Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние антициклических карбоновых кислот и эндотелина на генерализованные припадки и генетически обусловленные абсансы у крыс (электрофизиологическое исследование)

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние антициклических карбоновых кислот и эндотелина на генерализованные припадки и генетически обусловленные абсансы у крыс (электрофизиологическое исследование)"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.Ломоносова Биологический факультет

РГ8 О _ 9 ИЮ.П '

МОГИМИ АЛИ

(Исламская Республика Иран)

ВЛИЯНИЕ АЛИЦИКЛИЧЕСКИХ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ И ЭНДОТЕЛИНА НА ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫЕ ПРИПАДКИ И ГЕНЕТИЧЕСКИ ОБУСЛОВЛЕННЫЕ АБСАНСЫ У КРЫС (электрофизиологичсское исследование)

03.00.13. - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

На правах рукописи УДК: 612.853 + 615.357 + 616.853

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Московского Государственного университета им.М.В.Ломоносова

Ведущее учреждение: Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии Российской Академии Наук

Защита состоится: 16 июня 1997 года в 14.00 час на заседании Специализированного Совета Д.0553.05.35. в Московском Государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Воробьевы Горы, МГУ Биологический факультет, в аудитории ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Заведующий кафедрой Академик РАМН Игорь Петрович Ашмарин

Научные руководители: доктор биол. наук

проф. С.А.Чепурнов канд.биол. наук доцент Н.Е.Чепурнова

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук профессор В.И.Бадиков

- кандидат биологических наук доцент И.А.Шестова

Автореферат разослан:

с/ и/с>/^Ст1

г.

кандидат биологичесь

В экспериментальной эпилептологии накоплен большой опыт. Оценивая его, Президент Всемирной Противоэпилептической Лиги (ILAE) проф. J.Engel Jr. (1995) отмечал, что нужны новые модели, соответствующие запросам клиники. Исследуя региональный метаболизм и мозговой кровоток, экспрессию генов - ранних и поздних, контролирующих синтез нейротропных факторов и рецепторов, можно исслё-довать, какие анатомически связанные мозговые образования ответственны за эпилептогенез, какие нейрохимические звенья межнейронной передачи ответственны за эпилепсию и эпилептические синдромы. Особое место в изучении эпилепсии всегда отводилось созданию экспериментальных моделей на животных, когда in vivo удается независимо моделировать разные компоненты эпилепсии (Крушинский, 1960; Крыжановский, Луценко, Караганов, 1991). Выбор модели определяется не только особенностями клиники эпилепсии (Gale, 1995), но и обоснованным поиском новых противосудорожных средств на основании новых данных о нейрохимических механизмах межцентральной передачи и характеристиках припадков или их электрографических и моторных эквивалентов. В клинике характер припадка также является решающим при выборе противосудорожного препарата или их сочетания (Wolf, 1994).

Современные нейрохимические данные о возбуждении и торможении нервных клеток и нервных сетей, участии глии в этих процессах позволили создать ряд новейших противосудорожных средств. Дальнейшее исследование роли в этих процессах регуляторных пептидов (Ашмарин и др, 1986, 1996) является актуальной задачей (Дамбинова, 1995; Воронина, 1995; Шандра, 1994; Meldrum, 1995; Chadwick, 1995; Reynolds,1968,1995; Levy, Mattson, Meldrum,1995; Majkowski, 1993). В традициях фундаментальных исследований по эпилепсии - стремление раскрыть базовые механизмы контроля возбудимости нейронов. Фармакология новых противосудорожных стредств (Reynolds, 1995; Majkowski, 1995) опирается, в основном, на успешные исследования ГАМК-ергичес-кой и глутаматергической систем, прямой регуляции ионных каналов. Однако около 20% больных эпилепсией не поддаются лечению. Изучение и внедрение новых противосудорожных препаратов нейропептидной

природы остается актуальной задачей теоретической и практической эпилептологии (Болдырев, 1984; Карлов, 1990; Асанова, 1995; Максутова, 1994; Гусев, Бурд, 1994; P.Wolf, 1995; Темин, Никанорова,1997). Несмотря на большие успехи патофизиологии регуляторных нейропептидов (Ашмарин и др., 1978, 1986; Судаков, 1984; Крыжановский, Глебов, 1983; Крыжановский, Луценко, 1995; Айрапетянц, 1992,1996; Саркисова,1996), многое еще не реализовано в лечебные программы. Ярким примером тому является отсутствие противоэпилептических лекарств нового поколения - нейропептидной природы.

Новая экспериментальная модель эпилептогенеза метаболического типа была недавно открыта П.Гроссманом (Gross.Weaver, 1993) при введении эндотелина в ультрамалых дозах непосредственно в желудочки мозга. Как большинство нейропептидов, эндотелии, известный первоначально как вазоакгивный пептид, секретируемый эндотелиальными клетками (Yanagisawa, Kurihara et al., 1988; Lembeck, 1990), обладает широким, до конца не изученным спектром физиологических регуляций (Графов, Медведва, Медведев, 1995). Возможно, что именно снижение скорости кровотока в перивентрикулярных структурах запускает механизм эпилептогенеза, но ведущим является прямое действие на нервные клетки. Семейство эндотелинов [ЕТ-1, ЕТ-2, ЕТ-3] действует через два подтипа G-белок связанных рецепторов (ЕТА и ЕТв) (Sakamoto, Yanagisawa et al., 1993), причем они содержатся в значительном количестве в структурах мозга и в гиппокампе - ведущей структуре эпилептогенеза (Hoyer et al., 1989; Jones, Hiley et al., 1989). Прямое введение ЕТ-1 в желудочки мозга вызывает ротацию (barrel-rolling) и эпилептиподобные поведенческие признаки. Было высказано предположение о проконвульсантном действии эндотелина на основании его кальций-опосредованного гиперметаболического эффекта в нейронах и через НМДА-рецепторы к глутамату. ЕТ-1 резко усиливает обмен глюкозы в перивентрикулярных структурах мозга. Вместе с тем, неврологические механизмы эффекта ЕТ-1 не исследованы, а электрографические корреляты судорожного припадка при введении ЕТ-1 вообще ранее не были зарегистрированы. Для определения специфичности проконвулъсантного действия эндотелина и выявления

