Влияние белков вируса гепатита C на регуляцию окислительного стресса и метаболизм биогенных полиаминов

Смирнова, Ольга Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние белков вируса гепатита C на регуляцию окислительного стресса и метаболизм биогенных полиаминов
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние белков вируса гепатита C на регуляцию окислительного стресса и метаболизм биогенных полиаминов"

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

005053Ю*

На правах рукописи

СМИРНОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ВЛИЯНИЕ БЕЛКОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С НА РЕГУЛЯЦИЮ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА И МЕТАБОЛИЗМ БИОГЕННЫХ ПОЛИАМИНОВ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1 1 ОКТ. 2012

2012

005053184

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук Научный руководитель:

Старший научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук, кандидат химических наук A.B. Иванов

Официальные оппоненты:

Заведующий Лабораторией иммунорегуляции Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук, доктор биологических наук, профессор Д.В.Купраш

Заведующий Лабораторией биоэнергетики клетки Научно-исследовательского Института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В.Ломоносова доктор биологических наук Б.В.Черняк

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук

Защита диссертации состоится 2012 года в _^час. на заседании

Диссертационного совета Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан

2012 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат химических наук

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Вирус гепатита С (ВГС) вызывает одно из наиболее распространенных и опасных заболеваний человека. По данным ВОЗ этим вирусом инфицировано около 170 млн человек. Геном ВГС представляет собой (+)-цепь РНК, содержащую одну рамку считывания, кодирующую единственный полипротеин. В результате его процессинга образуется четыре структурных (белок капсида (С), гликопротеины Е1 и Е2, белок р7) и шесть неструктурных белков (протеиназы NS2 и NS3, РНК-зависимая РНК-полимераза NS5B, регуляторные белки NS4A, NS4B и NS5A). У 80% инфицированных ВГС заболевание переходит в хроническую форму и характеризуется высоким риском развития тяжелых патологий печени, таких как цирроз, фиброз и гепатоклеточная карцинома, а также способствует развитию у больных заболеваний крови (криоглобулинемия и неходжскинская лимфома), почек (глорумелонефрит) и иммунной системы (диабет). В настоящее время терапия хронического гепатита С основана на применении интерферона альфа комбинации с рибавирином, однако данный вид лечения малоэффективен - не более 40% инфицированных ВГС отвечает на терапию. В 2011 г в клиническую практику было введено два ингибитора протеиназы, применение которых в сочетании с интерфероном и рибавиринов позволило повысить эффективность терапии. К настоящему моменту несколько ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы и протеиназы NS3 вируса находятся на последних стадиях клинических испытаний. Стоит подчеркнуть, что все эти лекарственные препараты направлены на борьбу непосредственно с вирусом гепатита С, но не на терапию тяжелых патологий, характерных для хронического гепатита С.

В настоящее время одной из возможных причин развития тяжелых сопутствующих заболеваний, характерных для хронического гепатита С, считается окислительный стресс (ОС). Известно, что ВГС вызывает ОС в инфицированной клетке, что может являться причиной трансформации гепатоцитов. Точный механизм возникновения окислительного стресса при инфекции ВГС до сих пор не выяснен, вклад в этот процесс индивидуальных вирусных белков также не изучен. Несмотря на то, что за последние годы появилось много данных, свидетельствующих о связи ряда вирусных заболеваний с ОС, влияние соответствующих вирусов на систему защиты от стресса до сих пор мало изучено. В связи с этим изучение влияния ВГС и его белков на систему защиты клетки от окислительного стресса, а также более детальное изучение механизмов возникновения последнего и ответа на него представляет собой актуальную задачу.

Биогенные полиамины спермин (Spm), спермидин (Spd) и их предшественник путресцин (Put) присутствуют в клетках в миллимолярных и субмиллимолярных концентрациях и выполняют различные функции, в том числе участвуют в защите клетки от окислительного стресса. Однако о влиянии последнего на метаболизм полиаминов известно мало, а взаимосвязь между инфекцией ВГС и метаболизмом биогенных полиаминов, а также активностями ферментов-регуляторов этого метаболизма ранее вообще не рассматривалась. Соответственно, исследование этих вопросов также представляется весьма актуальным.

Цели и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение влияния белков вируса гепатита С на регуляцию окислительного стресса и метаболизм биогенных полиаминов. Для достижения данной цели в работе были сформулированы следующие задачи:

1. Оценить вклад индивидуальных белков ВГС в индукцию окислительного стресса и изучить механизмы возникновения последнего при экспрессии белков, влияющих на эту индукцию в наибольшей степени.

2. Выявить белки ВГС, активирующие систему защиты клетки от окислительного стресса, и рассмотреть детальные механизмы активации этой системы при экспрессии данных белков.

3. Изучить влияние экспрессии белков ВГС на метаболизм биогенных полиаминов.

4. Оценить возможность применения регуляторов метаболизма полиаминов для подавления репликации РНК ВГС в клеточных системах.

Научная новизна и практическое значение работы.

В работе показано, что белки NS5A, NS4B, El, Е2, а также белок капсида ВГС вызывают окислительный стресс в клетках гепатомы человека Huh7, и последний является наиболее активным индуктором стресса. Впервые продемонстрировано, что N-концевой домен белка капсида активирует экспрессию NADPH-оксидаз, что приводит к усилению продукции супероксид-радикапа, тогда как его С-концевой домен 37-191 вызывает активацию экспрессии цитохрома Р450 2Е1 (CYP 2Е1) и оксидоредуктина эндоплазматического ретикулума (Eróla) - источников супероксид-радикала и пероксида водорода, соответственно.

Установлено, что белки, El, Е2, NS4B, NS5A и белок капсида активируют систему защиты клетки (Nrf2/ARE каскад) от активных форм кислорода (АФК) по нескольким независимым механизмам. Все эти белки вызывают усиленную экспрессию «ферментов II фазы защиты» путем фосфорилирования фактора транскрипции Nrf2 протеинкиназой С (РКС) по АФК-зависимому механизму. Белок капсида и белок NS5A способны также активировать фактор Nr£2 по механизму, не зависящему от концентрации АФК, при участии фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и казеинкиназы 2 (СК2). Наиболее активным регулятором Nrf2/ARE каскада также является белок капсида, N-концевой домен которого отвечает за индукцию АФК-независимого, а С-концевой - АФК-зависимого механизмов активации системы защиты клетки от окислительного стресса.

Продемонстрировано, что в клетках гепатомы человека Huh7 окислительный стресс, вызванный химическими агентами, приводит к повышению уровней биогенных полиаминов Spm и Spd вследствие усиления экспрессии орнитиндекарбоксилазы (ODC) и спермидин/спермин-Ы'-ацетилтрансферазы (SSAT), опосредованного факторами транскрипции Nrf2 и NF-kB. ОС, вызванный белком NS5A и белком капсида вируса гепатита С, также вызывает активацию транскрипции генов ODC и SSAT, что, однако, сопровождается снижением активности кодируемых ими ферментов и падением уровня полиаминов.

Впервые показано, что клетки Huh7, несущие полноразмерный репликон ВГС, обладают пониженным уровнем биогенных полиаминов и активностей ферментов их метаболизма, а повышение концентрации спермина и спермидина при помощи низкомолекулярных соединений приводит к ингибированию репликации ВГС и снижению уровня геномной РНК вируса.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 16th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses (Nice, France. October 2009), 17th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses (Pacifico Yokohama, Japan, September 2010), VIII Annual Conference of New Visby Network on Hepatitis С (Vilnius, Lithuania, February 2011), Polyamine Gordon Research Conference (Waterville Valley, New Hampshire, USA, June 2011), 18th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses (Seattle, Washington, USA, September 2011), IX Annual Conference of New Visby Network on Hepatitis С (St. Petersburg, Russia, April 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей в научных журналах и 5 тезисов докладов в материалах конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на _ страницах, состоит из

введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов

и списка литературы, включающего _источников. Материал иллюстрирован

_рисунками и_таблицами.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант 10-04-00047а), гранта Президента Российской Федерации (МК-5035.2011.4), Государственного контракта №11.519.11.2017 в рамках Федеральной Целевой Программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2013 годы» и программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология». Часть экспериментов проводилась при использовании оборудования ЦКП «Геном» (ИМБ РАН).

Список использованных сокращений

вгс Вирус гепатита С

ОС Окислительный стресс

Spm Спермин

Spd Спермидин

Put Путресцин

АФК Активные формы кислорода

ODC Орнитиндекарбоксилаза

SSAT Спермидин/спермин-Ы'-ацетилтрансфераза

tBHQ Трет-бутилгидрохинон

Tm Туникамицин

PDTC Пирролидиндитиокарбамат

DCFHDA Диацетат 2',7'-дихлорфлуоресцеин

DHE Дигидроэтидий

NOX NADPH-оксидаза

TQFP Трансформирующий фактор роста бета

COX-2 Циклооксигеназа 2

Его Оксидоредуктин эндоплазматического ретикулума

Nqol МАВ(Р)Н:хиноноксидоредуктаза 1 человека

HOI Гемоксигеназа 1 человека

ARE Antioxidant Response Element

PRE Polyamine Response Element

PKC Протеинкиназа С

PI3K Фосфоинозитид-З-киназа

CK2 Казеинкиназа 2

Основное содержание работы Влияние белков гепатита С на индукцию окислительного стресса

Репликация ВГС или экспрессия некоторых его белков (капсида и белка NS5A) вызывает ОС (Mitsuyoshi, Itoh et al. 2008) по крайней мере по двум параллельным механизмам. Один из них связан с повышением концентраций Са2+ в цитоплазме и митохондриях, что способствует накоплению в клетке активных форм кислорода (Gong, Waris et al. 2001). Другой механизм заключается в активации NADPH-оксидаз 1 и 4 (NOX 1 и 4) - белков, вырабатывающих супероксид-радикап (Boudreau, Emerson et al. 2009). Оба эти механизма связаны в первую очередь с белком капсида и белком NS5A. Предполагается, что в ВГС-инфицированной клетке существуют и иные, пока не выявленные, источники АФК.

Для исследования вклада отдельных белков ВГС в возникновение окислительного стресса нами были сконструированы плазмиды, экспрессирующие каждый из десяти белков ВГС в эукариотических клетках. Все эксперименты проводились в культуре клеток гепатомы человека Huh7 - единственной клеточной культуре, поддерживающей репликацию ВГС. Оценка уровня экспрессии с помощью иммуноблотгинга показала, что белки начинают синтезироваться примерно через 18 ч после трансфекции. Как видно, белок капсида накапливался в клетках в значительно меньшем количестве, чем белки NS5A и NS5B (рис.1 А).

750 600 450

fI ,

у* у,,

-Капсид

ns5a ■ ns5b

15 20 25 30 35 40 Время после трансфекции (ч)

4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

5 10 15 20 Время после трансфекции (ч)

Рис.1. Кинетика накопления белков ВГС и их влияние на окислительный стресс и ARE-зависимую транскрипцию в клетках гепатомы человека I-Iuh7. (А) Диаграмма, демонстрирующая содержание белков, NS5A, NS5B и белка капсида в клетке, определенное по результатам ■•©■• дан иммуноблотгинга. (Б) Кинетика накопления АФК в клетке при экспрессии белка капсида и белков NS5A « nss и NS5B, АФК измерялись при помощи красителя ns: DCFHDA. (В) Активация ARE-зависимой экспрессии люциферазы при экспрессии в клетке 15 20 25 30 35 40 белков NS5A, NS5B и белка капсида или обработке Время после трансфекции (ч) клеток 100 мкМ tBHQ через 18 ч после трансфекции.

Окислительный стресс детектировали, обрабатывая клетки флуоресцентными красителями DCFHDA или DHE. Как видно из рис. 1Б, после трансфекции плазмидами,

ш капсид » «• ns5a -i- ns5b

кодирующими индивидуальные белки ВГС, рост концентрации АФК начинается через 16-18 ч, что совпадает с временем, при котором детектируются индивидуальные белки вируса. Установлено, что белки р7, N82, N53, Ш4А и Ш5В не изменяют уровень АФК в клетке, в то время как экспрессия белка капсида, гликопротеинов Е1 и Е2, а также белков Ы84В и ^5А вызывает ОС (Рис. 2А, Б).

ШШ ИСД(Дт?т1.Й10„ 2 2 И (Л СЛ (Л ш

■ ■ррр 1 183

-РРТ<

ЭМБО

1ВНО Капсид

Рис. 2. Влияние траизиториой экспрессии белков ВГС на накопление АФК в клетке. (А)

Уровень АФК при экспрессии в клетке белков ВГС или обработке клеток 100 мкМ 1ВН(3 или 1 мкг/мл Тт через 18 ч после трансфекции. Данные приведены по результатам трех экспериментов, *р< 0,05 по сравнению с клетками НиЬ7, трансфицированными вектором рсОНА3.1(+) и обработанными диметилсульфоксидом. (Б) Специфичность красителя ОСРНОА в отношении АФК была подтверждена обработкой клеток 40 мкМ антиоксиданта пирролидиндитиокарбамата (РОТС), приводящей к практически полному исчезновению флуоресценции.

Несмотря на то, что в клетке белка капсида синтезируется в 6-7 раз меньше других белков ВГС, вызывающих ОС, экспрессия этого белка приводит к тому же уровню АФК. Следовательно, белок капсида обладает максимальной способностью активировать продукцию АФК и вносит основной вклад в возникновение ОС при ВГС-инфекции.

Выявление доменов белка капсида ВГС, отвечающих за индукцию окислительного стресса в клетках и активацию ключевых АФК-продуцирующих

ферментов

Как указано выше, основной вклад в индукцию окислительного стресса среди всех белков ВГС вносит белок капсида. Для анализа механизмов возникновения стресса были картированы домены белка, отвечающие за нарушение окислительно-восстановительного потенциала в клетке. Для этого нами был сконструирован набор фрагментов белка капсида ВГС. Полноразмерный белок капсида состоит из 191 а.о., и полученная нами панель состояла из форм белка, усеченных с С-конца или Ы-конца полипептидной цепи. Анализ внутриклеточной локализации этих форм методом конфокальной микроскопии показал, что фрагменты белка капсида, не содержащие С-концевого гидрофобного участка (152-191 а.о.), имеют преимущественно ядерную локализацию, тогда как содержащие этот участок формы локализованы в цитоплазме.

Анализ роли индивидуальных фрагментов белка капсида ВГС в индукции окислительного стресса был проведен при помощи низкомолекулярных флуоресцентных красителей АФК, а также генетически-кодируемого биосенсора пероксида водорода. В качестве низкоспецифичного красителя, детектирующего большинство АФК, использовали

DCFHDA, для детекции супероксид-радикала использовали краситель DHE. При помощи красителя DCFHDA было показано, что как N-, так и С-концевые фрагменты белка вызывают накопление АФК в клетке (Рис. ЗА). Применение DHE в аналогичном эксперименте подтвердило, что как фрагмент 1-36 а.о., так и 37-191 а.о. усиливают продукцию супероксид-радикала (Рис. ЗБ). Анализ уровня пероксида водорода был проведен при помощи белка НуРег, представляющего собой вариант желтого флуоресцентного белка, уровень флуоресценции которого зависит от количества Н2О2 в клетке. Было установлено, что полноразмерный белок капсида ВГС действительно вызывает повышение уровня пероксида водорода, причем это его свойство связано с аминокислотными остатками 37-191 (Рис. ЗВ). Следует подчеркнуть, что использование вариантов белка НуРег, имеющих цитоплазматическую или митохондриальную локализацию, выявило, что повышение уровня Н2Ог наблюдается в основном в цитоплазме (Рис. ЗВ), в то время как в митохондриях оно менее выражено (данные не приведены). Таким образом, можно предположить как наличие нескольких независимых механизмов возникновения окислительного стресса белком капсида ВГС, так и существование нескольких различных источников АФК.

