоцитов также характерен полиморфизм митохондрий-Они набухшие, с . мутным матриксом. • Появляются внутримитохондриалыше вакуоли. Наблюдается уменьшение I1 фрагментация гранулярного рь^икулума. В цитоплазме появляются липидные капли- По мнению Э.А. Турсунова (199Г"), эти изменения свидетельствуют о низкой активности митохондрий.

При отравлении бутилкаптаксом на 3-й день в гепатоцитах эмбрионов обнаружены липидные капли, по структуре похожие на нейтральные аиры. По данным Е-Б- Бурлаковой (1989) и л.Г. ¡(¿ло1~ (1990), вировые капли в цитоплазме клетки - результат наруг-шия метаболических процессов перекисного окисления липидов. Большое число капель ра'еполоиено на синусоидальном полюсе.' Нитохондрт набухшие, матрикс их светлый, но кристы деформированы.

Гранулярная оеть слабо вырагена, отмечается везикуляция их. В зезикулах содергчтся 'хлопьевидный материал. Гранулярная сеть, зкутывавщая митохондрии, имеет более близкий контакт с ними.

Отравление дроппом в этот хе срок приводит к появлению о гепатоцитах эмбрионов митхондрий различных форму и плотности. Эсковная масса митохондрий умеренно набухшая, матрико мутный, контуры мембран и кристы нечеткие, плохо различимы. Пестами этмечагстся скопления гранулярного ретикулума в виде удленешшх канальцев. Некоторые из них фрагментированы и густо усеяны рибосомами.

В гепзтоцитах печени беременных крыс и эмбрионов, отравлении:: бутилкаптаксом и дроппом на 13-й день беременности, наблюдаются изменения в ульггаструктуре митохондрий и эндоплазматического ретикулума, но они выражены слабее чем на 3-й день.

На 19-й день беременности при отравлении бутилкаптаксом н дроппом в гепатоцитах печени матери и плода такге наблюдается полиморфизм митохондрий. Кристи их нечеткие, укороченные, матрикс просветленный. Эндоплазматический ретикулум фрагментирован. Появляются липидные капли в большом количестве. Следовательно, при интоксикации этими пестицидами к 19-му дня беременности ультраструктура не нормализуется.

На основе электронномикроскопических исследований мояно заключить, что бутилкаптакс и дропп вызывают ультрзструктурные изменения в гепатоцита* беременных крыс и эмбрионов.

Свойства биологических мембран во многом зависят от фосфолипидного состава, который регулирует их проницаемость для различных веществ и продуктов метаболизма, а такге сопрягенность и последовательность многочисленных ферментативных процессов.

Обнаруженные нами изменения в морфологической картине печени беременных крыс и их эмбрионов при затравке бутилкаптаксом и дроппом предполагают наличие колебаний и в структурных компонентах мембран органелл гепатоцитов. Поэтому в следующей серии экспериментов мы исследовали влияние бутилкаптакса и дроппа на липидннй состав митохондрий и микросом печени беременных крыс и эмбрионов в различные сроки беременности.

При затравке беременных крыс бутилкаптаксом на 3-Й день беременности в митохондриях наблюдается повышение содержания• фосфлтмдной кислоты (ФК) и лизофосфолипидов (МЛ). На 13-й день

беременности отмечено снижение уровня фосфатидилэтаноламина (ФЭ) и суммарной фракции фосфолипидов на фоне повышения уровня ФК, ЛФЛ и отношения ХС/ФЛ. При отравлении на 19-й день беременности отмечено достоверное снижение содержания фракции ФЭ и суммы фосфолипидов на фоне повышения • содержания ФК. ЛФЛ, а также отношения ХС/ФЛ.