его роли в различных формах эпилептогенеза необходимо было также доказать участие его специфических рецепторов.

Новым направлением в фармакологии эпилепсии является разработка препаратов на основе алициклических бикарбоновых кислот. Разработан препарат - "сакрицин" (СКЦ) (С.А.Саакян и соавт., 1995 - О.О.О. САКРИМЕД), который не имеет структурных аналогов. СКЦ не обладает теми побочными эффектами, которые ограничивают применение известных противосудорожных средств. Результаты доклинических испытаний показали, что СКЦ не обладает сенсибилизирующей активностью, не проявляет мутагенных свойств, по предварительным данным он не влияет на поведение и память и не обнаруживает снотворного седативного транквилизирующего или других подобных эффектов. СКЦ не обладает кумулятивными свойствами (Саакян, 1997). К механизмам возможного центрального действия следует отнести влияние СКЦ на холино-рецепторы и торможение холинергической синаптической передачи (Пивоваров, Саакян, 1996). Исследование СКЦ представляется целесообразным для разработки новых подходов к дифференцированной фармакотерапии генерализованных форм эпилепсии и раскрытию механизмов эпилептогенеза.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного целями работы были:

1. Используя модель дробного введения хемоконвульсанта (пенти-лентетразол), изучить противосудорожные свойства нового химического соединения, относящегося к химии алициклических карбоновых кислот ("сакрицин"), сопоставив эффективность системного (подкожного) и интраназального способов введения.

2. Исследовать центральные эффекты пептида эндотелина (ЕТ-1, ЕТ-3) при его прямом введении в желудочки мозга в ультрамалых дозах, выяснить участие эндотелина в формировании эпилептиформных разрядов последействия в ЭГ-активности мозга и генезе моторной асимметрии.

3. Определить специфичность центральных эффектов эндотелина в ультрамалых дозах, изучить эффект агониста ЕТд.рецепторов.

4. Изучить особенности формирования электрических реакций абсантного типа на примере крыс с генетической обусловленностью эпилепсии линии "WAG/Rij" и исследовать влияние эндотелина на проявление судорожной активности типа абсанс.

В трех экспериментальных разделах диссертации решались следующие задачи:

- используя хемоконвульсантную модель ПТЗ-вызванных судорог, изучали дозо-завискмые противосудорожные эффекта СКЦ при его подкожном и интраназальном способах введения;

- исследовали влияние СКЦ на характер эпилептиформной активности, вызванной ГГГЗ, в коре и гиппокампе до и в разные периоды судорожного моторного припадка;

- изучали метаболическую модель эпилептогенеза, создаваемую внутрижелудочковым введением эндотелина в ультрамалых дозах;

- сравнивали поведенческие и электрофизиологические корреляты центрального действия эндотелина и выясняли роль блокирования ЕТв рецепторов в генезе судорожной активности;

- изучали особенности поведения крыс линии WAG/Rij в открытом поле и по тесту на тревожность в крестообразном лабиринте;

- анализировали с помощью компьютерной системы электрическую активность и характер спонтанных генерализованных пик-волновых разрядов в коре и гиппокампе у крыс линии WAG/Rij с генетически обусловленными асбантными приступами;

- исследовали влияние эндотелина на абсантные приступы у крыс линии WAG/Rij.

Научная новизна исследования. Впервые выполнено исследование электрофизиологических коррелят судорожных процессов и вращательных движений (моторных асимметрий), возникающих при центральном действии эндотелина (ЕТ-1) в ультрамалых дозах (пикомолярных концентрациях). Действие эндотелина вызывает приступ комплексной парциальной эпилепсии с вторично генерализованными судорогами. Доказано, что появление пик-волновой активности и ее генерализация предшествует ротационному поведению (barrel-rolling) и клонико-тоническому судорож-

ному припадку. Впервые сопоставлены проконвульсантные свойства ЕТ-1 и ЕТ-3, а с помощью агониста М-5ис-[С1и9-А1а"'15]Епбо1ЬеПп-1(8-21) показана возможность изолированного специфического вызова эффектов эндотелина только через ЕТд рецепторы. На модели метаболической активации судорожного атвета показан противоположный эффект эндотелина при его применение у крыс линии ШАв/Яу с генетически обусловленными формами абсантных припадков. Впервые обнаружены новые механизмы торможения абсантных приступов эндотелином и конкурентные отношения в этих реакциях с агонистом ЕТв -рецепторов.

На модифицированной модели ПТЗ-вызванных судорог доказано по поведенческим критериям (увеличение латентных периодов судорожного моторного ответа или его полное блокирование) и по электрофизиологическим показателям (торможение разрядов последействия в коре и гиппокампе), что "сакрицин" (препарат, относящийся к химии алициклических карбоновых кислот) обладает противосудорожными свойствами.