Рис. 3. Влияние транзиторной экспрессии фрагментов белка капсида на накопление в клетке перекиси водорода и супероксид-раднкала. Уровень АФК при экспрессии фрагментов белка капсида или обработке клеток 100 мкМ tBHQ через 18 ч после трансфекции, измеренный (А) с помощью DCFHDA - неспецифического флуоресцентного красителя АФК, (Б) DHE - красителя супероксид-радикала или (В) белка HyPer-cyto - сенсора перекиси водорода в цитоплазме. Данные приведены по результатам трех экспериментов, *р<0,05 по сравнению с клетками Huh7, трансфицированными вектором pVaxl, #р>0,05 (капсид(1-36) по сравнению с NS5B).

В эукариотических клетках существуют различные источники АФК, в т.ч. органеллы (митохондрии, пероксисомы) и ферменты (NADPH-оксидазы (NOX) и другие) (Bedard and Krause 2007). NADPH-оксидазы являются источником супероксид-радикала (Ago, Kitazono et al. 2004); усиление экспрессии ряда их изоформ (NOX1 и NOX4) может сопровождаться развитием различных патологий, в т.ч. фиброза печени (Paik, Iwaisako et al. 2011), рака мочевого пузыря (Shimada, Fujii et al. 2011) и др. В литературе имеются сообщения об активации этой группы ферментов в клетках, инфицированных ВГС (de Mochel, Seronello et al. 2010). Одной из целей нашей работы стало установление роли белка капсида и его индивидуальных доменов в регуляции экспрессии NADPH-оксидаз NOX1 и NOX4. Было показано, что экспрессия в клетках полноразмерного белка капсида или его фрагментов, содержащих первые 36 а.о. с N-конца, вызывает активацию транскрипции генов NOX1 и NOX4, в то время как белок, лишенный этого домена, не вызывает изменений в уровне их

транскрипции (Рис. 4 А,Б). Мы также обнаружили, что N-концевой домен белка капсида активирует и транскрипцию генов трансформирующего фактора роста р (TGFP) и циклооксигеназы 2 (СОХ-2) (Рис. 4 В,Г) - белков, экспрессия которых повышена при ВГС-инфекции и которые, по ряду данных, являются регуляторами экспрессии NADPH-оксидаз (Sancho, Martin-Sanz et al. 2011). Наконец, нами было продемонстрировано, что подавление активации N0X1 и N0X4 при помощи коротких интерферирующих РНК ослабляет продукцию АФК, в т.ч. супероксид-радикала (примерно на 30-45%) в клетках, экспрессирующих белок капсида.

А 18 ¡É 16 а 12

N0X1

* * и

г- <а ч- т-

U1 м И ш

Б 18

„15

Ем 2

.о 9

® с ш 6

т- CQ £ Z

NOX4

I.J..

о о о> ю

В18 „15

л 9

I 6

TGFpi

III У

— tD T- T-

COX-2

СП со q> in

Рис. 4. Накопление супероксид-радикала при экспрессии фрагмента 1-36 а.о. белка капсида сопровождается активацией экспрессии NADPH-оксидаз 1 и 4. (А-Г) Уровни мРНК NOX1 (A), NOX4 (Б), TGFpi (В) и СОХ-2 (Г) в клетках, экспрессирующих белок капсида или его фрагменты, измеренные методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Данные приведены по результатам трех экспериментов, * р <0,01 по сравнению с клетками Huh7, трансфицированными вектором pVaxl.

Другим возможным источником супероксид-радикала могут выступать цитохромы Р450, в т.ч. изоформа 2Е1 (CYP 2Е1), локализованная в эндоплазматическом ретикулуме. Известно, что у больных ВГС уровень экспрессии этой изоформы цитохрома повышен (Gochee, Jonsson, 2003). В нашей работе было установлено, что полноразмерный белок капсида ВГС, а также его С-концевой фрагмент (37-191 а.о.) вызывают усиление экспрессии CYP 2Е1 (Рис. 5А). Подавление активности данного цитохрома в клетках, экспрессирующих белок капсида, при помощи ингибитора фермента 4-метилпиразола (4-МР) привело к двукратному снижению уровня супероксид-радикала, что подтвердило участие данного фермента в индукции ОС.

Возможным источником пероксида водорода вне митохондрий могут быть оксидоредуктины (Eróla и Р), локализованные в эндоплазматическом ретикулуме и участвующие в фолдинге белков (Molteni, Fassio, 2004). Оценка уровней транскрипции генов оксидоредуктинов в клетках, экспрессирующих белок капсида ВГС, выявило резкое повышение количества мРНК белка Eróla (5Б) и, в меньшей степени, Erolp (Рис 5В). Сходное повышение наблюдалось и при экспрессии С-концевого фрагмента вирусного белка, который, как было показано выше, вызывает усиление продукции Н2О2. Таким образом, оксидоредуктины Eróla и, возможно, Eroip, являются потенциальными источниками пероксида водорода в ВГС-инфицированных клетках.

Д 32 м 28 X 24 | 20 J 16

1 12

а 8 >. 4

Í О

CYP2E1 Б-2"'!* Eróla

* * 16 • Т

lL LL

с- m — г CQ О с ír - г: ш

В 20

Eroip

iuJL*

Рис. 5. Накопление супероксид-радикала и перекиси водорода в клетках, экспрессирующих фрагмент 37-191 а.о. сопровождается активацией цитохрома Р450 2Е1 и оксидоредуктинов 1а и ip. Уровни мРНК CYP 2Е1 (A), Eróla (Б) и Eroip (В) в клетках, экспрессирующих белок капсида или его фрагменты, измеренные методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Данные приведены по результатам трех экспериментов, * р <0,01 по сравнению с клетками Huh7, трансфицированными вектором pVaxl.

Анализ состояния системы защиты клетки от окислительного стресса при экспрессии индивидуальных белков ВГС

В эукариотических клетках АФК нейтрализуются низкомолекулярными соединениями - антиоксидантами, а также т.н. «ферментами II фазы защиты» (Aleksunes and Manautou 2007). Экспрессия «ферментов II фазы защиты» и ферментов метаболизма антиоксидантов регулируется общим фактором транскрипции Nrf2, который способен узнавать консервативную последовательность ARE (Antioxidant Response Element) в промоторной области генов соответствующих ферментов. В отсутствие стресса фактор Nrf2 удерживается в цитоплазме белком-партнером Keapl, а при повышении уровня АФК Nrf2 подвергается фосфорилированию, что вызывает его транслокацию в ядро и последующее связывание с ARE-последовательностями в ДНК (Motohashi and Yamamoto 2004).

Нами был проведен анализ влияния индивидуальных белков ВГС на Nrf2/ARE каскад. На начальной стадии исследования в качестве инструмента использовали репортерные плазмиды, кодирующие люциферазу под контролем промотора SV40 с минимальным ARE-элементом гена фермента II фазы защиты - МАО(Р)Н:хиноноксидоредуктазы 1 человека (Nqol) или под контролем полноразмерных промоторов Nqol или гемоксигеназы 1 (HOI). Ко-трансфекция репортерной плазмиды pARE-Luc с плазмидами, экспрессирующими индивидуальные белки ВГС, показала, что белок капсида, гликопротеины El и Е2, а также неструктурные белки NS4B и NS5A усиливают ARE-зависимую экспрессию люциферазы (Рис. 6А). Экспрессия в клетке белка NS3 приводила к незначительной активации ARE-зависимой транскрипции, а экспрессия других белков ВГС вовсе не вызывала изменений.

Рис. 6. Экспрессия в клетке белков, El, Е2, NS4B, NS5A и белка капсида приводит к активации системы защиты клетки от окислительного стресса. (А, Б) Уровень экспрессии люциферазы под контролем минимального ARE-элемента (А) или полноразмерных промоторов Nqol и Н01 (Б) в клетках, экспрессирующих белки ВГС. Данные приведены по результатам трех экспериментов, *<0,01 по сравнению с клетками Huh7, трансфицированными вектором pcDNA3.1(+) и обработанными DMSO. (В) Анализ уровня мРНК Nqol и HOI в клетках, экспрессирующих белки ВГС, методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Данные приведены по результатам трех экспериментов. (Г) Иммуноблотгинг лизатов клеток, экспрессирующих белки ВГС.

Изучение кинетики экспрессии люциферазы показало, что активация промотора начинается через 18 ч и достигает максимума примерно через 28-30 ч после трансфекции (Рис. №), что совпадает с кинетикой экспрессии белков ВГС (Рис. 1А), а также с кинетикой накопления АФК в клетке (Рис. 1Б).

Экспрессия белков El, Е2, NS4B, NS5A и белка капсида усиливает транскрипцию мРНК ряда Ыг(2-зависимых генов (Nqol и HOI) (Рис. 6В), что приводит к накоплению в клетке соответствующих белков (Рис. 6Г). Таким образом, эти белки ВГС способны не только вызывать ОС, но и активировать систему защиты от этого стресса.

Механизм активации ARE/Nrf2 каскада в клетках, экспрессирующих белки ВГС

Следующим шагом работы было исследование механизмов активации ответа на ОС в клетках, экспрессирующих индивидуальные белки ВГС. Соответственно, вначале нами была проведена оценка роли АФК в этом процессе. Так, клетки Huh7, ко-трансфицированные репортерной плазмидой pARE-Luc и «пустым» вектором pcDNA3.1(+) и дополнительно обработанные tBHQ, инкубировали с антиоксидантом PDTC. Этот эксперимент показал, что PDTC практически полностью предотвращает активацию ARE-зависимой экспрессии

люциферазы в ответ на ОС, вызванный химическим агентом (Рис. 7 А). В случае клеток, ко-трансфицированных репортерной плазмидой и плазмидами, экспрессирующими белки ВГС, применение антиоксиданта ингибировапо активацию лишь на 40%, причем наименьший эффект был отмечен в случае белка капсида (подавление экспрессии на 20%) (Рис. 7А). Полученные данные указывают на то, что белки ВГС способны активировать ответ на ОС не только по механизму, зависящему от концентрации АФК в клетке, но и по АФК-независимому механизму. Интересным является и тот факт, что аналогичный эффект наблюдался и в случае индукции стресса ЭР туникамицином.

Рис. 7. Белки ВГС активируют Nrf2/ARE каскад, усиливая транскрипцию ARE-зависимых генов и активируя фактор транскрипции Nrf2. (А) Анализ уровня ARE-зависимой экспрессии люциферазы в клетках экспрессирующих белки ВГС и инкубированных с 40 мкМ PDTC (+PDTC) или без антиоксиданта (-PDTC) в течение 12 ч. Данные приведены по результатам трех экспериментов. (Б) Иммуноблоттинг цитоплазматической (Cyt) и ядерной (Nu) фракций лизатов клеток, экспрессирующих белки ВГС.

Известно, что активация транскрипции ARE-зависимых генов предполагает фосфорилирование транскрипционного фактора Nrf2 с последующим его перемещением из цитоплазмы в ядро. Подтверждение активации фактора Nrf2 было получено путем разделения фракций ядерных и цитоплазматических белков и детекцией Nrf2 в них методом иммуноблоттинга. Как видно из рис 7Б, экспрессия белков El, Е2, NS4B, NS5A и белка капсида действительно приводит к транслокации фактора транскрипции Nrf2 из цитоплазмы в ядро.

В зависимости от типа клеток и индуктора окислительного стресса в фосфорилироваиии фактора Nrf2 могут участвовать как минимум шесть различных протеинкиназ: протеинкиназа С (РКС), фосфоинозитид-3-киназа (PI3K), р38 митоген-активируемая протеинкиназа, внеклеточная сигнал-регулируемая киназа (ERK1/2), казеинкиназа 2 (СК2) и мембранная е1Р2-киназа (PERK) (Apopa, Не et al. 2008, Burdette, Olivarez et al. 2010). Для того, чтобы выяснить, какие именно протеинкиназы фосфорилируют фактор Nrf2 и активируют транскрипцию генов «ферментов II фазы защиты» в случае белков ВГС в клетках Huh7, мы использовали ингибиторы всех этих протеинкиназ, за исключением PERK. Роль протеинкиназ была оценена в экспериментах с репортерными плазмидами pARE-Luc, несущими гены всех белков ВГС. В случае химического агента tBHQ и белка NS5A ВГС был дополнительно измерен уровень мРНК генов Nqol и HOI и проанализирована локализация фактора Nr£2.

5 0,8 j

m 0,6

î 0,4

SH01 □ Nqo1

DMSO PDTC RO

SB WORT DRB DMSO

1 1,2

* 1,0

S 0,8 л

I 0,6

о о.

J 0,4

5 0,2 0,0

DMSO PDTC RO

SB WORT DRB DMSO

tBHQ

çî- <C ^

Cyt NuCytNuCyÎNuCyt N :yt Nu - Л Nu Cyt Nu Cyt Nu 8 9 10 11 12 13 14 15 16

2 3 4 5 6

JT_ £ ^

Cyt Nu Cyt Nu Cyt Nu Cyt Nu Cyt Nu Cyt Nu Cyt Nu

9 10 11 12 1

Рис. 8. Белки ВГС активируют Nrf2/ARE каскад по двум независимым механизмам. (А, Б)

Уровень ARE-зависимой экспрессии люциферазы в клетках, экспрессирующих белки ВГС и обработанных ингибиторами протеинкиназы PI3K (Wortmannin, WORT), протеинкиназы СК2 (DRB) и протеинкиназы РКС (Ro 31-8220, RO) в присутствии (+PDTC) или отсутствие (-PDTC) антиоксиданта. (В, Д) Уровень мРНК ферментов Nqol и Н01 в клетках обработанных 100 мкМ tBHQ (В) или экспрессирующих белок NS5A (Д). Клетки обрабатывали антиоксидантом (PDTC), ингибиторами протеинкиназы РКС (Ro 31-8220), протеинкиназы р38 (SB 239063, SB), протеинкиназы ERK1/2 (PD98,059, PD), протеинкиназы СК2 (DRB), протеинкиназы PI3K (Wortmannin, WORT). (Г, E) Иммуноблотгинг цитоплазматической (Cyt) и ядерной (Nu) фракций лизатов клеток, обработанных 100 мкМ tBHQ (Г) или экспрессирующих белок NS5A (Е). *р<0,01 по сравнению с клетками Huh7, обработанными DMSO и tBHQ (В) или по сравнению с клетками Huh7, экспрессирующими белок NS5A и обработанными DMSO (Г).