Затравка беременных крыс бутилкаптаксом оказывает влияние и на лилидиый состав митохондрий печени эмбрионов в различные сроки

Таблица 1

Фосфолипидный состав митохондрий печени беременных крыс при действии бутилкаптакса (в % к общему липидному фосфору, п=7)

Фракции фосфоли-

ФХ ФЭ ДФГ ФС ФИ ФК ЛФЛ ФЛмкМоль ХСмкМоль ХС/ФЛ

Т_~с_в1е_к1йт_б1е_Е_ё1м_ети1н_й_с_1_и_ Контроль J 3 J 13 • J 19

_Н_11ИЙ1

46.1

30.2 13.1

2,5

3.5

2.3

1.6 14 2

5.4

4,1

2,7 0,8 0,5 0,3 0,4 0,2 0.7 0,6

0,380

44,5 27,4 14,4 2,9

4.1 3,9 2.1

13,1

5.2

0,326

5,2 2.1 1,1 0,7 0,3 0,5 0,4 0,4 0,5

43,4 26,2 14,9 3,1 4,4 4,1 2,8 12,4 5,0

4,8 1 ,6 1.2 0.4 0,6 0,3 0,4 0,5 0.7

0,408

40,2

24.5 17,4

3,6 4,6 4,5 4,5

11.6 4,9

0,422

о 5 í>* 1.2 0,4 0,5 0,3 0,7** 0,6** 0,3

Фракции фосфоли-

ЛШЮВ____

ФХ

ФЭ

ДФГ

ФС

ФИ

ФК

си

ЛФЛ ОмкМоль ХСмкМоль ХС/ФЛ

Таблица 2

Фосфолипидный состав митохондрий печени эмбрионов крыс при действии бутилкаптакса (в % к общему липидному фосфору, п=7)

СгшОйШоПальшдо

Контроль J з_ J" ~13~ J "l9~

42,4 35,8 13,2 2,5 1,5 1,3 0,7 2,0 13,1 4,7 О

2.5 2,4 0.6 0,15 0,09 0,06 0,04 0,12 0,06 0,05

,358

42.8

34.9 13,4

2,9 0,7 1.5 0.9 2.0 6.2 2,3

3,1 3.1 0,91 0,21 0,08 0,07 0,08 0,09 0.0Л 0,12

0,365

42,0 33,4 13,6

3.1 1,0

1.7

1.2 2,6

9.8 3,7

0,375

1.9

2.1 0,7 0,18 0,12 0,09 0,10 0,08 0,09 0,14

41,0 ± 2,1 32,9 t 1 ,8 13,8 í 1,1 2,5 ± 0,12

1,4

2,0 1 .0 3,8 12,9 5,0

0,387

0,09 0,11** 0,11 0,17**'

0,08' 0,72

Примечания: д&нные Btí к общему фосфору, п=7.

*.' Р < 0*05 *** Р < 0,01

IX догоггчя.- Однако эти избиения менее ппраяшм* »тметить. что и к этом г.дуча1.» наблюдается трндешпш к псоинпш» 1роцрнтного соотч- г>«т<я ТК и ЛМ, а тлкго отношения ХС/ФЛ при правлении на 19-й день развития (табл. 1 и 2).

При затравке »цветных дрогшем и липидном составе мипхсч-Фт! гечени беременных крыс отмечено достоверно» поянчк'ике щюцентното едеряания'ФК и ЛФЛ на фоне снижения ФЭ и супин липидон. сношение ХС/ФЛ повышается.

П митохондриллышх фракциях гепатоцнтсп плода при отравлении роппом на 19-й день развития обнаружено достоверное увеличение К и МЛ в процентном соотношении и в пересчете на лшшдинЯ осфор на фоне снижения содержания ТЭ и суммы ФЛ в пер^чето ип ипидный фосфор. А другие сроки эмбрионального рлапития при травлении пестицидами заметных тмпкчшй в липидном составе итохондрий печени эмбрионов не выяплено.

При введении бутилкаптакса на 3, 13 и 19-й дни беременности в икросочальных фракциях печени беременных крыс наб.эдаг'ТПЯ енленция к снижению уровня фссфолниидоп относительно контроля и ри пересчете содержания фосфолинидннх фракций на .пшидчы! осфор. При этом ФЭ -фракция снижается е чем на ЗСК, 'IX - на 5%. снияениз уровня фсч-фояичидов с Лоямшй мзссой приводит 15 аденип согер'ачия суммлрнсй Фракции фосфолипидои к 19-му лип

Таблица 3

эсфолипиднкй состав микросом ме утилкзптакса (в % к общему лини,

ч"ми беременных крыс при действии дному фосфору, п=7)

льо.ЙЛГЙПЛМЙ!