Теоретическое и практическое значение. Полученные фундаментальные даные расширяют представления о роли нейропептидов в механизмах эпилепсии, о метаболических механизмах эпилептогенеза, участии стволовых мозговых структур при воздействии эпилептогенов с поверхности эндотелия мозговых желудочков.

Разработана новая модель индукции судорожных припадков с помощью ультрамалых доз эндотелина. Модель может быть применена для проверки различных противосудорожных средств. Обнаружена возможность купирования или продолжительного торможения генеза врожденных абсансов, что указывает на перспективу разработки новых средств противоэпилептических средств купирующих приступ абсантного типа на базе агонистов и антагонистов к эндотелиновым рецепторам.

Представлены физиологические обоснования нового клинического применения сакрицина в качестве противосудорожного средства при эндоназальном способе лечения.

Исследования сакрицина проведены в соответствии с клиническими рекомендациями проф. докт. мед. наук Л.МАсановой (Лаб. Пароксиз-

мальных Состояний, НИИ Профилактической Психиатрии и Судебной Медицины им. Сербского МЗ РФ), за что мы приносим ей искреннюю благодарность.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на: XXI Международном Конгрессе по Эпилепсии Международной Противо-эпилептической Лиги (ILAE), Sydney, Австралия, 1995; 1-ой Конференции Украинской Противоэпилептической Лиги, Киев, 1995; 1-ом Российско-Американском Симпозиуме по клиническим и социальным аспектам эпилепсии, Санкт-Петербург, 1996; Международном Междисциплинарном симпозиуме "Рецепторы к пептидам", Монреаль, Канада, 1996; II Европейском Конгрессе по Эпилепсии, Гаага, Нидерланды, 1996; 11-ом Международном Симпозиуме "Регуляторные пептиды", Копенгаген, Дания, 1996. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации Работа состоит из Введения, 4-х глав: Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты исследования и обсуждение (3 части), Заключение. Общий объем составляет ... стр., включая .... рис., 3-х таблиц. Список литературы состоит из .... источников, в том числе .... на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные. Работа выполнялась на беспородных крысах и крысах линии "WAG/Rij", созданных в лаборатории проф. Т.Соепеп и проф. G.Luijtelaar (The Netherlands, Nijmegen) и любезно предоставленных нам д.б.н. Г.Д.Кузнецовой (НИИ ВНД и НФ РАН) в соответствии с общепринятыми правилами исследования механизмов расстройств деятельности ЦНС, а также скрининга эффектов антиэпилептических препаратов. Использовали животных в возрасте от 3 месяцев массой 180-300 г. Всего использовано: 427 взрослых животных в поведенческих опытах и 44 крысы в электрофизиологических экспериментах. Опыты проводились с соблюдением требований, предъявляемых к работе с экспериментальными животными в России (Приказ Министерства Здравоохранения СССР №755 от 12.08.1977 г. "О мерах по дальнейшему совершенствованию форм работы с использованием экспериментальных животных».), и в соответствии с требованиями Между-

народной Комиссии по Биоэтике Международного Союза Физиологических Наук (IUPS) (1993, 1997).

Электрофизиологические методики. Вживление электродов для регистрации ЭГ-активности и канюли для внутримозговых введений проводили по известной методике (Волшин, 1987; Буреш и др., 1991). Электроды изготавливали из нихромовой проволоки в лаковой изоляции диаметром 250 мкм и с расстоянием между кончиками 0.5 мм. Канюли представляли собой электролитически заточенные иглы с наружным диаметром 0.7 мм, длиной в среднем 10 мм. Вживление электродов и канюль проводили под наркозом в стереотаксическом аппарате. Анестезию осуществляли внутрибрюшинным введением фенобарбитала ("Somnotol", МТС PHARMACEUTICALS, Cambridge) в дозе 47 мг/кг. Дополнительно осуществляли инфильтрацию мягких тканей головы и области наружного слухового прохода 0.5 % раствором новокаина. Используемые координаты по Е.Фифковой и Дж. Маршалл (Буреш и др., 1962):

Структура мозга AP L H

Cortex frontalis 3.0 2.0 1.0

Cortex occipitalis 5.0 2.0 2.0

Hippocampus 2.0 1.5 3.3

Amygdala 1.0 3.5 8.0

Ventriculus lateralis 1.0 1.5 3.3

Регистрацию ЭГ проводили с помощью 4-х канальной усилительной системы с компьютерным анализом ЭЭГ - "CONAN" (А.П.Кулаичев, 1996). Система CONAN позволяет визуально исследовать запись, вычислять амплитудно-частотные характеристики, вычислять спектр текущей эпохи по методу быстрого преобразования Фурье, картировать по диапазонам частот и эпохам, проводить усреднение и статистическое сравнение карт, проводить экспресс-диагностику (А.П.Кулаичев, 1997). ЭГ-актив-ность регистрировали в норме и при развитии эпилептических судорог в условиях свободного поведения животного не ранее, чем через трое суток после операции. Определяли амплитуду, частоту, и продолжительность судорожных припадков, вызванных ПТЗ, или изменение этих показателей

после введения СКЦ, а у крыс линии WAG/Rij изменение абсансов после внутримозгового введения ЕТ.

По окончании опытов проводили морфологический контроль. Эвтаназию крыс осуществляли эфиром. После фиксации мозга серийные срезы приготавливали на замораживающем микротоме.

