Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние аскорбиновой кислоты на обмен гликозаминогликанов и резистентность организма к токсическим воздействиям

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние аскорбиновой кислоты на обмен гликозаминогликанов и резистентность организма к токсическим воздействиям"

На правах рукописи

Ерофеева Ольга Евгеньевна

ВЛИЯНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ОБМЕН ГЛИКОЗАМИ-НОГЛИКАНОВ И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОРГАНИЗМА К ТОКСИЧЕСКИМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа - 2007

003059103

Работа выполнена в лаборатории биологически активных веществ Института нефтехимии п катализа РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Башкатов Сергей Александрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических паук, профессор Мустафина Ольга Евгеньевна доктор биологических наук, профессор Ральчснко Ирина Викторовна

Ведущая организация: Ижевская государственная медицинская

академия

Защита диссертации состоится «.$/» 2007 г в « {6» часов на заседа-

нии Регионального диссертационного совета КМ 002 133 01 при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу 450054, г Уфа, проспект Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

Автореферат разослан «¿/£>> б-Л/Ы'^б.007 г

Ученый секретарь Регионального диссертационного совета I ' С.М Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Проблема поиска средств, повышающих адапга-ционные возможности организма к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в последнее время стала особенно актуальной Это связано как с ухудшением экологической обстановки, так и с возрастанием информационно-эмоциональной нагрузки на психику человека Иными словами, даже в случае здорового образа жизни при любом неблагоприятном воздействии в клеточном микроокружении появляются токсические вещества эндогенной или экзогенной природы, что неизбежно требует своей коррекции (Башкатов С А , 1996) Основным путем обезвреживания этих соединений является их конъюгация с УДФ-глюкуроновой кислотой (УДФ-ГК) с последующим выведением из организма Однако за УДФ-ГК конкурируют и другие метаболические процессы, основным из которых является биосинтез гетерополисахаридов - гликозами-ногликанов межклеточного матрикса, что приводит к снижению эффективности детоксикации (Зимницкий А Н , Башкатов С А , 2004) Таким образом, и глю-куронидные конъюгаты, и гликозаминогликаны (ГАГ) синтезируются из общего предшественника - УДФ-глюкуроновои кислоты После выполнения своей функции гликозаминогликаны метаболизируются в глюкуронат-ксилулозчом цикле (ГКЦ), одним из метаболитов которого является аскорбиновая кислота Из сказанного следует, что метаболизм УДФ-глюкуроновои кислоты, тесно сопряженный с функционированием ГКЦ, обменом ГАГ и аскорбиновой кислоты (АК), имеет большое значение для защиты организма при самых различных неблагоприятных воздействиях

В методическом плане отметим, что в организме крыс аскорбиновая кислота синтезируется в глюкуронат-ксилулозном цикле в количестве примерно 50 мг/кг и является необходимым метаболитом биосинтеза ГАГ У приматов (в том числе человека) и морских свинок аскорбиновая кислота не синтезируется из-за отсутствия двух специфических ферментов ГКЦ (Ь-гулонат гулоно-у-лактонгидролазы (альдонолактоназы) 3 1 1 18 и гулоно-у-лактон кислород-

оксидоредуктазы (Ь-гулонодактоноксидазы) 113 8 (Дэгли С , Николсон Д, 1973), является витамином, который, однако, по механизму своего действия представляет собой типичный нормальный метаболит Катаболизм гликозами-ногликанов с образованием аскорбиновой кислоты у крыс протекает также в глюкуронат-ксилулозном цикле, поэтому представляется вероятным, что нагрузка этого цикла большим количеством АК должна замедлить катаболизм ГАГ и направить основной предшественник их синтеза УДФ-глюкуроновую кислоту в реакции глюкуронидной конъюгации, обеспечивающие процессы де-токсикации в организме и тем самым повысить его неспецифическую резистентность

Дважды нобелевский лауреат Лайнус Полинг отмечал, что систематическое применение больших доз аскорбиновой кислоты улучшает состояние больных различными заболеваниями Очевидно, это заключение Л Полинга свидетельствует в пользу доводов о повышении аскорбиновой кислотой неспецифической резистентности ор! анизма

Для изучения антитоксической эффективности аскорбиновой кислоты нами в качестве модельного агента был выбран фенол, обладающий выраженным нейротоксическим действием и детоксицирующийся организмом в реакциях глюкуронидной конъюгации с превращением в нетоксичные фенилглюкуро-ниды

Таким образом, выбор нами аскорбиновой кислоты в качестве средства, модулирующего обмен веществ, обусчовтен необходимостью предложить новые подходы к регуляции обмена веществ нормальными метаболитами на примере аскорбиновой кисло гы для аскорбат-независимого вида (крыс) и экстраполировать полученные результаты на аскорбат-зависимые виды С учетом изложенного, представляется обоснованным выдвижение основной эмпирической гипотезы об ингибирующем действии больших дозировок аскорбиновой кислоты на биосинтез гликозаминогликанов, приводящем к перераспределению в организме фонда УДФ-глюкуроновой кислоты в сторону реакций конъюгации

и повышающим за счет этого его неспецифическую резистентность к токсическим воздействиям Целью настоящей экспериментальной работы являлось изучение влияния больших доз аскорбиновой кислоты на обмен гликозаминог-ликанов и защитную эффективность при остром отравлении фенолом, а также теоретическое обоснование ее применения в качестве средства, повышающего иеспецифическую резистентность организма к неблагоприятным экзо- и эндогенным воздействиям Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1 Изучить влияние больших доз аскопбиновой кислоты на состояние обмена гликозаминогликанов и их фракций - гиалуроновой кислоты и сульфа-тированных гликозаминогликанов - в различных органах белых некн-бредных крыс

2 Изучить влияние больших доз аскорбиновой кислоты на содержание нуклеиновых кисло г в различных органах белых неинбредных крыс

3 Оценить защитную эффективность аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом белых неинбредных крыс

4 Изучить вчияние аскорбиновой кислоты на ингерсивность реакций глю-куроншшой конъюгации с применением в качестве токсического агент 14С-фенола

5 Разработать практические рекомендации по дальнейшему изучению аскорбиновой кислоты в качестве средства, повышающего неспецифическую резистентность организма

Научная новизна. Проведенные исследования позволили существенно расширить представления о биохимических механизмах лежащих в основе фармакологических эффектов аскорбиновой кислоты Установлено, что в организме белых неинбредных крыс аскорбиновая кислота в дозе 100 мг/кг ингиби-рует анаболизм гликозаминогликанов и их фракций, в дозе 500 мг/кг - ишиби-рует и анаболизм, и катаболизм этих биополимеров, а в дозе 1000 мг/кг - к блокированию обмена гликозаминогликанов добавляется нарушение соотношения

фракционного состава сульфатированных и несульфатированных ГАГ Установлено защитное действие аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом белых крыс, одним из биохимических механизмов которого выступает повышение интенсивности реакций глюкуронидной конъюгации, происходящее на фоне увеличения содержания в печени нуклеиновых кислот, что является косвенным подтверждением интенсификации биосинтетических процессов Теоретически обосновано, что биохимические механизмы фармакологических эффектов именно больших доз аскорбиновой кислоты носят сходный характер у аскорбат-зависимых и аскорбат-независимых видов Не вызывает сомнений целесообразность проведения дальнейших фундаментальных исследований в этом направлении

Практическая значимость. Показана возможность принципиально нового подхода к разработке средств, повышающих адаптационные резервы организма Практически продемонстрировано, что нормальный метаболит (аскорбиновая кислота) может быть использован для биохимического регулирования интенсивности метаболических потоков макроэргических соединений (УДФ-глюкуроноьой кислоты) для решения тех или иных фармакологических задач Предложен как общий принцип повышения адаптационных возможностей организма, так и конкретный методический подход, заключающийся в применении для этих целей аскорбиновой кислоты для аскорбат-независимых видов, например, в ветеринарии и животноводстве Вместе с тем для практического внедрения нашего предложения необходимо проведение большого количества доклинических исследований уточняющего характера

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Пироговской научной конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2003), Конференции ученых Республики Башкортостан «Научный прорыв - 2004» (Уфа, 2004), на Межрегиональной научно-практической конференции «Формирование здорового образа жизни государственные, национальные, личностные приоритеты» (Уфа, 2005), Всероссийской научно-

практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины (Уфа, 2006)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 113 страницах, содержит 27 таблиц, 36 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 197 источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные эксперименты были выполнены на 640 белых инбредных половозрелых крысах Исследовали биохимические показатели белых неинбредных крыс весом 180-220 г Определяли содержание гликозаминогликанов и их фракций, нуклеиновых кислот в головном мозге, легких, сердце, печени и кишечнике Концентрации фенилглюкуронидов оценивали в печени по реакции Дише на уроновые кислоты и по радиоактивности 14С-фенильного радикала Определяли защитную эффективность аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом в дозе ОЬв) Оценивали влияние больших однократных дозировок аскорбиновой кислоты (100, 500 и 1000 мг/кг), введенных внутркбрю-шинно, на динамику содержания гликозаминогликанов и нуклеиновых кислот (НК) в вышеперечисленных органах и антитоксическую резистентность организма Определение гликозаминог чиканов, их фракций и нуклеиновых шслот проводили с использованием гельфильтрации на сефадексе 0-25 и аниоиооб-менной хроматографии на ВЕАР-цечлюлозе (Зимницкии А Н , Еашкатов С А , 2004) При обработке полученных данных рассчитывали средние зна-тсния, стандартные отклонения, вычисляли г-критерий Стыоденга, Р-критерий Фишера, и-критерий Манна-Уитни, применяли однофакторный дисперсионный анализ (ОДА)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние аскорбиновой кислоты на содержание гликозаминоглика-нов и нуклеиновых кислот в органах крыс.