19

ракцпи

зефоли! ЗИЛов___

ФХ ФЭ ФС ФИ 4К СИ ЛФЛ

ИмкНол1 ЗмкМоль 1С/ФЛ

Контроль

37,5 ?2,3 1С,9 7,2 3,5 16,0 2,1 16,5 7,01 0,425

1.6 0,70 0,56 0,1П 1,1 0.13 0,91 0,44

3

26,0 1 2 21,3 ± 1 П,1 1 О

7.0 ± О '1,6 ♦ О

15,2 ± О 2,9 ± О 14,2 ± 1

6.1 £ О 0,429

,7

,5

,74

,21 ,95 , 12

А

37.2 I 3,0 ;9,о I 1,1

12.3 ± 0,63 7,8 ± 0,51

5.5 1 0,33

13.4 * 0,72

1.6 * 0,21 14,0 « 1,0

6,0 ± 0,27 0,120

37,4 ± 3,2 „ 10,1 * 0,82

10.4 ♦ 0,91

7.3 * 0,62

4.4 * 0,15

16.5 ± 0,05 5,8 ± 0,10"'

13,0 ± 0,65 * 6,4 ± 0,44 0,460 ■

Примечания *Р < 0,05 *'Р < 0,02 ***Р < 0,001

беременности на 15«. Наблюдается такге падение уровня СС (к 19-му дню на 20%). Отмечено повышение уровня ЛФЛ, содержание которых при отравлении на 19-й день беременности повышается в 2,3 раза в пересчете на липидный фосфор и в 3 раза в процентном соотношении (табл. 3 и 4).

В липидном составе микросом печени эмбрионов при отравлении бутилкаптаксом также прослеживается тенденция к снижению содеряания ФЭ, фосфатидилхолиновой (ФХ) и сфингомиелиновой (СИ) фракций фосфолипидов. Следует отметить, чтб и в этом случае образование лизопродуктов возрастает почти в 3 раза.

Таблица 4

Фосфолипидный состав микросом печени эмбрионов крыс при действий

бутилкаптакса (В " к общему липидному фосфору, п=7)

3 I 13 I 19

Фракции фосфоли!

_пидов___

ФХ ФЭ ФС ФИ ФК

си

лфл ФЧмкМоль ХСмкМоль ХСГГЛ

Контроль

34,1 22.3 14,5 Т.б 5,2 14,8 1.2 14,3 4,8

2,20 0,91 0,71 0,53 0,28 0,65 0,05 0,70 0,20

34,5 21,8 15,1 7,5 5,9 14,1 2,2 12,0

2,85 1.91 1,0 0,51 0,40 1.1 0,14 1.0

0,337 Примечания

,4,14'* 0,35 0,345 .

34,8

19.4 15,7

7.8 5.4

14.5 2,4

12,5

1 ,95 1 ,84 1,3 0,46 .0,36 1,0 0,11 1.22

4,481 0,41 0,358

*Р < 0,05 **Р < 0,02 ***Р < 0,001

34,1 ± 2,0 18,5 ± 0,97*

13,1 1 0,65 ±

8,3 7,1 15,1 3,8 12,8

0,71 0,56" 0,92 0,27"* 0,81

4,67± 0,28 0,365

При действии дроппа наблюдается сходная тенденция в изменениях в липидном составе микросом печени бэременних крыс и эмбрионов. Снижается содержания ФХ, ФЭ и СМ фракций, что приводит к снижению уровня суммарной фракции ФЛ на фоне повышения уровня лизопродуктов фосфолипидов, ФК и отношения ХС/ФЛ.