Вещества. Внутрибрушинно применяли пентилентетразол (ПТЗ), «Sigma», в объеме 0.20-0.30 мл. в однократной дозе 25 мг/кг. Сакрицин (СКЦ) вводили перед введением ПГЗ интраназально в объеме 20 мкл по А.А.Каменскому (Л.В. Антонова, А.А.Каменский, 1982) в концентрациях -от 1 мкг до ЮОмкг. Подкожно СКЦ вводили в дозах от 200 до 600 мг/кг. Для внутрижелудочкового введения применяли эндотелины: ЕТ-1, (синтезированный в НИИ ОЧБП, Санкт-Петербург, д.х.н. М.П.Смирновой в отделе проф. ОАКаурова); ЕТ-3 (human, rat, 21 аминокислота, М.в. -2643.05 (Yanagisawa et al., 1988), "NEOSYSTEM", (France) и ETB-рецепторов агонист: N-Suc-[Glu9-Alau-15]Endothelin-I(8-21) (14 аминокислот, M.B.-1820.96 - IRL 1620, "NEOSYSTEM"). Применяли также MK-801 (Dizocilpine maleate, "Sigma") и галанин (синтезированный М.П.Смирновой, НИИ ОЧБП, Санкт-Петербург).

Внугрижелудочковые введения ЕТ осуществляли с помощью Гамиль-тоновского микроинъектора, соединенного с помощью полихлорвиниловой трубки диаметром 0.8 мм с инъекционной, электролитически заточенной иглой наружным диаметром 0.5 мм. В качестве контроля использовали физ. ра-р 0.9% NACL (рН=7.4) в объеме 3 мкл вводимы с той же скоростью 1.0 мкл/мин.

Модель судорожной активности, вызываемой ПТЗ при дробном введении в подпороговой дозе, и оценка эпилептического припадка.

Для изучения судорожной активности животных была использована методика оценки моторных припадков, разработанная на кафедре физиологии человека и животных МГУ (Chepumov et al.,1988; Craig, Colosanti, 1989). Вводили ПТЗ (i.p.) в дозе 25 мг/кг каждые 15 мин, но не более трех раз. При достижении максимальной судорожной моторной активности дальнейшие введения ПТЗ прекращали. Трехкратное введение пороговых доз ПТЗ позволяло дифференцированно измерять судорожный порог и

оценивать профиль судорожного припадка каждого животного. Метод исключал передозировку эпилептогена при повторных введениях в последующие экспериментальные дни с целью экспресс-оценки противо-судорожных свойств вводимого вещества. После интраназального введения СКЦ крыс помещали в индивидуальные прозрачные пластмассовые клетки (25x25x25) и наблюдали за поведением животных в течение 1ч -1ч 30 мин после введения СКЦ.

Стадии судорожного припадка определяли визуально и оценивали следующим образом: 0 баллов- нет изменений в поведении; 0.5 баллов -периоды замирания, напряжение мышц пальцев и хвоста и продолжительное умывание; 1 балл - изолированные миоклонические вздрагивания головы (myoclonic jerks); 2 балла - атипичные минимальные судороги (minimal seizures); 3 балла - клонические судороги мышц туловища и предных конечностей; 4 балла - судороги мышц всего тела, подъем на задние конечности («поза кенгуру») и повторные клонусы мышц предных конечностей (major seizures); 5 баллов - генерализованные клонико-тонические судорога с потерей выпрямительных рефлексов (generalized tonic-clonic seizures) с падением животных на бок (P.Mares, M.Pohl, H.Kubova, 1983; P.Mares, H.Kubova, 1985; Аббасова, 1997). Кроме того, определяли латентный период 1-ой, 2-ой, 3-ей, 4-ой и 5-ой стадий и количество генерализованных тонико-клонических судорог и процент крыс в каждой группе, достигших 5-ой стадии.

Показателями эффективности противосудорожной активности СКЦ служили данные индивидуальной изменчивости моторной судорожной активности, количество животных, у которых на фоне СКЦ полностью или частично блокировалась судорожная активность, изменение латентных периодов 1-ой, 3-ой, 4-ой и 5-ой стадий и процент различных стадий судорожной активности.

Для изучения изменений в поведении беспородных крыс и крыс линии WAG/Rij, после внтурюкелудочкового введения эндотелина использовали (одновременно с записью ЭЭГ) следующие показатели: ротации, экзофтальм, тремор, ригидность хвоста, жевание /судорожные челюстные движения/, вокализация, опистотонус.

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с помощью общепринятых в медико-биологических исследованиях непараметрических методов (точный метод Фишера и критерия Вилкоксона-Манна-Уитни). Графики и таблицы были построены с помощью графического редактора Qwatrro Pro. и Excel.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЛИЯНИЕ АЛИЦИКЛИЧЕСКИХ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ (ПРЕПАРАТ САКРИЦИН) НА СУДОРОЖНЫЕ ПРИПАДКИ, ВЫЗВАННЫЕ ПЕНТИЛЕНТЕТРАЗОЛОМ (ХЕМОКОНВУЛЬСАНТНАЯ МОДЕЛЬ ЭПИЛЕПСИИ) Противосудорожное влияние СКЦ определяли в двух вариантах опытов- при подкожном и интраназальном введениях. На основании ранее проведенных исследований фармакокинетики препарата, которые показали, что он достаточно быстро всасывается (среднее время всасывания 0.9 часа при подкожном введении), нами был выбран следующий протокол опыта: СКЦ вводили за 20 мин и 1 час до введения ПТЗ. Поскольку дробное введение конвульсанта предполагает наблюдение за реакцией животного в течение часа, в нашем варианте опыта концентрация СКЦ все время нарастала. При подкожном введении исследовали дозы 600, 500, 400 и 200 мг/кг. Отдельно проводили исследования на группах самцов и самок. По показателю снижения тяжести судорожного ответа все дозы были эффективны. Наиболее демонстративным было увеличение латентных периодов клонической и клонико-тонической стадий судорожной активности, причем минимальной эффективной оказалась доза 200 мг/кг. При подкожном введении СКЦ полностью блокировал судорожную активность 5 стадии и в 60% случаев - судорожный ответ 4 стадии.