Как видно из Рис. 8, при индукции стресса tBHQ ARE-зависимая транскрипция (Рис. 8А,В) и перемещение фактора Nrf2 (Рис. 8Д) в ядро регулируется протеинкиназой С. При обработке клеток антиоксидантом ингибитор РКС не оказывал никакого эффекта на активацию системы защиты клетки от окислительного стресса: не наблюдалось усиления транскрипции ARE-зависимых генов и транскрипционный фактор Nrf2 оставался в цитоплазме (Рис. 8А,Г,Е). В случае экспрессии в клетках белков капсида (Рис. 8А) и NS5A (Рис. 8А,Г) ARE-зависимая транскрипция регулировалась тремя протеинкиназами: PI3K, СК2 и РКС. При этом обработка клеток антиоксидантом не оказывала никакого дополнительного влияния в случае протеинкиназ СК2 и PI3K, в то время как ингибитор РКС был эффективен только в отсутствие антиоксиданта (Рис. 8А). При экспрессии в клетке гликопротеинов Е1 и Е2, белка NS4B или туникамицина - контрольного индуктора стресса ЭР, регуляция ARE-зависимой экспрессии люциферазы осуществлялась протеинкиназой РКС (Рис. 8А). Однако, так как обработка клеток антиоксидантом не приводила к полному подавлению ARE-зависимой экспрессии люциферазы, можно предположить наличие еще одной неустановленной протеинкиназы, отвечающей за активацию ответа на ОС по АФК-независимому механизму. Согласно литературным данным, таким ферментом может быть протеинкиназа PERK, которая активируется при возникновении стресса ЭР (Cullman, Zhang et al. 2003). Однако проверить это предположение представляется затруднительным из-за отсутствия ее коммерчески-доступных химических ингибиторов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в клетках гепатомы человека Huh7 ОС вызывает активацию ARE-зависимой транскрипции при участии протеинкиназы РКС. В то же время, белки ВГС обладают способностью активировать Nrf2/ARE каскад и без участия АФК, и в этом случае ключевыми регуляторами являются протеинкиназы СК2 и PI3K (в случае белков NS5A и капсида), а также PERK (в случае гликопротеинов El, Е2 и белка NS4B).

Выявление доменов белка капсида ВГС, отвечающих за активацию системы защиты от окислительного стресса, и анализ ее механизмов

Для установления домена белка капсида, отвечающего за активацию системы защиты от окислительного стресса, использовали весь арсенал методов, описанных выше. Было показано, что экспрессия как N-, так и С-концевых фрагментов белка капсида ВГС приводит к транслокации фактора транскрипции Nrf2 из цитоплазмы в ядро (Рис. 9В), что вызывает активацию системы защиты от ОС. В экспериментах по оценке эффективности транскрипции при помощи репортерных плазмид (Рис. 9А) или методом ОТ-ПЦР в реальном времени (данные не приведены) была отмечена слабая (двухкратная) активация в случае С-концевого фрагмента белка. В то же время анализ уровней экспрессии «ферментов II фазы защиты» методом вестерн-блотгинга выявил сходное увеличение уровня Nqol и НО-1 обоими фрагментами белка капсида (Рис. 9Б).

«¡ 6 § 8 4

s г í-a-2

lili

O) M M Ю

s 5

Б ¿

-t- -S ís ^

л к ^ ^ г ^

//// -S? 4 A? 4?

■ I

* mm mm HO-1 № Nqo1

^ A. í4 <■ í? í: ^ # Г

f / <f ^

|(3-act¡n

Cyt Nu Cyt Nu Cyt Nu Cyt Nu Cyt Nu Cyt Nu Cyt Nu

mm m mm •*» am Ш <m

— — — —

Nrf2

Tubulin

Histone

Рис. 9. Экспрессия в клетке фрагментов белка капсида приводит к активации системы защиты клетки от окислительного стресса. (А) Анализ уровня экспрессии люциферазы под контролем минимального АКБ-элемента в клетках, экспрессирующих фрагменты белка капсида. Данные приведены по результатам трех экспериментов. (Б) Иммуноблотгинг лизатов клеток, экспрессирующих белки ВГС. (В) Иммуноблотгинг цитоплазматической (Су^ и ядерной (№) фракций лизатов клеток, экспрессирующих усеченные формы белка капсида

Для исследования механизма активации транскрипции генов системы защиты от окислительного стресса применялся подход с использованием ингибиторов протеинкиназ и антиоксиданта, описанный раннее для полноразмерных белков ВГС (Рис. 10).

о 2 2

Капсид(1-191)

lílll

Капсид(1-36)

2- 3 3

о а ,

Капсид(37-191)

S i 1

Рис. 10. Фрагмент 1-36 а.о. белка капсида активирует ARE-зависимую экспрессию по АФК-независимому механизму, в то время как фрагмент 37-191 а.о. белка осуществляет регуляцию по АФК-зависнмому механизму. Анализ ARE-зависимой экспрессии люциферазы в клетках, экспрессирующих полноразмерный (А), N-концевой (Б) и С-концевой (В) фрагменты белка капсида. Клетки обрабатывали ингибиторами протеинкиназ РКС, СК2, PI3K или антиоксидантом PDTC. Данные приведены по результатам трех экспериментов, *р<0,05 по сравнению с клетками Huh7, обработанными DMSO

Установлено, что при экспрессии С-концевого фрагмента белка капсида (37-191 а.о.) ARE-зависимая транскрипция регулируется протеинкиназой РКС (Рис. 10В), а в случае N-концевого фрагмента (1-36 а.о.) - протеинкиназами PI3K и СК2 (Рис. 10Б). Антиоксидант PDTC предотвращал активацию транскрипции лишь в случае С-концевого фрагмента белка капсида (Рис. 10В) или полноразмерного белка (Рис. 10А). Суммируя эти данные, можно

сделать вывод, что АФК-зависимый и АФК-независимый механизмы активации Nrf2/ARE каскада белком капсида ВГС реализуются его различными доменами.

Влияние окислительного стресса на метаболизм биогенных полиаминов спермина

и снермидина

Биогенные полиамины спермин и спермидин принимают участие во многих внутриклеточных процессах, в том числе в защите клетки от окислительного стресса, непосредственно нейтрализуя АФК (Sa, Sirisoma et al. 1998). Метаболизм полиаминов регулируется в основном двумя ферментами: орнитиндекарбоксилазой (ODC) и спермидин/спермин-Ы'-ацетилтрансферазой (SSAT), катализирующими скорость-лимитирующие стадии их биосинтеза и деградации, соответственно (Pegg, 2009). До сих пор ОС рассматривался в основном как следствие изменений в метаболизме полиаминов, в то время как обратная задача, а именно влияние стресса на метаболизм полиаминов, оставалась практически неизученной. Крайне немногочисленные литературные данные свидетельствуют о возможности повышения внутриклеточной активности SSAT при окислительном стрессе в клетках рака молочной железы (Chopra and Wallace 1996), а также об активации транскрипции гена ODC (Otieno and Kensler 2000) и ускорении деградации этого белка (Asher, Bercovich et al. 2005). Однако практически неизвестными остаются изменения метаболизма биогенных полиаминов в ответ на ОС, вызываемый в клетках печени химическими индукторами или белками различных вирусов, а также молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений.

На первом этапе этой части работы было проведено исследование изменений метаболизма полиаминов в клетках гепатомы человека Huh7 в ответ на ОС, вызванный химическими индукторами (tBHQ, Н202). Измерение уровней индивидуальных полиаминов показало увеличение концентрации спермина, спермидина и пугресцина, причем изменение уровня последнего было наиболее выражено (Табл. 1). Повышение содержания полиаминов сопровождалось возрастанием внутриклеточных активностей ODC и SSAT. Так, что при окислительном стрессе в клетках Huh7 активности ODC и SSAT увеличивались в 10-30 и 3-5 раз, соответственно (рис. 11 А,Б). Это изменение сопровождалось повышением уровней мРНК обоих ферментов (Рис. 11 В,Г), что свидетельствовало о регуляции экспрессии SSAT и ODC на уровне транскрипции их генов.

Таблица 1. Уровни полиаминов в лизатах клеток Huh7, обработанных 100 мкМ tBHQ или 200 мкМ Н202 в течение 18 ч.

Нмоль полиамина / мг ДНК

Путресцин Спермидин Спермин

Н20 0,7 ±0,1 23,6 ±3,8 59,4 ± 8,0

tBHQ 30,6 ±4,4 148 ±22 173 ±27

н2о2 7,2 ± 1,6 167 ±20 240 ± 20

160 140 ' 120 ■ 100 SO 60

•Г ^

I ¡i-actin

2.7 Отн. уровень экспрессии SSAT

Рис. 11. Окислительный стресс в клетках Huh7 вызывает активацию ODC и SSAT и усиливает транскрипцию их генов. (А,Б) Активность ODC (А) и SSAT (Б) в лизатах клеток Huh7 обработанных 100 мкМ tBHQ или 200 мкМ Н202 в течении 18 ч. (В,Г) Уровень мРНК ODC (В) и SSAT (Г) в клетках Huh7, обработанных tBHQ или Н202. определенный методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Данные приведены по результатам трех экспериментов, р*<0,01 по сравнению с клетками Huh7, обработанными DMSO. (Д) Иммуноблоттинг лизатов клеток, обработанных tBHQ или Н202.

Таким образом, ОС в клетках гепатомы человека Huh7 вызывает ускорение как биосинтеза, так и деградации биогенных полиаминов, что в конечном итоге приводит к повышению уровня спермина, спермидина и путресцина в клетке.

Механизм регуляции активности основных ферментов метаболизма полиаминов при окислительном стрессе

Регуляция активности SSAT и ODC осуществляется в ответ на множество стимулов. Ранее было показано, что активация транскрипции гена SSAT в ответ на изменение внутриклеточного содержания полиаминов регулируется фактором транскрипции Nrf2, который принимает участие и в регуляции системы защиты клетки от окислительного стресса. В данной работе была оценена роль этого фактора в активации транскрипции генов SSAT и ODC в ответ на стресс, вызванный химическими агентами. Для этого был исследован уровень транскрипции генов ODC и SSAT при нормальном (экспрессия эндогенного фактора) и повышенном (гиперэкспрессия, приводящая к образованию активированного фактора) уровне Nrf2 (Рис. 12А). Было показано, что гиперэкспрессия фактора Nrf2 в клетках вызывает усиление транскрипции генов ODC и SSAT в 3-5 раз. Дополнительная обработка таких клеток индукторами окислительного стресса не приводила к дополнительной активации транскрипции гена ODC (Рис. 12Б), но усиливала транскрипцию гена SSAT (Рис. 12В). Из этих данных можно сделать два вывода. Во-первых, ген ODC является Nrf2-зависимым. Во-вторых, усиление транскрипции гена ODC при окислительном стрессе достигается при участии только фактора Nrf2, тогда как усиление транскрипции гена SSAT опосредованно как Nrf2, так и другим(и) фактором(и) транскрипции.

Рис. 12. Фактор транскрипции Nrfl участвует в активации транскрипции ODC и SSAT

(А) Иммуноблотгинг лизатов клеток, гиперэкпрессирующих транскрипционный фактор Nrf2; клетки дополнительно обрабатывали 100 мкМ tBHQ или 200 мкМ Н202 в течение 18 ч. В качестве отрицательного контроля использовали лизаты клеток Huh7 без гиперэкспрессии фактора Nrf2. (Б,В) Уровень мРНК ODC (Б) и SSAT (В) в клетках Huh7, экспрессирующих фактор транскрипции Nrf2 и дополнительно обработанных tBHQ или Н2С>2. Данные приведены по результатам трех экспериментов, р*<0,05 по сравнению с клетками Huh7, обработанными DMSO

Мы также провели анализ роли сайтов связывания транскрипционных факторов в промоторе гена SSAT при активации ее транскрипции в ответ на ОС. Наиболее вероятными факторами, регулирующими транскрипцию этого гена, являются Nrf2 и NF-kB (Babbar, Gerner et al. 2006). В промоторе гена SSAT ранее был идентифицирован PRE-элемент (Polyamine Response Element), с которым взаимодействует фактор Nrf2, а также три сайта связывания фактора NF-kB (Tomitori, Nenoi et al. 2002). Для установления роли отдельных сайтов мы использовали серию репортерных плазмид, несущих ген люциферазы под контролем полноразмерного (1700 п.о.) или усеченного (777 п.о.) промотора гена SSAT, а также форм последнего с удаленным одним или двумя сайтами связывания фактора NF-kB (Рис. 13).

Д Рис. 13. Репортериые плазмиды,

j _ кодирующие люциферазу под контролем

-1700 -777

♦ NF-kB

+1 reHSS. промотора SSAT. (А) Регион промотора

g " SSAT, содержащий сайт связывания

.1700 -777 Г*Limii... ФактоРов транскрипции Nrf2 и NF-kB. (Б)

+ 1 пюцифс Схематическое изображение вариантов промоторной области SSAT, клонированных

г—+139 „

j_в репортерный вектор pGL3-Basic.

+1 люцифе

4-1-1—»-»-

SSAT(17D0)-luc

-777 г—+139 SSAT(777)-luc I_|_

SSAT(777)delta(NF-KB1)-luc I_f

777 j—+139

-777 [—+139 SSAT(777)d0lta(NF-KB2)-luc I_

+1 люцифе

С!

SSAT(777)delta(NF-KB)2-luc L

-777 r—+139

люцифе

Как и в экспериментах по измерению уровня мРНК SSAT, гиперэкспрессия фактора Nrf2 приводила к усилению экспрессии люциферазы в случае плазмиды с полноразмерным промотором SSAT(1700)-Iuc (Рис. 14А). В то же время этот эффект отсутствовал при использовании плазмиды SSAT(777)-luc с укороченным промотором, лишенным в т.ч. PRE элемента (Рис. 14Б) При этом обработка клеток индукторами окислительного стресса приводила к усилению экспрессии люциферазы в случае обоих конструктов (Рис. 14А,Б). Это свидетельствует о наличии других факторов транскрипции кроме Nrf2, регулирующих экспрессию SSAT при окислительном стрессе, а также о том, что сайты связывания этих факторов находятся в проксимальной области промотора (-777 - +36 п.о.).

| SSAT(1700)-luc |

I I g I

Sr 4

BDMSO

ufflHQ ^

■ H202 j

H* *

Г ' if | * * В H

лШ I и.

J .д. 3

sl*

О. С

BDMSO □ tBHQ ■ H202

| SSAT(777)-tuc |

PCDNA3.1 pcDNA4-Nrf2

J? ^ ^ t jF JF .

pcDN A3.1 pcDNA4-Nrf2

BSSAT(777Huc oSSAT|777)delta(NF-kB)2-luc BSSAT{777)delta(NF-kB1)-IUC aSSATt777)delta(NF-kB2)-luc

Рис. 14 Факторы транскрипции Nrf2 и NF-кВ участвуют в активации транскрипции гена ssat в клетках Huli7. (А,Б) Анализ активности промотора гена SSAT в клетках Huh7 при базальной экспрессии (pcDNA3.1) или гиперэкспрессии (pcDNA4-Nrf2) транскрипционного фактора Nrf2. Клетки трансфицировапи репортерными плазмидами SSAT(1700)-luc (А) или SSAT(777)-luc (Б). (В) Иммуноблотгинг лизатов клеток Huh7, обработанных 100 мкМ tBHQ в течение 6 или 24 ч, или 200 мкМ Н202 в течение 24 ч. (Г) Анализ роли сайтов связывания фактора NF-кВ, находящихся в промоторе гена SSAT при обработке клеток Huh7 tBHQ или Н202 в течении 18 ч. Данные приведены по результатам трех экспериментов, р*<0,05 по сравнению с клетками Huh7, обработанными DMSO

Для оценки роли фактора транскрипции NF-kB в регуляции экспрессии гена SSAT в ответ на ОС, нами был измерен уровень белка в ядре при стрессе, а также использованы варианты репортерной плазмиды SSAT(777)-luc, у которых один из двух или оба сайта связывания этого фактора были заменены на случайные последовательности. Было показано, что обработка клеток индукторами окислительного стресса приводит к накоплению субъединицы р65 фактора NF-kB в ядре, что свидетельствует о активации этого фактора (Рис 14В). Удаление сайтов связывания фактора NF-kB в репортерных конструктах выявило, что только один сайт, расположенный в области -304 - -280 п о. от точки старта транскрипции, участвует в активации транскрипции гена SSAT (Рис. 14Г).

Таким образом, в работе было установлено, что возникновение в клетках гепатомы человека Huh7 окислительного стресса приводит к активации как минимум двух транскрипционных факторов, активирующих экспрессию ключевых ферментов метаболизма полиаминов ODC и SSAT.