Крысам АК вводили однократно внутрибрюшинно в дозах 100, 500 и 1000 мг/кг, через 30 мин животных забивали и определяли ГАГ и НК в органах В таблице 1 приведены средние значения и стандартные отклонения показателей содержания гликозаминогликанов (ГАГ) в органах интактных крыс и крыс, получавших аскорбиновую кислоту (АК) в дозах 100, 500 и 1000 мг/кг Одно-факторный дисперсионный анализ показал, что АК не влияет на уровень ГАГ в кишечнике крыс (Р(3, 24)~2,2913; р=0,10382) Вместе с тем, сравнение средних по ^критерию Стьюдента (МеБ^ обнаружило статистически значимые различия лишь между группами животных, получавших АК в дозах 500 и 1000 мг/кг (р=0,043959) Полученные рез>льтаты позволяют заключить, что АК не увеличивает уровень ГАГ в ткани кишечника подопытных крыс

Таблица 1. Содержание гликозамииогликанов в органах крыс, получав-

ших различные дозы аскорбиновой кислоты

Доза АК, мг/кг п* Содержание ГАГ, мкг/1 ткани

Кишечник Легкие Мозг Печень Сердце

0 7 55,38±24,69 76,54+28,21 47,33±17,47 74,01+21,86 52,10+8,58

100 7 67,86±30,48 41,52±9,45 28,96±9,36 29,12±8,36 39,62±7,23

500 7 89,14±37,56 54,37±11,57 55,47+17,58 95,74±27,85 64,89±12,32

1000 7 52,70±20,61 44,98+9,77 28,7519,53 41,56±12,40 61,19±11,55

*п — здесь и далее - количество животных в группе

В легких АК, по результатам ОДА, статистически значимо уменьшала содержание ГАГ (Р(3, 24)=0,00276, р=0,00276) Так, г-геэг показал, что введение крысам АК в дозе 100 мг/кг приводило к уменьшению содержания АК в 1,84 раза

(р=0,008933), в дозе 500 мг/кг - в 1,41 раза (р=0,078379, тенденция различий) и в дозе 1000 М1 /кг- в 1,70 раза (р=0,016123) АК в дозах 100 и 1000 м1/ю уменьшала содержание ГАГ в головном мозге крыс (Р(3, 24)=6,3763, р=0,00248) по ь Теэг, соответственно в 1,63 (р=0,030475) и 1,65 (р=0,029469) раза Аналогичная картина наблюдалась и в печени АК снижала содержание ГАГ в печени (Р(3, 24)=17,490, р=0,000001) по Мея!, в дозе 100 мг/кг в 2,54 раза (р=0,000273), а в дозе 1000 мг/кг - в 1,78 раза (р=0,005109) АК уменьшала содержание ГАГ в сердце крыс (Б(3, 24)=8,6218, р=0,00046) По Мев^ введение АК в дозе 100 мг/кг привело к снижению концентрации ГАГ в 1,31 раза (р=0,012280)

Анализируя общие закономерности влияния аскорбиновой кислоты на уровень гликозаминогликанов в органах крыс, можно отметить, что в контрольной группе интактных животных наибольшее содержание ГАГ отмечалось в легких и печени, соответственно 76,54 и 74,01 мкг/1 ткани Меньшие значения этого показателя наблюдались в кишечнике, мезге и сердце соответственно 55,38, 47,33 и 52,10 мкг/г Введение аскорбиновой кислоты в дозе 100 м1/кг приводило к уменьшению уровня ГАГ в легких, мозге, печени и сердце в 1,84, 1,63, 2,54 и 1,31 раза Из этого можно сделать заключение об уменьшении биосинтеза ГАГ в этих органах Биохимический механизм этого процесса, очевидно, заключается в ингибировалии по механизму обратной связи биосинтеза ГАГ аскорбиновой кислотой как метаболитом глюкуронат-ксилулозного цикла Увеличение дозы аскорбиновой до 500 мг/кг приводило к следующим биохимическим эффектам Так, содержание ГАГ по сравнению с показателями животных, получивших АК в дозе 100 мг/кг, в органах резко возрастало при этом в легких наблюдалось увеличение показателя в 1,31 раза, в мозге - в 1,92, в печени - 3,29 и в сердце - 1,64 Представляется важным, что абсолютные значения концентраций ГАГ животных, получивших аскорбиновую кислоту в дозе 500 мг/кг, оставались в пределах контрольных значений этого показателя По нашему мнению, полученные результаты можно объяснить тем, что введение столь большой дозы аскорбиновой кислоты по механизму обратной связи через

глюкуронат-ксилулозный цикл полностью блокирует как анаболизм, так и катаболизм гликозаминогликанов в органах и тканях

Дальнейшее увеличение дозировки аскорбиновой кислоты до 1000 мг/кг приводило к уменьшению содержания ГАГ в легких, мозге и печени соответственно в 1,70, 1,64 и 1,78 раза Хотя внешне картина напоминала ситуацию при введении аскорбиновой кислоты в дозе 100 мг/кг, однако, по-видимому, полученные результаты свидетельствуют о последствиях токсического эффекта АК в этой дозировке В пользу этого можно привести следующие аргументы Во-первых, известно, что суточная потребность в аскорбиновой кислоте организма составляет примерно 1 мг/кг Во-вторых, в дозе 100 мг/кг аскорбиновая кислота уменьшала содержание ГАГ в органах, что можно объяснить уменьшением их биосинтеза, а в дозе 500 мг/кг не влияла на их уровень, что мы интерпретировали как ингибирование обмена ГАГ в целом Поэтому повторное снижение не может по своему механизму быть аналогичным эффекту аскорбиновой кислоты в дозе 100 мг/кг Можно предположить, что аскорбиновая кислота в дозе 1000 мг/кг обладает токсическим действием, в результате которого настолько нарушается структура органов, что они теряют гликозаминогликаны Иными словами, ГАГ из межклеточного матрикса с тканевой жидкостью попадают в лимфу и далее в кровяное русло Поскольку гликозаминогликаны являются полимерными кислотами, свойства которых обусловлены карбоксильными группами гексуроновых кислот, представляется весьма вероятным, что положительно заряженные анионы аскорбиновой кислоты, накопившиеся в тканях в чрезмерно большой концентрации, способствуют вытеснению ГАГ из межклеточного матрикса органов сначала в тканевую жидкость, затем в лимфу и далее в систему кровообращения

Получив столь интересные данные при изучении влияния больших дозировок аскорбиновой кислоты на содержание гликозаминогликанов в органах, мы решили оценить, как при этом будет меняться фракционный состав гликозаминогликанов, а именно несульфатированная фракция, представленная гиа-

луроновой кислотой (ГК) и сульфатированная фракция (СГАГ), представленная в основном хондроитин- и гепарансульфатами Средние значения и стандартные отклонения показателей содержания гиалуроновой кислоты в органах крыс, получивших различные дозы аскорбиновой кислоты, представлены в таблице 2

Таблица 2. Содержание гиалуроновой ккслоты в органах крыс, получавших различные дозы аскорбиновой кислоты

Доза АК, мг/кг п Содержание ГК, мкг/г ткани

Кишечник Легкие Мозг Печень Сердце

0 6 27,90+6,61 38,32+8,65 21,62+5,49 31,83+5,11 25,81+8,19

100 6 28,70+7,54 18,20±2,9'; 14,5б±3,72 11,21+2,15 17,64±3,04

500 6 27,95±4,3б 17,33+3,19 33,02+8,99 32,77±6,47 36,10±5,95

1000 6 26,55±6,81 8,95±1,61 15,25±4,29 13,88+2,49 32,78±5,01

АК не влияла на уровень ГК в кишечнике крыс (Р(3, 20)=0,11528, р=0,95012) Сравнение средних значений по ^критерию Стыоденга также не выявило статистически значимых различий АК во всех дозировках уменьшала содержание ГК в легких крыс (Б(3, 20)=38,700, р=0,000001) (рис 1), по Меэ^ в дозе 100 мг/кг - в 2,11 раза (р=0,000305), в дозе 500 мг/кг - в 2,20 раза (р=0,000236), в дозе 1000 мг/кг - в 4,28 раза (р=0,000010)

АК снижала уровень ГК в головном мозге крыс (Р(3, 20)=12,236, р-0,00009) по Ыевг, в дозе 100 мг/кг - в 1,48 раза (р-0,026340), в дозе 1000 мг/кг - в 1,42 раза (р=0,049216) В этих же дозировках АК снижала концентрацию ГК в печени крыс (Р(3, 20)=40,0614, р=0,000001) по Мев^ в дозе 100 мг/кг АК уменьшала уроьень ГК в 2,84 раза (р=0,000004), а в дозе 1000 мг/кг - в 2,29 раза (р-0,000016) АК статистически значимо уменьшала уровень ГК в сердце крыс (Р(3, 20)=11,724, р=0,00012) в дозе 100 мг/кг в 1,46 раза (р=0,045071)

45

В <0

5 25

0 100 500 1000

Аскорбиновая кислота, мг/кг

Рис. 1. Влияние аскорбиновой кислоты на уровень гиалуроновой кисло! ы в легких крыс.

Таким образом, аскорбиновая кислота в дозе 100 мг/кг снижала содержание ГК в легких, мозге, печени и сердце соответственно в 2,11, 1,48, 2,79 и 1,46 раза Увеличение дозы АК до 500 мг/кг повышало ее содержание относительно показателей воздействия в дозе 100 мг/кг в мозге, печени и сердце соответственно в 2,27, 2,92 и 2,05 раза Введение в дозе 1000 мг/кг вновь снижало показатели ее содержания в мозге, печени и сердце относительно показателей воздействия в дозе 500 мг/кг соответственно в 2,17 и 2,36 раза В целом, динамика изменений содержания ГК под влиянием возрастающих доз аскорбиновой кислоты была аналогична динамике ГАГ и может быть объяснена теми же причинами

Средние значения и стандартные отклонения содержания сульфатирован-ных гликозаминогликанов (СГАГ) в органах крыс, получавших различные дозировки аскорбиновой кислоты, представлены в таблице 3

Таблица 3. Содержание сульфатированных гликозаминогликанов в орга-

нах крыс, получавших различные дозы аскорбиновой кислоты

Доза АК, мг/кг п Содержание СГАГ, мкг/г ткани

Кишечник Легкие Мозг Печень Сердце

0 6 26,86±5,49 37,77±6,53 25,43±6,23 41,90±7,38 26,0214,80

100 6 34,57±5,88 37,02±6,94 17,56±4,90 18,03±3,71 25,1914,88

500 6 52,12+9,00 37,50+6,84 26,28±7,26 53,67±11,73 27,0015,46

1000 6 32,74±5,34 37,5019,22 16,38+4,01 28,25±6,16 28,0315,78

АК в дозах 100 и 500 мг/кг статистически значимо увеличивала уровень СГАГ в кишечнике крыс (F(3, 20) =16,287, р=0,00001) по t-test, соответственно в 1,29 раза (р=0,040949) и в 1,94 раза (р=0,000158) АК не влияла на содержание СГАГ в легких крыс (F(3, 20)^0,01053, р~0,99847) все дозировки АК не изменяли уровня этого показателя (р=0,851028, р=0,946282, р-=0,955039) АК в дозах 100 и 1000 мг/кг уменьшала содержание СГАГ в головном мозге крыс (КЗ, 20)=4,8697, р=0,01057), по t-test, соответственно в 1,49 раза (р=0,0352031 и в 1,55 раза (р=0,013491) АК в дозах 100 и 1000 мг/кг снижала концентрацию СГАГ в печени крыс (F(3, 20)^23,914, р=0,000001) По t-te^t, количественно содержание СГАГ снизилось соответственно в 2,32 раза (р=0,000034) и 1,48 раза (р=0,005934) АК во всех дозировках не влияла на содержание СГАГ в сердце крыс (F(3, 20)=0,32958, р=0,80401) Сравнение средних не выявило различий между контрольной и экспериментальными группами