Нами впервые применено интраназальное введение СКЦ. Были исследованы дозы I, 10 и 100 мг/кг. Достоверные результаты противо-эпилептического действия препарата по всем показателям судорожного ответы были получены при дозе 100 мг/кг (Рис.1). При интраназальном

введении СКЦ 5 стадия судорожной активности блокировалась в 70% случаев, однако судорожный ответ 4 стадии сохранялся. Препарат более эффективен при его применении на самцах по сравнению с самками.

363026 20 161060

1ГГЗ САЦ.

**

Л

-Г*—-г

0.6 1 2 3

1 I

4 б

Рис.1 Увеличение латентных периодов наступлений ПТЗ-вызванных судорог при интраназальном введении сакрицина (САЦ) в дозе 100 мг/кг * - р< 0.04 ** р < 0.01.

Огалии.судорюг

С целью выявления противосудорожного действия СКЦ на более ранние стадии эпилептогенеза после введения ПТЗ, нами исследована эпилептиформная активность коры и гиппокампа. Длительное монито-рирование ЭГ-активности сочетали с анализом стадий моторных судорожных ответов. СКЦ отчетливо угнетал разряды эпилептиформной активности у всех исследованных животных. Это демонстрируется как в записях электрограмм, так и при их спектральном анализе (Рис. 2). Количественная обработка электрограмм выявила достоверное снижение частоты появления разрядов за весь период наблюдения, а также укорочение продолжительности каждого спонтанного разряда, возникающего после введения ПТЗ (Рис. 3).

Таким образом СКЦ в дозе 100 мг/кг оказывает тормозное действие на формирование не только моторной судорожной активности, но и предшествующую ей эндогенно возникающую эпилептиформную активность, возникающую в коре и гиппокампе.

Рис.2. Частичное блокирование ПТЗ-вызванной эпилептиформной активности в коре и гиггпокамне мозга крысы в условиях предварительного введения СКЦ: а) фоновая актго кость; Ь) РПД после введения ПТЗ; с) ЭГ-акгивность после введения СКЦ.

Нами было проверено, не влияет ли эта оптимальная доза 100 мг/кг в целом на поведение животных. В опытах с исследованием поведения животных двух групп - контрольной и опытной с введением СКЦ в открытом поле с норковыми камерами никаких различий по следующим показателям не было получено: исследовательская деятельность, дефекация, умывание, стойки, число пересеченных квадратов.

С целью выявления роли НМДА-рецепторов в эффектах СКЦ было проведено исследование его совместного действия с блокатором МК-801. Сочетание СКЦ в дозе 100 мг/кг с МК-801 в дозах, полностью блокирующих судорожный ответ, не привело к полному торможению судорож-

ного ответа. По-видимому, СКЦ оказывает действие на механизмы, связанные с функцией НМДА-рецепторов.

Рис.3 Ингибирующее влияние СКЦ при его иктраназальном введении в дозе ¡00 мкг/кг на частоту разрядов пик-волновой активности (А) и продолжительность разрядов РПД (Б), вызванных введением ПТЗ.

20 25 30 Время, мин.

Итак, на примере хемоконвульсантной модели экспериментальной эпилепсии достоверно доказано протквосудорожное действие препарата СКЦ, являющегося производным алициклических карбоновых кислот. СКЦ может блокировать наиболее тяжелые стадии судорожного припадка, тормозит генерализованные пик-волновые разряды в коре и гиппо-кампе, чем препятствует распространению эпилептической активности на моторные структуры мозга. Препарат оказывает оптимальное противо-судорожное действие при интраназальном способе введения, когда его центральные эффекты проявляются локализованно.

ЦЕНТРАЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ЭНДОТЕЛИНА В УЛЬТРАМАЛЫХ ДОЗАХ ПРИ ВНУТРИЖЕЛУДОЧКОВОМ ВВЕДЕНИИ (МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ЭПИЛЕПСИИ)

Центральное действие ЕТ-1 при i.e.v. введении выражается в ряде неврологических признаков, как это впервые было продемонстрировано P.Gross et al., (1993). Нами выявлены следующие реакции у крыс (п=29), указывающие на вовлечение стволовых структур, вестибулярной системы, тегментума и мозжечка (который также богат рецепторами к ЕТ-1 по: Hiley, 1995). Это прежде всего - опистотонус и нистагм, глазо-двига-тельные реакции, экзофтальм и стереотипии. В 100% случаев развивается стереотипия, у некоторых крыс перед barrel-rolling наблюдается судорожная активность мышц тела и в 50% случаев гипертонус хвоста. Все эти нарушения поведения проявляются последовательно, и было определено, что пороговой является доза 9 pkmol/2-4 мкл. Латентный период развития событий составляет в среднем - 10 мин. Увеличение дозы уже в 2 раза приводит к стремительному возникновению стереотипии, бочкообразным движениям (barrel-rolling) и судорогам, которые могут вызвать гибель животного. Сравнение эффектов введения ЕТ-1 и ЕТ-3 показало, что все компоненты реакции повторяются, но латентные периоды короче при i.c.v. введении ЕТ-1.