Влияние белков ВГС на метаболизм биогенных полиаминов

Считается, что изменения метаболизма биогенных полиаминов спермина и спермидина связаны с возникновением и развитием различных видов раковых заболеваний. Ранее было показано, что увеличение уровня путресцина способствует трансформации гепатоцитов (Wang, Feith et al. 2007), a гиперэкспрессия ODC и SSAT y трансгенных животных приводит к возникновению различных видов опухолей (Coleman, Pegg et al. 2002). Однако возможные нарушения метаболизма полиаминов при вирусных инфекциях изучены недостаточно. Поэтому следующей задачей нашей работы было исследование влияния белков ВГС на метаболизм биогенных полиаминов и определение роли окислительного стресса в этом процессе.

Оценка влияния транзиторной (кратковременной) экспрессии индивидуальных белков ВГС на транскрипцию генов ODC и SSAT была проведена методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Установлено, что только два белка ВГС, а именно капсида и NS5A, заметно активируют транскрипцию этих генов (Рис. 15А). Интересно отметить, что усиление транскрипции не сопровождается увеличением внутриклеточной ферментативной активности SSAT и ODC (Рис. 15Б,В). Напротив, уровень активности ODC уменьшался в два раза в случае белка капсида и в девять раз в случае белка NS5A. При этом оба вирусных белка не оказывали существенного влияния на активность SSAT.

О ÏC

g 5 1500 У ? mnn

g 60000 50000

fe Sf 40000

w è со 71

л S 30000

s p

X "3 20000 Ш с

S О

I | 10000

lui

Рис. 15. Белки капсида и ^5А активируют транскрипцию генов О ОС и 88ЛТ и понижают активность СШСв клетке. (А) Уровень мРНК ООС и БЭАТ в клетках, экспрессирующих белки ВГС. (Б,В) Активность СЮС (Б) и БЭАТ (В) в лизатах клеток, экспрессирующих белки капсида и М85А. Данные приведены по результатам трех экспериментов.

Уменьшение активности ООС в клетках, экспрессирующих белки капсида и Ы85А, не сопровождалось значительными изменениями в концентрации полиаминов (Табл. 2). Из полученных данных можно сделать вывод, что регуляция активности ферментов метаболизма полиаминов при экспрессии белков ВГС осуществляется не на уровне транскрипции (как происходит в случае обработки клеток индукторами окислительного стресса), а на других уровнях.

Таблица 2. Уровни полиаминов в клетках Huh7, экспрессирующих белок капсида и белок NS5A.

нмоль полиамина / мг ДНК

Путресцин Спермидин Спермин

pcDNA3.1 0,7 ±0,1 23,6 ±3,8 59,4 ±8,0

Белок капсида 2,5 ± 1,9 30,2 ± 11,9 70,5 ± 27,2

NS5A 3,2 ± 0,5 25,6 ±6,3 84,6 ±25,9

Стоит отметить, что описанные выше изменения метаболизма полиаминов были показаны для случая кратковременной экспрессии белков ВГС (28-72 часа). Для оценки изменений в метаболизме спермина и спермидина при более длительной экспрессии вирусных белков была использована стабильная линия клеток Huh7, несущих полноразмерный репликон ВГС и содержащая все белки вируса, в т.ч. NS5A и белок капсида. В этой системе нами установлено пониженное содержание биогенных полиаминов, по сравнению с контрольной линии гепатомы Huh7 (Табл. 3). Уровни активности ODC и SSAT в клетках, несущих репликон ВГС, были также ниже контрольных значений (Табл. 3).

Таблица 3. Уровень полиаминов и активность ODC и SSAT в клетках Huh7 и клетках, несущих полноразмерный репликон ВГС (НиИ7/ВГС)

нмоль полиамина / мг ДНК Активность фермента (пмоль/ч/мг белка

Спермид ин Сперми н ODC SSAT

Huh7 55,3 ± 10,8 49,6 ± 8,3 9,3 ± 1,2 33,1 ±2,6

НиЬ7/ВГС 38,7 ± 6Д 27,9 ± 10,6 4,3 ± 1,1 8,6 ±0,8

Полученные данные свидетельствуют о том, что метаболизм полиаминов в стабильной линии клеткок, несущей полноразмерный репликон ВГС, замедлен. Возможно, что именно подобные изменения являются одной из причин наблюдающегося замедления роста клеток.

Синтетические регуляторы метаболизма полиаминов как ингибиторы репликации ВГС

Заключительной частью диссертационной работы стала оценка потенциала синтетических соединений - регуляторов ферментов метаболизма полиаминов как потенциальных анти-ВГС агентов. В качестве таких соединений были выбраны 2-дифторметилорнитин (DFMO) и З-аминоокси-1-аминопропан (АРА) - ингибиторы ODC, М',М"-диэтилнорспермин (DenSpm), М'-циклогептилметил-М"-этилнорспермин (CHENS) и Н'-циклопропилметил-Ы"-этилнорспермин (CPENS) - индукторы SSAT, а также N,N1-бис(2,3-бутандиенил)-1,4-диаминобутан (MDL) - ингибитор полиаминоксидазы (АРАО) и сперминоксидазы (SMO), участвующих в деградации полиаминов (Casero and Pegg 2010). Оценку противовирусной активности соединений проводили в системе полноразмерного репликона ВГС измерением уровня РНК ВГС методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Как видно из рис. 16А, DenSpm оказывал умеренное усиливающее действие на репликацию ВГС, его аналоги CHENS и CPENS практически не влияли на репликацию ВГС, тогда как DFMO и

АРА, а также MDL обладали сильным ингибирующим действием, понижая титр вирусной РНК на два порядка.

0,1

0,001

III

Рис. 16. Обработка клеток, несущих репликон, ингибиторами ферментов метаболизма нолиаминов приводит к резкому падению уровня РНК ВГС. (А,Б) Уровень вирусной РНК в клетках, несущих репликон ВГС и, обработанных индукторами SSAT: 50 мкМ DenSpm, 20 мкМ CHENS, 20 мМ CPENS (А), ингибиторами ODC, 1 мМ DFMO, 20 мкМ АРА или 20 мкМ ингибитора полиаминоксидаз MDL (Б) в течении 72 ч. Данные приведены по результатам трех экспериментов.

Таблица 4. Уровень полиаминов и активность ODC и SSAT в клетках Huh7 и клетках, несущих полноразмерный репликон ВГС (НиЬ7/ВГС). Клетки обрабатывали 20 мкМ DenSpm в течении 48 ч, 1 мМ DFMO, 20 мкМ MDL в течении 24ч.

Huh7

нмоль полиамина / мг ДНК активность, пмоль/ч/мг белка

Спермидин Спермин ODC SSAT

Huh 7 55,3 ± 10,8 49,6 ± 8,3 9,3 ± 1,2 33,1 ±2,6

Huh7+DenSpm 41,8 ±9,5 17,9 ±3,9 54,7 ± 3,2 217,5 ± 18,6

Huh7+DFMO 47,0 ± 10,1 37,2 ±5,4 5,5 ±0,6 2,7 ± 1,5

Huh7+MDL 63,5 ± 13,8 51,2 ± 13,7 4,4 ± 0,7 2,3 ± 0,2

Huh7/BrC

Huh7/BrC 38,7 ±6,1 27,9 ± 10,6 4,3 ± 1,1 8,6 ±0,8

Huh7/BrC+DenSpm 33,3 ± 8,3 14,1 ±7,4 38,7 ± 2,1 190,3 ± 10,7

Huh7/BrC+DFMO 177,3 ±42,2 140,1 ± 52,1 7,1 ± 1,5 1,2 ±0,1

Huh7/BrC+MDL 227,6 ± 39,4 177,6 ± 27,8 17,4 ± 3,3 1,2 ±0,2

Интересно, что обработка несущих репликон клеток DFMO или MDL приводила к резкому повышению уровней спермина и спермидина, чего не наблюдалось в контрольных клетках гепатомы Huh7 (Табл. 4), а также не сопровождалась сильным снижением активности ODC в случае DFMO. Причины подобных изменений метаболизма полиаминов пока неясны. Тем не менее, можно утверждать, что экспрессия в клетке белков ВГС

приводит к замедлению метаболизма полиаминов и небольшому снижению концентраций спермина и спермидина, тогда как повышение уровня этих соединений при помощи синтетических регуляторов способствует подавлению репликации ВГС.

Выводы

1. Белки NS5A, NS4B, El, Е2, а также белок капсида вируса гепатита С вызывают окислительный стресс в клетках в клетках гепатомы человека Huh7; наиболее активным регулятором которого является белок капсида. N-концевой домен белка капсида активирует экспрессию NADPH-оксидаз 1 и 4, что приводит к усилению продукции супероксид-радикала, тогда как его С-концевой домен вызывает активацию экспрессии цитохрома Р450 2Е1 (CYP 2Е1) и оксидоредуктина (Eróla) - источников супероксид-радикала и пероксида водорода, соответственно.

2. Белки El, Е2, NS4B, NS5A и белок капсида активируют систему защиты клетки (Nrf2/ARE каскад) от активных форм кислорода (АФК) в клетках Huh7 по нескольким независимым механизмам. Все эти белки вызывают усиленную экспрессию «ферментов II фазы защиты» путем фосфорилирования фактора транскрипции Nrf2 протеинкиназой С (РКС) по АФК-зависимому механизму. Белок капсида и белок NS5A способны также активировать фактор Nrf2 по механизму, не зависящему от концентрации АФК, при участии фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и казеинкиназы 2 (СК2). В случае белков El, Е2 и NS4B активация Nrf2 по АФК-независимому механизму предположительно опосредовано протеинкиназой PERK. Наиболее активным регулятором Nrf2/ARE каскада является белок капсида, N-концевой домен которого отвечает за индукцию АФК-независимого, а С-концевой - АФК-зависимого механизмов защиты.

3. В клетках гепатомы человека Huh7 окислительный стресс, вызванный химическими агентами, приводит к повышению уровней биогенных полиаминов спермина и спермидина вследствие усиления экспрессии орнитиндекарбоксилазы (ODC) и спермидин/спермин-Ы'-ацетилтрансферазы (SSAT), опосредованного факторами транскрипции Nrf2 и NF-kB. Окислительный стресс, вызванный белком капсида и белком NS5A вируса гепатита С, также вызывает активацию транскрипции генов ODC и SSAT, что, однако, сопровождается снижением активности кодируемых ими ферментов и падением уровня полиаминов в клетке.

4. Клетки Huh7, несущие полноразмерный репликон ВГС, обладают сниженным уровнем биогенных полиаминов и активностей ферментов их метаболизма, а повышение концентрации спермина и спермидина приводит к ингибированию репликации ВГС и снижению уровня геномной РНК вируса.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

Статьи в журналах

1. Smirnova О.A., Isaguliants M.G., Hyvonen М.Т., Keinanen Т.А., Tunitskaya V.L., Vepsalainen J., Alhonen L., Kochetkov S.N., Ivanov A.V. Chemically induced oxidative stress increases polyamine levels by activating the transcription of ornithine decarboxylase and spermidine/spermine-N'-acetyltransferase in human hepatoma HUH7 cells. Biochimie (2012) Published ahead of print

2. Ivanov A.V., Smirnova O.A., Ivanova O.N., Masalova O.V., Kochetkov S.N., Isaguliants M.G. Hepatitis С Virus Proteins Activate NRF2/ARE Pathway by Distinct ROS-Dependent and Independent Mechanisms in HUH7 cells. PLoS One, 6, e24957, (2011).

3. Masalova O., Lesnova E., Pichugin A., Melnikova Т., Grabovetsky V., Petrakova N., Smirnova O., Ivanov A., Zaberezhny A., Ataullakhanov R., Isaguliants M., Kushch A. The successful immune response against hepatitis С nonstructural protein 5A (NS5A) requires heterologous DNA/protein immunization. Vaccine, 28, p. 1987-1996, (2010)

4. Смирнова O.A., Иванов A.B., Иванова О Н., Валуев-Эллистон В.Т., Кочетков С.Н. Клеточные системы защиты от окислительного стресса и стресса эндоплазматического ретикулума: механизмы регуляции и влияние вируса гепатита С. Молекулярная биология, 45, 1, стр. 110-122,(2011).

5. Масалова О.В., Леснова Е.И., Грабовецкий В.В., Смирнова О.А., Уланова Т.И., Бурков А.Н., Иванов А.В., Забережный А.В., Атаулханов Р.И., Кущ А.А. ДНК-иммунизация плазмидой, содержащей ген неструктурного белка NS5A вируса гепатита С, индуцирует эффективный клеточный иммунный ответ. Молекулярная биология, 44, 2, стр 275-283, (2010).

Тезисы конференций

1. Ivanov A., Smirnova О., Alekseeva Е., Ivanova О., Somninskaya I., Kochetkov S. Isaguliants M. Induction of the antioxidant Nrf2/ARE defence pathway by HCV core is controlled by amino acids 1-36. 18th International Symphosium on Hepatitis С virus and related viruses, Seattle, Washington, USA, 8-12 September 2011, abstract book p.188.

2. Smirnova O., Isaguliants M., Ivanova O., Khomutov A., Kochetkov S., Ivanov A. Hepatitis С virus core and NS5A proteins modulate expression of ODC and SSAT thus affecting polyamine metabolism. 18th International Symphosium on Hepatitis С virus and related viruses, Seattle, Washington, USA, 8-12 September 2011, abstract book p.195.

3. Ivanov A., Smirnova O., Isaguliants M., Ivanova O., Kochetkov S. Hepatitis С virus proteins activate Nrf2/ARE pathway by distinct ROS-dependent and independent mechanisms. 17th International Symphosuim on Hepatitis С and related viruses, Pacifico Yokohama, Japan, 10-14 September, 2010, abstract book p.75.

4. Ivanov A., Smirnova O., Isaguliants M., Ivanova O., Kochetkov S. Regulation of polyamine catabolism by hepatitis С virus proteins. 16th International Symphosium on Hepatitis С and related viruses, Nice, France, 3-7 October, 2009, abstract book p. 124.

5. Smirnova O., Ivanov A., Isaguliants M., Ivanova O., Kochetkov S. Hepatitis с virus proteins activate cellular system of defence against oxidative stress. 16th International Symphosium on Hepatitis С and related viruses, Nice, France, 3-7 October, 2009, abstract book p. 129.

Объем: 2,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 7076 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Проспект Вернадского д. (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнова, Ольга Александровна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Вирус гепатита С.

Геном и протеом вируса гепатита С.

Белок капсида.

Гликопротеины оболочки Е1 и Е2.

Белок р7.

Белок N52.

Белки N83 и ^4А.

Белок Ш4В.

Белок N85 А.

Белок Ш5В.

Клеточные и животные модели репликации ВГС.

Окислительный стресс.

Система защиты от окислительного стресса.

Цис- элементы, регулирующие клеточный ответ на окислительный стресс.

Факторы транскрипции, регулирующие экспрессию АЯЕ-зависимых генов.

Структура фактора транскрипции №12.

Взаимодействие фактора транскрипции №12 с белком Кеарі в отсутствие окислительного стресса.

Регуляция активности фактора транскрипции Nrf2.

Влияние вируса гепатита С на системы защиты клетки от окислительного стресса.

Биогенные полиамины и регуляция их метаболизма.

Функции орнитиндекарбоксилазы и регуляция ее активности.

Регуляция и функции спермидин/спермин-N 1 -ацетилтрансферазы.

Функции полиаминоксидазы (АРАО) и регуляция ее активности.

Функции сперминоксидазы и регуляция ее активности.