Таким образом, бутилкаптакс и дропп, введенные береме! ным крысам в различные сроки беременности, вызывают достове.. ше изменения в фосфолипидном составе митохондрий и микросом печени. Эти изменения обусловлены, вероятно, активацией эндогенных фосфолипаз, о .'чем свидетельствует повышение содержания лизопродуктов ФЛ и ФК, и,' кроме того, стимуляцией процессов ПО.,., о

чем свидетельствует снижение содержания ФЭ и повышение отношения ХС/ФЛ. Это косвенно 'может указывать на повышение микровязкости мембран митохондрий и микросом гепатоцитов. В следующей серии экспериментов мы исследовали активность нефермента1) итюго (аскорбат-зависимого) и ферментативного (НАДФ.Н-завмсимого) ПОЛ в митохондриях и микросомах печени беременных крыс, и их эмбрионов после затравки бутилкаптаксом и дроппом в различные сроки.

Установлено, что введение бутилкаптакса на 3-й день беременности вызывает усиление как Ферментативного, так и неферментативного ПОЛ в митохондриях соответственно на 61 и 75%, в микросомах - на 60 и 72$. При затравке этим пестицидом на 13-,1 и 19-й дни беременности также наблюдается усиление НАДФ-Н и аскорбат-зависимого ПОЛ в митохондриях и микросомах (соответственно на 50-75; 74-661; и 62-58; 67-62$). Сходная картина активности ПОЛ наблюдается в митохондриях и микросомах печени эмбрионов- Наиболее высокий уровень НДА по ферментативному пути окисления отмечен при отравлении на 3-й день развития.

При исследовании влияния дроппа также установлено возрастание уровня МДА по ферментативному и неферментативному пути окисления в митохондриях и микросомах печени беременных крыс и их эмбрионов. И р этом случае более высокий уровень 1Ш отмечен при отравлении на 3-й и 19-й дни ¡эмбрионального развития (соответственно на 66 и 61%, 57, и 52Ж).

Из полученных данных нидно, что наибольшее накопление МДЛ отмечается при отравлении бутипкаптаксом на 3-й день эмбрионального развития-

По-видимому, активация ПОЛ в органеллэх гепатоцитов при затравке пестицидами приводит к нарушению пространственной организации липидннх компонентов мембран. В данном случае это проявляется в снижении содержания фосфолипидов с ненасыщенными цепями жирных кислот, в частности ФЭ, что, в сбою очередь увеличивает доступ к субстратам эндогенных фос+олипаз.

Моуно заключить, что одной из причин (возможно, главной) изменений в липидном составе митохондрий и микросом печени беременных крыс и их эмбрионов при затравке пестицидами является активация ПОЛ.

Известно,'что липиды. и в .частности фосфолиииды, входят в микроокрухение ферментных систем. Следовательно, обнаруженные

*

24111

к. и !«С, 'а а

•А 200

158

ю»

50

к я (1

У/

г/ щ

V

___хА

I 9 Дни беременности

И

ш

щ.

11 и

'К Б

V/ 'V

V ■

V

у,

1 9 Дни эчбриог

Рис. I

НАЦФ.И-заеисипое ПОЛ в ниюкинднипх нечени беременных коис /А/ и их эмбрионов /Б/.

Щ ~ ПОЛ беременных крыс и их -гмьрионои при Бутиисап-таконои отравш шш

Е9 ~ ПОП беременных крис и их эмбрионов при отравлении дроппом

X 200

150 100 50

V. 208

15В

100

50

1

9

Г

' 3

и

19 Дни беремеиносш

,,, И

Ь-—&

13

19 Дни эмбриоген" за

Р^С 2_Йекорват-эависимое ПОП в митохондриях печени беременных мрыс /й/ и их эмБрионоа /Б/.

' ПОЛ (¡ерененных крие и их эмбрионов при бутиякап-таконом отравлении

ЕЗ ~ ПОЛ беременных крыс и их эмбрионов при отравлении дроппом

нами изменения в липидном составе митохондрий и микросом при отравлении пестицидами долены оказывать влияние и на ферментные системы этих органелл.

В результате изучения изменений функциональных показателей митохондрий гепатоцитов матери и эмбрионов, затравленных в описанные выше сроки бутилкаптаксом и дроппом, выявлена довольно тесная корреляция их с изменениями структурных параметров.