В опытах с одновременной регистрацией поведения и ЭГ-активности коры и гиппокампа время наблюдения продолжалось после введения ЕТ-1 до 2-х часов. Определялись корреляции ЭГ-активности и поведенческих реакций - стереотипий, причем из-за физических артефактов мы не могли регистрировать ЭГ-активносгь в период стереотипий, но в период относительного мышечного покоя можно было наблюдать изменения ЭГ-активности, указывающие на формирование эпилептогенеза. Поведенчески это часто выражалось в клонической судороге мышц передних конечностей. Наблюдались случаи, когда эпилептиформная активность в коре и гиппокампе развивалась без видимых изменений тонуса и поведения. Однако, если в ЭГ-активности формировались продолжительные пик-волновые разряды, они индуцировали развитие тяжелой клонико-тонической моторной судороги с потерей позы.

Рис. 4. Изменение ЭГ-активности гиппокампа (верхняя запись) и неокортекса (нижняя запись) мозга крысы после введения ЕТ-1 в дозе 9pkmol/4mkl в латеральный желудочек мозга через: а) 5 мин; Ь) 7 мин; с) 14 мин после введения, d) 35 мин - непосредственно перед возникновением второй ротации (barrel-rolling).

По-видимому, временные характеристики развития судорог определялись метаболическими изменениями в коре, мозжечке, перивент-рикулярном отделе хвостатого ядра (усиление обмена глюкозы) и вовлечением НМДА-рецепторов (на что указывают нейрохимические данные Chew, Weawer, Balaban, Gross,1994). Отмечены следующие особенности развития эпилептиформных разрядов: появление коротких разрядов пик-волновой активности с частотой 4-5кол/с, увеличиение частоты пиков внутри разрядов. Перед наступлением barrei-rotling активность снижается по типу интериктального торможения (рис. 4).

Итак, внутрижелудочковое введение эндстелинов вызывает метаболические изменения в нейронах, проявляющие и усиливающие моторную асимметрию мозга, индуцирует эпилептиформную активность в коре и гиппокампе.

ВЛИЯНИЕ ЭНДОТЕЛИНА (ЕТ-1 И ЕТ-3) НА ЭЛЕКТРИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МОЗГА КРЫС С ГЕНЕТИЧЕСКИ ОБУСЛОВЛЕННЫМИ АБСАНСАМИ (WAG/Rij) Патологические ЭЭГ паттерны - генерализованная пик-волновая активность, фото-пароксизмальные паттерны и низковольтная ЭЭГ могут быть связаны с мутациями в определенных локусах хромосом. У крыс линии WAG/Rij абсансы и пик-волновая активность появляются в определенный период постнатального развития, и гены еще не определены (Van Luijtelaar, Coenen, 1988; Coenen, Dringenburg, Inoue, Van Luijtelaar, 1992, 1996). Согласно Международной Классификации (ILAE, 1989) абсансы относят к генерализованным формам эпилепсии (идиопатическим - первичным или криптогенным - симптоматическим). Наблюдаемые генерализованные пик-волновые разряды определяются таламо(п.гейси1ап5)-кортикальными взаимоотношениями (Пенфильц, Джаспер, 1954; Gloor, Avoli, Kostopoulos, 1990). В первых опытах с крысами линии WAG/Rij было необходимо проверить характер ЭГ-активности, сопровождающей абсантные приступы. По нашим данным эпилептиформные разряды в возрасте более 6-ти месяцев возникают в среднем с частотой 3 в мин, что соответствует данным других авторов (обзор: Noebels, Tharp, 1995). Частота пик-волн в разрядах

Рис. 5 Влияние эндотелина-1 на проявление абсантного приступа у крысы линии WAG/Rij. а) спонтанный приступ, б) торможение абсантного приступа через 30 мин после i.c.v. введения ЕТ-1; в-восстановление ослабленного абсантного приступа через 1 час после введения. Регистрируетя ЭГ активность коры в обоих полушариях: (сверху вниз): cortex frontalis d., occipitalis d., frontalis s., occipitalis s.

последействия у ^АС/Щ имела два максимума в диапазоне 7-8 кол/с и 16 кол/с.

Как и у больных, у крыс линии \УАО/11у абсансы наблюдаются визуально. Они сопровождаются иммобилизацией в период регистрации разряда пик-волновой активности, при этом наблюдается учащение дыхания и дрожание вибрисс, покачивания головой. С целью выяснить поведенческие особенности и различия в эмоциональном статусе крыс линии WAG/Rij, их тестировали в норковой камере (рис.6.) и крестообразном приподнятом лабиринте (рис.7).

Для сравнения брали белых беспородных крыс и линии \Vistar. Достоверные отличия были получены по числу стоек с опорой на стенку закрытого луча. Беспородные крысы делали в среднем 4,6 стоек, что в два раза больше, чем крысы линии ^/АО/Яу (2,3 стойки/5 мин теста) и

зо-2520,15-' 105-

о-

Умыв Пеаггр Норпт Д»фртг

ТГАЕ/Нц

1

2

Бесппр.

Горизонтальная активность.