Таким образом, в дозе 500 мг/кг АК увеличивала уровень СГАГ по отношению к показателям группы, получавшей АК в дозе 100 мг/кг, кишечнике, мозге и печени соответственно в 1,51, 1,50 и 2,98 раза В дозе 1000 мг/кг АК уменьшала содержание СГАГ в сравнении с группой, получавшей АК в дозе 500 мг/кг, в кишечнике, мозге и печени соответственно в 1,59, 1,60 и 1,90 раза

Анализируя динамику содержания ГАГ, ГК и СГАГ под воздействием различных доз аскорбиновой кислоты, можно отметить общие закономерности,

выражающиеся в уменьшении этих показателей для доз 100 и 1000 мг/кг и в их увеличении в дозе 500 мг/кг Как мы отмечали выше, выявленные закономерности можно объяснить тем, что в дозе 100 мг/кг АК ингибирует биосинтез ГАГ и их фракций, в дозе АК 500 мг/кг ингибируется не только анаболизм, но и катаболизм этих соединений, а в дозе АК 1000 мг/кг происходит интоксикация, сопровождающаяся вытеснением ГАГ и их фракций из межклеточного матрикса органов, вероятно, по ионообменному механизму

Выявив и обсудив общие закономерности динамики изучаемых биополимеров, нам представляется важным проанализировать особенности изучаемых процессов по отдельным органам и по соотношениям концентраций сульфати-рованных и несульфатированных ГАГ (табл 4)

Таблица 4. Соотношение концентраций несульфатированных и сульфати-рованных гликозаминогликанов в органах крыс, получавших различные дозы аскорбиновой кислоты

Доза АК, мг/кг Соотношение концентраций

Кишечник Легкие Мозг Печень Сердце

0 1,04 1,01 0,85 0,76 0,99

100 0,83 0,49 0,83 0,62 0,70

500 0,54 0,46 1,26 0,61 1,34

1000 0,81 0,27 0,93 0,49 1,17

Аскорбиновая кислота в дозе 100 мг/кг уменьшала соотношение ГК/СГАГ во всех органах, кроме мозга В легких этот показатель снижался до 0,49 В дозе 500 мг/кг эта картина сохранялась в кишечнике (0,54), легких (0,46) и печени (0,61), а в мозге и сердце, наоборот, соотношение ГК/СГАГ стало существенно превышать единицу В дозе 1000 мг/кг аскорбиновая кислота чрезвычайно сильно уменьшала соотношение ГК/СГАГ в легких и печени - до 0,27 Также низким оставался этот показатель в печени (0,49)

Таким образом, можно заключить, что аскорбиновая кислота в дозе 100 мг/кг, очевидно, ингибирует анаболизм ГАГ и их фракций, в дозе 500 мг/кг блокируется как анаболизм, так и катаболизм этих биополимеров, в дозе 1000 мг/кг отмечается обеднение органов ГАГ и их фракций, по-видимому, за счет токсических эффектов аскорбиновой кислоты Следует подчеркнуть, что одним из возможных токсических механизмов больших дозировок аскорбиновой кислоты может выступать вытеснение ГАГ и их фракций из межклеточного мат-рикса по анионообменному механизму

Средние значения и стандартные отклонения показателей содержания в органах крыс, получивших различные дозировки аскорбиновой кислоты, представлены в таблице 5 АК во всех дозировках снижала содержание НК в кишечнике крыс (Р(3, 20)=20,887, р=0,000001) по в дозе 100 мг/кг в 1,20 раза (р=0,007397), в дозе 500 мг/кг - в 1,56 раза (р=0,000013), в дозе 1000 мг/кг - в 1,20 раза (р=0,007503) В легких АК также изменяла содержание НК (Р(3, 20)=20,725, р=0,000001) При этом, по Мез1, АК в дозе 500 мг/кг в 1,18 раза (р=0,003033) уменьшала уровень НК, а в дозе 1000 мг/кг в 1,18 раза (р=0,003054) увеличивала этот показатель

Таблица 5. Содержание нуклеиновых кислот в органах крыс, получавших различные дозы аскорбиновой кислоты

Доза АК, мг/кг п Содержание НК, мкг/г ткани

Кишечник Легкие Мозг Печень Сердце

0 6 811±76 642±50 411+50 534+65 464+77

100 6 676±63 651±47 292±35 1127+143 422170

500 6 520+49 542±39 350±42 1025±130 325154

1000 6 676±64 758±54 432+59 1019+114 487181

1300

я 1200 га а

и "00

1 1000

g 900

ч

о

| 800 v

3 700 о

Я 600

0J

П

500 400 300

0 100 500 1000

Аскорбиновая кис юта, мг/кг Рис 2 Влияние аскорбиновой кис юты на уровень нуклеиновых кислот в печени крыс.

АК в дозах 100 и 500 мг/кг уменьшала содержание НК в головном мозге крыс (F(3, 20)=10,725, р=0,00020) по t-test, соответственно в 1,41 раза (р=0,000735) и в 1,17 раза (р=0,045449) Введение АК приводило к увеличению содержания НК в печени крыс (F(3, 20)=31,153, р-0,000001) (рис 3 2) По t-test, в дозе 100 мг/кг АК увеличивала показатель содержания НК в 2,11 раза (р=0,000003), в дозе 500 мг/кг-в 1,92 раза (р=0,000009), в дозе 1000 мг/кг-в 1,91 раза (р=0,000004) АК уменьшала уровень НК в сердце крыс (F(3, 20)=6,0930, р=0,00406) При этом АК в дозе 500 мг/кг снижала этот показатель в 1,43 раза (р=0,004666)

Полученные данные убедительно свидетельствуют, что в тканях кишечника, мозга и сердца наблюдалось умеренное снижение концентрации нуклеиновых кислот В легких уровень нуклеиновых кислот был достаточно стабильным Однако в печени картина была по истине впечатляющей Так, все дозировки аскорбиновой кислоты и 100, и 500, и 1000 мг/кг увеличивали содержание в печени нуклеиновых кислот По нашему мнению, это можно объяснить

интенсивным биосинтезом, направленным на выведение из организма токсических веществ

Защитная эффективность аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом белых неинбредных крыс.

Выше по тексту мы отмечали, что аскорбиновая кислота в дозе 100 мг/кг ингибирует анаболизм, а дозе 500 мг/кг - и катаболизм гликозаминогликанов в печени В дозе 1 ООО мг/кг АК проявляет токсическое действие, заключающееся в снижении общего содержания гликозаминогликанов в печени и доли в ГАГ гиалуроновой кислоты Известно, что ПС выполняет структурообразующую функцию, объединяя протеогликаны в макромолекулярные комплексы, которые и придают ткани органов соответствующие ей физико-химические свойства Поэтому снижение доли ГК в печени в 1,55 раза, то есть соотношения ГК/СГАГ свидетельствует о серьезном нарушении структуры этого органа Нами установлено, что АК во всех использованных дозировках повышает в печени интенсивность биосинтеза нуклеиновых кислот, что является необходимым условием повышения интенсивности биосинтеза белка, в том числе для нужд реакций детоксикации Также, учитывая тот факт, что снижение интенсивности биосинтеза ГАГ и их фракций в печени имеет место при введении аскорбиновой кислоты в дозах 100 и 500 мг/кг без нарушения соотношения ГК/СГАГ, мы предположили, что однократное введение АК в этих дозировках повысит антитоксическую эффективность печени за счет повышения резервов реакций глю-куронидной конъюгации, поскольку известно, что биосинтез гликозаминогликанов и реакции глюкуронидной детоксикации конкурируют за один и тот же метаболит - УДФ-глюкуроновую кислоту

В качестве модельного токсического соединения нами был выбран фенол, который, детоксицируется в реакции глюкуронидной конъюгации и выводится из организма в виде фенилглюкуронида В экспериментах на крысах была определена доза, которая при однократном внутрижелудочном введении вызыва-

ла в течение 1 суток падеж 84% животных (DL84) Она составила 290 мг/кг Три экспериментальные группы крыс по десять животных массой 180 - 200 г получали профилактически аскорбиновую кислоту в дозах 50, 100 или 500 мг/кг внутрибрюшинно и затем через 10 мин внутрижелудочно фенол в дозе DL84 Эксперименты по выявлению защитного эффекта АК при введении фенола в дозе DLs4 показали, что АК в дозе 50 мг/кг практически не влияет на выживаемость животных, в дозе 100 мг/кг обеспечивает выживаемость 80% подопытных крыс, а в дозе 500 мг/кг доводит показатель защиты до 100%

Таким образом, наибольшая защитная эффективность аскорбиновой кислоты, проявляемая в дозе 500 мг/кг, согласуется с ингибированием ею обмена гликозаминогликанов в той же дозировке Неэффективность профилактической дозировки 50 мг/кг, очевидно, объясняется тем, что естественная продукция аскорбиновой кислоты в организме крысы, по данным литературы, составляет примерно 50 мг/сутки и введение нами дополнительно 50 мг существенно не изменяет концентрацию этого метаболита в организме, что сказывается на отсутствии различии в результатах с контрольной группой

Влияние аскорбиновой кислоты на детокснкацию 14С-ф»>нола.

Гипотеза об ускорении детоксикации фенола под воздействием аскорбиновой кислоты была доказана в экспериментах с радиоактивно меченным 14С-фенолом Животные опытной группы получали 14С-фенол в дозе 50 мг/кг, радиоактивность которою составляла 4* 108 Бк/кг массы тела, за 10 мин до введения аскорбиновой кислоты в дозе 500 мг/кг Животные контрольной группы получали только радиоактивный фенол Животных забивали через 15, 30, 60, 90 и 120 минут после начала эксперимента Из печени хроматографически выделяли фенилглюкуронидную фракцию и определяли ее радиоактивность на сцинтилляционном счетчике Результаты исследования приведены на рисунке 3 В связи с малыми объемами выборок (по три животных в группе) мы обработали данные с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни Было

установлено, что суммы рангов в опытных группах превышают суммы рангов контрольных групп на 60 и 90 мин от начала эксперимента (р<0,05) К 120 минуте картина меняется на противоположную сумма рангов контрольной группы превышает сумму рангов опытной группы (р<0,05) К 150 минуте показатели контрольной и опытной группы перестают различаться Таким образом, скорость выведения фенилглюкуронидов из печени животных опытной группы выше, чем у животных контрольной группы

Рис. 3. Влияние аскорбиновой кислоты на динамику содержания в печени иС-фенилглюкуронндов (ерш - счет импульсов в минуту).