Связь нарушений метаболизма полиаминов с различными заболеваниями.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Смирнова, Ольга Александровна

выводы

2. Белки El, Е2, NS4B, NS5A и белок капсида активируют систему защиты клетки (Nrf2/AREKacKa/<) от активных форм кислорода (АФК) в клетках Huh7 по нескольким независимым механизмам. Все эти белки вызывают усиленную экспрессию «ферментов Пфазы защиты» путем фосфорилирования фактора транскрипции №Опротеинкиназой С (РКС) по АФК-зависимому механизму. Белок капсида и белок NS5A способны также активировать фактор Nrf2 по механизму, не зависящему от концентрации АФК, при участии фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и казеинкиназы 2 (СК2). В случае белков El, Е2 и NS4B активация Nrf2 по АФК-независимому механизму предположительно опосредовано протеинкиназой PERK. Наиболее активным регулятором №12/А11Екаскада является белок капсида, N-концевой домен которого отвечает за индукцию АФК-независимого, а С-концевой - АФК-зависимого механизмов защиты.

3. В клетках гепатомы человека Huh7 окислительный стресс, вызванный химическими агентами, приводит к повышению уровней биогенных полиаминов спермина и спермидина вследствие усиления экспрессии орнитиндекарбоксилазы (ODC) и спермидин/спермин-N -ацетилтрансферазы (SSAT), опосредованного факторами транскрипции Nrf2 и NF-kB. Окислительный стресс, вызванный белком капсида и белком NSSABHpyca гепатита С,также вызывает активацию транскрипции генов ОБСи SSAT, что, однако, сопровождается снижением активности кодируемых ими ферментов и падением уровня полиаминов в клетке.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнова, Ольга Александровна, Москва

1. Shepard C.W., Findli L.Alter M.J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. // Lancet 1.fect. Dis. 2005. V. 5, P. 558-567.

2. Nordenstedt H, White D.L.El-Serag H.B. The changing pattern of epidemiology in hepatocellular carcinoma. /¡Dig. Liver Dis. 2010. V. 42 Suppl 3, P. S206-214.

3. Nocente R., Ceccanti M., Bertazzoni G., Cammarota G., Silveri N.G.Gasbarrini G. HCV infection and extrahepatic manifestations. // Hepatogastroenterology 2003. V. 50, P. 1149-1154.

4. Manns M.P., Wedemeyer H.Cornberg M. Treating viral hepatitis C: efficacy, side effects, and complications. // Gut 2006. V. 55, P. 1350-1359.

5. Forestier N. Reesink H.W., Weegink C.J., McNair L., Kieffer T.L., Chu H.M., Purely S., Jansen P.L.Zeuzem S. Antiviral activity of telaprevir (VX-950) and peginterferon alfa-2a in patients with hepatitis C. // Hepatology 2007. V. 46, P. 640-648.

6. Thomas D.L. Advances in the treatment of hepatitis C virus infection. // Top. Antivir. Med. 2012. V. 20, P. 5-10.

7. Njoroge F.G., Chen K.X., Shih N.Y.Piwinski J.J. Challenges in modern drug discovery: a case study of boceprevir, an HCV protease inhibitor for the treatment of hepatitis C virus infection. HAcc. Client. Res. 2008. V. 41, P. 50-59.

8. Gaboriau F., Vaultier M., Moulinoux J.P.Delcros J.G. Antioxidative properties of natural polyamines and dimethylsilane analogues. II Redox. Rep. 2005. V. 10, P. 9-18.

9. Casero R.A.Pegg A.E. Polyamine catabolism and disease. // Biochem. J. 2009. V. 421, P. 323-338.

10. Lindenbach B.D., Evans M.J., Syder A.J., Wolk B., Tellinghuisen T.L., Liu C.C., Maruyama T., Hynes R.O., Burton D.R., McKeating J.A.Rice C.M. Complete replication of hepatitis C virus in cell culture. II Science 2005. V. 309, P. 623-626.

11. Lohmann V., Korner F., Koch J., Herian U., Theilmann L.Barlenschlager R. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. II Science 1999. V. 285, P. 110-113.

12. Smirnova O.A., Ivanov A.V., Ivanova O.N., Valuev-Ellison V.T.Kochelkov S.N. Cellular defense systems against oxidative and ER stresses: mechanisms of regulation and influence of hepatitis C virus., // Mol. Biol. (Mosk) 2011. V. 45, P. 127-141.

13. Lohmann V., Hoffmann S., Herian U., Penin F.Bartenschlager R. Viral and cellular determinants of hepatitis C virus RNA replication in cell culture. // J. Virol. 2003. V. 77, P. 3007-3019.

14. Dubuisson J. Hepatitis C virus proteins. // World J. Gastroenterol. 2007. V. 13, P. 24062415.

15. Bartenschlager R., Frese M.Pietschmann T. Novel insights into hepatitis C virus replication and persistence. II Adv. Virus Res. 2004. V. 63, P. 71-180.

16. Simmonds P. Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus—15 years on. // J. Gen. Virol. 2004. V. 85, P. 3173-3188.

17. Alter M.J. Prevention of spread of hepatitis C. // Hepatology 2002. V. 36, P. S93-98.

18. Global surveillance and control of hepatitis C. Report of a WHO Consultation organized in collaboration with the Viral Hepatitis Prevention Board, Antwerp, Belgium. // J. Viral Hepat. 1999. V. 6, P. 35-47.

19. Bartenschlager R.Lohmann V. Replication of hepatitis C virus. // J. Gen. Virol. 2000. V. 81, P.1631-1648.

20. Hope R.G., Murphy D.J.McLauchlan J. The domains required to direct core proteins of hepatitis C virus and GB virus-B to lipid droplets share common features with plant oleosin proteins. II J. Biol. Client. 2002. V. 277, P. 4261-4270.

21. Irshad M.Dhar I. Hepatitis C virus core protein: an update on its molecular biology, cellular functions and clinical implications. // Med. Princ. Pract. 2006. V. 15, P. 405-416.

22. Santolini E., Migliaccio G.La Monica N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis C virus core protein. II J. Virol. 1994. V. 68, P. 3631-3641.

23. Kunkel M., Lorinczi M., Rijnbrand R., Lemon S.M.Watowich S.J. Self-assembly of nucleocapsid-like particles from recombinant hepatitis C virus core protein. // J. Virol. 2001. V. 75, P. 2119-2129.

24. McLauchlan J., Lemberg M.K., Hope G.Martoglio B. Intramembrane proteolysis promotes trafficking of hepatitis C virus core protein to lipid droplets. // EMBO J. 2002. V. 21, P. 39803988.

25. Suzuki R., Matsuura Y, Suzuki T., Ando A., Chiba J., Harada S., Saito I.Miyamura T. Nuclear localization of the truncated hepatitis C virus core protein with its hydrophobic C terminus deleted. II J. Gen. Virol. 1995. V. 76 ( Pt 1), P. 53-61.

26. Schwer B., Ren S., Pietschmann T., Kartenbeck J., Kaehlcke K., Barlenschlager R., Yen T.S.Ott M. Targeting of hepatitis C virus core protein to mitochondria through a novel C-terminal localization motif. II J. Virol. 2004. V. 78, P. 7958-7968.

27. Cerutti A., Maillard P., Minisini R., Vidalain P.O., Roohvand F., Pecheur E.I., Pirisi M.Budkowska A. Identification of a functional, CRM-l-dependent nuclear export signal in hepatitis C virus core protein. // PLoS One 2011. V. 6, P. e25854.

28. Kao C.F., Chen S.Y., Chen J.Y.Wu Lee Y.H. Modulation of p53 transcription regulatory activity and post-translational modification by hepatitis C virus core protein. // Oncogene 2004. V. 23, P. 2472-2483.

29. Mamiya N. Worman H.J. Hepatitis C virus core protein binds to a DEAD box RNA helicase. II J. Biol. Chem. 1999. V. 274, P. 15751-15756.

30. Ray R.B., Meyer K.Ray R. Suppression of apoptotic cell death by hepatitis C virus core protein. // Virology 1996. V. 226, P. 176-182.

31. Soguero C., Joo M., Chianese-Bullock K.A., Nguyen D.T., Tung K.Hahn Y.S. Hepatitis C virus core protein leads to immune suppression and liver damage in a transgenic murine model. // /. Virol. 2002. V. 76, P. 9345-9354.

32. Shoukry N.H., Sidney J., Sette A. Walker C.M. Conserved hierarchy of helper T cell responses in a chimpanzee during primary and secondary hepatitis C virus infections. // J. Immunol. 2004. V. 172, P. 483-492.

33. Kittlesen D.J., Chianese-Bullock K.A., Yao Z.Q., Braciale T.J.Hahn Y.S. Interaction between complement receptor gClqR and hepatitis C virus core protein inhibits T-lymphocyte proliferation. H J. Clin. Invest. 2000. V. 106, P. 1239-1249.

34. Okuda M., Li K., Beard M.R., Show alter L.A., Scholle F., Lemon S.M.Weinman S.A. Mitochondrial injury, oxidative stress, and antioxidant gene expression are induced by hepatitis C virus core protein. // Gastroenterology 2002. V. 122, P. 366-375.

35. Shi S.T., Polyak S.J., Tu IL, Taylor D.R., Gretch D.R.Lai M.M. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. // Virology 2002. V. 292, P. 198-210.

36. Tanaka N., Moriya K., Kiyosawa K., Koike K., Gonzalez F.J.Aoyama T. PPARalpha activation is essential for HCV core protein-induced hepatic steatosis and hepatocellular carcinoma in mice. // J. Clin. Invest. 2008. V. 118, P. 683-694.

37. Boulant S., Vanbelle C., Ebel C., Penin F.Lavergne J.P. Hepatitis C virus core protein is a dimeric alpha-helical protein exhibiting membrane protein features. // J. Virol. 2005. V. 79, P. 11353-11365.

38. Kushima Y., Wakita T.Hijikata M. A disulfide-bonded dimer of the core protein of hepatitis C virus is important for virus-like particle production. II J. Virol. 2010. V. 84, P. 9118-9127.

39. Almrud J.J., Oliveira M.A., Kern A.D., Grishin N.V., Phillips M.A.Hackert M.L. Crystal structure of human ornithine decarboxylase at 2.1 A resolution: structural insights to antizyme binding. 11 J. Mol. Biol. 2000. V. 295, P. 7-16.

40. Op De Beeck A.Dubuisson J. Topology of hepatitis C virus envelope glycoproteins. // Rev. Med. Virol. 2003. V. 13, P. 233-241.

41. Dubuisson J.Rice C.M. Hepatitis C virus glycoprotein folding: disulfide bond formation and association with calnexin. // J. Virol. 1996. V. 70, P. 778-786.

42. Cocquerel L., Voisset C.Dubuisson J. Hepatitis C virus entry: potential receptors and their biological functions. II J. Gen. Virol. 2006. V. 87, P. 1075-1084.

43. Budkowska A. Mechanism of cell infection with hepatitis C virus (HCV)—a new paradigm in virus-cell interaction. II Pol. J. Microbiol. 2009. V. 58, P. 93-98.

44. Helle F. Dubuisson J. Hepatitis C virus entry into host cells. 11 Cell Mol. Life ScL 2008. V. 65, P. 100-112.

45. Ciccaglione A.R., Marcantonio C., Tritarelli E., Equestre M., Magurano F., Costantino A., Nicoletti L.Rapicetta M. The transmembrane domain of hepatitis C virus El glycoprotein induces cell death. // Virus Res. 2004. V. 104, P. 1-9.

46. Liberman E., Fong Y.L., Selby M.J., Choo Q.L., Cousens L., Houghton M. Yen T.S. Activation of the grp78 and grp94 promoters by hepatitis C virus E2 envelope protein. // J. Virol. 1999. V. 73, P. 3718-3722.

47. Chan S. W.Egan P. A. Hepatitis C virus envelope proteins regulate CHOP via induction of the unfolded protein response. // FASEB J. 2005. V. 19, P. 1510-1512.

48. ShenX., Zhang K.Kaufman R.J. The unfolded protein response-a stress signaling pathway of the endoplasmic reticulum. // /. Chem. Neuroanat. 2004. V. 28, P. 79-92.

49. Ji C.Kaplowitz N. ER stress: can the liver cope? // J. Hepatol. 2006. V. 45, P. 321-333.

50. Wu J.Kaufman R.J. From acute ER stress to physiological roles of the Unfolded Protein Response. // Cell Death Diffe.r 2006. V. 13, P. 374-384.

51. TardifK.D., IVaris G.Siddiqui A. Hepatitis C virus, ER stress, and oxidative stress. // Trends Microbiol. 2005. V. 13, P. 159-163.

52. Jones C.T., Murray C.L., Eastman D.K., Tassello J.Rice C.M. Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus. // J Virol 2007. V. 81, P. 8374-8383.

53. Steinmann E., Renin F., Kallis S., Patel A.H., Bartenschlager R.Pietschmann T. Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions. // PLoS Pathog. 2007. V. 3, P. el03.

54. Griffin S.D., Beales L.P., Clarke D.S., Worsfold O., Evans S.D., Jaeger J., Harris M.P.Rowlands D.J. The p7 protein of hepatitis C virus forms an ion channel that is blocked by the antiviral drug, Amantadine. // FEBS Lett. 2003. V. 535, P. 34-38.

55. Clarke D., Griffin S., Beales L., Gelais C.S., Burgess S., Harris M.Rowlands D. Evidence for the formation of a heptameric ion channel complex by the hepatitis C virus p7 protein in vitro. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281, P. 37057-37068.

56. Tscheme D.M., Jones C.T., Evans M.J., Lindenbach B.D., McKeating J.A.Rice C.M. Time-and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. // J. Virol. 2006. V. 80, P. 1734-1741.

57. Grakoui A., McCourt D.W., Wychowski C., Feinstone S.M.Rice C.M. Characterization of the hepatitis C virus-encoded serine proteinase: determination of proteinase-dependent polyprotein cleavage sites. // J. Virol. 1993. V. 67, P. 2832-2843.

58. Welbourn S.Pause A. The hepatitis C virus NS2/3 protease. // Curr. Issues Mol. Biol. 2007. V. 9, P. 63-69.

59. Lorenz I.C., Marcotrigiano J., Dentzer T.G.Rice C.M. Structure of the catalytic domain of the hepatitis C virus NS2-3 protease. II Nature 2006. V. 442, P. 831-835.

60. Yamaga A.K.Ou J.H. Membrane topology of the hepatitis C virus NS2 protein. // J. Biol. Client. 2002. V. 277, P. 33228-33234.

61. She Y„ Liao Q., ChenX., Ye L. Wu Z. Hepatitis C virus (HCV) NS2 protein up-regulates HCV IRES-dependent translation and down-regulates NS5B RdRp activity. // Arch. Virol. 2008. V. 153, P. 1991-1997.

62. Stapleford K.A.Lindenbach B.D. Hepatitis C virus NS2 coordinates virus particle assembly through physical interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes. // J. Virol. 2011. V. 85, P. 1706-1717.

63. Morikawa K., Lange C.M., Gouttenoire J., Meylan E., Brass V., Penin F.Moradpour D. Nonstructural protein 3-4A: the Swiss army knife of hepatitis C virus. // J. Viral. Hepat. 2011. V. 18, P. 305-315.

64. Walk B., Sansonno D., Krausslich H.G., Dammacco F., Rice C.M., Blum H.E.Moradpour D. Subcellular localization, stability, and trans-cleavage competence of the hepatitis C virus NS3

65. NS4A complex expressed in tetracycline-regulated cell lines. // J. Virol. 2000. V. 74, P. 22932304.

66. Ma K, Yates J., Liang Y., Lemon S.M.Yi M. NS3 helicase domains involved in infectious intracellular hepatitis C virus particle assembly. // J. Virol. 2008. V. 82, P. 7624-7639.