тагГаг

сш

Каяки

шт

беспородные

Рис. 6

Сравнительная характеристика поведения крыс линии \УАС/Щ|, беспородных и линии Вистар в норковой камере (п=30), * - р<0.05; ** - р<0.01.

Г

Рис. 7

Оценка тревожности крыс линии ХУАО/Щ! при наблюдении их поведения в крестообразном лабиринте (п=30), * - р<0.05; ** - р<0.01.

эашгр

откр

умыв

линии \Vistar (2,8 стоек). Уровень значимости отличия беспородных крыс от крыс линии У/АО/Щ) был р<0,01. По большинству параметров: "число заходов в открытые лучи", числу "переходов из закрытых лучей в открытые", число дефекаций и "выглядываний" - достоверных различий между группами получено не было. Общий уровень активности в крестообразном лабиринте крыс линии \УАС/11ц ниже, чем у крыс других линий. За 5 минут теста они делали в среднем 3,2 попытки пересечь центральную платформу, что почти в 1,5 раза меньше, чем крысы линии \Vistar (4,7). При оценке первого выбора после помещения крысы в крестообразный лабиринт значимых отличий не обнаружено. На умывание крысы с врожденными абсансами тратили почти в 3 раза меньше времени, чем беспородные к линии \Vistar. Итак, ранее не изучавшиеся с помощью поведенческих методик крыс с генетически врожденными абсансами линии \УАО/Ш] можно охарактеризовать как

пассивных, эмоционально уравновешенных животных со сниженной исследовательско-ориентнровочной реакцией, что, по всей видимости, связано с периодически наступающими абсантными приступами.

Максимальное наблюдение за абсансами с мониторированием ЭГ -активности мы проводили до 12 часов (в ночное время). Наблюдали более продолжительные периоды бодрствования, по сравнению со здоровыми беспородными крысами, разряды пик-волновой активности чаще регистрировали в периоды глубокого медленно-волнового сна.

Введение ЕТ-1 (i.e.v.) крысам линии WAG/Rij вызывало те же поведенческие реакции, которые мы регистрировали у здоровых беспородных крыс, но по влиянию на паттерны ЭГ-активности наблюдали противоположные эффекты. Прежде всего, происходило урежение абсантных припадков и уменьшение их продолжительности, снижалась частота появления пик-волновых разрядов (рис. 5). Под влиянием ЕТ-1 достоверно снижалась (р<0.01) частота пик-волн (рис.8). Тормозные эффекты, по-видимому, определялись метаболическими изменениями, вызванными ЕТ-1, они заканчивались через час, но и после этого разряды появлялись с меньшей амплитудой и измененной частотой пик-волн, а 2.5-

> 24

3

4

W ( г; О,

о «

а, н в н

о 0.5

о £б

У о

=f=

**

1

контроль эндотелии

время.мин

Рис. 8. Влияние ЕТ-1 при ¡.с.у. введении в дозе 9 ркто1/2тк1.на частоту разрядов пик-волновой активности в коре мозга крыс \УАО/Щ).

Поскольку для ЕТ-1 избирательными являются ЕТд-рецепторы, в дальнейших экспериментах мы использовали ЕТ-3 и специфический агонист ЕТв - рецепторов, которые проявляют одинаковое сродство ко всем типам эндотелинов.

ЧАСТОТА РАЗРЯДОВ/мин ДЛИТЕЛЬНОСТЬ РАЗРЯДОВ/с

Рис. 9 Угнетение эффекта ET-J при предварительном введении i.e.v. агониста ETg - рецепторов крысам линии WAG/Rij.

Заключение. Нейрохимический подход к изучению эпилепсии, как правило, включает изучение веществ, снижающих уровень ГАМК, блокирующих работу ГАМК-рецепторов или имитирующих действие глутамата на NMDA, АМРА/каинатные рецепторы, или имитирующие действие ацетилхолина на мускариновые рецепторы. Наши исследования проведены несколько в другом направлении. В качестве веществ, инициирующих или блокирующих судороги, исследованы алициклические карбоновые кислоты и эндотелины. Исследованный механизм эпилеп-тогенеза связан, в данном случае, с локальным гиперметаболизмом (отмечаемом по глюкозе) в коре и прилежащих к желудочкам стволовых образованиях мозга, и вовлечением НМДА-опосредованных регуляций судорожного порога. ЕТ-1 и ЕТ-3 действуют на мембраны нейронов через метаботропные рецепторы, провоцируют синтез аспартата, способствуют образованию цГМФ и синтезу N0. Возможно, что в механизмы индукции стереотипических движений и судорожной активности включается

локальная гипоксия и ограничения транспорта глюкозы через ГЭБ. На основании ряда работ Р. С го 5.9 ее а1. (1993) структурами, - инициирующими судорожную активность под влиянием энцотелинов считали латеральный септум и перивентрикулярные отделы хвостатого ядра. Было ранее показано, что миндалина включается в эпилептогенез одновременно или до вращательных движений (СЬеригпоУ м а!., 1995), но в наших исследованиях убедительно доказано, что такой структурой является гиппокамп.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что производные алициклических карбоновых кислот обладают противосудорожным действием при системном (подкожном) и интраназальном введении у крыс, снижают тяж есть судорожного припадка, увеличивают латентный период и предотвращают развитие клонико-тонической стадии судорог, вызванных пентилен-тетразолом.

2. Эндотелины (ЕТ-1, ЕТ-3) при введении в латеральный желудочек мозга вызвают поведенческие сетереотипические реакции, опистотонус, нистагм, экзофтальм, гипертензию хвоста, бочкообразные вращательные движения. ЕТ-1 эффективен при введении в ультрамалых дозах -9ркто1/2шк1. Стереотипии предшествуют формированию активности по типу комплексной парциальной- эпилепсии с вторично-генерализованными судорогами и вовлечением в генерализованную эпилептическую активность гиппокампа и неокортекса обоих полушарий.

3. Изучены поведенческие особенности и электрофизиологические корреляты абсантных припадков у взрослых крыс линии \УАС/Щ] с генетически обусловленной пик-волновой активностью в диапазонах частот 7-8кол/с и 1бкол/с.

4 Выявлено угнетающее действие эндотелеина на проявление абсантных приступов у крыс линии Продолжительность

каждого абсанса и их частота в среднем уменьшается.

5. Предварительное введение в желудочки мозга агониста ЕТв-рецепторов ослабляет, тормозные эффекты ЕТ-3 у крыс линии ХУАС/Ш].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

[1]. Abbasova K.R., Sato Masako, Moghimi A., et al. Restorative influence of carbamazepine intranasal administration on the "Cognitive Map" and memory in rats during experimental epilepsy.//21 Intern. Epilepsy Congress. Sydney, Australia, 3-8 September. 1995. / Epilepsia. Vol. 36, Suppl.3. P. S44.

[2]. Асанова Л.М., Саакян C.A. Чепурнова H.E., Могими A:, Чепурнов C.A. Альтернативные подходы к разработке новых противо-судорожных средств. // 1-ая Конференция Украинской Противоэпилеп-тической Лиги, посвященная 30-летию центра "Эпилепсия", Киев. - Май, 22-24. 1995,- С. 70.

[3]. Саакян С.А., Асанова Л.М., Чепурнова Н.Е., Могими А., Чепурнов С.А. Новое противосудорожное средство на основе химии карбоновых кислот. // Труды 1-го Ежегодного Российско-Американского симпозиума по клиническим и социальным аспектам эпилепсии. Санкт-Петербург, Россия, Июнь, 3-5, 1996. - Р.54.

[4] Saakyan S., Atikuzzaman М., Krytskaya I., Asanova L., Chepurnova N., Moghimi A., Chepurnov S. New alternate contributor of antiepileptic drug // 2nd Congress of the European Federation of Neurological Societies. 30 October- 3 November, 1996. Roma - Italy. 1996. P.00

[5]. Moghimi A., Chepurnova N.E., Chepurnov S.A. Central effects of endothelin in the ultra low doses. 11th Intern. Symposium on Regulatory Peptides. Copenhagen, Denmark. September, 3-7. 1996 // Regulatory Peptides. Vol. 64. N 1-3. - P. 128

[6]. Chepurnova N.E., Smirnova M.P., Chepurnov S.A., Moghimi A. Central effects of endothelin in the ultra low doses. // Intern. Multidisciplinary Symposium (Montreal, July 28 - August 1, 1996). Peptide Receptors, (abs. p3.17). - P.64.

[7]. Asanova L.M., Moghimi A, Sato M, Chepurnova N.E., Rodionova V.I. Chepurnov S.A. Cognitive functions and spatial orientation in experimental epilepsy // The 2nd European Congress of Epileptology. The Hague. The Netherlands, September, 1-5, 1996 / Epilepsia. Vol.37. Suppl.4 1996 P. 31.

[8] Могими А., Клюева Ю.А, Бердиев P.K., Мартьянов A.A., Чепурнова Н.Е..Чепурнов С.А. Поведенческая характеристика крыс с генетически обсуловленными абсантными приступами (линии WAG/Rij)

// Журн. высш. нервн. деят., 1997 (в печати).

***

Глубоко благодарен академику И.П.Ашмарину за мою научную подготовку в МГУ в области нейрохимии и нейрофизиологии. Выражаю благодарность моим руководителям доц. Н.Е.Чепуриовой и проф. С.А.Чепурнову.

Благодарю к.б.н.С.А.Саакян, автора любезно предоставленного нам препарата "сакрицин".

ALI MOGHIMI (Islamic Republic of Iran)

ALICYCLIC CARBONATE ACIDS AND ENDOTHELIN INFLUENCES ON THE GENERALIZED SEIZURES AND GENETIC MODELS OF ABSENCE EPILEPSY IN RATS (Electrophysiological investigations) New experimental model of epilepsy was studied. Endothelins (ET-1, ET-3) administrated into lateral ventricle in rats. The dose 9pmol/4 mkl of ET was really threshold doses. High doses ET induced fatal causes. Behaviour fits and electrical activity of frontal cortex, and hippocamp were recorded. The stereotype behavior, barrel-rolling and seizures of partial and secondary-generalized type were observed. The afterdischarges into the amygdala preceded the motor fits, which have very short latency.

Spike-wave activity of adult WAG/Rij rats were also investigated by computer monitoring of EEG. ET-1 inhibited the spike-wave activity in the WAG/Rij rats. The i.c.v. administration of N-Suc-[Glu9-Ala11-15) Endothelin-I(8-21) -ETg agonist-receptors suppressed influences of ET-3.

The new obtained foundamentai results reveal the possibility of correction of epilepsy and epileptical syndroms by regulatory peptides and indicate new metabolic mechanisms of epileptogenesis. Our experiments suggest that the endothelins in ultra low doses have an important role in the. neurochemical processes of epileptogenesis. <=v—-_