С учетом полученных результатов, можно заключить, что радиоактивные фенилглюкурониды определялись в печени животных во временном диапазоне 1-2,5 часа после введения фенола Максимум концентрации фенилглюкуронидов приходился в контрольной группе на 120 мин, а в опытной группе, получавшей аскорбиновую кислоту, на 90 мин Статистическая обработка полученных данных позволила констатировать достоверность различий в показателях радиоактивности сравниваемых 1рупп и доказать ускорение аскорбиновой ки-слотои детоксикации фенола Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что аскорбиновая кислота в дозе 500 мг/кг в организм крыс способствует замедлению обмена гликозаминогликанов, одновременно увеличива-

ет интенсивность реакций глюкуронидной конъюгации и повышает общую (неспецифическую) резистентность организма к токсическим воздействиям

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Теоретической основой выполненной работы было предположение о способности аскорбиновой кислоты в больших дозировках ингибировать обмен 1ЛИкозаминогликанов в организме аскорбат-независимых видов и тем самым сохранять фонд УДФ-глюкуроновой кислоты для использования в реакциях глюкуронидной конъюгации Подчеркнем, что печень и легкие являются органами, выполняющими основной объем реакций детоксикации, основным механизмом которых выступает глюкуронидная конъюгация Представляется важным, что в наших исследованиях именно в печени и легких аскорбиновая кислота по мере повышения дозы сначала ингибировала биосинтез гликозаминог-ликанов и их фракций, затем их катаболизм, а в максимальной дозе существенно нарушала нормальное соотношение фракций ГАГ В дозе 500 мг/кг АК обеспечивала повышение биосинтеза нуклеиновых кислот, а также 100% защиту подопытных крыс при остром отравлении фенолом в дозе ОЛ84 и стимулировала его деюксикацию по фенилглюкуронатному механизму

По нашим данным и сведениям литераторы, аскорбиновая кислота увеличивает биосинтез нуклеиновых кислот Однако в отличие от авторов, также изучавших влияние аскорбиновой кислоты на ткани крыс, мышей и быка, принадлежащих к аскорбат-независимым видам животных, наблюдавших увеличение или неизменность синтеза ГАГ, мы, наоборот, наблюдали его угнетение Это можно объяснить тем, что в наших исследованиях концентрация аскорбиновой кисло 1Ы в органах и тканях была существенно выше, и по механизму отрицательной обратной связи, который широко распространен в метаболических процессах, замедляла биосинтез ГАГ

Поскольку аскорбиновая кислота не относится к лекарственным препаратам, проявляющим антидотные свойства (Голиков С Н и др , 1986), она не способна проявлять специфический антагонизм в отношении действия какого-либо токсиканта Поэтому обнаруженную нами ее антитоксическую эффективность по отношению к экспериментальному отравлению фенолом можно объяснить только с позиций неспецифического опосредованного действия По нашим данным, большие дозировки аскорбиновой кислоты повышали интенсивность реакций глюкуронидной конъюгации, и, очевидно, именно этот биохимический механизм лежит в основе защитной эффективности аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом

По своей сути любой патологический процесс в организме сводится к появлению в клеточном микроокружении токсических веществ экзо- или эндогенной природы Гидрофильные токсиканты немедленно включаются в реакции конъюгации и в виде нетоксичных конъюгатов выводятся из организма Гидрофобные токсические соединения предварительно метаболизируются моноокси-геназной системой цитохрома Р-450 с образованием полярных нуклеофильных группировок и после этого детоксицируются в реакциях конъюгации (Coon М J , Persson А V , 1980) Из этого следует, что любой лекарственный препарат, стимулирующий реакции конъюгации, будет проявлять адаптогенную активность, то есть повышать неспецифическую резистентность организма к любым неблагоприятным ситуациям, чем и можно объяснить многочисленные фармакологические эффекты аскорбиновой кислоты

Представляется важным сравнить биологическую активность малых и больших дозировок аскорбиновой кислоты В настоящее время официальной медицинской литературой признается суточная потребность человека в аскорбиновой кислоте в размере 50 - 100 мг (Зайчик А Ш, Чурилов JIП , 2001) Это так называемая минимальная антискорбутная доза В указанной связи все дозировки АК, превышающие для человека 100 мг в сутки можно отнести к большим дозам этого препарата Для среднего человека весом 70 кг доза в 100

мг/сутки составит примерно 1,4 мг/кг Установлено, что в организме крысы синтезируется 26 - 58 мг/кг АК, и если пересчитать на средний вес человека (70 кг), это даст 1,8 - 4,1 г Сходные данные получены и для других животных

В современном обзоре литературы, посвященном цинге и действию мега-доз аскорбиновой кислоты, АШ Зайчик и ЛП Чурилов (2001) отмечают, что хотя минимальная потребность в аскорбиновой кислоте и составляет 50-100 мг/сутки, но она сильно повышается при разнообразных состояниях, связанных со стрессами и напряженной адаптацией, поэтому многие авторы рекомендуют более значитепьные дозы как минимально необходимые

В антискорбутных дозах аскорбиновая кислота в организме человека участвует в реакциях гидроксилирования биомолекул, синтеза простагландина РОЕ1, стимуляции иммунной системы, синтеза кортикостероидов и некоторых катехоламинов и т д. Однако в минимальных антискорбугных дозировках АК мы не наблюдаем повышения резистентности организмов ни к неблагоприятным воздействиям, ни к заболеваниям Эти фармакологические эффекты - прерогатива «сверхдоз» аскорбиновой кислоты В этой связи становится понятным, почему в научной литературе в течение последних двух десятилетий присутствуют различные мнения относительно полезности больших дозировок аскорбиновой кислоты для человека, в зависимости от того, о чем идет речь о профилактике авитаминоза аскорбиновой кислоты или о повышении неспецифической резистентности организма к небла1 оприятным воздействиям В заключение отметим, что, очевидно, аскорбиновая кислота в антискорбутных дозировках обеспечивает весь комплекс биохимических реакций, описанный классической медицинской биохимией При повышенных уровнях ее воздействия начинают наблюдаться эффекты повышения неспецифической резистентности организма к неблагоприятным воздействиям со стороны окружающей и внутренней среды В связи с этим представляется целесообразным проведение дополнительных биохимических исследований, направленных на уточнение механизмов фармакологической активности больших дозировок аскорбиновой

кислоты у аскорбат-зависимых видов, а также теоретических и экспериментальных разработок, направленных на обоснование методического подхода к решению фармакологических задач на основе применения больших дозировок эндогенных соединений для целенаправленного перераспределения метаболических потоков Полученные нами результаты убедительно свидетельствуют в пользу того, что одним из существенных механизмов этих эффектов является интенсификация реакции глюкурониднон конъюгации, позволяющей выводить из организма токсиканты самой разнообразной экзо- и эндогенной природы

ВЫВОДЫ

1 Аскорбиновая кислота в больших дозировках 100, 500 и 1000 мг/кг введенная в организм белых крыс, доза-зависимо ингибирует обмен гликоза-миногликанов и их фракций - гиалуроновой кислоты и сульфатированных ГАГ, соответственно сначала подавляя анаболизм, затем и катаболизм этих биополимеров

2 Аскорбиновая кислота во всех больших дозировках - 100, 500 и 1000 мг/кг - увеличивает биосинтез нуклеиновых кислот в печени крыс

3 Аскорбиновая кислота в диапазоне доз 100 — 500 мг/кг проявляет защитную эффективность при остром отравлении белых крыс фенолом в дозе ВЬ^

4 Аскорбиновая кислота в дозировке 500 мг/кг повышает интенсивность реакций глюкуронидной конъюгации в печени крыс на модели острого отравления фенолом

5 Теоретически и экспериментально обоснована принципиальная возможность повышения адаптационных возможностей ас^орбат-независимых видов путем применения больших дозировок аскорбиновой кислоты

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ерофеева О Е Влияние больших доз аскорбиновой кислоты на содержание гликозаминогликанов и глюкуронидных конъюгатов в печени крыс / Хус-нутдинова С Б , Ерофеева О Е //Материалы Пироговской научной конференции студентов и молод ученых - М РГМУ, 2003 - С 59

2 Ерофеева О Е Модуляция аскорбиновой кислотой обмена гликозаминогликанов в организме крыс / Ерофеева О Е , Хуснутдинова С Б , Башкатов С А , Гилязов А Ф '/Сборник научных трудов конференции ученых Республики Башкортостан «Научный Прорыв - 2004» -Уфа БГМУ, 2004 - С 15

3 Ерофеева О Е Содержание и метаболизм гликозаминогликанов в органах и тканях белых крыс различного возраста / Зимницкий А Н , Башкатов С А , Хуснутдинова С Б , Петренко h Г , Ерофеева О Е //Биомедицинская химия -2004 -Т 50 -№6 -С 592-599

4 Ерофеева О Е Новый биохимический механизм фармакологической активности аскорбиновой кислоты / Башкатов С А , Ерофеева О Е , Зимницкий

А Н , Хуснутдинова СБ// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Ак гуальные проблемы ветеринарной медицины» - Уфа БГАУ, 2006 -С 14-16

5 Ерофеева О Ь Уточнение локализации биосинтеза гликозаминогликанов и его динамики с применением 14С-глюкозы, меченной по С] /Ерофеева ОЕ , Зимницкий А Н, Башкатов С А //Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» - Уфа БГАУ, 2006 -С 48-50

Подписано в печать 14 03 2007 Бумага офсетная Формат 60x84 1/16 Печать методом ризографии Уел-псч л 1 0 Уч-изд л 1 2 Тираж ЮОэкз Заказ №¡55

Отпечатано в типографии ООО «Офсет» 45007В, г Уфа, Владивостокская 1а

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ерофеева, Ольга Евгеньевна

Список принятых сокращений.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Обмен гликозаминогликанов.

2.1.1. Структура и функции гликозаминогликанов.

2.1.2. Биосинтез гликозаминогликанов. Взаимосвязь синтеза гликозаминогликанов с процессами детоксикации ксенобиотиков.

2.1.3. Катаболизм протеогликанов.

2.2. Глюкуронидная конъюгация.

2.3. Глюкуронат-ксилулезный цикл: описание и биохимические эффекты его функционирования.

2.4. Структура и функции аскорбиновой кислоты. Роль аскорбиновой кислоты в биохимических и физиологических процессах.

2.5. Влияние аскорбиновой кислоты на метаболизм протеогликанов. Сопряженность обмена аскорбиновой кислоты с функционированием глюкуронат-ксилулезного цикла и глюкуронидной коньюгацией.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние аскорбиновой кислоты на обмен гликозаминогликанов и резистентность организма к токсическим воздействиям"

Актуальность работы. Проблема поиска средств, повышающих адаптационные возможности организма к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в последнее время стала особенно актуальной. Это связано как с ухудшением экологической обстановки, так и с возрастанием информационно-эмоциональной нагрузки на психику человека. Иными словами, даже в случае здорового образа жизни при любом неблагоприятном воздействии в клеточном микроокружении появляются токсические вещества эндогенной или экзогенной природы, что неизбежно требует своей коррекции [5]. Основным путем обезвреживания этих соединений является их конъюгация с УДФ-глюкуроновой кислотой (УДФ-ГК) с последующим выведением из организма. Однако за УДФ-ГК конкурируют и другие метаболические процессы, основным из которых является биосинтез гетерополисахаридов -гликозаминогликанов межклеточного матрикса, что приводит к снижению эффективности детоксикации [5]. Таким образом, и глюкуронидные конъюгаты, и гликозаминогликаны (ГАГ) синтезируются из общего предшественника - УДФ-глюкуроновой кислоты. После выполнения своей функции гликозаминогликаны метаболизируются в глюкуронат-ксилулозном цикле (ГКЦ), одним из метаболитов которого является аскорбиновая кислота. Из сказанного следует, что метаболизм УДФ-глюкуроновой кислоты, тесно сопряженный с функционированием ГКЦ, обменом ГАГ и аскорбиновой кислоты, имеет большое значение для защиты организма при самых различных неблагоприятных воздействиях.