67. Borowski P., Oehlmann K., Heiland M.Laufs R. Nonstructural protein 3 of hepatitis C virus blocks the distribution of the free catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase. // J. Virol. 1997. V. 71, P. 2838-2843.

68. Lundin M., Monne M., Widell A., Von Heijne G.Persson MA. Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B. 11 J. Virol. 2003. V. 77, P. 5428-5438.

69. Gorbalenya A.E., Blinov V.M., Donchenko A.P.Koonin E.V. An NTP-binding motif is the most conserved sequence in a highly diverged monophyletic group of proteins involved in positive strand RNA viral replication. // J. Mol. Evol. 1989. V. 28, P. 256-268.

70. Einav S., Elazar M., Danieli T.Glenn J.S. A nucleotide binding motif in hepatitis C virus (HCV) NS4B mediates HCV RNA replication. I I J. Virol. 2004. V. 78, P. 11288-11295.

71. Konan K.V., Giddings T.H., Jr., Ikeda M., Li K., Lemon S.M.Kirkegaard K. Nonstructural protein precursor NS4A/B from hepatitis C virus alters function and ultrastructure of host secretory apparatus. II J. Virol. 2003. V. 77, P. 7843-7855.

72. Jones DM., Patel A.H., Targett-Adams PMcLauchlan J. The hepatitis C virus NS4B protein can trans-complement viral RNA replication and modulates production of infectious virus. // J. Virol. 2009. V. 83, P. 2163-2177.

73. Tong W.Y., Nagano-Fujii M., Hidajat R., Deng L., Takigawa Y.Hotta H. Physical interaction between hepatitis C virus NS4B protein and CREB-RP/ATF6beta. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 299, P. 366-372.

74. Tellinghuisen T.L., Marcotrigiano J., Gorbalenya A.E.Rice C.M. The NS5A protein of hepatitis C virus is a zinc metalloprotein. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279, P. 48576-48587.

75. Hirota M., Satoh $., Asabe S., Kohara M, Tsukiyama-Kohara K., Kato N., Hijikata M.Shimotohno K. Phosphorylation of nonstructural 5A protein of hepatitis C virus: HCV group-specific hyperphosphorylation. // Virology 1999. V. 257, P. 130-137.

76. Tanji Y., Kaneko T., Satoh S.Shimotohno K. Phosphorylation of hepatitis C virus-encoded nonstructural protein NS5A // Virol. 1995. V. 69, P. 3980-3986.

77. Reed K.E., Xu J.Rice CM. Phosphorylation of the hepatitis C virus NS5A protein in vitro and in vivo: properties of the NS5A-associated kinase. II J. Virol. 1997. V. 71, P. 7187-7197.

78. Evans M.J., Rice C.M.Goff S.P. Phosphorylation of hepatitis C virus nonstructural protein 5A modulates its protein interactions and viral RNA replication. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. V. 101, P. 13038-13043.

79. Rosen H.R.Gretch D.R. Hepatitis C virus: current understanding and prospects for future therapies. // Mol. Med. Today 1999. V. 5, P. 393-399.

80. Gong G., Waris G., Tanveer R.Siddiqui A. Human hepatitis C virus NS5A protein alters intracellular calcium levels, induces oxidative stress, and activates STAT-3 and NF-kappa B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001. V. 98, P. 9599-9604.

81. Miyanari Y., Atsuzawa K., Usuda N., Watashi K., Hishiki T., Zayas M., Bartenschlager R., Wakita T., Hijikata M.Shimotohno K. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. II Nat. Cell Biol. 2007. V. 9, P. 1089-1097.

82. Arima N., Kao C.Y., Licht T., Padmanabhan R.Sasaguri Y. Modulation of cell growth by the hepatitis C virus nonstructural protein NS5A II J. Biol. Client. 2001. V. 276, P. 12675-12684.

83. Levegue V.J., Johnson R.B., Parsons S., Ren J., Xie C., Zhang F.Wang Q.M. Identification of a C-terminal regulatory motif in hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase: structural and biochemical analysis. II J. Virol. 2003. V. 77, P. 9020-9028.

84. Oh J. W., Sheu G.T.Lai M.M. Template requirement and initiation site selection by hepatitis С virus polymerase on a minimal viral RNA template. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, P. 1771017717.

85. Egger D., WolkB., Gosert R., Bianchi L., Blum H.E., Moradpour D.Bienz K. Expression of hepatitis С virus proteins induces distinct membrane alterations including a candidate viral replication complex. // J. Virol. 2002. V. 76, P. 5974-5984.

86. Ilan E., Eren R., Lubin /., Nussbaum O., Zauberman A.Dagan S. The Trimera mouse: a system for generating human monoclonal antibodies and modeling human diseases. // Curr. Opin. Mol. Ther. 2002. V. 4, P. 102-109.

87. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A.J., Overby L.R., Bradley D.W.Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. // Science 1989. V. 244, P. 359-362.

88. Lohmann V. HCV replicons: overview and basic protocols. // Methods Mol. Biol. 2009. V. 510, P. 145-163.

89. Blight K.J., McKealing J.A., Marcolrigiano J.Rice C.M. Efficient replication of hepatitis C virus genotype la RNAs in cell culture. II J. Virol. 2003. V. 77, P. 3181-3190.

90. Kato T., Date T., Miyamoto M., Furusaka A., Tokushige K, Mizokami M. Wakita T. Efficient replication of the genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon. // Gastroenterology 2003. V. 125, P. 1808-1817.

91. Takahashi M. Oxidative stress and redox regulation on in vitro development of mammalian embryos. // J. Reprod. Dev. 2012. V. 58, P. 1-9.

92. RyterS.W., Kim H.P., Hoetzel A., ParkJ.W., Nakahira K, Wang X.Choi A.M. Mechanisms of cell death in oxidative stress. // Antioxid. Redox Signal. 2007. V. 9, P. 49-89.

93. Miller A. F. Superoxide dismutases: ancient enzymes and new insights. // FEBS Lett. 2012. V. 586, P. 585-595.

94. Dinkova-Kostova A.T.Talalay P. NAD(P)H:quinone acceptor oxidoreductase 1 (NQOl), a multifunctional antioxidant enzyme and exceptionally versatile cytoprotector. II Arch. Biochem. Biophys. 2010. V. 501, P. 116-123.

95. Asher G., Lotem J., Kama R., Sachs L.Shaul Y. NQOl stabilizes p53 through a distinct pathway. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. V. 99, P. 3099-3104.

96. Griffith O. W. Biologic and pharmacologic regulation of mammalian glutathione synthesis. // Free Radix Biol. Med. 1999. V. 27, P. 922-935.

97. Kang K.W., Lee S.J.Kim S.G. Molecular mechanism of nrf2 activation by oxidative stress. // Antioxid. Redox Signal. 2005. V. 7, P. 1664-1673.

98. Maines M.D. The heme oxygenase system: update 2005. I I Antioxid. Redox Signal. 2005. V. 7, P. 1761-1766.

99. Tsiftsoglou A.S., Tsamadou A.I.Papadopoulou L.C. Heme as key regulator of major mammalian cellular functions: molecular, cellular, and pharmacological aspects. // Pharmacol. Titer. 2006. V. Ill, P. 327-345.

100. Nguyen T., Huang H.C.Pickett C.B. Transcriptional regulation of the antioxidant response element. Activation by Nrf2 and repression by MafK. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, P. 1546615473.

101. Zhang Y.Gordon G.B. A strategy for cancer prevention: stimulation of the Nrf2-ARE signaling pathway. // Mol. Cancer Titer. 2004. V. 3, P. 885-893.

102. Venugopal R.Jaiswal A.K. Nrfl and Nrf2 positively and c-Fos and Fral negatively regulate the human antioxidant response element-mediated expression of NAD(P)H:quinone oxidoreductasel gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996. V. 93, P. 14960-14965.

103. Biswas M.Chan J.Y. Role of Nrfl in antioxidant response element-mediated gene expression and beyond. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2010. V. 244, P. 16-20.

104. Lee O.H., Jain A.K., Papusha V.Jaiswal A.K. An auto-regulatory loop between stress sensors INrf2 and Nrf2 controls their cellular abundance. // J. Biol. Chem. 2007. V. 282, P. 36412-36420.

105. Wang W.Chan J.Y. Nrfl is targeted to the endoplasmic reticulum membrane by an N-terminal transmembrane domain. Inhibition of nuclear translocation and transacting function. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281, P. 19676-19687.

106. Ohtsuji M., Katsuoka F., Kobayashi A., Aburatani H., Hayes J.D.Yamamoto M. Nrfl and Nrf2 play distinct roles in activation of antioxidant response element-dependent genes. // J. Biol. Client. 2008. V. 283, P. 33554-33562.

107. Aleksunes L.M.Manautou J.E. Emerging role of Nrf2 in protecting against hepatic and gastrointestinal disease. // Toxicol. Pathol. 2007. V. 35, P. 459-473.

108. Motohashi H.Yamamoto M. Nrf2-Keapl defines a physiologically important stress response mechanism. // Trends Mol. Med. 2004. V. 10, P. 549-557.

109. Chan J.Y., Kwong M., Lu R„ Chang J., Wang B., Yen T.S.Kan Y.W. Targeted disruption of the ubiquitous CNC-bZIP transcription factor, Nrf-1, results in anemia and embryonic lethality in mice. // Embo J. 1998. V. 17, P. 1779-1787.

110. Beyer T.A., Xu IV., Teupser D., auf dem Keller U., Bugnon P., Hildt E., Thiery J., Kan Y. W. Werner S. Impaired liver regeneration in Nrf2 knockout mice: role of ROS-mediated insulin/IGF-1 resistance. // Embo J. 2008. V. 27, P. 212-223.

111. Johnsen O., Murphy P., Prydz H.Kolsto A.B. Interaction of the CNC-bZIP factor TCFll/LCR-Fl/Nrfl with MafG: binding-site selection and regulation of transcription. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26, P. 512-520.

112. Motohashi H., Katsuoka F., Engel J.D.Yamamoto M. Small Maf proteins serve as transcriptional cofactors for keratinocyte differentiation in the Keapl-Nrf2 regulatory pathway. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. V. 101, P. 6379-6384.

113. Dhakshinamoorthy S.Jaiswal A.K. c-Maf negatively regulates ARE-mediated detoxifying enzyme genes expression and antioxidant induction. // Oncogene 2002. V. 21, P. 5301-5312.

114. Wang W., Kwok A.M.Chan J. Y. The p65 isoform of Nrfl is a dominant negative inhibitor of ARE-mediated transcription. // J. Biol. Client. 2007. V. 282, P. 24670-24678.

115. Iloh K, Ishii T., Wakabayashi N. Yamamoto M. Regulatory mechanisms of cellular response to oxidative stress. HFreeRadic. Res. 1999. V. 31, P. 319-324.

116. Itoh K, Wakabayashi N., Kaloh Y, Ishii T., Igarashi K., Engel J.D.Yamamoto M. Keapl represses nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain. // Genes Dev. 1999. V. 13, P. 76-86.

117. Jain A.K., Bloom D.A.Jaiswal A.K. Nuclear import and export signals in control of Nrf2. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280, P. 29158-29168.

118. Li W.Kong A.N. Molecular mechanisms of Nrf2-mediated antioxidant response. // Mol. Carcinog. 2009. V. 48, P. 91-104.

119. Nioi P., Nguyen T„ Sherratt P.J.Pickett C.B. The carboxy-terminal Neh3 domain of Nrf2 is required for transcriptional activation. II Mol. Cell Biol. 2005. V. 25, P. 10895-10906.

120. Theodore M., Kawai Y., Yang J., Kleshchenko Y., Reddy S.P., Villalta F.Arinze I.J. Multiple nuclear localization signals function in the nuclear import of the transcription factor Nrf2. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283, P. 8984-8994.

121. Zhang D.D., Lo S.C., Cross J.V., Templeton D.J.Hannink M. Keapl is a redox-regulated substrate adaptor protein for a Cul3-dependent ubiquitin ligase complex. II Mol. Cell Biol. 2004. V. 24, P. 10941-10953.

122. Kang M.I., Kobayashi A., Wakabayashi N., Kim S.G.Yamamoto M. Scaffolding of Keapl to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes. HProc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. V. 101, P. 2046-2051.

123. Velichkova M.Hasson T. Keapl regulates the oxidation-sensitive shuttling of Nrf2 into and out of the nucleus via a Crml-dependent nuclear export mechanism. // Mol. Cell. Biol. 2005. V. 25, P. 4501-4513.

124. Sun Z, Chin Y.E.Zhang D.D. Acetylation of Nrf2 by p300/CBP augments promoter-specific DNA binding of Nrf2 during the antioxidant response. // Mol. Cell Biol. 2009. V. 29, P. 26582672.

125. Yamamoto T., Suzuki T., Kobayashi A., Wakabayashi J., Maher J., Motohashi H.Yamamoto M. Physiological significance of reactive cysteine residues of Keapl in determining Nrf2 activity. II Mol. Cell Biol 2008. V. 28, P. 2758-2770.

126. Numazawa S., Ishikawa M., Yoshida A., Tanaka S.Yoshida T. Atypical protein kinase C mediates activation of NF-E2-related factor 2 in response to oxidative stress. // Am. J. PhysioLCell Physiol. 2003. V. 285, P. C334-342.

127. Sun Z., Huang Z.Zhang D.D. Phosphorylation of Nrf2 at multiple sites by MAP kinases has a limited contribution in modulating the Nrf2-dependent antioxidant response. // PLoS One 2009. V. 4, P. e6588.

128. Cullinan S.B., Zhang D., Hannink M., Arvisais E., Kaufman RJ.Diehl J.A. Nrf2 is a direct PERK substrate and effector of PERK-dependent cell survival. // Mol. Cell Biol. 2003. V. 23, P. 7198-7209.

129. Zipper L.M.Mulcahy R.T. Erk activation is required for Nrf2 nuclear localization during pyrrolidine dithiocarbamate induction of glutamate cysteine ligase modulatory gene expression in HepG2 cells. // Toxicol. Sci. 2003. V. 73, P. 124-134.

130. Reichard J.F., Motz G.T.Puga A. Heme oxygenase-1 induction by NRF2 requires inactivation of the transcriptional repressor BACH1. II Nucleic Acids Res. 2007. V. 35, P. 70747086.

131. Sun J., Brand M., Zenke Y., Tashiro S., Groudine M.Igarashi K. Heme regulates the dynamic exchange of Bachl and NF-E2-related factors in the Maf transcription factor network. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. V. 101, P. 1461-1466.

132. Li W, Yu S.W.Kong A.N. Nrf2 possesses a redox-sensitive nuclear exporting signal in the Neh5 transactivation domain. II J. Biol. Chem. 2006. V. 281, P. 27251-27263.

133. War is G., Tardif K.D.Siddiqui A. Endoplasmic reticulum (ER) stress: hepatitis C virus induces an ER-nucleus signal transduction pathway and activates NF-kappaB and STAT-3. // Biochem. Pharmacol. 2002. V. 64, P. 1425-1430.

134. Koike K. Pathogenesis of HCV-associated HCC: Dual-pass carcinogenesis through activation of oxidative stress and intracellular signaling. // Hepatol Res. 2007. V. 37 Suppl 2, P. SI15-120.

135. Choi J. Oxidative stress, endogenous antioxidants, alcohol, and hepatitis C: pathogenic interactions and therapeutic considerations. // Free Radic. Biol. Med. 2012. V. 52, P. 1135-1150.