Введение бутилкаптакса и дроппа на 3, 13 и 19-й дни беременности достоверно снижает скорость окисления сукцината и а-кетаглутарата в состоянии что приводит к уменьшению

величины ДК по Чансу и коэффициента АДФ/0- При этом наблюдается пздение скорости окисления субстратов в состоянии V* и при разобщенном окислении - Наиболее значительное снинение этих показателей обнаружено на 19-й день беременности. 3 частности, в этот срок беременности а митохондриях печени матери скорость окисления сукцнната в состояниях V*, У3 и снижается

соответственно на 19, 22 н 1£Я, а в средах с а-кетаглутаратом -на 26, 18 и Р-ОХ- Следует ответить, что скорость окисления субстратов

Таблица 5

Влияние бутилкаптакса на дыхание и окислительное фюсфорилирование митохондрий печени беременных крыс.(И ± м, п^8)

Показа- Контроль а И беременцо с т а I •

тели 3 I 13 I 19 |

38 ± 2 Сукцинат 36 ± 1 1 33 ± 1 31 ± 1

115 ± б 108 ± 5 I 99 ± 4 90 ± 2

V, 40 ± 2 41 ± 3 42 ± 1 42 ± 3

7Днф ,дк АДФ/0 167 ± 7 150 ± 5 1 142 * 4 137 ± 6

2 1 ,87 ± 0,04 ,89 ± 0,02 19 ± 2 2 1 ,62 ± 0,03 ,84 ± 0,04 а - кетогл 17 ± 1 1 2,35 ± 0,04 1 1,60 ± 0,0! утарат ^ 2 1 ,14 ,71 14 ± 0,02 ± 0,02 ± 1

ь 56 ± 2 52 ± 3 1 48 ± 2 46 ± 1

18 ± 2 17 ± 2 1 16 ± 1 19 ± 2

V даФ АДФ/0 60 ± 3 53 ± 2 1 51 ± 1 48 ± 1

3 2 ,12 ± 0,08 ,42 ± 0,07 3 2 ,01 ± 0,06 ,43 ± 0,04 1 2,92 ± 0,05 1 2,18 ± 0,03 2 2 37 14 ± 0,05 ± 0,02

Примечания: Скорость дыхания иг.атом кислорода/мин-иг белка

Р < 0,05

в состоянии не изменяется, вследствие чего величина ДК и коэффициент ЛДФ/0 в средах с сукцинатом уменьшаются соответственно на 25 и 10%, ас а-кетаглутаратом - на 24 и 12$ (табл. 5 и б).

Сходные значения скорости переноса электронов по дыхательной цепи при затравке пестицидами получены и для митохондрий эмбрионов. В среде с сукцинатом бутилкаптакс снижает ДК и коэффициент АДФ/0 соответственно на 20 и 32%, в среде с а-кетаглутаратом - на 37 и 35Я. По-видимому, тормояение АДФ-стимулированного дыхания связано с ингибированием дыхательной цепи или торможением транспорта внутрь митохондрии фосфата или А'ГФ,который играет ключевую роль в механизме окислительного фосфорилирования.

Таблица б

Влияние бутилкаптакса на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий печени эмбрионов крыс(М ± м, п=8)

Показа! тели

Контроль

____ЭмСриоаальное_Еазви1иет1с.УГ.КИ^_____

_____3______1____13______I_____19__

V:

V

днф ДК

АДФ/О

п

уз ^

у

ДНф

ДК

АДф/0

41 ± 2 54 ± 3 43 ± 2 132 ± 4

1,26 1,64

18

33 17 30

* 0,08 ± 0,04

± 1

± 2

± 1

± г

Сукцинат 42 ± 1 I

52 ± 1 !

46 ± 2 !

124 ± 3 I

1,13 ± 0,04 I 1,07 1,43 ± 0,06 I 1,32 а - кетоглутарат 16 ± 1 1 16

1

1

30 16

28

± 2 ± 1 ± 1

!