В методическом плане отметим, что в организме крыс аскорбиновая кислота (АК) синтезируется в глюкуронат-ксилулозном цикле в количестве примерно 50 мг/кг и является необходимым метаболитом биосинтеза (ГАГ), выступающих одним из основных компонентов межклеточного матрикса. У приматов (в том числе человека) и морских свинок аскорбиновая кислота не синтезируется из-за отсутствия двух специфических ферментов ГКЦ (Ьгулонат: гулоно-у-лактонгидролазы (альдонолактоназы) 3.1.1.18 и гулоно-у-лактон: кислород-оксидоредуктазы (L-гулонодактоноксидазы) 1.1.3.8 [26], является витамином, который, однако, по механизму своего действия представляет собой типичный нормальный метаболит.

Катаболизм гликозаминогликанов с образованием аскорбиновой кислоты у крыс протекает также в глюкуронат-ксилулозном цикле, поэтому представляется вероятным, что нагрузка этого цикла большим количеством АК должна замедлить катаболизм ГАГ и направить основной предшественник их синтеза УДФ-глюкуроновую кислоту в реакции глюкуронидной конъюгации, обеспечивающие процессы детоксикации в организме и тем самым повысить его неспецифическую резистентность. В качестве уровней однократного воздействия аскорбиновой кислоты нами были выбраны 100, 500 и 1000 мг/кг, превышающие нормальный биосинтез этого метаболита у крыс соответственно в 2, 10 и 20 раз и не вызывающие летальных эффектов, что не противоречит основным фармакологическим принципам испытания биологической активности веществ. В указанной связи следует отметить, что в фармакологических исследованиях часто используются дозы 1/10 - 1/30 от уровня среднесмертельного воздействия, то есть от DL50.

К эмпирическим предтечам настоящей работы можно отнести экспериментальные данные о фармакологической эффективности больших дозировок аскорбиновой кислоты, полученные дважды лауреатом Нобелевской премии Лайнусом Полингом и опубликованные им в работах «Витамин С и простуда» («Vitamin С and the Common Cold») [163] и «Рак и витамин С» («Cancer and Vitamin С») (1979). В этих книгах JI. Полинг отмечал, что систематическое применение больших доз аскорбиновой кислоты улучшает состояние больных. На наш взгляд, заключение JI. Полинга свидетельствует в пользу доводов о повышении аскорбиновой кислотой неспецифической резистентности организма.

Для изучения антитоксической эффективности аскорбиновой кислоты нами в качестве модельного агента был выбран фенол, обладающий выраженным нейротоксическим действием и детоксицирующийся организмом в реакциях глюкуронидной конъюгации с превращением в нетоксичные фенилглюкурониды.

Таким образом, выбор нами аскорбиновой кислоты в качестве средства, модулирующего обмен веществ, обусловлен необходимостью предложить новые подходы к регуляции обмена веществ нормальными метаболитами на примере аскорбиновой кислоты для аскорбат-независимого вида (крыс) и экстраполировать полученные результаты на аскорбат-зависимые виды.

С учетом изложенного, представляется теоретически обоснованным выдвижение основной эмпирической гипотезы о существовании ингибирующего действия больших дозировок аскорбиновой кислоты на биосинтез гликозаминогликанов, приводящего к перераспределению в организме фонда УДФ-глюкуроновой кислоты в сторону реакций конъюгации и повышающего за счет этого его неспецифическую резистентность к токсическим воздействиям. В указанной связи целью настоящей экспериментальной работы являлось изучение влияния больших доз аскорбиновой кислоты на обмен гликозаминогликанов и защитную эффективность при остром отравлении фенолом, а также теоретическое обоснование ее применения в качестве средства, повышающего неспецифическую резистентность организма к неблагоприятным экзо- и эндогенным воздействиям.

Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Изучить влияние больших доз аскорбиновой кислоты на состояние обмена гликозаминогликанов и их фракций - гиалуроновой кислоты и сульфатированных гликозаминогликанов - в различных органах белых неинбредных крыс.

2. Изучить влияние больших доз аскорбиновой кислоты на содержание нуклеиновых кислот в различных органах белых неинбредных крыс.

3. Оценить защитную эффективность аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом белых неинбредных крыс

4. Изучить влияние аскорбиновой кислоты на интенсивность реакций глюкуронидной конъюгации с применением в качестве токсического агента ,4С-фенола.

5. Разработать практические рекомендации по дальнейшему изучению аскорбиновой кислоты в качестве средства, повышающего неспецифическую резистентность организма.

Научная новизна. Проведенные исследования позволили существенно расширить представления о биохимических механизмах, лежащих в основе фармакологических эффектов аскорбиновой кислоты. Установлено, что в организме белых неинбредных крыс аскорбиновая кислота в дозе 100 мг/кг ингибирует анаболизм гликозаминогликанов и их фракций, в дозе 500 мг/кг -ингибирует и анаболизм, и катаболизм этих биополимеров, а в дозе 1 ООО мг/кг - к блокированию обмена гликозаминогликанов добавляется нарушение соотношения фракционного состава сульфатированных и несульфатированных ГАГ. Установлено защитное действие аскорбиновой кислоты при остром отравлении фенолом белых крыс, одним из биохимических механизмов которого выступает повышение интенсивности реакций глюкуронидной конъюгации, происходящее на фоне увеличения содержания в печени нуклеиновых кислот, что является косвенным подтверждением интенсификации биосинтетических процессов. Теоретически обосновано, что биохимические механизмы фармакологических эффектов именно больших доз аскорбиновой кислоты носят сходный характер у аскорбат-зависимых и аскорбат-независимых видов. Не вызывает сомнений целесообразность проведения дальнейших фундаментальных исследований в этом направлении.

Практическая значимость Показана возможность принципиально нового подхода к разработке средств, повышающих адаптационные резервы организма. Практически продемонстрировано, что нормальный метаболит (аскорбиновая кислота) может быть использован для биохимического регулирования интенсивности метаболических потоков макроэргических соединений (УДФ-глюкуроновой кислоты) для решения тех или иных фармакологических задач. Предложен как общий принцип повышения адаптационных возможностей организма, так и конкретный методический подход, заключающийся в применении для этих целей аскорбиновой кислоты для аскорбат-независимых видов, например, в ветеринарии и животноводстве. Вместе с тем для практического внедрения нашего предложения необходимо проведение большого количества доклинических исследований уточняющего характера.

На защиту выносятся следующие научные положения:

1. Аскорбиновая кислота при введении белым крысам в больших дозировках ингибирует обмен гликозаминогликанов и их фракций -гиалуроновой кислоты и сульфатированных ГАГ.

2. Аскорбиновая кислота в больших дозировках увеличивает в организме крыс биосинтез нуклеиновых кислот.

3. Аскорбиновая кислота проявляет защитную эффективность при остром отравлении белых крыс фенолом.

4. Аскорбиновая кислота в больших дозировках повышает в организме крыс интенсивность реакций глюкуронидной конъюгации.

5. Существует принципиальная возможность повышения адаптационных возможностей аскорбат-независимых видов путем применения больших дозировок аскорбиновой кислоты.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Пироговской научной конференции студентов и молодых ученых

Москва, 2003), Конференции ученых Республики Башкортостан «Научный прорыв - 2004» (Уфа, 2004), на Межрегиональной научно-практической конференции «Формирование здорового образа жизни: государственные, национальные, личностные приоритеты» (Уфа, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины (Уфа, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 113 страницах, содержит 27 таблиц, 36 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 197 источников, из которых 78 отечественных и 119 иностранных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Ерофеева, Ольга Евгеньевна

IX. ВЫВОДЫ

1. Аскорбиновая кислота в больших дозировках: 100, 500 и 1000 мг/кг введенная в организм белых крыс, доза-зависимо ингибирует обмен гликозаминогликанов и их фракций - гиалуроновой кислоты и сульфатированных ГАГ, соответственно сначала подавляя анаболизм, затем и катаболизм этих биополимеров.

2. Аскорбиновая кислота во всех больших дозировках - 100, 500 и 1000 мг/кг - увеличивает биосинтез нуклеиновых кислот в печени крыс.

3. Аскорбиновая кислота в диапазоне доз 100 - 500 мг/кг проявляет защитную эффективность при остром отравлении белых крыс фенолом в дозе 01,84.

4. Аскорбиновая кислота в дозировке 500 мг/кг повышает интенсивность реакций глюкуронидной конъюгации в печени крыс на модели острого отравления фенолом.

5. Теоретически и экспериментально обоснована принципиальная возможность повышения адаптационных возможностей аскорбат-независимых видов путем применения больших дозировок аскорбиновой кислоты.

X. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Представляется целесообразным проведение дополнительных биохимических исследований, направленных на уточнение механизмов фармакологической активности больших дозировок аскорбиновой кислоты у аскорбат-зависимых видов.

2. Представляется целесообразным проведение теоретических и экспериментальных исследований, направленных на обоснование методического подхода к решению фармакологических задач на основе применения больших дозировок эндогенных соединений для целенаправленного перераспределения метаболических потоков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ерофеева, Ольга Евгеньевна, Уфа

1. Алехин Е.К., Богданова А.Ш., Плечев В.В., Фархутдинов Р.Р. Влияние лекарственных средств на процессы свободнорадикального окисления: Справочник.- Уфа: БГМУ, 2002.- С.288.

2. Андреева М.П., Раскин A.M. Заболевания надпочечников // Руководство по внутренним болезням, 2002.- Т.7.- С.423-499.

3. Бабаева А.Г. Традиционные и нетрадиционные представления о роли системы иммуногенеза в организме // Вестник АМН СССР.- 1986. № 1. - С.22.

4. Баренбойм Г.М., Маленков А.Г. Биологически активные вещества. Новые принципы поиска. М.: Наука, 1986. - С.368.

5. Башкатов С. А. Гликозаминогликаны в механизмах адаптации организма.-Уфа: БашГУ, 1996. -144 с.

6. Беленький M.JI. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л.: Медицина, 1963. - 152 с.

7. Белоусов Ю.Б., Моисеев B.C., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. М.: Универсум, 1993. - 400 с.

8. Березов Т.Г. Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1982.-750 с.

9. Биохимический справочник.- Киев: Вища школа, 1979. 304 с.

10. Бойд У. Основы иммунологии.- М.: Мир, 1969.- 647 с.

11. Брехман И.И. Человек и биологически активные вещества, 2-е изд. М.: Наука, 1980.-С. 120.

12. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты и синтетические ингибиторы радикальных реакций // Успехи химии.- 1975. Т.44. - №10. - С.874-886.

13. Бычков С.М., Захарова М.М. Новые данные о гликозаминогликанах и протеогликанах //Вопр. мед. хим. 1979, - №3. - С.227-237.

14. Бышевский А.Ш., Терсенов O.A. Биохимия для врачей.-Екатерининбург: Уральский рабочий, 1994 384с.

15. Введение в клиническую биохимию (основы патохимии) / Под ред. Иванова И.И.- Л.: Медицина, 1969. 493с.

16. Вельтищев Ю.У. Наследственные аномалии обмена витаминов. // Генетика.- 1980. Т.5. - С. 123-148.

17. Гадаскина И.Д., Филов В.А. Превращение и определение промышленных органических ядов в организме. JL: Медицина, 1971. - 304 с.

18. Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов JI.A. Общие механизмы токсического действия. JL: Медицина, 1986. - 280с.

19. Головенко Н.Я. Механизмы реакций метаболизма ксенобиотиков в биологических мембранах. Киев, 1981. - 312с.

20. Гофман Э. Динамическая биохимия. М.: Медицина, 1971. - 321с.

21. Гуськова P.A., Виленчик М.М., Кольтовер В.К. Роль свободных супероксидных радикалов в старении биологических объектов // Биофизика. -1980.-Т. 25.-С. 102-105.

22. Ермолаев О.Ю. Математическая статистика для психологов. -М.:Флинта, 2002. С.336.

23. Денисенко П.П. Экстремальные состояния как фармакологическая проблема // Поиск фармакологических средств для профилактики и ранней терапии нарушений, вызванных экстремальными факторами: Сб. науч. тр. Ленинградского СГМИ.-Л., 1986. С. 4-7.

24. Джиоев Ф.К. Влияние глюкуроновой кислоты на канцерогенное действие уретана, дибунилнитрозамина и 7,12-диметилбенза.антрацена //Вопросы онкологии. 1988. - Т.34. - №4. - С.463-467.

25. Дэгли С., Николсон Д. Метаболические пути.- М.:Мир, 1973. 3Юс.

26. Жамгоцев Г.Г., Предтеченский М.Б. Медицинская помощь пораженным сильнодействующими ядовитыми веществами (СДЯВ). М.: Медицина, 1993. -208с.

27. Журавлев А.И. Биоантиокислители в животном организме // Биоантиокислители: Тр. Моск. об-ва исп. природы. М.: Наука, 1975. - Т.52. -С.15-29.

28. Журавлев А.И. Развитие идей Б.Н.Тарусова о роли цепных процессов в биологии // Биоантиокислители в регуляции метаболизма в норме и патологии: Тр. Моск. об-ва исп. природы.-М.:Наука,1982.-Т.57.-С.З-37.

29. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы патохимии СПб., 2001. - С.374-379

30. Зимина Н.П., Дмитриев И.П., Рыкова В.И. Состав и степень сульфатирования гликозаминогликанов из тканей животных различных видов: гетерогенность и тканевая специфичность гепарансульфатов // Биохимия,-1987. Т.52.- Вып.6. - С.984-990.

31. Зимина Н.П., Рыкова В.И., Архипов И.А. Протеогликаны животных тканей как нерегулярные биополимеры: информативность структуры и контроль биосинтеза // Успехи современной биологии.-1992. Т.112.- Вып. 4. -С.571-588.

32. Зимина Н.П., Рыкова В.И. Протеогликаны животных тканей и их влияние на синтез ДНК //Биохимия,- 1986. Т.51.- С.1555-1561.

33. Зимина Н.П. Рыкова В.И., Дмитриев И.П. Сравнительная характеристика состава и степени сульфатирования гликозаминогликанов покоящихся и активно пролиферирующих тканей. // Биохимия.- 1987. Т. 52.-С. 856-861.

34. Зимницкий А.Н., Башкатов С.А. Гликозаминогликаны в биохимических механизмах адаптации организма к некоторым физиологическим и патологическим состояниям. М.: Фармацевтический Бюллетень, 2004. - С.208.

35. Зимницкий А.Н., Башкатов С.А. Сопряженность биосинтеза гликозаминогликанов с ядерным и микросомальным аппаратом клетки // Молекулярная биология, 2006.- Т. 40.- № 2. С.1-11.

36. Ивантер Э.В., Коросов A.B. Основы биометрии: введение в статистический анализ биологических явлений и процессов.- Петрозаводск: ПГУ, 1992.-С.163.

37. Киселева А.Ф., Житников А.Я., Кейсевич J1.B. и др. Морфофункциональные методы исследования в норме и при патологии. Киев: Здоров'я, 1983. - 168с.

38. Клещенко Е. Аскорбинка по Полингу: вопрос решен или забыт? //Химия и жизнь, 1999.-№10. С. 18-22

39. Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия. М.: Мир, 2000.- 469с.

40. Кожура И.М. Содержание фракций белков и липопротеидов в сыворотке крови кроликов разного возраста при экспериментальном атеросклерозе // Механизмы старения. Киев: Государственное медицинское издательство УССР, 1963. - С. 121 -126.

41. Крылов Ю.Ф., Неугодова Н.П., Смирнов П.А. Роль биотрансформации лекарственных средств в реализации фармакологического эффекта // Вестник АМН СССР. 1984. - №12. - С.76-80.

42. Лабори Г. Регуляция обменных процессов (теоретический, экспериментальный, фармакологический и терапевтический аспекты). -М.:Медицина,1970. -С.384.

43. Лабори Г. Метаболические и фармакологические основы нейрофизиологии. М.: Медицина, 1974. - С. 168.

44. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета.-М.: Медицина, 1985.-256с.

45. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. - С.352.

46. Ландау М.А. Молекулярная природа отдельных физиологических процессов. М.: Наука, 1985.- 264с.

47. Лашнеева Н.В., Тутельян В.А. Индукция цитохрома Р-450 в печени крыс при воздействии полихлорированных дифенилов // Фармакология и токсикология.-1984. №6. - С. 77-80.

48. Логаткин М.Н. Критерии адекватного питания. Л.: ЛПМИ, 1984. - С.88

49. Маршалл В.Дж. Клиническая биохимия -2-ое изд. пер с англ. СПб.: Невский диалект, 2002. - С.784.

50. Меньшиков В.В. Руководство по клинической лабораторной диагностике. -М.: Медицина, 1982. С.576.

51. Методы биохимических исследований / Под ред. М.И.Прохоровой.- Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. 272с.

52. Методы практической биохимии / Под ред. Уильямса Б., Уилсона К. -М.:Мир,1978.- 272с.

53. Методы химии углеводов / Под ред. Н.К.Кочеткова. М.: Мир, 1967. -С.38-42.

54. Мешкова Н.П., Северин С.Е. Практикум по биохимии.-М.:Изд-во МГУ, 1979.- 430с.

55. Мхитарян В.Г., Агаджанов М.И., Геворкян Д.М. Ферментные механизмы антирадикальной защиты клетки при экстремальных состояниях // Вестн. АМН СССР. -1982. №9. - С.15-19.

56. Обухова Л.К., Эмануэль Н.М. Роль свободнорадикальных реакций окисления в молекулярных механизмах старения живых организмов // 1983. -Т.52.-С.353-371.

57. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии,- М. :Медицина, 1968.-372с.

58. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений.-М.:Медицина,1973.-287с.

59. Полинг Л. "Витамин С и здоровье".- М.:Наука, 1974.- С. 115

60. Роберте Дж., Касерио М. Основы органической химии. М.: Мир, 1978.320 с.

61. Северин М.В., Юшков Б.Г., Ястребов А.П. Регенерация тканей при экстремальных воздействиях на организм. Екатеринбург, 1993. - 187с.

62. Сергеев П.В., Галенко-Ярошевский П.А., Шимановский H.JI. Очерки биохимической фармакологии. М.: РЦ "Фармединфо",1996. - 384с.

63. Сергеев П.В. и соавт. Биохимическая фармакология. М.: Высшая школа, 1982. - С.343.

64. Серов В.В., Шехтер В.Б. Соединительная ткань М.: Медицина, 1981. — С.312.

65. Слуцкий Л.И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. Л.: Медицина, 1969.- С.376.

66. Соколовский В.В. Окислительно-восстановительные процессы в биохимическом механизме неспецифической реакции организма на действие экстремальных факторов внешней среды // Антиоксиданты и адаптация. Л., 1984.- С.5-19.

67. Стейси М., Баркер С. Углеводы живых тканей. М.:Мир, 1965. - С.324.

68. Страйер Л. Биохимия: в 3-х т. Пер. с англ. М.: Мир, 1985. - Т.З. -С.400.

69. Уайт. Дж. Основы биохимии. М.: Мир, 1982. - Т.З. - 232с.

70. Фукс Б.Б., Фукс Б.И. Очерки морфологии и гистохимии соединительной ткани.- Л. :Медицина,1968. 216с.

71. Хмелевский Ю.В., Усатенко O.K. Основные биохимические константы человека в норме и при патологии.- Киев: Здоров'я, 1987. 160с.

72. Хочачка П., Сомеро Дж. Стратегия биохимической адаптации. Мир, 1977. -С.216-228

73. Хьюз Р. Гликопротеины.-М.: Мир.- 1985.

74. Чекман И.С., Гриневич А.И. Конъюгация ксенобиотиков //Фармакология и токсикология. 1988. - №1. - С.86-89.

75. Шараев П.Н., Иванов В.Г., Рябов В.И. Биохимические методы анализа показателей обмена биополимеров соединительной ткани. Ижевск, 1989.-15с.

76. Эмануэль Н.М. Ингибиторы радикальных процессов (антиоксиданты) и возможности продления жизни //Геронтология и гериатрия. -Киев, 1979. -С.118-127.

77. Banhegyi G., Braun L., Csala М., Puskas F., Mandl J. Ascorbate metabolism and its regulation in animals // Free Radic. Biol. Med. 1997. - Vol.23. - №5. -P.793-803.

78. Bean A., Almarza A., Athanasiou K. Effects of Ascorbic Acid Concentration on the Tissue Engineering of the Temporomandibular Joint Disc // Journal of Engineering in Medicine.-2006.-Vol.220.-N.3.-P.439-447.

79. Bird T.A., Schvartz N.B., Peterkofsky B. Mechanism for the decreased biosynthesis of cartilage proteoglycans in the scorbutic guinea pig // J. Biol. Chem. -1986. Vol.261. - №24. - P. 11166-11172.

80. Bird T.A., Spanheimer R.G., Peterkofsky B. Coordinate regulation of collagen and proteoglycan synthesis in costal cartilage of scorbutic and acutely fasted, vitamin C-suplemented guinea pigs. // Arch. Biochem. Biophis. 1986. - № 246 (1).-P.42-51.

81. Boyle J., Luan B., Cruz T.F., Kandel R.A. Characterization of proteoglycan accumulation during formation of cartilagenous tissue in vitro // Osteoarthritis Cartilage. 1995. - Vol.3. - №2. -P.l 17-125.

82. Bray B.J., Rosengren R.J. Retinol potentiates acetomiphen-induced hepatotoxity in the mouse: mechanistic studies // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2001. -Vol.173.-№3.- P.129-136.

83. Burlakova E.B. Irradiation effect on free radical mechanism of cell proliferation regulation // Simp. Papers I Intern. Biophys. Congr.-Pushchino, 1973. -P.55-62.

84. Campo G., Avenoso A., Campo S., Ferlazzo A. Efficacy of treatment with glycosaminoglycans on experimental collagen-induced arthritis in rats // Artritis Research & Therapy. 2003. - Vol.5, №3. - P. 122-132.

85. Cappelletti R., Del Rosso M., Chiarugi V.P. A new electrophoretic method for the complete separation of all known animal glycosaminoglycans in a monodimentional run//Anal. Biochem.-1979.-Vol.99. P.311-315.

86. Cassaro C.M.F., Dietrich C.P. Distribution of sulfated mucopolysaccharides in invertebrates Hi. Biol. Chem. 1977. - Vol.252, №7. - P.2254-2261.

87. Comper W.D. Evolution and development of extracellular matrixes is correlated with the sulfation of matrix macromolecules to form higly variable macroion binding templates // Interplag. Genet. Phys. Processes. Dev. Biol. Form. -1994. -P.121-127.

88. Coon M.J., Persson A.V. Microsomal cytochrome P-450: A central catalyst in detoxication reactions //Enzymatic basis of detoxication /Ed. Jakobt V.B. N.Y., I980.-Vol.l. - P. 117-134.

89. Coughtrie M.W., Sharp S. Glucuronidation of imipramine in rabbit and human liver microsomes: assay conditions and interaction with other tertiary amine drugs//Biochem.Pharmacol.- 1991.-Vol.42. -№7.-P.1497-l501.

90. Dietrich C.P., Sampaio L.O., Toledo O.M.S. Characteristic distribution of sulfated mucopolysaccharides in different tissuse and their mitochondria // Biochem. and Biophys. Res. Commun 1977. - Vol.75.- №2.- P.329-336.

91. Dingell J.V., Sossi N. Studies on the glucuronidation of 7-hydroxychlorpromazine in vitro //Drug. Metab. Dispos. 1977. - Vol.5. - №4. -P.397-404.

92. Diculescu I., Onicescu D, The histochemistry o epimerases. Uridin diphosphatase glucuronic acid epimerases // Acta Histochem. 1966. - Vol.25. -№5. - P.242-250.

93. Edward M, Oliver RF. Changes in the synthesis, distribution and sulphation of glycosaminoglycans of cultured human skin fibroblasts upon ascorbate feeding. // Cell Sci.- 1983.- N. 11.- P.245-254.

94. Edward M. Ascorbate induced changes in glycosaminoglycan synthesis and distribution of normal and SV40-transformed fibroblasts. // J. Cell Sci. -1986.-N.9.-P.217-229.

95. Fink R.M, Lengfelder E. Hyaluronic acid degradation by ascorbic acid and influence of iron. // Free Radic. Res. Commun. 1987. - Vol.3. - №1-5. - P.85-92.

96. Fisher E., McLennan S.V., Tada H., Heffernan S., Yue D.K., Turtle J.R. Interaction of ascorbic acid and glucose on production of collagen and proteoglycan by fibroblasts // Diabetes. 1991. - Vol.40. - №3. - P.371-376.

97. Fishman W.H., Smith M., Thompson D.B. et. al. Investigation of glucuronic acid metabolism in human subjects // J. Clin. Invest. 1951. -Vol.30. - P.685-696.

98. Freeman C., Hopwood J.J. Human liver glucuronate 2-sulfatase. Purificatin, characterization catalytic properties // Biochem. J. 1989. - Vol.259. - №1. - P. 209216.

99. Furucava K. Glycosaminoglycans in cell nuclei and their biological functions // Saibo Kogaru. 1990. - Vol.9. - №3. - P.207-214.

100. Garg H.G., Siebert E.P., Swann D.A. Isolation and some structure analyses of a copolymeric chondroitin sulfate-dermatan sulfate proteoglycan from post-burn, human hypertrophic scar//Carbohydr. Res.-1990. Vol.197. - P. 159-169.

101. González M.J. Orthomolecular Oncology Review: Ascorbic Acid and Cancer 25 Years Later// Integrative Cancer Therapies.-2005.-Vol.4.-N.l .-P.32-44.

102. Glaser L., Brown D.H. Purification and properties of d-glucose-6-phosphate dehydrogenase // Proc.Natl. Acad. Sci. US, 1955. -N.41. -P.253.

103. Glaser J.H., Conrad H.E. Chick emryo liver beta-glucuronidase. Comparison of activity on natural artificial substrates // J. Biol. Chem. 1979. - Vol.254. -N. 14. -P. 6588-6597.

104. Glowaski A., Kozma E.M., Olczyk K., Kucharz E.J. Glycosaminoglycans -structure and function//Posteiy Biochem 1995. - Vol. 41. - №23. - P. 139-148.

105. Glucuronic Acid. (Ed. Dutton G.). New York: Acad Press. - 1966.

106. Gomes P.B., Dietrich C.P. Distribution of heparin and other sulfated glycosaminoglycans in vertebrates //Comp. Biochem. and Physiol.- 1982. Vol.73 N.4. - P.857-863.

107. Goode D., Lewis M.E., Crabbe M.J. Accumulation of xylitol in the mammalian lens is related to glucuronate metabolism. //FEBS Lett. 1996. -Vol.395.-N.2-3.-P.174-178.

108. Hagner-Mcwhirter A., Lindahl U., Li J. Biosynthesis of heparin/heparan sulfate: mechanism of epimerization of glucuronyl C5. //Biochem. J. 2000. -Vol.347.-N.1.-P.69-75.

109. Harper G.S., O'Shannessy D.I., Gahl W.A. High-performance ion-exchange chromatographic separation of proteoglycans //Anal. Biochem.- 1986. Vol. 159.-P. 150-156.

110. Hata R.I., Nagai Y. A low-sulfated chondroitin sulfate in rat blood: an acidic glycosaminoglycan wih a hight metabolic rate // Biochim. Biophys. Acta. 1978. -Vol.543. -N.2.-P.149-155.

111. Hata R., Senoo H. L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblast // J. Cell. Physiol. 1989. - Vol.138. - N.l. - P.8-16.

112. Hata R, Sunada H, Arai K, Sato T, Ninomiya Y, Nagai Y, Senoo H. Regulation of collagen metabolism and cell growth by epidermal growth factor and ascorbate in cultured human skin fibroblasts // Eur J. Biochem.- 1988.-N.15.- P.261-267.

113. Haulthouse A.L., Becker K., Beck M. Proteoglycan synthesis by cultured human chondrocytes // Microsc. Res. Tech. 1994. - Vol.28. - N.6. - P.520-526.

114. Herbert V. Nutrition Cultism.-Philadelphia: G.F.Stickley & Co, 1980.-234p.

115. Herbert V. Vitamins and "Health" Foods.- G.F.Stickley & Co: Philadelphia, 1980.-P.94-96.

116. Hochman Y., Zakim D. Stadies of the catalitic mechanism of microsomal UDP-glucuroniltransferase. Alpha-glucuronidase activity and its stimulation by phospholipids //J.Biol.Chem. 1984. - Vol.259. - N.9. - P.5521 -5525.

117. Hook M., Kjellen L., Jahansson S., Robinson J. Cell-surface glycosaminoglycans. // Annual Rev. Biochem. 1984. -N.6. - P.847-869.

118. Horecker BL. The biochemistry of sugars // int. Z. Vitam. Ernahrungsforsch. Beih.-1976.-Vol.15.-P.l-21.

119. Hunter G.K., Heersche J.N.M., Aubin J.E. Isolation of three species of proteoglycan synthesized by cloned bone cells //Biochemistry.- 1983. Vol.22.- N.4. -P.831-837.

120. Jeffrey D Esko. Influence of core protein sequence on glycosaminoglycan assembly /Jeffrey D Esko, L. Zhang // Current Opinion in Structural Biology. 1996. -Vol.5.-P. 663-670.

121. Jorge A., Robertson W., Robertson K. Ascorbic acid and the synthesis of chondroitin sulfate // Biochimica and biophysica acta. 1998 - Vol.124. - N.l. -P.86-94.

122. Jouis V., Bocquet J., Pujol J.P. Effect of ascorbic acid on secreted proteoglycan from rabbit articular chondrocytes // FEBS Lett. 1985. - Vol.186. -N.2. - P.233-240.

123. Kasper Ch., Henton D. Glucuronidation. In: Enzymatic Basis of Detoxication/Ed. W. Jakoby N.W., London; Toronto; Sydney; San Francisco, 1980.-Vol.2.- P.3-36.

124. Kao J., Huey G., Kao R., Stern R. Ascorbic acid stimulates production of glycosaminoglycans in cultured fibroblasts // Exp. Mol. Pathol. 1990. - Vol.53. -N.l. -P.l-10.

125. Kazuyuki S., Hiroshi K. Recent advances in the study of the biosynthesis and functions of sulfated glycosaminoglycans // Current Opinion in Structural Biology. 2000. - Vol.10. - N.5. - P.518-527.

126. Kim G, Okumura M, Bosnakovski D, Ishiguro T, Park CH, Kadosawa T, Fujinaga T. Effects of ascorbic acid on proliferation and biological properties of bovine chondrocytes in alginate beads // Jpn. J. Vet. Res.- 2003. Vol.51. - N.2. -P.83-94.

127. Koide N., Tsuji T.Proteoglycan // Kan. Tan. Sui. 1995. - Vol. 31. - N.3. -P.361-369.

128. Kolb E. Recent knowledge concerning the biochemistry and significance of ascorbic acid Z Gesamte // Inn Med. 1984.-N. 1. - P.21 -27.

129. Nambisan B, Kurup PA. Ascorbic acid and glycosarninoglycan and lipid metabolism in guinea pigs fed normal and atherogenic diets Atherosclerosis. // Inn Med. 1975.-N. 11-12.-P.447-461.

130. Lam R. The nature of cytoplasmic vacuoles in chondroma cells. A correlative enzyme and electron microscopic histochemical study // Pathol.Res. Pract. 1990. -Vol.186.-N.5.-P.642-650.

131. Lau, Eduardo C., lean V. Chromatography on DEAE-cellulose microcolumns: a quantitative method for the fraction of small quantities of GAG //Anal. Biochem.-1983.-Vol.130.- N.l. P.237-245.

132. Laurent T.C. Biochemistry of hyaluronan // Acta Otolaryngol. Suppl. -1987.-Vol.442.-P.7-24.

133. Lindahl U ., Kjellen L. // Biology of proteoglican. Eds Wight T.N., Mecham R.P. Orlando: Acad. Press. 1987. P.59.

134. Levene C. I., Bates C. J. Growth and Macromolecular Synthesis in the 3T6 Mouse Fibroblast. General Description and the Role of Ascorbic Acid // Journal of Cell Science.-1970.-Vol.7.-P.671-682.

135. Linster C.L., Van Schaftingen E. Rapid stimulation of free glucuronate formation by non-glucuronidable xenobiotics in isolated rat hepatocytes //J. Biol. Chem. 2003. - Vol.278. - N.38. - P.36328-36333.

136. Lyon M., Nieduszynski I.A. A study of equilibrium binding of link protein to hyaluronate //Biochem. J. 1983. - Vol.213.- P.445-450.

137. Markovic O., Huttl S. Contribution to a methodical approach to determination of protein and glycoprotein components in synovial fluid // Cas Lek Cesk. 1964.- N.5.- P.522-525.

138. Margolis R.K., Crockett C.P., Kiang W.L. Glycosaminoglycans and glycoproteins associated with rat brain nuclei //Biochim. et Biophys. Acta. 1976. -Vol.451.-N.2.-P.465-469.

139. Marsh C. A. Metabolism of glucuronolactone in mammalian system. 3. Further studies of D-glucuronolactone dehydrogenase of rat liver /7 Biochem. J. -1963.-Vol.89.-P.108-114.

140. Marsh C. A. Metabolism of glucuronolactone in mammalian system. Identification of D-glucaric acid as a normal constituent of urine //Biochem. J. -1963.-Vol.83.-P.77-86.

141. Marsh C. A. Metabolism of glucuronolactone into D-glucaric acid by tissue preparation // Biochem. J. 1963. - Vol.87. - P.82-90.

142. Matyas G.R., Morre D.J. Coupling of uridine-5-diphosphate (UDP) formation and nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) reduction for cytochemical localization of glycosyltransferases // J. Histochem. Cytochem. 1983. - Vol.31. -N.10.-P.1175-1182.

143. McAuliffe A.V. High glucose inhibits effect of ascorbic acid on 35S. sulfate incorporation in mesangial cell and matrix proteoglycan / A.V. McAuliffe, E.J. Fisher, S.V. McLennan // Diabetes Ras. Clin. Pract. 1997. - Vol.37. - N.2. -P.101-108.

144. McAuliffe A.V., Brooks B.A., Fisher E.J., Molyneaux L.M., Yue D.K. Administration of Ascorbic Acid and an Aldose Reductase Inhibitor (Tolrestat) in

145. Diabetes: Effect on Urinary Albumin Excretion I I Nephron.-1998.-Vol.80.-P.277-284.

146. Meech R., Mackenzie P.I. Structure and function of uridine diphosphate glucuronosyltransferase // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1997. - Vol.24. - N.12. -P.907-915.

147. Merimee T.J., Misbin R.L, Gold L. Elevated L-xylulose concentrations in serum: a difference between type I and type II diabetes // Metabolism. 1984. -Vol33. -N.1.-P.82-84.

148. Mitolo M. The glucuronic acid-xylulose cycle as metabolic alternative of glucides // Progr. Vtl. 1961. - Vol 15. -N.17. - P.151-158.

149. Mochizuki H., Oda H., Yokogoshi H. Dietary taurine alters ascorbic acid matabolism in rats fed diets containing Polychlorinated Biphenyls // Journal of Nutrition. 2000. - Vol.130. - P.873-876.

150. Niedermeier W., Dobson C., Laney R.P. Studies on the ascorbic acid-induced depolymerization of haluronic acid // Biochimica and biophysica acta. 1967. -Vol.141.-N.9.-P.366-373.

151. Parke D.V., Williams R.T. The metabolism of benzene, a) The formation of phenylglucuronide and phenylsulphuric acid from C14 benzene, b) The metabolism of C14 phenol // Biochem. J.-1953.- Vol.55.- P.337.

152. Parquet M., Pessah M., Sacquet E., Salvat C., Raizman A. Effective glucuronidation of 6 alpha-hydroxylated bile acids by human hepatic and renal microsomes // Eur. J. Biochem. 1988. - Vol.171. -N. 1-2. - P.329-334.

153. Pacifi M. Independent secretion of proteoglycans and collagens in chick chondrocyte cultures during acute ascorbic acid treatment. // Biochem. J. 1990. -Vol.15. -N.272(1).- P.193-199.

154. Pauling L: Vitamin C and the Common Cold. San Francisco: WH Freeman, 1976.- 220p.

155. Pauling L. Vitamin C and longevity // Agressologe.-1983.-V.24.-N.7.-P.317-319.

156. Pauling L, Cameron E. Supplemental ascorbate in the supportive treatment of cancer: réévaluation of prolongation of survival times in terminal human cancer // Proceeding of the National Academy of Sciences.- 1978.- Vol. 75.- P.4538-4542.

157. Pedersen L.C., DardenT.A., Negishi M. Crystal structure of beta 1,3-glucuronyltransferasel in complex with active donor substrate UDP-GlcUA // J. Biol. Chem. 2002. - Vol.277. - N.24. - P.21869-21873.

158. Pedersen L.C., Tsuchida K., Kitagawa H., Sugahara K., Darden T.A., Negishi M. Heparan/chondroitin sulfate biosyntesis. Structure and mechanism of human glucuronyltransferase // J. Biol. Chem. 2000. — Vol.275 - P.34580-34585.

159. Price V.F., Schulte J.M., Jollow. Mechanism of fasting-induced supression of acetamiphen glucuronidation in the rat //Adv. Exp. Med. Biol. 1986. - Vol.197. -P.697-706.

160. Radominska-Pandya A., Czernik P.J., Little J.M., Battaglia E., Mackenzie P.I. Structure Mid function of UDP- glucuronosyltransferases // Drug Metab. Rev. -1999. Vol.31. - N.4. - P.817-899.

161. Robinson J.A., Robinson H.C. Initiation of chondroiti sulfate syntesis by beta-D-galactosides. Substrates for galactosyltransferase II. // Biochem. J. 1985. -Vol. 227. - N.3. - P.805-814.

162. Rohrmann K., Niemann R., Budecke E. Two N-acetylgalactosaminyltransferase are involved in the biosynthesis of chondroitin sulfate //Eur. J. Biochem. 1985. - Vol.148. -N.3. - Vol.463-469.

163. Rondle C.J.M., Morgan W.T.The determination of glucosamine and galactosamine. // Biochem J. 1955.- N.12.- P.586-589.

164. Roseman S., Ludowieg J, Moses F., Dorfman A. The biosynthesis of the glucuronic acid moiety of hyaluronic acid // Arch. Biochem. Biophys. 1953.- N.2.-P.472-473.

165. Rosenberg L., Hellmann W., Kleinschmidt A.K. Electron microscopic studies of proteoglycan aggregates from bovine articular cartilages // J. Biol. Chem.-1975.-Vol.250.- N.5.- P. 1877-1883.

166. Schwartz E.R., Adamy L. Effect of ascorbic acid on arylsulfatase activities and sulfated proteoglycan metabolism in chondrocyte cultures // J. Clin. Invest.-1977.-Vol.60.-N. 1.- P.96-106.

167. Silbert J.E. Structure and metabolism of proteoglycans and glycosaminoglycans // J. Invest. Dermatol. 1982. - Vol.79. - N. 1. - P.31 -37.

168. Silbert J.E. Sugumaran G .Intracellular membranes in synthesis, transport, and metabolism of proteoglycans Biochim. // Biophys. Acta. 1995. - Vol. 1241. -N.3. -P.371-384.

169. Spindler K.P., Shapiro D.B., Gross S.B., Brighton C.T., Clark C.C. The effect of ascorbic acid on the metabolism of rat calvarial bone cells in vitro //J. Orthop. Res. 1989. - Vol. 7. - N.5. - P.696-701.

170. Smythies J.R. Persons E. Guide to Antioxydants.- Rutgers Univ.Press:New Brunswick.,1998.-P. 146.

171. Stein G.S., Roberts R.M., Davis J.L. et al. Are glycoproteins and glycosaminoglycans components of the eucaryotic genome? // Nature.- 1975.-Vol.258. N.5536. - P.639-641.

172. Srinivasan S., Govindarajulu A. Impact of oestradiol and progesterone on the glycosaminoglycans and their depolymerizing enzymes of the rat mammary gland // Acta Physiologica Scandinavica.-2000.-Vol.l68.-N.3.-P385.

173. Tool B.D., Biswas Ch., Gross J. Hyaluronat and invasiness of the rabbit V2 carcinoma // Proc. Nat. Acad. Sci. USA Biol. Sci. 1979. - Vol.76.- N.12.-P.6299-6303.

174. Ueno N., Chakrabarti B., Garg H.G. Hyaluronic acid of human skin and post-burn scar: heterogeneity in primary structure and molecular weight // Biochem.Int. -1992. Vol.26.- N.5.- P.787-796.

175. Valla S., Li J., Barbeyron T., Lindahl U. Hexuronil C5-epimerases in alginate and glysaminoglycan biosynthesis // Biochimie. 2001. - Vol.83. - N.8. - P.819-830.

176. Vogel K.G. Glycosaminoglycans and proteoglycans. Review // Extracell Matrix. Assem. Struct. Edited by Yurchenco P.D Academic San Diego, Calif., 1994.- 382p.

177. Vogel K.G., Peterson D.W. Extracellular surface and intracellular proteoglycans produced by human embryo lung fibroblasts in culture (IMR-90) // J.Biol.Chem. -1981. Vol.256.- N.24.- P. 13235-13242.

178. Waddington R.J., Roberts H.C., Sugars R.V. Differentias roles for small leucine-rich proteoglycans in bone formations // Europian Cells and Materials. -2003.- Vol.6. -P.12-21.

179. Wislocki P.G., Miwa G.T., Lu A.Y. Reactions catalyzed by the cytochrome P-450 system // Enzymatic basis of detoxication /Ed. Jakoby W.B. N.Y.,1980. -Vol.1. -P.135-182.

180. White B.N., Shetlar M.R., Shurley H.M., Shilling J.A. Incorporation of (1-14C) Glucosamine into mucopolysaccarides of rat connective tissue. // Biochim Biophys Acta.- 1965.- N.3.- P.97-105.

181. Wong S.F, Halliwell B, Richmond R, Skowroneck WR. The role of superoxide and hydroxyl radicals in the degradation of hyaluronic acid induced by metal ions and by ascorbic acid. // J. Inorg. Biochem.-1981.- N.4. P. 127-134.

182. Zhou L., Higginbotham E.J., Yue B.Y. Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture // Taylor & Francis.-1998.-Vol. 17.-N.2.-P.211-217.