136. Waris G.Siddiqui A. Hepatitis С virus stimulates the expression of cyclooxygenase-2 via oxidative stress: role of prostaglandin E2 in RNA replication. // J. Virol. 2005. V. 79, P. 97259734.

137. Tsatsanis C., Androulidaki A., Venihaki M.Margioris A.N. Signalling networks regulating cyclooxygenase-2. II Int. J. Biochem. Cell Biol. 2006. V. 38, P. 1654-1661.

138. Bowman T., Garcia R„ TurksonJ.Jove R. STATs in oncogenesis. // Oncogene 2000. V. 19, P. 2474-2488.

139. PeggA.E. Mammalian polyamine metabolism and function. // IUBMB Life 2009. V. 61, P. 880-894.

140. Wallace H.M., Fraser A.V.Hughes A. A perspective of polyamine metabolism. // Biochem. J; 2003. V. 376, P. 1-14.

141. Coleman C.S., Stanley B.A., Viswanath R.Pegg A.E. Rapid exchange of subunits of mammalian ornithine decarboxylase. H J. Biol. Client. 1994. V. 269, P. 3155-3158.

142. Seely J.E.Pegg A.E. Ornithine decarboxylase (mouse kidney). // Methods Enzymol. 1983. V. 94, P. 158-161.

143. Hayashi S.Murakami Y. Rapid and regulated degradation of ornithine decarboxylase. // Biochem. J. 1995. V. 306 ( Pt 1), P. 1-10.

144. Kahana C., Asher G.Shaul Y. Mechanisms of protein degradation: an odyssey with ODC. 11 Cell Cycle 2005. V. 4, P. 1461-1464.

145. Zhang M., Pickart C.M.Coffino P. Determinants of proteasome recognition of ornithine decarboxylase, a ubiquitin-independent substrate. // EMBO J. 2003. V. 22, P. 1488-1496.

146. Zhang M., MacDonald A.I., Hoyt M.A.Coffino P. Proteasomes begin ornithine decarboxylase digestion at the C terminus. II J. Biol. Client. 2004. V. 279, P. 20959-20965.

147. Asher G., Bercovich Z., Tsvetkov P., Shaal Y.Kahana C. 20S proteasomal degradation of ornithine decarboxylase is regulated by NQOl. // Mol. Cell 2005. V. 17, P. 645-655.

148. Zhao B.Butler A.P. Core promoter involvement in the induction of rat ornithine decarboxylase by phorbol esters. II Mol. Carcinog. 2001. V. 32, P. 92-99.

149. Qin С., Samudio /., Ngwenya S.Safe S. Estrogen-dependent regulation of ornithine decarboxylase in breast cancer cells through activation of nongenomic cAMP-dependent pathways. 11 Mol. Carcinog. 2004. V. 40, P. 160-170.

150. Packham G.Cleveland J.L. Induction of ornithine decarboxylase by IL-3 is mediated by sequential c-Myc-independent and c-Myc-dependent pathways. // Oncogene 1997. V. 15, P. 1219-1232.

151. Nils son J. A., Maclean K.H., Keller U.B., Pendeville H., Baudino T.A.Cleveland J.L. Mnt loss triggers Мус transcription targets, proliferation, apoptosis, and transformation. // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24, P. 1560-1569.

152. Origanti S.Shantz L.M. Ras transformation of RIE-1 cells activates cap-independent translation of ornithine decarboxylase: regulation by the Raf/MEK/ERK and phosphatidylinositol 3-kinase pathways. // Cancer Res. 2007. V. 67, P. 4834-4842.

153. Pyronnet S., Pradayrol L.Sonenberg N. Alternative splicing facilitates internal ribosome entry on the ornithine decarboxylase mRNA // Cell Mol. Life Sci. 2005. V. 62, P. 1267-1274.

154. Shantz L.M.Pegg A.E. Translational regulation of ornithine decarboxylase and other enzymes of the polyamine pathway. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. V. 31, P. 107-122.

155. Shantz L.M., Coleman C.S.Pegg A.E. Expression of an ornithine decarboxylase dominantnegative mutant reverses eukaryotic initiation factor 4E-induced cell transformation. // Cancer Res. 1996. V. 56, P. 5136-5140.

156. Lovkvist Wallslrom E., Takao K, Wendt A., Vargiu C., Yin H.Persson L. Importance of the 3' untranslated region of ornithine decarboxylase mRNA in the translational regulation of the enzyme. // Biochem. J. 2001. V. 356, P. 627-634.

157. Auvinen M., Paasinen-Sohns A., Hirai H., Andersson L.C.Holtta E. Ornithine decarboxylase- and ras-induced cell transformations: reversal by protein tyrosine kinase inhibitors and role of ppl30CAS. II Mol. Cell. Biol. 1995. V. 15, P. 6513-6525.

158. Chen Y., Megosh L.C., Gilmour S.K., Sawicki J.A.O'Brien T.G. K6/ODC transgenic mice as a sensitive model for carcinogen identification. // Toxicol. Lett. 2000. V. 116, P. 27-35.

159. Tamori A., Nishiguchi S., Kuroki T., Koh N., Kobayashi K., Yano Y.Otani S. Point mutation of ornithine decarboxylase gene in human hepatocellular carcinoma. // Cancer Res. 1995. V. 55, P. 3500-3503.

160. Guo Y., Harris R.B., Rosson D., Boorman D.O'Brien T.G. Functional analysis of human ornithine decarboxylase alleles. // Cancer Res. 2000. V. 60, P. 6314-6317.

161. Libby P.R., Ganis B., Bergeron R.J.Porter C.W. Characterization of human spermidine/spermine N1-acetyl transferase purified from cultured melanoma cells. I I Arch. Biochem. Biophys. 1991. V. 284, P. 238-244.

162. PeggA.E. Spermidine/spermine-N(l)-acetyltransferase: a key metabolic regulator. II Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2008. V. 294, P. E995-1010.

163. Delia Ragione F.Pegg A.E. Studies of the specificity and kinetics of rat liver spermidine/spermine Nl-acetyltransferase. II Biochem. J. 1983. V. 213, P. 701-706.

164. Wallace H.M.Mackarel A.J. Regulation of polyamine acetylation and efflux in human cancer cells. II Biochem. Soc. Trans. 1998. V. 26, P. 571-575.

165. Coleman C.S. Wallace H.M. Polyamine excretion from human cancer cells. // Biochem. Soc. Trans. 1990. V. 18, P. 1228-1229.

166. Casero R.A., Jr., Celano P., Ervin S.J., Applegren N.B., Wiest L.Pegg A.E. Isolation and characterization of a cDNA clone that codes for human spermidine/spermine N1-acetyltransferase. II J. Biol. Chem. 1991. V. 266, P. 810-814.

167. Coleman C.S.Pegg A.E. Proteasomal degradation of spermidine/spermine N1-acetyltransferase requires the carboxyl-terminal glutamic acid residues. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272, P. 12164-12169.

168. Matsui I.PeggA.E. Increase in acetylation of spermidine in rat liver extracts brought about by treatment with carbon tetrachloride. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. V. 92, P. 1009-1015.

169. Wallace H.M., Nuttall M.E.Robinson F.C. Acetylation of spermidine and methylglyoxal bis(guanylhydrazone) in baby-hamster kidney cells (BHK-21/C13). // Biochem. J. 1988. V. 253, P. 223-227.

170. Casero R.A., Jr.Woster P.M. Terminally alkylated polyamine analogues as chemotherapeutic agents. II J. Med. Chem. 2001. V. 44, P. 1-26.

171. Fogel-Petrovic M„ Shappell N.W., Bergeron R.J.Porter C.W. Polyamine and polyamine analog regulation of spermidine/spermine Nl-acetyltransferase in MALME-3M human melanoma cells. II J. Biol.Chem. 1993. V. 268, P. 19118-19125.

172. Tian Y., Wang S„ Wang B., Zhang J., Jiang R.Zhang W Overexpression of SSAT by DENSPM treatment induces cell detachment and apoptosis in glioblastoma. // Oncol. Rep. 2012. V. 27, P. 1227-1232.

173. Kaasinen S.K., Grohn O.H., Keinanen T.A., Alhonen L.Janne J. Overexpression of spermidine/spermine Nl-acetyltransferase elevates the threshold to pentylenetetrazol-induced seizure activity in transgenic mice. // Exp. Neurol. 2003. V. 183, P. 645-652.

174. Alhonen L., Parkkinen J.J., Keinanen T., Sinervirta R., Herzig K.H.Janne J. Activation of polyamine catabolism in transgenic rats induces acutc pancreatitis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2000. V. 97, P. 8290-8295.

175. Holtta E. Oxidation of spermidine and spermine in rat liver: purification and properties of polyamine oxidase. II Biochemistry 1977. V. 16, P. 91-100.

176. Wallace H.M., Duthie J., Evans D.M., Lamond S., Nicoll K.M.Heys S.D. Alterations in polyamine catabolic enzymes in human breast cancer tissue. // Clin. Cancer Res. 2000. V. 6, P. 3657-3661.

177. Wang Y., Devereux W, Woster P.M., Stewart T.M., Hacker A.Casero R.A., Jr. Cloning and characterization of a human polyamine oxidase that is inducible by polyamine analogue exposure. // Cancer Res. 2001. V. 61, P. 5370-5373.

178. Cervelli M., Amendola R., Polticelli F.Mariottini P. Spermine oxidase: ten years after. // Amino Acids 2012. V. 42, P. 441-450.

179. Cervelli M., Polticelli F., Federico R.Mariottini P. Heterologous expression and characterization of mouse spermine oxidase. II J. Biol. C/iem. 2003. V. 278, P. 5271-5276.

180. Bianchi M., Amendola R., Federico R., Polticelli F.Mariottini P. Two short protein domains are responsible for the nuclear localization of the mouse spermine oxidase mu isoform. // FEBS J. 2005. V. 272, P. 3052-3059.

181. Murray-Stewart T., Wang Y., Goodwin A., Hacker A., Meeker A.Casero R.A., Jr. Nuclear localization of human spermine oxidase isoforms possible implications in drug response and disease etiology. // FEBS J. 2008. V. 275, P. 2795-2806.

182. Babbar N., I lacker A., Huang Y.Casero R.A., Jr. Tumor necrosis factor alpha induces spermidine/spermine Nl-acetyltransferase through nuclear factor kappaB in non-small cell lung cancer cells. II J. Biol. Chem. 2006. V. 281, P. 24182-24192.

183. Gerner E. W.Meyskens F.L., Jr. Polyamines and cancer: old molecules, new understanding. II Nat. Rev. Cancer 2004. V. 4, P. 781-792.

184. Lotan R., Francis G.E., Freeman C.S.Waxman S. Differentiation therapy. // Cancer i?es. 1990. V. 50, P. 3453-3464.

185. Russell D.H. Clinical relevance of polyamines. // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 1983. V. 18, P. 261-311.

186. Linsalata M., Caruso M.G., Leo S., Guerra V., D'Attoma B.Di Leo A. Prognostic value of tissue polyamine levels in human colorectal carcinoma. // Anticancer Res. 2002. V. 22, P. 24652469.

187. Becciolini A., Porciani S., Lanini A., Balzi M., Cionini L.Bandettini L. Polyamine levels in healthy and tumor tissues of patients with colon adenocarcinoma. // Dis. Colon. Rectum. 1991. V. 34, P. 167-173.

188. Kubota S., Okada M., Yoshimolo M., Murata N., Yamasaki Z, Wada T., Imahori K., Ohsawa N.Takaku F. Urinary polyamines as a tumor marker. // Cancer Detect. Prev. 1985. V. 8, P. 189-192.

189. Weiss T.S., Bernhardt G., Buschauer A., Thasler W.E., Dolgner D., Zirngibl H.Jauch K.W. Polyamine levels of human colorectal adenocarcinomas are correlated with tumor stage and grade. // Int. J. Colorectal. Dis. 2002. V. 17, P. 381-387.

190. Loser C., Folsch U.R., Paprotny C.Creutzfeldt W. Polyamines in colorectal cancer. Evaluation of polyamine concentrations in the colon tissue, serum, and urine of 50 patients with colorectal cancer. // Cancer 1990. V. 65, P. 958-966.

191. Uehara N., Shirakciwa S., Uchino H.Saeki Y. Elevated contents of spermidine and spermine in the erythrocytes of cancer patients. // Cancer 1980. V. 45, P. 108-111.

192. Bergeron C., Bansard J.Y., Le Moine P., Bouet F., Goasguen J.E., Moulinoux J.P., Le Gall E.Catros-Quemener V. Erythrocyte spermine levels: a prognostic parameter in childhood common acute lymphoblastic leukemia. // Leukemia 1997. V. 11, P. 31-36.

193. Klein S., Miret J.J., Algranati I.D.de Lustig E.S. Effect of alpha-difluoromethylornithine in lung metastases before and after surgery of primary adenocarcinoma tumors in mice. // Biol. Cell 1985. V. 53, P. 33-36.

194. Kubota S., Ohsawa N.Takaku F. Effects of DL-alpha-difluoromethylornithine on the growth and metastasis of B16 melanoma in vivo. H Int .J.Cancer. 1987. V. 39, P. 244-247.

195. Pouyssegur J., Dayan F.Mazure N.M. Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression. // Nature 2006. V. 441, P. 437-443.

196. De Marzo A.M., Bradshaw C., Sauvageot J., Epstein J. I.Miller G.J. CD44 and CD44v6 downregulation in clinical prostatic carcinoma: relation to Gleason grade and cytoarchitecture. // Prostate 1998. V. 34, P. 162-168.

197. Aziz S.M., Olson J.W.Gillespie M.N. Multiple polyamine transport pathways in cultured pulmonary artery smooth muscle cells: regulation by hypoxia. I I Am. J. Respir. Cell Mol. Bio.l 1994. V. 10, P. 160-166.

198. Tsujinaka S., Soda K., Kano Y.Konishi F. Spermine accelerates hypoxia-initiated cancer cell migration. II Int. J. Oncol. 2011. V. 38, P. 305-312.

199. Cohen L.F., Lundgren D. W.Farrell P.M. Distribution of spermidine and spermine in blood from cystic fibrosis patients and control subjects. II Blood 1976. V. 48, P. 469-475.

200. Cooper K.D., Shukla J.B.Rennert O.M. Polyamine compartmentalization in various human disease states. // Clin. Chim. Acta 1978. V. 82, P. 1-7.

201. Smirnova I.S., Aksenov N.D., Vonsky M.S.Isaguliants M.G. Different transformation pathways of murine fibroblast NIH 3T3 cells by hepatitis C virus core and NS3 proteins. // Cell Biol. Int. 2006. V. 30, P. 915-919.

202. Farcionio R., Vergara P., Di Marzo D., Piercmtoni M.G., Napolitano M., Russo T.Cimino F. p53 suppresses the Nrf2-dependent transcription of antioxidant response genes. // J Biol Chem 2006. V. 281, P. 39776-39784.

203. Traylor A., Hock T.Hill-Kapturczak N. Specificity protein 1 and Smad-dependent regulation of human heme oxygenase-1 gene by transforming growth factor-betal in renal epithelial cells. // Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2007. V. 293, P. F885-894.

204. Bartenschlager R.Lohmann V. Novel cell culture systems for the hepatitis C virus. // Antiviral Res. 2001. V. 52, P. 1-17.

205. Sambrook J. F.E.F., Maniatis T., Molecular Clonning, ed. Nolan C.1989: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

206. Hyvonen T., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Lapinjoki S.Eloranta T.O. Uptake of 3H-labeled l-aminooxy-3-aminopropane by baby hamster kidney cells. // J. Biochem. 1990. V. 107, P. 817-820.