1,92 ± 0,06 1,89 * 0,04

I.86 ± 0,04 1,84 ± 0,03

40

48

44 ± 2

122 ± 3

± 0,08 ± 0,00

± 2 * 1 ± 2 ± 2 0,09

26 16 29

1 ,54 1,48. ± 0,0

Примечания:

42 ± 1 46 ± 1 45 ± 2 118 ± 2

1,02 1,11

17 22

18 31

± 0,06

± 0,06 ± '

± 2 ± 1 ± 1

Скорость дыхания нг-атом киплородаЛи Р < 0,05

1,22 ± 0,06 1,24 ± 0,07

Н'МГ белка

Исследование активности оксидазных систем мембран митохондрий беременных крыс и эмбрионов показало, что при отравлении бутилкаптаксом и дроппом снижается активность НЛД.Н-оксидазы, сукцинатсжсидагн и цитохром-с-оксидазы во все сроки исследования. Наиболее значительно снижается активность НАД.Н-оксидазной

J 18В t s

0 If

H ¿ 120 * ""

н J to I

ra

108 - 1

80 - л

60 - 'л <

40 - Y/. 'у

20 г/, V

Y/Щь

w

V)

Щ

I

II

0 4 0 t

1 3 240 a о

3 о

1- 3 100 X 3

с u

3 120 X

100 а о so

40

20

i Í

РисЗ

Влияние 6 i (i л к з 11 i <1 и <i иоли^срмет нуи <;иси'ия Hfn(i|idii

митохондрий печени '-мекнкх крыс/Л/ и « t >< эм<>ри омои/Г/ ш>и о i ра в л V im и м<* i е рч нско г о opi анизиа н л 3/ I / , 13/2/ ti l'J/З/ сутки беременности .

г

240

3 юа

I с

J ф

H ¿ 120

■ I Gil I

■» 3 I- I

и ч

•I 3 240 a о з a

t-o 1.40

■i S

я и

3 120 i

7.

во

□

ra и

I

I;

НЛД.H - оксида c'jKi.'.tJ на токси дз i л ци тохрои-с-оксчда эз

1 во-

ин 60 40 20

RucA

i

í/^'-J ^'(.-i

ш

> St.-J i

100

00

у 60

Т/ к 48 -

[1 20

МД

2 i

V

ö ли w. fj e дроппа н j и или ферментную cur теми мемьра н H'JTOKGit/ipuii печени беременных крис/А/ и их эмбрионое/Б/ i и» и о тра в пении материнекого opiи ни змз на 3/\/, t 3/2/ и 1 'J/ 3/ сут ки беременное ти .

Г!! - НАД. II - оксида за t2 ~ ci)Ki|ti на т окси да эа ЕЭ t¡¿i тохром-с-окси д* за

6

- i3 -

системы дыхательной цепи митохондрий- Б частности, при затравке бутилкаптаксом на 19-й день беременности активность НЛД-Н-оксидаэы в митохондриях печени матери снижается на 40$, а эмбрионов - на 32. При затравке', дроппом в этот же срок активность фермента в митохондриях беременных крыс снижается на 29^, в митохондриях эмбрионов - на 25.

Таким образом, при отравлении животных пестицидами в митохондриях беременных крыс и эмбрионов снижается активность полиферментных систем, что, очевидно, связано с падением скорости переноса электронов в различных фрагментах дыхательной цепи. Наиболее значительное снижение происходит по НАД.Н-оксидазной системе дыхательной цепи митохондрий.

Основной способ детоксикации пестицидов в организме окислительная деградация. Начальный этап , ее осуществляется системой ферментов - цитохром Р-450-зависимой монооксигеназой.

В следующей серии экспериментов мы исследовали влияние бутилкаптакоа и дроппа на содержание цитохрома Р-450 в микросомалыюй фракции печени беременных крыс.

Установлено, что при введении бутилкаптакса и дроппа в микросомах печени беременных крыс снижается содержание цитохрома Р-450. При отравлении бутилкаптаксом и дроппом на 3-й день беременности содержание цитохрома Р-450 снижается соответственно на 42 и 24%, при отравлении на 13-й день - на 25 и 13, на 19-й день - ка 36 и 23Ж.

Таким образом, введение бутилкаптаксё и дроппа крысам в различные сроки беременности вызывает значительные изменения не только в морфологической картине их гепатоцитов, но и в структурно-функциональных характеристиках митохондрий и микроном-Возможно, пусковым механизмом повреждающего действия пестицидов на эти параметры является активация ПОД. Вызывая изменения в липидном составе митохондрий и микросом, она оказывает влияние на активность ферментов дыхательной цепи и цитохрома р-450.

ВЫВОДЫ

1. Введение бутилкаптакса и дроппа на 3, 13 и 19-й дни беременности рызывает нарушения ультраструктуры гепатоцитов.

- И -

Наибольшие изменения отмечаются при отравлении этики пестицидами на 3 и 19-й дни эмбрионального развития.

2. Бутилкаптакс и дропп сникают содержание фосфолипидов и повышают уровень ХС в митохондриальных и микросомальных фракциях пемени беременных крыс и их эмбрионов. Наиболее выраженные изменения в фосфолипидных компонентах митохондрий и микросом обнаружены на 19-й день оеременности.

3. При затравке пестицидами отмечается интенсификация НАДФ.Н и аскорбат-зависимого ПОЛ как в митохондриях,' так и в микросомах печени беременных крыс и эмбрионов. Наиболее высокий уровень МДА отмечен при отравлении бутилкаптаксом на 3-й день беременности.

4. Бутилкаптакс и дропп несколько тормозят скорость переноса электронов и окислительное фосфорилирование в митохондриях печени матери и эмбриона. Эти изменения наиболее сильно выражены при отравлении бутилкаптаксом на 19-й день беременности-

5. При введении бутилкаптакса и дроппа частично подавляются активность полиферментных систем дыхательной цепи митохондрий. Наиболее глубокое ингибирование наблюдается в НАД.Н-оксидазной ветви при отравлении бутилкаптаксом на 19-й день беременности.

6. Бутилкаптакс и дропп снижают содержание цитохрома Р-450 в микроеомальной фракции печени беременных крыс. Более выраженные изменения приходятся на 3-й и 19-й дни беременности-

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Butllcaptax Influence on the activities of antloxldative enzymes In rat liver mitochondria and microsomes /li.M.DJuraeva, R.D.Rnstamov, A.K.Mirakhmedov, D.S.TuJchleva// The 20th Meeting or the federation of European Biochemical Societies: Amstracts.-Hungarian, Budapest. P.160. 1990. 1. The effect of benzolsothlosol c:i the cell organoids /А.К.MiraMiinedov, M.li.Dguraeva, n.D.Rustamov, D.S.TuJchleva// The third European congress on cell biology: Abstracts. -Firen29. Italy. 1990. P.261. 3. Некоторые биохимические показатели гепатотоксичности бутилкаптакса и дроппа в системе мать - плод /А.К.Мирахмедов, Д.С.Туйчиева, Р.Д.Рустамов и др./ : Тез- V конф. биохимиков республик Ср. Азии и Казахстана. - Ташкент, 1991, с.311.

4. Влияние бутилкаптакса и дроппа на некоторые биохимические ' показатели субклеточных структур печени эмбрионов и беременных крыс /Д.С.Туйчиева, Р.Д.РустаМов, А.К.Мирахмедов и др.// Узб. биол. зурн. 1992, #1, с-6-9.

5. Влияние пегинола с-2000 на дыхание и . окислительное фосфорилирование митохондрий печени • . крыс, отравленных бутилкаптаксом /Р.Д.Рустамов, Б.М.Батиров, Д.С.Туйчиева,' А.К.Мирахмедов// Бюл. эксперм. биол. и медицины. 1992. &5с.г/Я9-

492

X У Л О С А

"Эмбрионал тарацнкат даврида каламуш кигари митохондрияси ва микросомасишшг структура ва функционал холатига бутилкаптакс ва

дроппнинг таъсири" „■» фмиладор .каламуш ва уларнинг змбрконлари гигари хуг:а"рэ органоидларшшнт морфо-фулкционал х;олатага пастнцидлар бутилкаптакс ва дроппнинг такрор таъсир этиш механизма динамшсида элзктронминроскопик, биокилавий ва биофизик методлар ердамида комплекс анализ цилинди.

Хрмиладорликшгнг 3, 13 ва 19 кунларл ва зкбрг.сшал тараккиатида пестнцидлар - бутилкаптакс ва дропп 1/10 ДД50 мшгдорда пборилганда х,омиладор каламуш ва уларгаптг змбрконлари гигар хужайраларини электронмнкроскспик тадкикотларида митохондрия, эндоплазматпк тур ва бсшк,а хуаг.аЯра органоидларшпптг мембрана структураларида маълум ультраструктуравий узгарноляр кузатилди. Тадкн^отлар натикасида токсшсологик гоиатит холатпга олиб келувчи: митохондрияларда полиморфизм, ички момбраналарнпнг рвдукцияси ва матрикснинг лойцаланипи, ондоплазматик туршпгг фрагмэнтлашяии, баъзи бир ггайларда даграпуляция холати па шутшгдек цнтоплазматик ва ядро структураларида цатор сифзт ва мивдор узгаришлари атщланди.

Хрмиладор каламуш ва улар змбрионларишиг бутилкаптакс ел дропп билан захарлантирилипи кигаршпгг митохондрия ва микросомасида б1ф цатор .функционал к^рсаткичларииинг узгариЕигп олиб калади. Митохондрияларда электронларнинг узатш тазлиги, хамда нафас олиш занллфида полиформент системалари активлигшпшг пасайиши аницланди.

Пу посткцидлар юборилганда х;омиладор каламуш ва улар ембрионларшшнг зшгар митохондрияси ва микросомаси мембраналарининг фосфолипидлар мивдори, НАДФ.Н ва аскорбатга боглщ булган липидларшшг перекисли оксидланишишиг- мат.лум даракада узгарнли кузатилди.

Гепатоцитларгашг митохондрия ва микросомасшшгг структурнвнй ва функционал узгаришлари шуни курсатадики, бу пестицидлариинг она ва бола организмига таъсири хомиладорлик ва эмбрионал тараадкэт даприга бог лик,.

Олютган натикалар атроф мухитни зушоя килиш, одам ва хайкон организмларга пестицидлар таъсирининг олдини олишда мухим тадбирларишлаб чикиш зарурлигидан далолат бероди.

- 17 -

SUMMARY

Butylcaptax and dropp pesticide effect on structural-functional Btate of rat lever mitochondria and microsomes in embryogenesls.

By means of electronic microscopy as well as biochemical and biophysical methods of study the complex analysis of mechanism of morpho-functional reconstruction of subcellular pregnant rat liver and rat embryo structures in dynamics after repeated administration of pesticides - butylcaptax and dropp has been carried out.

In the course of study on ultrastructure of pregnant rat liver and rat embryo hepatocytes by means of electronic microscopy significant alterations In morphology of mitochondria, endoplasmatic reticulum and other sucellular membrane structures have been discovered upon the effect of butylcaptax and dropp in the dose of 1/10 IDS0 on 3rd, 13th and 19th day of pregnancy and embryogenesls. Some phenomena characteristic of toxic hepatitis, such as mitochondrial polymorphism, crust reduction, mitochondrial matrix dimness as well as fragmentation and sometimes degranulation of erdoplasmatic reticulum channels and other qualitative and quantitative changes in cytoplasmatic and nuclear structures have been discovered.

Poisoning with butylcaptax and dropp causes changes in a number of functional parameters of • pregnant rat liver mitochondria and microsomes as well as of rat embryos. Electron speed transfer and oxidative phsophorylation decrease as well as Inhibition of activity of polyferment systems of mitochondrial respiratory chain have been discovered.

Upon administration of these pesticides considerable alterations In phospholipid content, NADF.H intensification as well as ascorbat-dependent lipid peroxidation of pregnant rat mitochondria and microsomes and rat embryos have been discovered.

The alterations discovered in the structure and function of hepatocyte mitochondria and microsomes show that the effect of the pesticides in question on the organism of both fetus and mother depends on the stage of embryogenesls and pregnancy.

The results obtained prove the necessity of measurements to protect environment and organisms agninst pest-killers.