207. Matsui /., Wiegand L.Pegg A.E. Properties of spermidine N-acetyltransferase from livers of rats treated with carbon tetrachloride and its role in the conversion of spermidine into putrescine. II J. Biol. Chem. 1981. V. 256, P. 2454-2459.

208. Mokhonov V.V., Novikov D.V., Samokhvalov E.I., Shatalov A.G., Selivanov N.A., Prilipov A.G.L'Vov D K. Genome analysis of hepatitis C virus strain 274933RU isolated in Russian Federation. // Vopr. Virusol. 2002. V. 47, P. 9-12.

209. Boissy R.E., Trinkle L.S.Nordlund J.J. Separation of pigmented and albino melanocytes and the concomitant evaluation of endogenous peroxide content using flow cytometry. // Cytometry 1989. V. 10, P. 779-787.

210. Bedard K.Krause K.H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. II Physiol. Rev. 2007. V. 87, P. 245-313.

211. Simula M.P.De Re V. Hepatitis C virus-induced oxidative stress and mitochondrial dysfunction: a focus on recent advances in proteomics. // Proteomics Clin. Appl. 2010. V. 4, P. 782-793.

212. Sancho P., Martin-Sanz P.Fabregat I. Reciprocal regulation of NADPH oxidases and the cyclooxygenase-2 pathway. // Free Radic. Biol. Med. 2011. V. 51, P. 1789-1798.

213. Molteni S.N., Fassio A., Ciriolo M.R., Filomeni G., Pasqualetto E., Fagioli C.Sitia R. Glutathione limits Erol-dependent oxidation in the endoplasmic reticulum. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279, P. 32667-32673.

214. Sevier C.S. New insights into oxidative folding. // J. Cell Biol. 2010. V. 188, P. 757-758.

215. Malhotra J.D.Kaufman R.J. Endoplasmic reticulum stress and oxidative stress: a vicious cycle or a double-edged sword? // Antioxid. Redox Signal. 2007. V. 9, P. 2277-2293.

216. Ray R.B., Lagging L.M., Meyer K., Steele R.Ray R. Transcriptional regulation of cellular and viral promoters by the hepatitis C virus core protein. // Virus Res. 1995. V. 37, P. 209-220.

217. Tomitori II, Nenoi M., Mita K., Daino K, Igarashi K.Ichimura S. Functional characterization of the human spermidine/spermine N(l)-acetyltransferase gene promoter. // Biochim. Biophys. Acta 2002. V. 1579, P. 180-184.

218. De Maria N., Colantoni A., Fagiuoli S., Liu G.J., Rogers B.K., Farinati F., Van Thiel D.H.Floyd R.A. Association between reactive oxygen species and disease activity in chronic hepatitis C. // Free Radic. Biol. Med. 1996. V. 21, P. 291-295.

219. Li S„ Ye L„ Yu X., Xu B., Li K, Zhu X., Liu II., Wu X.Kong L. Hepatitis C virus NS4B induces unfolded protein response and endoplasmic reticulum overload response-dependent NF-kappaB activation. // Virology 2009. V. 391, P. 257-264.

220. Ciccaglione A.R., Coslantino A., Tritarelli E., Marcantonio C., Equestre M., Marziliano N.Rapicetta M. Activation of endoplasmic reticulum stress response by hepatitis C virus proteins. II Arch. Virol. 2005. V. 150, P. 1339-1356.

221. Mehmeti I., Lortz S.Lenzen S. The H(2)0(2)-sensitive HyPer protein targeted to the endoplasmic reticulum as a mirror of the oxidizing thiol-disulfide milieu. // Free Radic. Biol. Med. 2012. V. 53, P. 1451-1458.

222. Gorlach A., Klappa P.Kietzmcmn T. The endoplasmic reticulum: folding, calcium homeostasis, signaling, and redox control. // Antioxid. Redox Signal. 2006. V. 8, P. 1391-1418.

223. Gilabert J A. Cytoplasmic calcium buffering. 11 Adv. Exp. Med. Biol. 2012. V. 740, P. 483498.

224. Wang T., Campbell R. V., Yi M.K., Lemon S.M. Weinman SA. Role of Hepatitis C virus core protein in viral-induced mitochondrial dysfunction. I I J. Viral. Hepat. 2010. V. 17, P. 784-793.

225. Gilady S.Y., Bui M., Lynes E.M., Benson M.D., Watts R., Vance J.E.Simmen T. Erolalpha requires oxidizing and normoxic conditions to localize to the mitochondria-associated membrane (MAM). // Cell. Stress. Chaperones. 2010. V. 15, P. 619-629.

226. Araki K.Inaba K. Structure, mechanism, and evolution of Erol family enzymes. II Antioxid. Redox Signal. 2012. V. 16, P. 790-799.

227. Yohannes E., Ghosh S.K., Jiang В., McCormick T.S., Weinberg A., Hill E., Faddoul F.Chance M.R. Proteomic signatures of human oral epithelial cells in HIV-infected subjects. // PLoS One 2011. V. 6, P. e27816.

228. Katsuyama M. NOX/NADPH oxidase, the superoxide-generating enzyme: its transcriptional regulation and physiological roles. I I J. Pharmacol. Sci. 2010. V. 114, P. 134146.

229. Aubert J., Begriche K., Knockaert L., Robin MA.Fromenty B. Increased expression of cytochrome P450 2E1 in nonalcoholic fatty liver disease: mechanisms and pathophysiological role. // Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol. 2011. V. 35, P. 630-637.

230. Lieber C.S. Cytochrome P-4502E1: its physiological and pathological role. II Physiol. Rev. 1997. V. 77, P. 517-544.

231. Ostapowicz G., Watson K.J., Locarnini S.A.Desmond P. V. Role of alcohol in the progression of liver disease caused by hepatitis C virus infection. // Hepatology 1998. V. 27, P. 1730-1735.

232. Hassan M.M., Hwang L.Y., Hatten C.J., Swaim M., Li D„ Abbruzzese J.L., Beasley P.Patt Y.Z. Risk factors for hepatocellular carcinoma: synergism of alcohol with viral hepatitis and diabetes mellitus. II Hepatology 2002. V. 36, P. 1206-1213.

233. Burdette D., Olivarez M.Waris G. Activation of transcription factor Nrf2 by hepatitis C virus induces the cell-survival pathway. II J. Gen. Virol. 2010. V. 91, P. 681-690.

234. Osman H.G., Gabr O.M., Lotjy S.Gabr S. Serum levels of bcl-2 and cellular oxidative stress in patients with viral hepatitis. // Indian J. Med. Microbiol. 2007. V. 25, P. 323-329.

235. Bataller R., Paik Y.H., Lindquist J.N., Lemaslers J.J.Brenner D.A. Hepatitis C virus core and nonstructural proteins induce fibrogenic effects in hepatic stellate cells. // Gastroenterology 2004. V. 126, P. 529-540.

236. Street A., Macdonald A., Crowder K.Harris M. The Hepatitis C virus NS5A protein activates a phosphoinositide 3-kinase-dependent survival signaling cascade. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279, P. 12232-12241.

237. Chakrabarti A., Chen A.W.Varner J.D. A review of the mammalian unfolded protein response. // Biotechnol. Bioeng. 2011. V. 108, P. 2777-2793.

238. BairdL.Dinkova-Kostova A.T. The cytoprotective role of the Keapl-Nrf2 pathway. // Arch. Toxicol. 2011. V. 85, P. 241-272.

239. Otieno M.A.Kensler T.W. A role for protein kinase C-delta in the regulation of ornithine decarboxylase expression by oxidative stress. // Cancer Res. 2000. V. 60, P. 4391-4396.

240. Chopra S. Wallace H.M. Hydrogen peroxide induces the catabolism of polyamines in human breast cancer cells. // Biochem. Soc. Trans. 1996. V. 24, P. 230S.

241. Babbar N. Gerner E.W.Casero R.A., Jr. Induction of spermidine/spermine N1-acetyltransferase (SSAT) by aspirin in Caco-2 colon cancer cells. // Biochem. J. 2006. V. 394, P. 317-324.

242. Persson L.Pegg A.E. Studies of the induction of spermidine/spermine Nl-acetyltransferase using a specific antiserum. ///. Biol. Chem. 1984. V. 259, P. 12364-12367.

243. Fogel-Petrovic M., Vujcic S., Brown P. J., Haddox M.K.Porter C. W. Effects of polyamines, polyamine analogs, and inhibitors of protein synthesis on spermidine-spermine Nl-acetyltransferase gene expression. // Biochemistry 1996. V. 35, P. 14436-14444.

244. Murakami Y., Matsufuji S., Kameji 71, Hayashi S., Igarashi K., Tamura T., Tanaka K.Ichihara A. Ornithine decarboxylase is degraded by the 26S proteasome without ubiquitination. II Nature 1992. V. 360, P. 597-599.

245. Milovic V.Turchanowa L. Polyamines and colon cancer. // Biochem. Soc. Trans. 2003. V. 31, P. 381-383.

246. Kingsnorth A.N., Wallace H.M., Bundred N.J.Dixon J.M. Polyamines in breast cancer. 11 Br. J. Surg. 1984. V. 71, P. 352-356.

247. Lipton A., Sheehan L.M.Kessler G.F., Jr. Urinary polyamine levels in human cancer. // Cancer 1975. V. 35, P. 464-468.

248. Kingsnorth A.N., Lumsden A.B.Wallace H.M. Polyamines in colorectal cancer. // Br. J. Surg. 1984. V. 71, P. 791-794.

249. Loser C., Folsch U.R., Paprotny C.Creutzfeldt W. Polyamine concentrations in pancreatic tissue, serum, and urine of patients with pancreatic cancer. // Pancreas 1990. V. 5, P. 119-127.

250. Coleman C.S., Pegg A.E., Megosh L.C, Guo Y., Sawicki J.A.O'Brien T.G. Targeted expression of spermidine/spermine Nl-acetyltransferase increases susceptibility to chemically induced skin carcinogenesis. // Carcinogenesis 2002. V. 23, P. 359-364.

251. Wang Z., Faith M., Patterson F., Tang K., Kerrin K, Wileyto E.P., Detre J.A.Lerman C. Neural substrates of abstinence-induced cigarette cravings in chronic smokers. // J. Neurosci. 2007. V. 27, P. 14035-14040.

252. Ha H.C., Sirisoma N.S., Kuppusamy P., Zweier J.L., Woster P.M.Casero R.A., Jr. The natural polyamine spermine functions directly as a free radical scavenger. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. V. 95, P. 11140-11145.

253. Tkachenko A.G.Fedotova M.V. Dependence of protective functions of Escherichia coli polyamines on strength of stress caused by superoxide radicals. // Biochemistry (Mosc) 2007. V. 72, P. 109-116.

254. Gibson W.Roizman B. Compartmentalization of spermine and spermidine in the herpes simplex virion. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1971. V. 68, P. 2818-2821.

255. Gibson W., van Breemen R., Fields A., LaFemina R.lrmiere A. D,L-alpha-difluoromethylornithine inhibits human cytomegalovirus replication. // J. Virol. 1984. V. 50, P. 145-154.

256. Clarke J.R.Tyms A.S. Polyamine biosynthesis in cells infected with different clinical isolates of human cytomegalovirus. II J. Med. Virol. 1991. V. 34, P. 212-216.

257. Sheppard S.L., Burness A.T.Boyle S.M. Polyamines in encephalomyocarditis virus. // J. Virol. 1980. V. 34, P. 266-267.

258. Lanzer W.Holowczak J.A. Polyamines in vaccinia virions and polypeptides released from viral cores by acid extraction. // J. Virol. 1975. V. 16, P. 1254-1264.

259. Kelly D.C.Elliott R.M. Polyamines contained by two densonucleosis viruses. // J. Virol. 1977. V. 21, P. 408-410.

260. Fukuma I.Cohen S.S. Polyamines in bacteriophage R17 and its RNA. // J Virol. 1975. V. 16, P. 222-227.

261. Quail A., Karrer E. Warren R.A. Polyamines in bacteriophage phi W-14 and in phi W-14-infected Pseudomonas acidovorans. II J. Gen. Virol. 1976. V. 33, P. 135-138.

262. McCormick F.P.Newton A.A. Polyamine metabolism in cells infected with herpes simplex virus. // J. Gen. Virol. 1975. V. 27, P. 25-33.

263. McCormick F. Polyamine turnover and leakage during infection of HeLa and L-cells with herpes simplex virus type 1. // Virology 1978. V. 91, P. 496-503.

264. Gibson W., and B. Roizman, The structural role and metabolic involvement of polyamines with herpes simplex virus,, in Polyamines in normal and neoplastic growth, Russell D.H., Editor 1973, Raven Press, Inc: New York.

265. Isom H.C. Stimulation of ornithine decarboxylase by human cytomegalovirus. // J. Gen. Virol. 1979. V. 42, P. 265-278.

266. Garnett H.M. Altered polyamine concentrations in cytomegalovirus-infected human cells. // S. Afr. Med. J. 1988. V. 73, P. 209-211.

267. Colombatto S., De Agostini M., Corsi D.Sinicco A. Polyamines in lymphocytes from patients infected by human immunodeficiency virus. // Biol. Chem. Hoppe Seyler 1989. V. 370, P. 745-748.

268. White E.L., Rose L.M., Allan P.W., Buckheit R.W., Jr., Shannon W.M.Secrist J.A., 3rd Polyamine pools in HIV-infected cells. // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 1998. V. 17, P. 101-103.

269. Tyms A.S.Williamson J.D. Inhibitors of polyamine biosynthesis block human cytomegalovirus replication. II Nature 1982. V. 297, P. 690-691.

270. Casero R.A., Jr., Celano P., Ervin S.J., Wiest L.Pegg A.E. High specific induction of spermidine/spermine Nl-acetyltransferase in a human large cell lung carcinoma. // Biochem. J. 1990. V. 270, P. 615-620.

271. Tuomi K, Mantyjarvi R.Raina A. Inhibition of Semliki Forest and herpes simplex virus production in alpha-difluoromethylornithine-treated cells: reversal by polyamines. // FEBS Lett. 1980. V. 121, P. 292-294.

272. A.H. Коровина В.Л.Т., M.A. Хомутов,A.P. Симонян A.P.X, A.B, Иванов*, C.H. Кочетков Биогенные полиамины сперсин и спермидин активируют РНК полимеразу и ингибируют РНК хеликазу вируса гепатита С. // Биохимия 2012. V. 77, Р. 1414-1423.

273. Meyskens F.L., Jr.Gerner E.W. Development of difluoromethylornithine (DFMO) as a chemoprevention agent. // Clin. Cancer Res. 1999. V. 5, P. 945-951.

274. Seiler N., Duranton B.Raul F. The polyamine oxidase inactivator MDL 72527. // Prog. Drug Res. 2002. V. 59, P. 1-40.

275. Soderstjerna E., Hoist C.M., Aim K.Oredsson S.M. Apoptosis induced by the potential chemotherapeutic drug N1, Nll-Diethylnorspermine in a neuroblastoma cell line. //Anticancer Drugs 2010. V. 21, P. 917-926.

276. Chang B.K, Liang Y., Miller D. W„ Bergeron R.J., Porter C. W. Wang G. Effects of diethyl spermine analogues in human bladder cancer cell lines in culture. // J. Urol. 1993. V. 150, P. 1293-1297.1. БЛАГОДАРНОСТИ

277. Мнехотелосьбыпоблагодарить своего научного руководителя Иванова Александра Владимировича за чуткое руководство и огромную помощь в подготовке диссертационной работы.

Информация о работе

Смирнова, Ольга Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Влияние белков вируса гепатита C на регуляцию окислительного стресса и метаболизм биогенных полиаминов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы